CN107523646A - 基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法。本发明提供4个基因的15个与乳腺癌相关的突变位点和10个基因的18个乳腺癌易感SNP位点的组合检测方法，利用SequenomMassARRAYSNP基因型分析技术对乳腺癌易感基因的SNP位点和与乳腺癌相关的基因突变位点进行基因分型检测。该方法对于乳腺癌的早期筛查更准确、技术重现性好、性价比高；相较于TaqMan‑PCR及二代平台测序的SNP检测，具有设计灵活、准确性高、检测位点样本量大、成本低等优点，可同时对数十个SNP位点进行数百至数千份样本检测。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法。
背景技术
乳腺癌(Breastcancer)被称为女性杀手，发病率仅次于肺癌。据世界卫生组织国际癌症研究中心发布的癌症报告(GLOBOCAN2008)估计，全世界每年约有138万妇女罹患乳腺癌，约有54万乳腺癌患者死亡。世界人口标化发病率为21.6/10万，居女性所有恶性肿瘤第2位；死亡率为5.7/10万，居女性癌症死亡的第6位。然而早期诊断早发现，乳腺癌病情的治愈还是相当乐观的。在第IV期得到诊断的乳腺癌患者中只有20％能够存活到5年之后，而在第I期就确诊的患者能100％活到5年之后。因此，乳腺癌的早期诊断是目前亟待解决的问题。
目前，临床上对乳腺癌检测有传统的检测方法，包括X线诊断、超声显象检查、细胞学及组织学诊断等，但这些检测手段针对性不强，检出率低，具有较大的局限性；还有一些基因检测手段，如免疫组化技术、荧光原位杂交技术、荧光定量PCR技术、基因芯片技术等。免疫组化技术可检测肿瘤和靶细胞蛋白表达情况，不能观察基因水平突变类型；FISH能直接和准确的判断革巴基因是否存在扩增，但较昂贵和繁琐；基因芯片技术可检测人数多、位点多，时间短，但仅用于己公布的基因位点、重复准确性低，价格高；荧光定量PCR技术试剂昂贵，需精密仪器。这些技术的缺点都大大的限制了乳腺癌早期诊断的应用。
国内外对乳腺癌易感基因的研究表明，乳腺癌患者在基因水平存在某些基因突变的现象，大多表现为SNP或碱基缺失多态性。研究发现，4个与乳腺癌相关的突变基因和10个与乳腺癌相关的风险基因，分别为BRCA1基因、BRCA2基因、PIK3CA基因、TP53基因、CD14基因、CYP1B1基因、ESR1基因、FGFR2基因、TOX3基因、Foxp3基因、NBS1基因、PTEN基因、BRIP1基因。因此，乳腺癌与基因多态性关联性和突变基因的研究成果使乳腺癌易感基因筛查成为可能。
已公布的乳腺癌早期筛查的专利中，SNP检测技术多为TaqMan-PCR和二代平台测序，但是TaqMan检测方法具有淬火难以彻底、本底较高，成本高、检测量低等缺陷，而二代测序技术费时费力，DNA链的二级结构还容易造成人工假象，使测序结果出现偏差。本发明所使用的SequenomSNP检测可以避免以上问题，并且还具有检测方法简便、灵活性强，高通量大、成本低等特点。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，此方法筛选出评估个体罹患乳腺癌风险的基因突变位点和乳腺癌易感SNP位点，并进行位点的组合，利用核酸质谱仪对乳腺癌相关的遗传学标识进行广泛筛查和检验，准确率更高，为乳腺癌发病风险的预测、预防和诊断提供依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)筛选出评估个体罹患乳腺癌风险的基因突变位点和乳腺癌易感SNP位点；
(2)设计步骤(1)的基因突变位点和乳腺癌易感SNP位点的扩增引物和单碱基延伸引物；
(3)将步骤(2)中的扩增引物分为4组，各组中所含的各SNP位点和基因突变位点的上下游引物混合，得到对应的4组扩增引物混合液；
(4)对应于步骤(3)中扩增引物分组的方式，将步骤(2)中的单碱基延伸引物分为4组，分别得到4组单碱基延伸引物混合液；
(5)以待测样本DNA为模板，利用步骤(3)中的每组扩增引物混合分别进行PCR扩增，获得目标位点的PCR产物；
(6)虾碱式磷酸酶消除步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；
(7)利用各组相对应的单碱基延伸引物对步骤(6)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
(8)脱盐树脂纯化延伸产物；
(9)MassARRAY平台检测分析进行芯片点样、扫描，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果，通过质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是突变。
进一步地，所述评估个体罹患乳腺癌风险的基因突变位点为：BRCA1基因的g.41246794delC、g.41246334C>G、g.41234551delG、g.41244291delT、g.41256138delT；BRCA2基因的g.32914191C>G、g.32929132delC、g.32945122C>A、g.32929399dupT、g.32911757C>T、g.32911659-32911662delAAAA、g.32912799T>C；TP53基因c.320g.7579367dupA、PIK3CA基因c.1658_1659GT>C、c.3140A>G。
进一步地，所述乳腺癌易感SNP位点分别为：BRCA1基因的rs799906，CD14基因的rs2569190，CYP1B1基因的rs1056836，ESR1基因的rs2046210，FGFR2基因的rs2912778、rs3135718、rs1219648、rs2981582，Foxp3基因的rs2294021，TOX3基因的rs8051542，PTEN基因的rs2299941、rs2735343，NBS1基因的rs2735385、rs6999227、rs1805812，BRIP1基因的rs7220719、rs16945628、rs11871753。
进一步地，所述评估个体罹患乳腺癌风险的基因突变位点的PCR引物、延伸引物的序列为：
g.41246794delC
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTGAACATCATCAACCCAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCCTGATACTTTTCTGGATGC-3'
延伸引物：5'-CTTTTCTGGATGCCTCTCAGCTGCAC-3'
g.41246334C>G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCTGATGACTCACATGATGGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAGAACGTCCAATACATCAGC-3'
延伸引物：5'-CAGCTACTTTGGCATTT-3'
g.41234551delG
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGGGATACCATGCAACATAAC-3'
下游5'-ACGTTGGATGCTCCCATGCTGTTCTAACAC-3'
延伸引物：5'-CCTGATAAAGCTCCAGCAG-3'
g.41244291delT
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTAGGTAGAAACAGAGGGC-3'
下游5'-ACGTTGGATGGTTTATAGACCTCAGGTTGC-3'延伸引物：5'-CAAAATTGAATGCTATGCTTAGAT-3'
g.41256138delT
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACAGAGTGAACCCGAAAATC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTTCTAGCCTGGGCCACAGA-3'延伸引物：5'-GAACCCGAAAATCCTTCCT-3'
g.32914191C>G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCAGGTTGTTACGAGGCATTG-3'
下游5'-ACGTTGGATGGAATGCGTGCTACATTCATC-3'延伸引物：5'-GAGAGTTATGAAGAATATCCTCT-3'
g.32929132delC
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGTATGAACATCTGACTTTGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGGCCTGTAGTAATCAAGTGTC-3'延伸引物：5'-GTAGCAGAAACTTGATAAAATG-3'
c.8517g.32945122C>A
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTTACAGTGGATGGAGAAGAC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGGGCCTCCACATATTTTGC-3'延伸引物：5'-TTCCTCTCTTTCATTGCGAAATAT-3'
g.32929399dupT
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAAACAACTCCAATCAAGCAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCCTAAAGGTTCTTCTTCACAC-3'延伸引物：5'-TCAAGCAGTAGCTGTAACTT-3'
g.32911757C>T
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCAGAGTAGTGTAGTTGTTTC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTTCTGCCTTTTGGCTAGGTG-3'延伸引物：5'-TCCTGCTTGGAAAATAACATCT-3'
g.32911659-32911662delAAAA
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCCTACTAGTTTAGCTTGTG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCAGTATTAATTGACTGAGGC-3'延伸引物：5'-AATTGACTGAGGCTTGCTCAGTTTC-3'
g.32912799T>C
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTTTTTCAGACTGCAAGTGGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCTTCTGGTTTCTGATCAAAG-3'延伸引物：5'-CTGCAAGTGGGAAAAATA-3'
c.3140A>G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3'延伸引物：5'-TTGTCCAGCCACCATGA-3'
c.1658_1659GT>C
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCTGAAATCACTGAGCAGGAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGCTGAGATCAGCCAAATTC-3'延伸引物：5'-AGGAGAAAGATTTTCTATGGA-3'
c.320g.7579367dupA
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCTTCCCAGAAAACCTACCAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAGTCACAGACTTGGCTGTCC-3'延伸引物：5'-AGAAGCCCAGACGGAAACCG-3'。
进一步地，所述乳腺癌易感SNP位点的PCR引物、延伸引物的序列为：rs799906
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCCCAGGAGTCTGGGGCAA-3'
下游5'-ACGTTGGATGCCCCAGGAGTCTGGGGCAA-3'延伸引物：5'-ACGTTGGATGCCCCAGGAGTCTGGGGCAA-3'
rs2569190
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCAATGAAGGATGTTTCAGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAGACACAGAACCCTAGATGC-3'延伸引物：5'-TCAGAATCCTTCCTGTTACGG-3'
rs1056836
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCAAAGTTCTCCGGGTTAGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTCCCACATTCCCAAAGACAC-3'延伸引物：5'-CTGTGAATCATGACCCA-3'
rs2046210
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCTCACACATACATACAGTC-3'
下游5'-ACGTTGGATGCCTCAACTGTCTTGTGAATC-3'延伸引物：5'-GAATCTTTTATTTCAGGTAGATG-3'
rs2912778
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCCTCAGAGTCATGCTTTAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGTCCTTGTGGTGACCTTGC-3'延伸引物：5'-TAGTCATGCTTTAGAGAAGA-3'
rs3135718
PCR引物：上游5'ACGTTGGATGCAGAAGCAACGTGACCTTAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAGGGAACGAGGTTGGTTATG-3'延伸引物：5'-TGGTTATGCCAACCC-3'
rs1219648
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCTGAAAATCTAAAGCACGCC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGAATCATTGGGACAAGC-3'延伸引物：5'-GCCTATTTTACTTGACACAC-3'
rs2981582
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCGGGTTCCTAAAGCCAGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGGCACTCATCGCCACTTAATG-3'延伸引物：5'-CCACTTAATGAACCTGTTTG-3'
rs2294021
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTGGTACACATGAGGACCC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTCAGACAAGATCTGGCAGAC-3'延伸引物：5'-GGCAGACACCATGGC-3'
rs8051542
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCATGTGTTTTAAACATTTAGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCTCTTTGGTTTTTGCTCC-3'
延伸引物：5'-TTTAAACATTTAGGTTATTAGAGGA-3'
rs2299941
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTAGTTCCATTACTTCACC-3'
下游5'-ACGTTGGATGAATTTAATACTCATAAAACCA-3'延伸引物：5'-CCATTACTTCACCTCATCT-3'
rs2735343
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAGCTTACAGGTCAGAACCAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCTTTTCATTTCTTCTGTTGC-3'延伸引物：5'-TCTTCTGTTGCCAAAGG-3'
rs2735385
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCCACAGTTAAAGAGGCTCC-3'
下游5'-ACGTTGGATGAAAGGACTTCAGAGGAGAGG-3'延伸引物：5'-GAAGCTTCTAAGCCCTGAT-3'
rs6999227
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGTGGACGACAAAGGTAATC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGCTGGGCTCTCTATAAGAC-3'延伸引物：5'-AGGTAATCCAATGAAAGGATA-3'
rs1805812
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTAGATCAAAGTGGGTAAGAC-3'
下游5'-ACGTTGGATGGGATATAACATCACTAGGAA-3'延伸引物：5'-GAGGTTTTGTAATGTCCTTGTCT-3'。
rs7220719
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCTTTTGAATTGCAATTCCTC-3'
下游5'-ACGTTGGATGGCTTTTGAATTGCAATTCCTC-3'延伸引物：5'-ATTCCTCTGTTTTCCCT-3'
rs16945628
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGGCATAGAAGAAGGCATAAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGGCACAAAGAAAAATGACTC-3'
延伸引物：5'-CAAAATGACTCATAAACTCAAAG-3'
rs11871753
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGGATACACTGTAGTCTAATG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTACTACCATGCCCAGCTTGT-3'
延伸引物：5'-AATGGAAAAGAGAAGCATAA-3'。
进一步地，所述步骤(3)中扩增引物分组的具体方法为：第一组P1包含rs3135718、rs1219648、rs2912778、rs799906、rs7220719、rs16945628、rs2299941、rs2735343、rs2735385、rs1805812、rs6999227和rs2569190共12个位点的扩增引物；第二组P2包含rs2294021、rs1056836、rs2981582、rs11871753、rs2046210和rs8051542共6个位点的扩增引物；第三组P3包含BRCA1_g.41246334C>G、BRCA1_g.41256138delT、BRCA1_g.41246794delC、BRCA2_g.32912799T>C、BRCA2_g.32911757C>T、BRCA2_g.32914191C>G、BRCA2_g.32945122delC、BRCA2_g.32911659-32911662delAAAA、BRCA2_g.32929399dupT和PIK3CA_c.1658_1659GT>C共10个位点的扩增引物；第四组P4包含PIK3CA_c.3140A>G、BRCA1_g.41234551delG、TP53_g.7579367dupA、BRCA2_g.32929132delC和BRCA1_g.41244291delT共5个位点的扩增引物。
进一步地同，所述步骤(4)中延伸引物分组的具体方法为：第一组E1包含rs3135718、rs1219648、rs2912778、rs799906、rs7220719、rs16945628、rs2299941、rs2735343、rs2735385、rs1805812、rs6999227和rs2569190共12个位点的延伸引物；第二组E2包含rs2294021、rs1056836、rs2981582、rs11871753、rs2046210和rs8051542共6个位点的延伸引物；第三组E3包含BRCA1_g.41246334C>G、BRCA1_g.41256138delT、BRCA1_g.41246794delC、BRCA2_g.32912799T>C、BRCA2_g.32911757C>T、BRCA2_g.32914191C>G、BRCA2_g.32945122delC、BRCA2_g.32911659-32911662delAAAA、BRCA2_g.32929399dupT和PIK3CA_c.1658_1659GT>C共10个位点的延伸引物；第四组E4包含PIK3CA_c.3140A>G、BRCA1_g.41234551delG、TP53_g.7579367dupA、BRCA2_g.32929132delC和BRCA1_g.41244291delT共5个位点的延伸引物。
进一步地，所述步骤(5)的扩增条件为：95℃、3min；95℃、15s，56℃、15s，72℃、1min，45个循环；72℃保持5min。
进一步地，所述步骤(6)的消化条件为：37℃40min，85℃5min。
进一步地，所述步骤(7)的延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，(52℃、5s，80℃、5s)，5个循环，35个循环；72℃保持5min
本发明的有益效果：
(1)本发明提供4个基因的15个与乳腺癌相关的突变位点和10个基因的18个乳腺癌易感SNP位点的组合检测方法，该方法对于乳腺癌的早期筛查更准确、技术重现性好、性价比高；
(2)本发明提供的基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法相较于TaqMan-PCR及二代平台测序的SNP检测，具有设计灵活、准确性高，可同时对数十个SNP位点进行数百至数千份样本检测。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。
实施例1：通过本发明技术检测乳腺癌易感性相关SNP位点及基因突变位点
一、提取外周血样本DNA，得DNA提取液；
1.取200μl外周血样本，放入1.5ml离心管。(如果全血起始量小于200μl，则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间，则后续操作按照比例增加试剂量。如果起始量介于300μl-1ml之间，则需要先进行红细胞裂解操作)
2.加入200μl结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，在加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，颠倒轻摇充分混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮。
3.加入100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀(上述各操作步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15s混匀，但不可用手剧烈振荡，以免剪切DNA)。
4.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
5.加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。
6.加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。
7.加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。
8.将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
10.DNA可以存放在2-8℃，若长时间存放，可以放置在-20℃。
二、设计基因突变位点和SNP位点的扩增引物和单碱基延伸引物并分组
1.设计出如表1、表2、表3和表4所示的扩增引物序列及延伸引物序列。
表1突变基因特异扩增引引物序列
表2突变基因单碱基延伸引物序列
表3 SNPs多态性基因型特异扩增引引物序列
表4 SNPs多态性基因型单碱基延伸引物序列
2.分别将表1和表3中的扩增引物分为4组、表2和表4中的单碱基引物分为4组，分组方式如表5所示。
表5基因SNPs及突变位点的分组编号
三、PCR扩增
以提取的样本DNA为模板，以表5中的特异性扩增引物进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。
PCR扩增反应体系(50μl)为：
DNA模板50-400ng
加ddH2O至50μl。
PCR反应程序为：
四、PCR产物碱性磷酸酶处理
使用博奥生物的试剂处理所获得的PCR产物，消除反应体系中剩余的dNTP。所用试剂包含:SAPBuffer(10*)、SAPEnzyme(1.7U/ul)、ddH2O。
虾碱式磷酸酶处理反应体系为7μl(每一个反应)：
SAPBuffer(10*) 0.17μl
SAPEnzyme(1.7U/ul) 0.3μl
扩增产物DNA 5μl
补ddH2O至7μl
消化反应条件为：
37℃、40min；85℃、5min。
五、单碱基延伸反应获得延伸产物
在虾碱性磷酸酶处理结束后，对目标产物的位点进行单碱基延伸。反应体系中所包含的试剂为：extendprimermix，iPLEXBufferplus，iPLEXterminator，iPLEXenzyme，ddH2O。
单碱基延伸反应体系：
单碱基延伸PCR反应体系：
六、树脂纯化
向上一步的产物中加入脱盐树脂，对延伸产物进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。具体步骤为：
1将CleanResin树脂平铺到6mg的树脂板中；
2加16ul水到延伸产物的对应孔内；
3将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触；
4离心使树脂沉入孔底部。
七、芯片点样
启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至96孔或384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
七、质谱分析
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeoffligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
实施例2：通过本发明技术方案检测乳腺癌细胞株
1.研究对象
选用已知突变位点MCF7,MDA-MB-361,CAMA-1,MDA-MB-468,UACC-3199，MDA-MB-231的6例肝癌细胞株(均能从ATCC购买得到)进行本检测方法的可行性分析，同时设立正常人基因组DNA(gDNA)(来源于就诊广州军区武汉总医院的正常人的口腔黏膜组织提取得到)做为阴性对照，水(H20)做为空白对照。
2.实验步骤
(1)提取乳腺癌细胞株DNA，得DNA提取液；
(2)如表5所示，分别将P1组的12对扩增引物、P2组6对扩增引物、P3组的9对扩增引物和P4组的6对扩增引物进行混合，然后将混合好的4组特异性扩增引物分别加入DNA提取液，分别在扩增仪中进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。所述PCR扩增体系的总体积为5μL，扩增体系的组分、浓度或含量如下：
扩增的热循环参数：
(3)应用核酸外切酶和虾碱式磷酸酶将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行消化处理，得到消化后的扩增产物，消化反应条件如下：
扩增产物的纯化反应体系总体积7μL
扩增产物纯化反应条件：
37℃、40min；85℃、5min。
(4)对步骤(3)中的目标产物的位点进行单碱基延伸，每个细胞株的4管消化扩增产物分别对应4管延伸引物，P1对应E1，以此类推进行单碱基延伸反应。延伸反应试剂和延伸反应条件如下：
延伸反应体系，反应体积9μl:
延伸反应的热循环参数
(5)将步骤(4)获得的产物加入脱盐树脂，进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。加入水41μl，CleanResin树脂15mg(96孔)或者水16μl，CleanResin树脂6mg(384孔)，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min,使树脂与反应物充分接触，然后3200g离心5min。
(5)启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果，根据观察质谱图上变异碱基处是否出峰，判断基因是否突变。表2
3.结论
建立方法检测6例乳腺癌细胞株的变异位点，验证结果显示与美国标准菌种收藏所(ATCC)细胞株的变异情况一致，本发明中使用的驱动基因突变位点均能在各自的细胞系中检测出相应的突变位点，其中MCF7、MDA-MB-361、CAMA-1人乳腺癌细胞系中可以检测到本发明中BRCA1基因rs799906，CD14基因rs2569190，CYP1B1基因rs1056827、rs1056836，ESR1基因rs2046210，FGFR2基因rs2912778、rs3135718、rs1219648、rs2981582易感基因SNP位点。阴性对照以及空白对照均没有检测到基因变异，表明本发明的基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法具有可行性。
实施例3：从26例病理已经诊断为乳腺癌患者的外周血中，检测一组乳腺癌早期诊断相关基因的SNPs和突变位点
1、实验步骤
通过从广州军区武汉总医院获得的26例病理已经诊断为乳腺癌患者的外周血中，检测一组乳腺癌早期诊断相关基因的SNP和突变位点，具体步骤如下：
(1)使用百泰克全血基因组DNA快速提取试剂盒获得受检者cfDNA样本
(a)取200μl收集的外周血，放入1.5ml离心管。加入200μl结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，在加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，颠倒轻摇充分混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。
(b)加入100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。(不可用手剧烈振荡，以免剪切DNA)。
(c)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
(d)加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。
(e)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s,弃掉废液。
(f)加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30s,弃掉废液。
(g)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(h)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
(i)DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
(2)以提取的外周血DNA为模板，以本发明中设计的扩增引物组为引物，进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。PCR的体系为：2*Phanta MaxBuffer1.2μl、dNTPMix(10mMeach)0.1μl、扩增引物混合液1μl、外周血DNA(10ng/μl)2μl，PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase(1U/μl)0.1μl，水补足至5μl。95℃3min；95℃15s、56℃15s、72℃1min，45个循环；72℃5min。
(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行虾碱式磷酸酶处理，加入核酸外切酶SAP0.3μl、SAP缓冲液0.17μl，水补足至7μl。37℃40min，85℃5min。
(4)对步骤(3)中目标产物的位点进行单碱基延伸，4管扩增引物分别对应4管延伸引物，P1对应E1，以此类推。加入extendprimermix0.804μl、iPLEX Bufferplus(10×)0.2μl、iPLEXterminator终止混合液(10×)0.2μl、iPLEXzyme热测序酶(33U/μl)0.041μl、水补足至9μl。94℃30s；【94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5个循环】，35个循环；72℃3min，进行单碱基延伸反应。
(5)将步骤(4)获得的产物加入脱盐树脂，进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。加入水41μl，CleanResin树脂15mg(96孔)或者水16μl，CleanResin树脂6mg(384孔)，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min,使树脂与反应物充分接触；3200g离心5min。
(6)启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果，根据质谱峰变异碱基处是否出现峰，判断突变。
2、结论
结果显示本实施例检测的26例病人样本中，每个样本都能检测到本发明所筛选出的6～13个突变位点和10～15个易感基因SNP，说明本发明技术能够有效的检测到乳腺癌患者体内存在的突变。其中PIK3CA-p.H1047R和PIK3CA-p.E545K位点是乳腺癌肿瘤治疗的新靶点，本发明包括此新突变位点，具有前沿优势。
序列表
<110> 武汉赛云博生物科技有限公司
<120> 基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法
<160> 99
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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acgttggatg actgaacatc atcaacccag 30
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caaaattgaa tgctatgctt agat 24
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gaacccgaaa atccttcct 19
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gtagcagaaa cttgataaaa tg 22
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tcaagcagta gctgtaactt 20
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tcctgcttgg aaaataacat ct 22
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acgttggatg aatttaatac tcataaaacc a 31
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ccattacttc acctcatct 19
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
acgttggatg agcttacagg tcagaaccag 30
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
acgttggatg cttttcattt cttctgttgc 30
<210> 81
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tcttctgttg ccaaagg 17
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
acgttggatg tccacagtta aagaggctcc 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
acgttggatg aaaggacttc agaggagagg 30
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gaagcttcta agccctgat 19
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
acgttggatg tgtggacgac aaaggtaatc 30
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
acgttggatg tgctgggctc tctataagac 30
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
aggtaatcca atgaaaggat a 21
<210> 88
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
acgttggatg tagatcaaag tgggtaagac 30
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
acgttggatg ggatataaca tcactaggaa 30
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gaggttttgt aatgtccttg tct 23
<210> 91
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
acgttggatg gcttttgaat tgcaattcct c 31
<210> 92
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
acgttggatg gcttttgaat tgcaattcct c 31
<210> 93
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
attcctctgt tttccct 17
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
acgttggatg ggcatagaag aaggcataag 30
<210> 95
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
acgttggatg gcacaaagaa aaatgactc 29
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
caaaatgact cataaactca aag 23
<210> 97
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
acgttggatg ggatacactg tagtctaatg 30
<210> 98
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
acgttggatg tactaccatg cccagcttgt 30
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
aatggaaaag agaagcataa 20
Claims (10)
1.一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)筛选出评估个体罹患乳腺癌风险的基因突变位点和乳腺癌易感SNP位点；
(2)设计步骤(1)的基因突变位点和乳腺癌易感SNP位点的扩增引物和单碱基延伸引物；
(3)将步骤(2)中的扩增引物分为4组，各组中所含的各SNP位点和基因突变位点的上下游引物混合，得到4组对应的扩增引物混合液；
(4)对应于步骤(3)中扩增引物分组的方式，将步骤(2)中的单碱基延伸引物分为4组，分别得到4组单碱基延伸引物混合液；
(5)以待测样本DNA为模板，利用步骤(3)中的每组扩增引物混合液为引物分别进行PCR扩增，获得目标位点的PCR产物；
(6)虾碱式磷酸酶消化步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；
(7)利用各组相对应的单碱基延伸引物对步骤(6)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
(8)脱盐树脂纯化延伸产物；
(9)MassARRAY平台检测分析进行芯片点样、扫描，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果，通过质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否突变。
2.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，其特征在于，所述评估个体罹患乳腺癌风险的基因突变位点为：BRCA1基因的g.41246794delC、g.41246334C>G、g.41234551delG、g.41244291delT、g.41256138delT；BRCA2基因的g.32914191C>G、g.32929132delC、g.32945122C>A、g.32929399dupT、g.32911757C>T、g.32911659-32911662delAAAA、g.32912799T>C；TP53基因c.320g.7579367dupA、PIK3CA基因c.1658_1659GT>C、c.3140A>G。
3.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，其特征在于，所述乳腺癌易感SNP位点分别为：BRCA1基因的rs799906，CD14基因的rs2569190，CYP1B1基因的rs1056836，ESR1基因的rs2046210，FGFR2基因的rs2912778、rs3135718、rs1219648、rs2981582，Foxp3基因的rs2294021，TOX3基因的rs8051542，PTEN基因的rs2299941、rs2735343，NBS1基因的rs2735385、rs6999227、rs1805812，BRIP1基因的rs7220719、rs16945628、rs11871753。
4.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，其特征在于，所述评估个体罹患乳腺癌风险的基因突变位点的PCR引物、延伸引物的序列为：
g.41246794delC
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTGAACATCATCAACCCAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCCTGATACTTTTCTGGATGC-3'
延伸引物：5'-CTTTTCTGGATGCCTCTCAGCTGCAC-3'
g.41246334C>G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCTGATGACTCACATGATGGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAGAACGTCCAATACATCAGC-3'
延伸引物：5'-CAGCTACTTTGGCATTT-3'
g.41234551delG
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGGGATACCATGCAACATAAC-3'
下游5'-ACGTTGGATGCTCCCATGCTGTTCTAACAC-3'
延伸引物：5'-CCTGATAAAGCTCCAGCAG-3'
g.41244291delT
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTAGGTAGAAACAGAGGGC-3'
下游5'-ACGTTGGATGGTTTATAGACCTCAGGTTGC-3'
延伸引物：5'-CAAAATTGAATGCTATGCTTAGAT-3'
g.41256138delT
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACAGAGTGAACCCGAAAATC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTTCTAGCCTGGGCCACAGA-3'
延伸引物：5'-GAACCCGAAAATCCTTCCT-3'
g.32914191C>G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCAGGTTGTTACGAGGCATTG-3'
下游5'-ACGTTGGATGGAATGCGTGCTACATTCATC-3'
延伸引物：5'-GAGAGTTATGAAGAATATCCTCT-3'
g.32929132delC
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGTATGAACATCTGACTTTGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGGCCTGTAGTAATCAAGTGTC-3'
延伸引物：5'-GTAGCAGAAACTTGATAAAATG-3'
c.8517g.32945122C>A
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTTACAGTGGATGGAGAAGAC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGGGCCTCCACATATTTTGC-3'
延伸引物：5'-TTCCTCTCTTTCATTGCGAAATAT-3'
g.32929399dupT
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAAACAACTCCAATCAAGCAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCCTAAAGGTTCTTCTTCACAC-3'
延伸引物：5'-TCAAGCAGTAGCTGTAACTT-3'
g.32911757C>T
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCAGAGTAGTGTAGTTGTTTC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTTCTGCCTTTTGGCTAGGTG-3'
延伸引物：5'-TCCTGCTTGGAAAATAACATCT-3'
g.32911659-32911662delAAAA
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCCTACTAGTTTAGCTTGTG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCAGTATTAATTGACTGAGGC-3'
延伸引物：5'-AATTGACTGAGGCTTGCTCAGTTTC-3'
g.32912799T>C
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTTTTTCAGACTGCAAGTGGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCTTCTGGTTTCTGATCAAAG-3'
延伸引物：5'-CTGCAAGTGGGAAAAATA-3'
c.3140A>G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3'
延伸引物：5'-TTGTCCAGCCACCATGA-3'
c.1658_1659GT>C
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCTGAAATCACTGAGCAGGAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGCTGAGATCAGCCAAATTC-3'
延伸引物：5'-AGGAGAAAGATTTTCTATGGA-3'
c.320g.7579367dupA
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCTTCCCAGAAAACCTACCAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAGTCACAGACTTGGCTGTCC-3'
延伸引物：5'-AGAAGCCCAGACGGAAACCG-3'。
5.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，其特征在于，所述乳腺癌易感SNP位点的PCR引物、延伸引物的序列为：
rs799906
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCCCAGGAGTCTGGGGCAA-3'
下游5'-ACGTTGGATGCCCCAGGAGTCTGGGGCAA-3'
延伸引物：5'-ACGTTGGATGCCCCAGGAGTCTGGGGCAA-3'
rs2569190
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCAATGAAGGATGTTTCAGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAGACACAGAACCCTAGATGC-3'
延伸引物：5'-TCAGAATCCTTCCTGTTACGG-3'
rs1056836
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCAAAGTTCTCCGGGTTAGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTCCCACATTCCCAAAGACAC-3'
延伸引物：5'-CTGTGAATCATGACCCA-3'
rs2046210
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCTCACACATACATACAGTC-3'
下游5'-ACGTTGGATGCCTCAACTGTCTTGTGAATC-3'
延伸引物：5'-GAATCTTTTATTTCAGGTAGATG-3'
rs2912778
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCCTCAGAGTCATGCTTTAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGTCCTTGTGGTGACCTTGC-3'
延伸引物：5'-TAGTCATGCTTTAGAGAAGA-3'
rs3135718
PCR引物：上游5'ACGTTGGATGCAGAAGCAACGTGACCTTAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAGGGAACGAGGTTGGTTATG-3'
延伸引物：5'-TGGTTATGCCAACCC-3'
rs1219648
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCTGAAAATCTAAAGCACGCC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGAATCATTGGGACAAGC-3'
延伸引物：5'-GCCTATTTTACTTGACACAC-3'
rs2981582
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCGGGTTCCTAAAGCCAGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGGCACTCATCGCCACTTAATG-3'
延伸引物：5'-CCACTTAATGAACCTGTTTG-3'
rs2294021
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTGGTACACATGAGGACCC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTCAGACAAGATCTGGCAGAC-3'
延伸引物：5'-GGCAGACACCATGGC-3'
rs8051542
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCATGTGTTTTAAACATTTAGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCTCTTTGGTTTTTGCTCC-3'
延伸引物：5'-TTTAAACATTTAGGTTATTAGAGGA-3'
rs2299941
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTAGTTCCATTACTTCACC-3'
下游5'-ACGTTGGATGAATTTAATACTCATAAAACCA-3'
延伸引物：5'-CCATTACTTCACCTCATCT-3'
rs2735343
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAGCTTACAGGTCAGAACCAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCTTTTCATTTCTTCTGTTGC-3'
延伸引物：5'-TCTTCTGTTGCCAAAGG-3'
rs2735385
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCCACAGTTAAAGAGGCTCC-3'
下游5'-ACGTTGGATGAAAGGACTTCAGAGGAGAGG-3'
延伸引物：5'-GAAGCTTCTAAGCCCTGAT-3'
rs6999227
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGTGGACGACAAAGGTAATC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGCTGGGCTCTCTATAAGAC-3'
延伸引物：5'-AGGTAATCCAATGAAAGGATA-3'
rs1805812
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTAGATCAAAGTGGGTAAGAC-3'
下游5'-ACGTTGGATGGGATATAACATCACTAGGAA-3'
延伸引物：5'-GAGGTTTTGTAATGTCCTTGTCT-3'。
rs7220719
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCTTTTGAATTGCAATTCCTC-3'
下游5'-ACGTTGGATGGCTTTTGAATTGCAATTCCTC-3'
延伸引物：5'-ATTCCTCTGTTTTCCCT-3'
rs16945628
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGGCATAGAAGAAGGCATAAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGGCACAAAGAAAAATGACTC-3'
延伸引物：5'-CAAAATGACTCATAAACTCAAAG-3'
rs11871753
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGGATACACTGTAGTCTAATG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTACTACCATGCCCAGCTTGT-3'
延伸引物：5'-AATGGAAAAGAGAAGCATAA-3'。
6.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，其特征在于，所述步骤(3)中扩增引物分组的具体方法为：第一组P1包含rs3135718、rs1219648、rs2912778、rs799906、rs7220719、rs16945628、rs2299941、rs2735343、rs2735385、rs1805812、rs6999227和rs2569190共12个位点的扩增引物；第二组P2包含rs2294021、rs1056836、rs2981582、rs11871753、rs2046210和rs8051542共6个位点的扩增引物；第三组P3包含BRCA1_g.41246334C>G、BRCA1_g.41256138delT、BRCA1_g.41246794delC、BRCA2_g.32912799T>C、BRCA2_g.32911757C>T、BRCA2_g.32914191C>G、BRCA2_g.32945122delC、BRCA2_g.32911659-32911662delAAAA、BRCA2_g.32929399dupT和PIK3CA_c.1658_1659GT>C共10个位点的扩增引物；第四组P4包含PIK3CA_c.3140A>G、BRCA1_g.41234551delG、TP53_g.7579367dupA、BRCA2_g.32929132delC和BRCA1_g.41244291delT共5个位点的扩增引物。
7.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，其特征在于，所述步骤(4)中延伸引物分组的具体方法为：第一组E1包含rs3135718、rs1219648、rs2912778、rs799906、rs7220719、rs16945628、rs2299941、rs2735343、rs2735385、rs1805812、rs6999227和rs2569190共12个位点的延伸引物；第二组E2包含rs2294021、rs1056836、rs2981582、rs11871753、rs2046210和rs8051542共6个位点的延伸引物；第三组E3包含BRCA1_g.41246334C>G、BRCA1_g.41256138delT、BRCA1_g.41246794delC、BRCA2_g.32912799T>C、BRCA2_g.32911757C>T、BRCA2_g.32914191C>G、BRCA2_g.32945122delC、BRCA2_g.32911659-32911662delAAAA、BRCA2_g.32929399dupT和PIK3CA_c.1658_1659GT>C共10个位点的延伸引物；第四组E4包含PIK3CA_c.3140A>G、BRCA1_g.41234551delG、TP53_g.7579367dupA、BRCA2_g.32929132delC和BRCA1_g.41244291delT共5个位点的延伸引物。
8.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，其特征在于，所述步骤(5)的扩增反应条件为：95℃、3min；95℃、15s，56℃、15s，72℃、1min，45个循环；72℃保持5min。
9.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，其特征在于，所述步骤(6)的消化条件为：37℃40min，85℃5min。
10.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测乳腺癌早期诊断相关基因的方法，其特征在于，所述步骤(7)的延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，(52℃、5s，80℃、5s)，5个循环，35个循环；72℃保持5min。
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|---|---|---|---|---|
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20171229 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |