CN107557461A

CN107557461A - 一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法

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Publication number: CN107557461A
Application number: CN201710986230.3A
Authority: CN
Inventors: 尚小云; 刘梦梅; 刁波
Original assignee: Wuhan Racing Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Racing Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-10-20
Also published as: CN107557461B

Abstract

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法。本发明考虑了中国人群与欧美人群肝癌基因谱的差异性，筛选出与中国人肝癌易感相关基因的SNPs以及与肝癌相关的基因突变位点的组合，利用核酸质谱仪对肝癌相关的遗传学标识进行广泛(高通量检测位点、高通量检测样本)筛查和检验。通过本发明的方法检出成功率高、技术重现性好、性价比高，可实现单个小样本多基因的检测，满足小样本最大化使用；本发明的方法是基于MassARRAY核酸质谱技术，较Sanger测序具有高准确性、高灵敏性的技术优势，检测结果稳定，提高了检测阳性率。

Description

一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法。

背景技术

原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是我国乃至全世界上常见，且具有危害性的恶性肿瘤之一，我国每年新发病例约占全球45％，是全世界致死率高居第三的恶性肿瘤，尽管随着各种新技术、新疗法的出现和诊疗水平的提高，肝癌的疗效有了很大的改善，但是我国肝癌年死亡率仍高达20.40/10万，约占全世界肝癌死亡率的1/2。

肝癌的发生是多基因多因素参与的复杂过程，是环境与遗传因素共同作用的结果。研究学者发现：肝癌发生发展是一个受遗传学调控的过程。近年来遗传学机制在肝癌发生发展中的作用已成为研究的重点内容。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)是一种遗传标记，是指基因组水平上由于单核苷酸的变异，而引起的DNA序列的多态性。在人群中的发生频率大于1％，包括单碱基的转换、颠倒以及单碱基的插入或缺失等形式表现，是一种新的遗传标志，可以为疾病的预测、诊断、治疗以及新型药物的研制提供可靠的有效的科学根据。

SNP在疾病基因定位中所发挥的作用主要包括：1.在疾病定位区域中寻找致病SNP，这种SNP的出现可能直接导致了基因转录水平上和翻译水平上的变化，即改变了基因表达量或者基因产物蛋白质的组成结构，从而导致某种疾病发生或使得个体对某种特殊的环境易感；2.SNP作为一个遗传标记，与疾病或表型紧密连锁。近年来利用SNP预测疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的热点，且在肿瘤和心脑血管等重大疾病预测上的应用价值已初见端倪。

目前，关于肝癌早期对小肝癌行肝叶切除，还有治愈的希望。临床研究表明，肝癌发现得越早，治疗效果越好，还能提高病人的预后及存活率，但是肝癌起病比较隐匿，约80％的患者确诊时多为中晚期。这在很大程度上增加了肝癌患者的死亡率。而目前临床上早期筛查HCC的主要指标是血清甲胎蛋白(AFP)水平和影像学B超检测。但是一部分HCC患者血清AFP长期保持低水平(<20ng/ml)，而B超在检测和进一步判断结节的特征时有一定的局限性，从而影响到肝癌早期诊断的灵敏性。目前临床尚未有十分有效的早期检查方法，因此建立高灵敏，经济，简单的分子技术筛查方法尤为重要。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种肝癌易感基因的核酸质谱早筛的方法，此方法筛选出与肝癌易感相关基因的SNPs以及与肝癌相关的基因突变位点，利用核酸质谱仪对肝癌相关的遗传学标识进行广泛筛查和检验，为肝癌发病风险的预测、预防和诊断提供依据。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，该方法包括如下步骤：

(1)筛选出可用来评估个体罹患肝癌风险的特异性和敏感性的基因SNPs和基因突变位点；

(2)设计步骤(1)的肝癌易感SNPs位点和基因突变位点的扩增引物和单碱基延伸引物；

(3)将步骤(2)中的扩增引物分组，各组中所含的各SNP位点和基因突变位点的上下游引物等摩尔混合，得到对应的扩增引物混合液，每管扩增引物混合液的最终工作浓度为0.5μM；

(4)依照步骤(3)中扩增引物分组的方式，将步骤(2)中的单碱基延伸引物分组，每一组根据其所含的每一条延伸引物的分子量，按相应体积进行混合，分别得到单碱基延伸引物混合液；

(5)以待测样品外周血基因组DNA为模板，对步骤(3)中的每组扩增引物混合液分别进行PCR扩增，所得扩增产物最终在4℃保存；

(6)应用核酸外切酶和虾碱式磷酸酶消化步骤(5)的扩增产物；

(7)将步骤(6)纯化后的产物进行单碱基延伸反应：分别将步骤(6)中纯化后的每组扩增产物加入步骤(4)中对应的延伸引物混合液，即第一组扩增产物加入第一组延伸引物混合液，第二组扩增产物加入第二组延伸引物混合液，第三组扩增产物加入第三组延伸引物混合液；

(8)脱盐树脂纯化延伸产物；

(9)MassARRAY平台检测分析进行芯片点样、扫描，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果，通过观察质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否存在基因变异。

进一步地，所述可用来评估个体罹患肝癌风险的特异性和敏感性的基因SNPs位点在NCBI中的SNP数据库的rs号分别为rs4730775、rs2233682、rs17006625、rs1800630、rs7574865、rs4678680、rs12979860、rs1056836、rs34237608、rs230496、rs1800566、rs28362491、rs17401966、rs4444903、rs2596542、rs648202、rs455804、rs9267673、rs2280883、rs3761549、rs9275319、rs9272105和rs8013403。

进一步地，所述可用来评估个体罹患肝癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点分别为c.121A>G、c.110C>G、c.133T>C和c.747G>T。

进一步地，所述肝癌易感SNPs基因位点和肝癌易感基因突变位点的PCR引物、延伸引物的序列为：

rs4730775

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGAAGGGTGATGGGCAGTTAG-3'

下游5'-ACGTTGGATGGTTTCCAGAGCTAACTCGTG-3'

延伸引物：5'-TTAGCAGACGGCGGA-3'

rs2233682

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCGAGTGTACTACTTCAACC-3'

下游5'-ACGTTGGATGTGCCCGTTTTTGCCACCACT-3'

延伸引物：5'-gCACTAACGCCAGCCA-3'

rs17006625

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACCTTCTTCTCCTTTTGCCG-3'

下游5'-ACGTTGGATGGGGAAGATGAGGTTGAATTG-3'

延伸引物：5'-GCCGGGGCAGTTATCA-3'

rs1800630

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCTATGGAAGTCGAGTATGG-3'

下游5'-ACGTTGGATGTTCCATACCTGGAGGTCCTG-3'

延伸引物：5'-GCCCTGTCTTCGTTAAG-3'

rs7574865

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGAGTGTGTATGCAGTAAAAG-3'

下游5'-ACGTTGGATGAATCCCCTGAAATTCCACTG-3'

延伸引物：5'-GTTGGTGACCAAAATGT-3'

rs4678680

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCATGGGACTCTGATACAATA-3'

下游5'-ACGTTGGATGTTCTGCCTTGGGTTTGTTC-3'

延伸引物：5'-TGCTTTCTTCCCTTTTCT-3'

rs12979860

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCGTGCCTGTCGTGTACTGA-3'

下游5'-ACGTTGGATGAGCGCGGAGTGCAATTCAAC-3'

延伸引物：5'-caCAATTCAACCCTGGTTC-3'

rs1056836

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCCTTGTCCAAGAATCGAGC-3'

下游5'-ACGTTGGATGCAACCAGTGGTCTGTGAATC-3'

延伸引物：5'-TCCGGGTTAGGCCACTTCA-3'

rs34237608

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGTGGAGTCAGACAGATATGG-3'

下游5'-ACGTTGGATGCAGGCACCTGGGAAGACTA-3'

延伸引物：5'-CCTGGGAAGACTAGATGAG-3'

rs230496

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGACCACATGTCTGGATTTGC-3'

下游5'-ACGTTGGATGTGGGCCACCTTTAAGAGTAG-3'

延伸引物：5'-ggtgAGGTCAGGGGCAAAC-3'

rs28362491

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTATCAGCGGCACTGCCAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGTAGGGAAGCCCCCAGGAAG-3'

延伸引物：5'-tCCTGCGTTCCCCGACCATTG-3'

rs1800566

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGTGCCCAATGCTATATGTC-3'

下游5'-ACGTTGGATGTTCTGTATCCTCAGAGTGGC-3'

延伸引物：5'-acGGCTTCCAAGTCTTAGAA-3'

rs17401966

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCAGCACTTAATGAAAACAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGAACCTCTAAGAACACTTGAC-3'

延伸引物：5'-CTAAGAACACTTGACTCAATA-3'

rs4444903

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTTTCAGCCCCAATCCAAG-3'

下游5'-ACGTTGGATGAGAGCAAGGCAAAGGCTTAG-3'

延伸引物：5'-gaaaTGATGGAAAGTTCCAGC-3'

rs2596542

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGGGCACATCTTTTCATAGC-3'

下游5'-ACGTTGGATGAATCGTCTCCCAAAGAACAG-3'

延伸引物：5'-atctaCCAAAGAACAGCTACAC-3'

rs648202

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCCTTTCTCCCAAAAGGACA-3'

下游5'-ACGTTGGATGATGGATAATCTCCAGAGCCG-3'

延伸引物：5'-cTGTCAAATTCCAAAACTCTCTC-3'

rs455804

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGAGAAGGTGTGTTGTTTTGC-3'

下游5'-ACGTTGGATGGGCTTGCATGTATTTTGTGG-3'

延伸引物：5'-cAAATCTGTCATAAACTAAGGCA-3'

c.133T>C

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTGGCAGCAACAGTCTTAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGCTCAGGATTGCCTTTACCAC-3'

延伸引物：5'-ACTACCACAGCTCCT-3'

c.747G>T

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCACCATCCACTACAACTAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGTCCAGTGTGATGATGGTGAG-3'

延伸引物：5'-GATGGTGAGGATGGG-3'

rs9267673

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGATGAAGAGCCTCAATGGCTG-3'

下游5'-ACGTTGGATGCACTGTCCAGTGGGAGAGA-3'

延伸引物：5'-ATGGCTGCCTCAACT-3'

rs2280883

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGAGATGAAGGAGTTGGGATG-3'

下游5'-ACGTTGGATGTGTCAATACACCCCCAACTG-3'

延伸引物：5'-AAGGAAAGGTTGGGAA-3'

rs3761549

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACATCACCTACCACATCCAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGACCCCACAGGTTTCGTTCC-3'

延伸引物：5'-GGTTTCGTTCCGAGAACT-3'

rs9275319

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTAGACTAGCGGTCTTCCA-3'

下游5'-ACGTTGGATGAGCCTTCAGTCTGTGGTTG-3'

延伸引物：5'-AGTCTGTGGTTGAAGGTC-3'

rs9272105

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTATAAGTTTCCTCTGCTTC-3'

下游5'-ACGTTGGATGAGTCCTGTATGCTGATATCC-3'

延伸引物：5'-TCATTAATTTTATGATTGTGAGAG-3'

rs8013403

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCTCCAGGGAACAACATACT-3'

下游5'-ACGTTGGATGTTGCTTCTTTCTTTTGTAG-3'

延伸引物：5'-acTTCTTTGGAAGACAGACA-3'

c.121A>G

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTGGCAGCAACAGTCTTAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGCTCAGGATTGCCTTTACCAC-3'

延伸引物：5'-tCATTCTGGTGCCACT-3'

c.110C>G

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTGGCAGCAACAGTCTTAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGCTCAGGATTGCCTTTACCAC-3'

延伸引物：5'-gggcaTGGACTCTGGAATCCATT-3'

进一步地，所述步骤(3)中扩增引物分组的具体方法为：第一组P1包含rs4730775、rs2233682、rs17006625、rs1800630、rs7574865、rs4678680、rs12979860、rs1056836、rs34237608、rs230496、rs1800566、rs28362491、rs17401966、rs4444903、rs2596542、rs648202、rs455804、c.133T>C、c.747G>T位点的19对扩增引物，第二组P2包含rs9267673、rs2280883、rs3761549、rs9275319、rs9272105、rs8013403、c.121A>G位点的7对扩增引物，第三组P3包含c.110C>G位点的1对扩增引物，这三组扩增引物中，每一组中各SNP位点和基因突变位点的上下游引物等摩尔混合，得到3管扩增引物混合液，每管扩增引物混合液的最终工作浓度为0.5μM。

进一步地，所述步骤(4)中延伸引物分组的具体方法为：第一组E1包含rs4730775、rs2233682、rs17006625、rs1800630、rs7574865、rs4678680、rs12979860、rs1056836、rs34237608、rs230496、rs1800566、rs28362491、rs17401966、rs4444903、rs2596542、rs648202、rs455804、c.133T>C、c.747G>T位点的19条延伸引物，第二组E2包含rs9267673、rs2280883、rs3761549、rs9275319、rs9272105、rs8013403、c.121A>G位点的7条延伸引物，第三组E3包含c.110C>G位点的1条延伸引物，这三组延伸引物中，每一组中各SNP位点和基因突变位点的延伸引物等分子量混合，得到3管延伸引物混合液。

进一步地，所述步骤(5)的扩增条件为：95℃、3min；95℃、15s，56℃、15s，72℃、1min，45个循环；72℃保持5min。

进一步地，所述步骤(6)的消化条件为：37℃40min，85℃5min。

进一步地，所述步骤(7)的延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，(52℃、5s，80℃、5s)，5个循环，35个循环；72℃保持5min。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的肝癌易感基因的核酸质谱早筛方法考虑了中国人与欧美人群肝癌基因谱的差异性，检测的易感基因更前沿，并纳入了多个与肝癌易感SNP位点，这些位点检出成功率高、技术重现性好、性价比高；

(2)本发明提供的检测技术，价格优势明显，改变传统单碱基检测价格昂贵、耗时长、操作繁琐等劣势。在肝癌易感基因早筛检测方面的灵敏度更高，通量更大，可实现单个小样本多基因的检测，满足小样本最大化使用；

(3)本发明提供的基于MassARRAY核酸质谱技术检测一组肺癌易感基因早筛的核酸质谱方法具有高准确性、高灵敏性的技术优势，检测结果稳定，较Sanger测序发具有明显优势，提高了检测阳性率。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。

实施例1：人类肝癌易感相关基因的SNPs以及与肝癌相关的基因突变位点筛选的可行性分析

本发明的发明人通过肝癌的全基因组测序分析，搜索NCBI国内外全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)研究文献和相关专利(专利文献5和非专利文献11等，包括但不限于此)，同时检索GWAS Catalog数据库和COSMIC，CIViC，ICGC和MYCANCER GENOME等癌症相关数据库，筛选出GWAS研究中亚洲人群阳性样本超过1000例、中国人群阳性样本超过500例，在大规模病理对照组临床研究中得到验证的肝癌发生相关位点，本发明人对其做出筛选和评估，选择了与亚洲人群罹患肝癌风险显著相关的4个肝癌热点突变和23个单核苷酸多态性位点，并且彼此独立，不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性，可用于评估个体罹患肝癌的风险。

专利文献：

专利文献1：公开号CN 103361404 A

专利文献2：公开号CN 104745710 A

专利文献3：公开号CN 106480212 A

专利文献4：公开号CN 103834639 A

专利文献5：公开号CN103834638 A

非专利文献：

1.Chen,Y H.et al.,Journal ofExperimental&Clinical Cancer Research,2013,32,39

2.Jiang,D K.et al.,Nature genetics,2013,45,72-75

3.Chen,W.et al.,Gene,2015,561,63-67

4.Gouas,D A.et al.,Carcinogenesis,2010,31,1475-1482

5.Tornesello,M L.et al.,.Genomics,2013,102,74-83

6.Chen,J H.et al.,Worldjournal ofgastroenterology,2016,22,4183

7.Gao,J.et al.,BMJ open,2014,4,e004427

8.Dayyeh,B KA.et al.,Gastroenterology,2011,141,141-149

9.Liu,F.et al.,Tumor Biology,2013,34,47-53

10.Huang,L.et al.,Tumor Biology,2016,37,6599-6606

11.Liu,F.et al.,Gene,2015,564,14-20

实施例2：通过本发明技术检测肝癌细胞株

1.研究对象

选用已知突变位点SNU-475,C3A,PLC/PRF/5,SK-HEP-1,SNU-387，SUN-449的6个肝癌细胞株(均能从ATCC购买得到)进行检测方法的可行性分析，同时设立正常人基因组DNA(gDNA)(来源于就诊广州军区武汉总医院的正常人的口腔黏膜组织提取得到)做为阴性对照，水(H₂0)做为空白对照。

2.实验步骤

(1)提取DNA，得DNA提取液；

(2)如表1所示，分别将P1组的19对扩增引物、P2组7对扩增引物和P3组的1对扩增引物进行混合，将混合好的特异性扩增引物加入DNA提取液，然后在扩增仪中进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。所述PCR扩增体系的总体积为5μL，扩增体系的组分、浓度或含量如下：

扩增的热循环参数：

(3)应用核酸外切酶和虾碱式磷酸酶将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行消化处理，得到消化后的扩增产物，消化反应条件如下：

扩增产物消化反应条件：

37℃ 40min

85℃ 5min

(4)对步骤(3)中的目标产物的位点进行单碱基延伸，每个细胞株的3管消化扩增产物分别对应3管延伸引物，P1对应E1，以此类推进行单碱基延伸反应。延伸反应试剂和延伸反应条件如下：

延伸反应的热循环参数

(5)将步骤(4)获得的产物加入脱盐树脂，进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。加入水41μl，Clean Resin树脂15mg(96孔)或者水16μl，Clean Resin树脂6mg(384孔)，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min,使树脂与反应物充分接触，然后3200g离心5min。

(5)启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果，根据观察质谱图上变异碱基处是否出峰，判断基因是否突变。

表1肝癌易感基因SNP扩增引物

表2肝癌易感基因SNP单碱基延伸引物

3.结论

建立方法检测6例肝癌细胞株的变异位点，验证结果显示与美国标准菌种收藏所(ATCC)细胞株的变异情况一致，本发明中使用的肝癌热点突变基因TP53能在CRL-8024细胞系中检测出来，其中SNU-475,C3A,PLC/PRF/5,SK-HEP-1人肝癌细胞系中可以检测到本发明中的rs4730775、rs7574865、rs1800630、rs34237608、rs4444903、rs17401966、rs455804、rs927531、rs9272105、rs8013403、rs9267673、rs2280883、rs2596542、rs28362491、rs1800测到基因变异，表明本发明技术具有可行性。

实施例3：检测外周血样本中肝癌早期诊断相关基因的SNPs和突变位点

1.研究对象

本研究采用广州军区武汉总医院待检测者外周静脉血标本，对标本样品进行基因检测，病例数为30例。对照组来自当地健康体检的健康人群样本。

2.实验步骤

应用本发明的技术来检测外周血样本中肝癌早期诊断相关基因的SNPs和突变位点的具体步骤如下所述：

(1)使用快速提取试剂盒提取cfDNA：

(a)取200μl收集的外周血，放入1.5ml离心管。加入200μl结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，在加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)溶液，颠倒轻摇充分混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。

(b)加入100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。(不可用手剧烈振荡，以免剪切DNA)。

(c)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。

(d)加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。

(e)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s,弃掉废液。

(f)加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30s,弃掉废液。

(g)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(h)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。

(i)2-8℃存放DNA，如果要长期存放，可以放置在-20℃。

(2)以提取的外周血DNA为模板，以表1中混合好的特异性扩增引物混合液为扩增引物，进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。

PCR的体系为：

扩增的热循环参数：

(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行虾碱式磷酸酶纯化处理，向步骤(2)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μl、SAP缓冲液0.17μl，水补足至7μl；纯化处理条件为：37℃40min，85℃5min。

(4)将步骤(3)中的目标产物的位点进行单碱基延伸，每个待测样品的3管纯化扩增产物分别对应3管延伸引物，P1对应E1，以此类推进行单碱基延伸反应。延伸反应试剂和延伸反应条件如下：

延伸反应的热循环参数：

(5)将步骤(4)获得的产物加入脱盐树脂，进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。具体实验步骤为：在步骤(4)产物中加入水41μl，CleanResin树脂15mg(96孔)或者水16μl，Clean Resin树脂6mg(384孔)，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min,使树脂与反应物充分接触；3200g离心5min。

(6)启动MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果，根据质谱峰变异碱基处是否出现峰，判断突变。

3.结论

结果显示本实施例检测的30例病人样本中，20例病人样本中能检查出热点突变TP53基因的c.747G>T位点，其中10例病人样本中能检查出热点突变CTNNB1基因的c.133T>C、c.121A>G位点。30例病人样本中能检测出rs4730775、rs2233682、rs17006625、rs1800630、rs7574865、rs4678680、rs12979860、rs34237608、rs1800566、rs17401966、rs4444903、rs2596542、rs455804、rs8013403等14个易感基因的SNP位点。其中TP53、CTNNB1是肝癌的研究热点突变基因，本发明包括此突变位点，具有前沿优势。

序列表

<110> 武汉赛云博生物科技有限公司

<120> 一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法

<130> 2017

<160> 81

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg tgaagggtga tgggcagtta g 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg gtttccagag ctaactcgtg 30

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttagcagacg gcgga 15

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgttggatg ccgagtgtac tacttcaacc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgttggatg tgcccgtttt tgccaccact 30

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcactaacgc cagcca 16

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgttggatg tgcccgtttt tgccaccact 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgttggatg gggaagatga ggttgaattg 30

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccggggcag ttatca 16

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgttggatg gctatggaag tcgagtatgg 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgttggatg ttccatacct ggaggtcctg 30

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gccctgtctt cgttaag 17

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgttggatg gagtgtgtat gcagtaaaag 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgttggatg aatcccctga aattccactg 30

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gttggtgacc aaaatgt 17

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgttggatg catgggactc tgatacaata 30

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgttggatg ttctgccttg ggtttgttc 29

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgctttcttc ccttttct 18

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acgttggatg tcgtgcctgt cgtgtactga 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acgttggatg agcgcggagt gcaattcaac 30

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cacaattcaa ccctggttc 19

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acgttggatg tccttgtcca agaatcgagc 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acgttggatg caaccagtgg tctgtgaatc 30

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tccgggttag gccacttca 19

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acgttggatg gtggagtcag acagatatgg 30

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acgttggatg caggcacctg ggaagacta 29

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cctgggaaga ctagatgag 19

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

acgttggatg gaccacatgt ctggatttgc 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

acgttggatg tgggccacct ttaagagtag 30

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ggtgaggtca ggggcaaac 19

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acgttggatg tctatcagcg gcactgccac 30

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

acgttggatg tagggaagcc cccaggaag 29

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acggcttcca agtcttagaa 20

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

acgttggatg tgtgcccaat gctatatgtc 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

acgttggatg ttctgtatcc tcagagtggc 30

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tcctgcgttc cccgaccatt g 21

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

acgttggatg ccagcactta atgaaaacac 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

acgttggatg aacctctaag aacacttgac 30

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ctaagaacac ttgactcaat a 21

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

acgttggatg tctttcagcc ccaatccaag 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

acgttggatg agagcaaggc aaaggcttag 30

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gaaatgatgg aaagttccag c 21

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

acgttggatg tgggcacatc ttttcatagc 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

acgttggatg aatcgtctcc caaagaacag 30

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

atctaccaaa gaacagctac ac 22

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

acgttggatg ccctttctcc caaaaggaca 30

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

acgttggatg atggataatc tccagagccg 30

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ctgtcaaatt ccaaaactct ctc 23

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

acgttggatg gagaaggtgt gttgttttgc 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

acgttggatg ggcttgcatg tattttgtgg 30

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

caaatctgtc ataaactaag gca 23

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

acgttggatg actggcagca acagtcttac 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

acgttggatg ctcaggattg cctttaccac 30

<210> 54

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

actaccacag ctcct 15

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

acgttggatg ccaccatcca ctacaactac 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

acgttggatg tccagtgtga tgatggtgag 30

<210> 57

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gatggtgagg atggg 15

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

acgttggatg atgaagagcc tcaatggctg 30

<210> 59

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

acgttggatg cactgtccag tgggagaga 29

<210> 60

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

atggctgcct caact 15

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

acgttggatg gagatgaagg agttgggatg 30

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

acgttggatg tgtcaataca cccccaactg 30

<210> 63

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

aaggaaaggt tgggaa 16

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

acgttggatg acatcaccta ccacatccac 30

<210> 65

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

acgttggatg accccacagg tttcgttcc 29

<210> 66

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

ggtttcgttc cgagaact 18

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

acgttggatg actagactag cggtcttcca 30

<210> 68

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

acgttggatg agccttcagt ctgtggttg 29

<210> 69

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

agtctgtggt tgaaggtc 18

<210> 70

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

acgttggatg tataagtttc ctctgcttc 29

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

acgttggatg agtcctgtat gctgatatcc 30

<210> 72

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

tcattaattt tatgattgtg agag 24

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

acgttggatg cctccaggga acaacatact 30

<210> 74

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

acgttggatg ttgcttcttt cttttgtag 29

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

acttctttgg aagacagaca 20

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

acgttggatg actggcagca acagtcttac 30

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

acgttggatg ctcaggattg cctttaccac 30

<210> 78

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

tcattctggt gccact 16

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

acgttggatg actggcagca acagtcttac 30

<210> 80

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

acgttggatg ctcaggattg cctttaccac 30

<210> 81

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

gggcatggac tctggaatcc att 23

Claims

1.一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(6)应用核酸外切酶和虾碱式磷酸酶消化步骤(5)的扩增产物；

(8)脱盐树脂纯化延伸产物；

2.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述可用来评估个体罹患肝癌风险的特异性和敏感性的基因SNPs位点在NCBI中的SNP数据库的rs号分别为rs4730775、rs2233682、rs17006625、rs1800630、rs7574865、rs4678680、rs12979860、rs1056836、rs34237608、rs230496、rs1800566、rs28362491、rs17401966、rs4444903、rs2596542、rs648202、rs455804、rs9267673、rs2280883、rs3761549、rs9275319、rs9272105 和rs8013403。

3.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述可用来评估个体罹患肝癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点分别为c.121A>G、c.110C>G、c.133T>C和c.747G>T。

4.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述肝癌易感SNPs基因位点和肝癌易感基因突变位点的PCR引物、延伸引物的序列为：

rs4730775

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGAAGGGTGATGGGCAGTTAG-3'

下游5'-ACGTTGGATGGTTTCCAGAGCTAACTCGTG-3'

延伸引物：5'-TTAGCAGACGGCGGA-3'

rs2233682

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCGAGTGTACTACTTCAACC-3'

下游5'-ACGTTGGATGTGCCCGTTTTTGCCACCACT-3'

延伸引物：5'-gCACTAACGCCAGCCA-3'

rs17006625

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACCTTCTTCTCCTTTTGCCG-3'

下游5'-ACGTTGGATGGGGAAGATGAGGTTGAATTG-3'

延伸引物：5'-GCCGGGGCAGTTATCA-3'

rs1800630

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCTATGGAAGTCGAGTATGG-3'

下游5'-ACGTTGGATGTTCCATACCTGGAGGTCCTG-3'

延伸引物：5'-GCCCTGTCTTCGTTAAG-3'

rs7574865

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGAGTGTGTATGCAGTAAAAG-3'

下游5'-ACGTTGGATGAATCCCCTGAAATTCCACTG-3'

延伸引物：5'-GTTGGTGACCAAAATGT-3'

rs4678680

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCATGGGACTCTGATACAATA-3'

下游5'-ACGTTGGATGTTCTGCCTTGGGTTTGTTC-3'

延伸引物：5'-TGCTTTCTTCCCTTTTCT-3'

rs12979860

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCGTGCCTGTCGTGTACTGA-3'

下游5'-ACGTTGGATGAGCGCGGAGTGCAATTCAAC-3'

延伸引物：5'-caCAATTCAACCCTGGTTC-3'

rs1056836

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCCTTGTCCAAGAATCGAGC-3'

下游5'-ACGTTGGATGCAACCAGTGGTCTGTGAATC-3'

延伸引物：5'-TCCGGGTTAGGCCACTTCA-3'

rs34237608

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGTGGAGTCAGACAGATATGG-3'

下游5'-ACGTTGGATGCAGGCACCTGGGAAGACTA-3'

延伸引物：5'-CCTGGGAAGACTAGATGAG-3'

rs230496

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGACCACATGTCTGGATTTGC-3'

下游5'-ACGTTGGATGTGGGCCACCTTTAAGAGTAG-3'

延伸引物：5'-ggtgAGGTCAGGGGCAAAC-3'

rs28362491

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTATCAGCGGCACTGCCAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGTAGGGAAGCCCCCAGGAAG-3'

延伸引物：5'-tCCTGCGTTCCCCGACCATTG-3'

rs1800566

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGTGCCCAATGCTATATGTC-3'

下游5'-ACGTTGGATGTTCTGTATCCTCAGAGTGGC-3'

延伸引物：5'-acGGCTTCCAAGTCTTAGAA-3'

rs17401966

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCAGCACTTAATGAAAACAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGAACCTCTAAGAACACTTGAC-3'

延伸引物：5'-CTAAGAACACTTGACTCAATA-3'

rs4444903

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTTTCAGCCCCAATCCAAG-3'

下游5'-ACGTTGGATGAGAGCAAGGCAAAGGCTTAG-3'

延伸引物：5'-gaaaTGATGGAAAGTTCCAGC-3'

rs2596542

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGGGCACATCTTTTCATAGC-3'

下游5'-ACGTTGGATGAATCGTCTCCCAAAGAACAG-3'

延伸引物：5'-atctaCCAAAGAACAGCTACAC-3'

rs648202

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCCTTTCTCCCAAAAGGACA-3'

下游5'-ACGTTGGATGATGGATAATCTCCAGAGCCG-3'

延伸引物：5'-cTGTCAAATTCCAAAACTCTCTC-3'

rs455804

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGAGAAGGTGTGTTGTTTTGC-3'

下游5'-ACGTTGGATGGGCTTGCATGTATTTTGTGG-3'

延伸引物：5'-cAAATCTGTCATAAACTAAGGCA-3'

c.133T>C

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTGGCAGCAACAGTCTTAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGCTCAGGATTGCCTTTACCAC-3'

延伸引物：5'-ACTACCACAGCTCCT-3'

c.747G>T

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCACCATCCACTACAACTAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGTCCAGTGTGATGATGGTGAG-3'

延伸引物：5'-GATGGTGAGGATGGG-3'

rs9267673

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGATGAAGAGCCTCAATGGCTG-3'

下游5'-ACGTTGGATGCACTGTCCAGTGGGAGAGA-3'

延伸引物：5'-ATGGCTGCCTCAACT-3'

rs2280883

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGAGATGAAGGAGTTGGGATG-3'

下游5'-ACGTTGGATGTGTCAATACACCCCCAACTG-3'

延伸引物：5'-AAGGAAAGGTTGGGAA-3'

rs3761549

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACATCACCTACCACATCCAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGACCCCACAGGTTTCGTTCC-3'

延伸引物：5'-GGTTTCGTTCCGAGAACT-3'

rs9275319

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTAGACTAGCGGTCTTCCA-3'

下游5'-ACGTTGGATGAGCCTTCAGTCTGTGGTTG-3'

延伸引物：5'-AGTCTGTGGTTGAAGGTC-3'

rs9272105

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTATAAGTTTCCTCTGCTTC-3'

下游5'-ACGTTGGATGAGTCCTGTATGCTGATATCC-3'

延伸引物：5'-TCATTAATTTTATGATTGTGAGAG-3'

rs8013403

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCTCCAGGGAACAACATACT-3'

下游5'-ACGTTGGATGTTGCTTCTTTCTTTTGTAG-3'

延伸引物：5'-acTTCTTTGGAAGACAGACA-3'

c.121A>G

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTGGCAGCAACAGTCTTAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGCTCAGGATTGCCTTTACCAC-3'

延伸引物：5'-tCATTCTGGTGCCACT-3'

c.110C>G

PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACTGGCAGCAACAGTCTTAC-3'

下游5'-ACGTTGGATGCTCAGGATTGCCTTTACCAC-3'

延伸引物：5'-gggcaTGGACTCTGGAATCCATT-3' 。

5.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述步骤(3)中扩增引物分组的具体方法为：第一组P1包含rs4730775、rs2233682、rs17006625、rs1800630、rs7574865、rs4678680、rs12979860、rs1056836、rs34237608、rs230496、rs1800566、rs28362491、rs17401966、rs4444903、rs2596542、rs648202、rs455804、c.133T>C、c.747G>T位点的19对扩增引物，第二组P2包含rs9267673、rs2280883、rs3761549、rs9275319、rs9272105、rs8013403、c.121A>G位点的7对扩增引物，第三组P3包含c.110C>G位点的1对扩增引物，这三组扩增引物中，每一组中各SNP位点和基因突变位点的上下游引物等摩尔混合，得到3管扩增引物混合液，每管扩增引物混合液的最终工作浓度为0.5μM。

6.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述步骤(4)中延伸引物分组的具体方法为：第一组E1包含rs4730775、rs2233682、rs17006625、rs1800630、rs7574865、rs4678680、rs12979860、rs1056836、rs34237608、rs230496、rs1800566、rs28362491、rs17401966、rs4444903、rs2596542、rs648202、rs455804、c.133T>C、c.747G>T位点的19条延伸引物，第二组E2包含rs9267673、rs2280883、rs3761549、rs9275319、rs9272105、rs8013403、c.121A>G位点的7条延伸引物，第三组E3包含c.110C>G位点的1条延伸引物，这三组延伸引物中，每一组中各SNP位点和基因突变位点的延伸引物等分子量混合，得到3管延伸引物混合液。

7.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述步骤(5)的扩增条件为：95℃、3min；95℃、15s，56℃、15s，72℃、1min，45个循环；72℃保持5min。

8.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述步骤(6)的消化条件为：37℃40min，85℃5min。

9.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述步骤(7)的延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，(52℃、5s，80℃、5s)，5个循环，35个循环；72℃保持5min。