CN106755544A - 一种与肺腺癌早期诊断相关的血清外泌体中的miRNA标志物及应用 - Google Patents

一种与肺腺癌早期诊断相关的血清外泌体中的miRNA标志物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种与肺腺癌早期诊断相关的血清外泌体中miRNA标志物及应用。该标志物选自hsa‑miR‑4516，hsa‑miR‑342‑3p，hsa‑miR‑199a‑3p，hsa‑miR‑150‑5p，hsa‑miR‑140‑3p，hsa‑miR‑18a‑5p，hsa‑miR‑222‑3p，hsa‑miR‑27a‑3p，hsa‑miR‑29a‑3p，hsa‑miR‑221‑3p，hsa‑miR‑500a‑3p，hsa‑miR‑6126和hsa‑miR‑6715a‑3p。该标志物能够将肺腺癌早期病例组与健康人组有效的分开。本发明所述标志物及其探针可用于制备肺腺癌早期诊断试剂盒。对肺腺癌的早期诊断具有辅助作用。

Description

一种与肺腺癌早期诊断相关的血清外泌体中的miRNA标志物 及应用
技术领域
本发明属于生物技术和诊断学领域，具体涉及一种用于肺腺癌早期诊断的血清外泌体miRNA标志物及应用。
背景技术
肺癌诊断缺乏早期诊断方法和特异性生物标志物
肺癌是全球范围内第二大高发癌症(男性发病率最高为前列腺癌；女性发病率最高为乳腺癌)。全球每年死于肺癌的人数超过120万人次，约占全球死亡人数的28％。虽然目前一些应用于肺癌诊治的分子靶向疗法颇有成效，然而病人的五年生存率仍不容乐观。原因在于缺乏早期的诊断方法和诊断分子标志物，大部分肺癌患者确诊时已处于疾病晚期。
目前肺癌的诊断主要依赖于胸部X线检查、胸部CT、磁共振显像(MRI)等影像学诊断、病理组织学诊断和血清学肿瘤标志物的化学诊断。临床上应用于肺癌诊断的血清分子标志物为癌胚抗原(CEA)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)，鳞状细胞癌抗原(SCC)，糖链抗原125(CA125)，角蛋白19片段(CYFRA21-1)，组织多肽抗原(TPA)等。而这些血清学标志物为广谱的癌症诊断分子标志物，对于肺癌的特异性诊断和早期诊断所发挥的作用具有很大的局限性。因此，开发肺癌特异性的血清学分子标志物对于肺癌的早期诊断无疑具有重要的临床意义。
外泌体是体液活检的重要组成部分；能反映其所来源组织的动态信息
体液活检目前常用检测的对象有循环肿瘤细胞、cell-free DNA、循环RNA和外泌体等。外泌体是细胞经过"内吞-融合-外排"而形成的细胞外纳米级小囊泡，直径为30-100nm。正常细胞和癌细胞在生理和病理条件下均能够释放外泌体。外泌体不仅存在于细胞培养基中，在体液中也广泛存在。常用的外泌体提取方法为蔗糖密度梯度离心(1.13–1.19g/mL)或超速离心法(100，000g for 70min)。外泌体为脂质双层膜结构，其膜表面高表达四跨膜蛋白超家族如CD63，CD81，CD9，热休克蛋白(HSP)和MHCI，而这些蛋白也成为外泌体鉴定的表面标记物。外泌体在血液、尿液、腹水甚至羊水等体液中广泛存在，并且可以通过体液运输。外泌体的内容物包含很多遗传信息(蛋白、mRNA和miRNA)，这些遗传物质能够反映其所在周围环境和其所来源组织的动态信息。
开发肺癌外周血液样本中microRNA作为生物标志物的必要性
所谓疾病的生物标志物，是指在疾病发生发展过程中，由于机体的内环境稳态改变、生理代谢过程异常等而引起的异常化的生物指标。通过检测某种疾病特定的生物标志物，对于疾病的诊断、治疗和疗效评价、预防乃至预后评估都具有重要的指导性作用。外周血液样本在众多的体液样本中是临床检验上必不可少的常规检测项目，因此开发外周血液样本来源的生物标志物，必然具有重要的临床疾病辅助诊断作用。
由于临床上目前辅助肺癌诊断的血清分子标志物为肿瘤学常用的广谱标志物，因此临床研究者们正致力于开发肺癌血清中的肺癌生物标志物以提高诊治的准确性。miRNA作为一种21-23nt的小分子RNA，在肿瘤的发展、转移过程中发挥重要的调节作用。差异表达的miRNA可能作为疾病早期诊断、分子分型和预后诊断的指标。
体液来源外泌体miRNA与体液中游离miRNA相比在临床诊断应用方面的优势
(1)外泌体中分子内容物含量丰富：目前在外泌体中共发现9769种蛋白质、3408种mRNAs、2838种micro RNAs和1116种脂质分子。因此，筛选肺癌外周血液样本来源的外泌体中的差异表达的miRNA，可能作为诊断、预测和治疗的生物标志物。
(2)稳定性强：外泌体直径仅30～100nm，可以避免被巨噬细胞吞噬。另外，外泌体的脂质双层膜结构所包含的生物分子，使其不被体液中的酶类降解。因此，与cell-freeDNA、循环RNA等游离生物分子相比，检测外泌体内容物中与疾病相关的生物标志物，可以得到更为稳定的数据。
(3)特异性强：外泌体miRNA不是随机整合入外泌体中的，而是通过一种选择机制进入外泌体，因此外泌体中的miRNA更具特异性。
(4)检测流程易标准化：外泌体miRNA因其稳定性好、含量较为丰富等特点，使其试验方法更容易标准化，所以，研究外泌体miRNA相比于直接分析血液中游离miRNA具有明显的优势。
因此，外泌体可以作为临床体液样本的重要检测项目，其存在的广泛性、良好的生物稳定性、样本来源的简易而又非侵入性使其在临床样本检验、诊断方面具有不容忽视的应用前景。开发血清外泌体中与肺癌早期诊断相关的血清外泌体中miRNA标志物，必然提高肺癌诊断的准确率和特异性，从而有利于肺癌的早期诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种用于肺癌诊断的血清miRNA标志物。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于肺癌诊断的血清miRNA标志物，所述标志物选自hsa-miR-4516，hsa-miR-342-3p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-150-5p，hsa-miR-140-3p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-6126和hsa-miR-6715a-3p。
在本发明的第二方面，提供了上述血清miRNA标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
在本发明的第三方面，提供了一种肺癌诊断试剂盒，其能够测定血清中的hsa-miR-4516，hsa-miR-342-3p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-150-5p，hsa-miR-140-3p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-6126和/或hsa-miR-6715a-3p的检测试剂。由于制备试剂盒的常用缓冲试剂等也是本领域技术人员的公知常识，因此，本发明在此并未限定试剂盒中的具体检测试剂。
对于上文所述的技术方案中，上述试剂盒中至少含有hsa-miR-4516，hsa-miR-342-3p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-150-5p，hsa-miR-140-3p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-6126和/或hsa-miR-6715a-3p的引物或引物探针。由于设计和合成引物探针是本领域技术人员的公知常识，因此，本发明在此并未限定具体的引物探针核苷酸序列等内容。
本发明的有益效果在于：首次发现了对肺腺癌具有较高诊断价值的生物标记物hsa-miR-4516，hsa-miR-342-3p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-150-5p，hsa-miR-140-3p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-6126，和hsa-miR-6715a-3p。通过血清miRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，使肺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。
本发明下述实施例中使用的研究对象：
病例组为2016年3月至2016年10月在大连医科大学附属第一医院收集的12例病例，经病理组织学确诊为原位癌或Ⅰ期肺腺癌患者，于入院后未经手术和放化疗前采血。对照组为同期进行疾病筛查的健康个体12例(男性、女性病例各半)，按性别和年龄(+5岁)与病例组进行相应的匹配。
实施例1
血清外泌体提取：
采用促凝管采肘静脉血5ml，3000rpm离心10min，吸取上层血清。将血清于4℃、20000g，离心30min，吸弃细胞碎片。得到的血清粗提液经0.22um滤膜过滤后，加入PBS，于4℃、150000g，离心90min。离心结束后吸弃PBS，加入PBS悬浮清洗沉淀，于4℃、150000g，离心60min。得到血清外泌体，加入500ul Trizol提取RNA。
样品总RNA抽提：
(1)实验进行之前先用无水乙醇拭擦实验台，减少实验台面灰尘并消毒；(2)取出样品解冻；(3)将含有Trizol LS的裂解液4℃12000rmp离心10min后，吸取上清到无RNase的离心管中，加入1/5体积的氯仿混匀，放置3min，然后4℃12000rpm离心15min；(4)吸取上清到新的无RNase的离心管中，再加入1/5体积的氯仿，混匀后离心15min，这一步主要是去除蛋白质杂质；(5)把上清转移到新的无RNase的离心管中，加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀；(6)将溶液转移至吸附柱(吸附柱放置在2ml收集管中)，离心8000rpm1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；(7)向吸附柱加入350ul RWT，8000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；(8)向吸附柱加入80ul DNaseI，在20-25℃消化DNA15min，由于DNasel比较脆弱，不能剧烈混合；(9)重复步骤(7)；(10)加入500ul RPE洗涤液洗涤两次，每次8000rpm离心1min；(11)弃掉收集管废液，然后12000rpm，离心2min；(12)把吸附柱移到新的1.5ml无RNase收集管中，然后加入15-20ul预热(50℃)过的RNase-freeWater，室温放置2min，12000rpm，离心2min，得RNA溶液。
Total RNA质检
(1)RNA浓度和纯度检测利用定容RNA的RNase-free Water作为空白对照，每个样品吸取1ul，用分光光度计测定RNA溶液在260和280nm下的吸光度值，检测RNA的浓度和纯度。按以下公式计算total RNA的浓度：Total RNA浓度(μg/ml)＝OD260×稀释倍数×40μg/ml以OD260/280值来检测RNA的纯度，OD260/280值在1.9-2.1之间时，可认为RNA的纯度较好；(2)RNA完整性检测每个样品吸取400-700ng的total RNA，用1.5％的甲醛变性凝胶电泳(120V)15min，在凝胶成像仪下检测总RNA中28s和18s的完整性。
RNA反转录和体外转录
(1)First-cDNA第一链合成
加入2ul稀释2*105RNA Spike control到500ng样品totalRNA后，总体积为5ul；然后加入5ul下列第一链反转录组分：
加入后用涡旋器混匀；在PCR仪中进行反转录，PCR程序：25℃，1h 42℃，1h 4℃，至少2min，结束后取出PCR管离心，5s后放在冰上，然后马上进行第二条cDNA合成。
(2)First-cDNA第二链合成
无核酸酶的PCR管放在冰上，准备合成第二条链cDNA链混合物：
涡旋混匀后离心5s转速3000rpm，吸取50ul混合液，加入到First-cDNA第一链反应结束的PCR管中，涡旋混匀，3000rpm离心5s，在PCR仪上进行反转录第二链合成，PCR程序：16℃，1h 65℃，10min 4℃，2min。
(3)体外转录(IVT)cRNA合成
在无RNase的PCR管中在室温下准备IVT Master Mix混合液：
涡旋混匀后3000rpm离心5s；吸取30ul混合液，加入到First-cDNA第二链合成产物PCR管中，终体积为90ul；然后，在PCR仪上40℃16h，结束后4℃过夜。反应结束后放在冰上进行纯化或-20℃保存。
(4)cRNA纯化
合成的cRNA中含有酶、盐和多余的核酸，为了保证cRNA的稳定性，需要纯化cRNA。在无RNase管子中准备cRNA Binding Mix，如下：
cRNA纯化 体积(μl)
Nucleic Acid Binding Beads核酸结合磁珠 10
Nucleic Acid Binding Buffer Concentrate缓冲液 50
吸取60ulcRNA binding Mix，加入到有cRNA合成PCR管中，然后用枪头上下打3次混匀，然后转移到新的无核酸酶的96孔U形板中；每个样品中加入60ul异丙醇，然后用枪头上下打3次混匀，用96孔封口膜封板，然后放在涡旋器上轻轻混匀至少2min，使磁珠和cRNA孵育结合；孵育结束后，放在磁力架上吸附磁珠，吸附5min，吸掉上清；然后，每个样品中加入100ulNucleic Acid Wash Solution，用96孔板封口膜封好后，放在涡旋器上涡旋1min，然后放在磁力架上5min，吸掉上清；重复第5步1次，然后干燥到没有明显液体，不能过度干燥，否则cRNA难溶解；每个样品中加入40ul 55-58℃预热的Elution Solution，溶解2min后，吸到无核酸酶的1.5ml离心管中，-80℃保存。然后用SMA3000分光光度计在260nm波长处检测cRNA浓度。
(5)2nd-cycle cDNA合成
在该过程中，利用10μgcRNA为模板，利用随机引物和含有dUTP适合浓度的dTTP进行反转录合成sense-strand cDNA。在冰上，向无核酸酶的PCR管中加入22ul(含有10μg)cRNA模板。加入2ul随机引物(random primes)，轻轻混匀后离心到管底，盖好后放在PCR仪上，70℃5min，然后25℃5min，最后4℃2min，离心5s，放在冰上。加入16ul 2nd-cycleMaster Mix混合液到第(2)步的PCR管中，轻轻混匀后离心5s，2nd-cycleMaster Mix组分如下：2nd-Cycle Master Mix component Volume for one reaction(μl)2nd-Cycle BufferMix82nd-Cycle Enzyme Mix 8Total Volume 16。把PCR管放在PCR仪上孵育，程序如下：25℃，10min 42℃，90min 70℃，10min 4℃，2min；反应结束后加入2ul RNaseH，去除cRNA模板，程序如下：37℃，孵育45min 95℃，5min 4℃，2min。
(6)2nd-cycle cDNA纯化
在PCR管中加入18μl nucleasefree water和60μl cDNABinding Mix，然后用枪头上下打3次混匀，然后转移到无核酸酶的96孔U型板上，cDNA Binding Mix组分如下：
cDNA Binding Mix component Volume for one reaction(μl)
Nucleic Acid Binding Beads 10
Nucleic Acid Binding BufferConcentrate 50
样品中加入120ul无水乙醇，放在涡旋器上涡旋孵育2min，然后放在磁力架上吸附5min，吸掉上清；加入100ul Nucleic Acid Wash Solution，在涡旋器上涡旋1min，然后放在磁力架上吸附5min，吸掉上清，再重复一次，挥发掉残余的乙醇；每个样品加入30ul 55-58℃预热的Elution Solution孵育2min，然后转移到无核酸酶的1.5ml离心管中，-80℃保存；吸取1ul，用SMA4000分光光度计在260nm波长处检验2nd-cDNA的浓度，并用2％的琼脂糖凝胶电泳检验2nd-cDNA分布大小。
样品标记和杂交
(1)2nd-cDNA片段化
吸取5.5μg 2nd-cDNA到无核酸酶的PCR管中，用RNase-free Water定容至31.2μl；加入16.8μl片段化混合液(Fragmention Master Mix)到样品2nd-cDNA中，混匀后离心5s，Fragmention Master Mix组分如下：Component Volume in 1Rxn(μl)RNase-freeWater1010×cDNA Fragmentation Buffer 4.8UDG，10U/μl 1.0APE 1，1，000 10U/μl1.0Total Volume16.8；放在PCR仪上进行孵育反应，程序如下：37℃，60min 93℃，2min 4℃，至少2min反应结束后离心5s；吸取2μl片段化产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳，检测片段化cDNA片段化大小，正常在100bp以下。
(2)片段化cDNA标记
吸取45ul片段化cDNA到无核酸酶的PCR管中，加入15ul标记试剂(labelingreagents)，混匀后离心5s。labeling reagents组分如下：Component Volume(μl)5×TdTBuffer12TdT 2DNA Labeling Reagent，5mM 1Total Volume 15；放在PCR仪上进行孵育，程序如下：37℃，60min 70℃，10min 4℃，至少2min；吸取2ul的标记产物，进行凝胶检测实验，检验标记结果。
(3)芯片杂交
把芯片从4℃存储冰箱中取出来，放在室温；在无核酸酶的PCR管中，加入5ul20*EukaryoticHybridization controls，在PCR仪上65℃孵育5min；在1.5ml无核酸酶的离心管中准备杂交混合液，配制好后放在无核酸酶的PCR管中，杂交液的组分如下：
反应组分终体积
杂交混合液放在PCR仪上进行孵育，程序如下：99℃，5min 45℃，5min结束后，离心1min；吸取配制好的杂交液100ul左右，加入到芯片中，加样口用贴纸封住；然后把芯片放在45℃60rpm的杂交炉上，杂交16h。
(4)芯片洗涤和扫描
杂交结束后，用枪头吸掉杂交液，加入100ul array holding buffer；在Affymetrix Gene Chip Command Console(AGCC)中用手持红外扫描设备扫描芯片条形码，注册样品信息，生成样品对应芯片ARR文件；把芯片洗涤液wash A、wash B和去离子水放在洗涤站的相应位置，然后运行AGCC FlutionsControl软件进行初始化；初始化结束后，在3个无核酸1.5ml离心管中分别加入600ml stain Cocktail 1、600mlstain cocktail2和800ml array holding buffer，然后放在洗脱站的1、2、3位置上，然后把芯片插入洗脱站的槽中；在AGCC flution Control软件的洗脱站Barcode中扫描芯片条形码和在Probe ArrayType中选择相应的芯片类型，然后点击运行，大约洗涤1h；洗脱结束后，把芯片放在affymetrix的扫描仪中，然后点击affymetrix Launcher中的AGCC Scan Control，点击工具栏中的Star进行芯片扫描生成数据。
(5)芯片数据分析
将生成的cel文件在Parteck 6.0上进行分析，采用one-way ANOVA进行比较分析，比较组间差异。
对于实施例1中上述实验结果的分析：
肺腺癌患者血清外泌体中hsa-miR-4516表达水平较对照组显著上调；而hsa-miR-342-3p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-150-5p，hsa-miR-140-3p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-6126，和hsa-miR-6715a-3p表达水平较对照组显著下降。具体数据如表1所示。
表1在肺腺癌血清外泌体中差异表达miRNA
用于肺癌诊断的试剂盒包括如hsa-miR-4516，hsa-miR-342-3p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-150-5p，hsa-miR-140-3p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-6126，和hsa-miR-6715a-3p所示的引物探针，可由Thermo公司购得。

Claims (4)

1.一种与肺癌诊断相关的血清来源外泌体中miRNA标志物，该标志物选自hsa-miR-4516，hsa-miR-342-3p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-150-5p，hsa-miR-140-3p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-6126和hsa-miR-6715a-3p。
2.权利要求1所述的血清外泌体miRNA标志物在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
3.一种肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于：含有用于检测血清外泌体中hsa-miR-4516，hsa-miR-342-3p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-150-5p，hsa-miR-140-3p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-6126，和/或hsa-miR-6715a-3p的检测试剂。
4.根据权利要求3所述的肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒至少含有检测血清外泌体hsa-miR-4516，hsa-miR-342-3p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-150-5p，hsa-miR-140-3p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-6126和/或hsa-miR-6715a-3p的引物或引物探针。
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