CN105586427A - 检测人类brca1和brca2基因突变的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

检测人类brca1和brca2基因突变的引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测人类BRCA1和BRCA2基因突变的引物、试剂盒及方法。其上游引物为SEQ？ID？NO:1,3,5,7,9-193所示序列，同时其5’端加上通用引物Tag1；下游引物为SEQ？ID？NO:2,4,6,8,10-194所示序列，同时其5’端加上通用引物Tag2；还包括带有P5序列和SEQ？ID？NO:221-236所示序列的上游引物；带有P7序列和SEQ？ID？NO:197-220所示序列的下游引物。能快速、准确、简便地检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变。

Description

检测人类BRCA1和BRCA2基因突变的引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及检测人类BRCA1和BRCA2基因突变的引物、试剂盒及方法。
背景技术
乳腺癌和卵巢癌是女性常见恶性肿瘤，一般人群中女性在其一生中罹患乳腺癌和卵巢癌的风险分别为13％和1.5％，我国近年来乳腺癌发病率高居女性恶性肿瘤的首位，并以3％以上的速度逐年递增(AntoniouA,PharoahPD,NarodS,etal.AveragerisksofbreastandovariancancerassociatedwithBRCA1orBRCA2mutationsdetectedincaseseriesunselectedforfamilyhistory:Acombinedanalysisof22studies.AmericanJournalofHumanGenetics2003；72(5):1117–1130)。目前认为大多数遗传性乳腺癌是由于基因突变引起的，其中BRCA1和BRCA2基因的突变与乳腺癌发病关系较为密切。有研究表明，携带BRCA1或BRCA2基因致病性突变的女性在其70岁后患病风险增加了5-30倍，分别高达75％和46％(CaoW,WangX,LiJC.HereditarybreastcancerintheHanChinesepopulation.JEpidemiol.2013；23:75–84)。
BRCA1基因定位于人类染色体17q12-21，全长81K，含24个外显子，编码蛋白含有1863个氨基酸残基。BRCA2基因定位于13q12.3，由27个外显子组成，编码蛋白含有3418个氨基酸残基。BRCA1和BRCA2基因都是肿瘤抑制基因，参与细胞周期的调控、基因转录的调节、DNA损伤的修复及凋亡等重要的细胞活动。一旦BRCA1或BRCA2基因发生致病性突变，致使其无法正常编码合成蛋白产物或合成的蛋白产物功能缺失，其抑癌作用将会受到影响，增加癌症发生发展的危险。
2014版NCCN乳腺癌临床指南建议：BRCA1/2基因突变的遗传性乳腺癌高风险人群应采取必要的预防和监控措施，对于BRCA1/2基因突变阳性的患者需考虑对侧癌变的高风险(NCCNClinicalPracticeGuidelinesversion12014forbreastcancer)。若对于乳腺癌/卵巢癌患者，携带BRCA1/2基因致病性突变会使多发病灶和对侧癌变的风险增加。2014年12月，美国FDA批准抗癌新药Olaparib(Lynparza)用于治疗BRCA1或BRCA2基因突变的卵巢癌患者。近期临床研究表明，生殖系BRCA1或BRCA2突变的多种肿瘤可以从Olaparib治疗中得到缓解(KaufmanB,Shapira-FrommerR,SchmutzlerRK,etal:OlaparibmonotherapyinpatientswithadvancedcancerandagermlineBRCA1/2mutation.JClinOncol33:244-50,2015)。通过对BRCA1和BRCA2基因突变的检测，可以预测乳腺癌或卵巢癌发生发展，也可以筛选出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，针对卵巢癌患者，更可以从抗癌新药Olaparib中获益。
目前，检测BRCA1/2基因突变的方法有很多，主要有：荧光定量PCR技术，该技术灵敏度高、特异性强，但每次只能检测一种类型的突变，无法完全覆盖BRCA1和BRCA2基因全编码区；限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)，用于检测酶切位点改变的基因，可直接判断基因型，但是不能用于没有产生新酶切位点的基因检测，且实验操作繁琐，检测周期长，成本高；Sanger测序法，靠近引物的序列容易测不准，且测序周期较长，操作复杂，成本昂贵，很难满足实际应用的需要。因此，急需能够相对方便、快捷、检测周期短、针对性强、检测结果准确可靠的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、全面准确、操作简便、成本低的检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的引物。
为实现上述目的，本发明提供一种检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的引物对，其特征在于，所述引物对中的上游引物为上游特异性引物，同时其5’端加上通用引物Tag1；下游引物为下游特异性引物，同时其5’端加上通用引物Tag2；其中上游特异性引物如SEQIDNO:1,3,5,7,9-193所示；下游特异性引物如SEQIDNO:2,4,6,8,10-194所示；所述Tag1序列如SEQIDNO:195所示，所述Tag2序列如SEQIDNO:196所示。
进一步，还包括新的引物对，所述新的引物对中的上游引物为带有P5序列和SEQIDNO:221-236所示序列的上游引物；下游引物为带有P7序列和SEQIDNO:197-220所示序列的下游引物。
本发明的另一个方面，提供检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。
本发明的另一个方面，提供检测BRCA1和BRCA2全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的方法，其特征在于，步骤为，
文库制备：
第一步PCR扩增：以待检测样本DNA作为模板，分为8管分别进行扩增；引物为上述所示序列；
第二步PCR扩增：以第一步PCR扩增得到的产物为模板，引物为上述所示新的引物对序列；
得到的第二步PCR扩增产物处理后即为文库；
测序与结果分析：对文库进行测序，测序的结果经过数据处理后得到检测基因的突变情况；数据处理为测序数据的转换、质控、与参考基因组NCBI137/Hg19的序列比对、突变位点分析，通过数据处理后得到检测样本的突变信息。
进一步，所述第一步PCR扩增的8管引物分别为：第一管的引物是SEQIDNO:1-30所示序列，第二管的引物是SEQIDNO:31-60所示序列，第三管的引物是SEQIDNO:61-80所示序列，第四管的引物是SEQIDNO:81-110所示序列，第五管的引物是SEQIDNO:111-140所示序列，第六管的引物是SEQIDNO:141-160所示序列，第七管的引物是SEQIDNO:161-180所示序列，第八管的引物是SEQIDNO:181-194所示序列。
进一步，所述第一步PCR扩增的程序是94℃预变性2分钟，94℃变性45秒、60℃退火45秒、68℃延伸2分钟循环20次，72℃最后延伸10分钟。
进一步，所述第二步PCR扩增所用的模板进行了纯化。
进一步，所述第二步PCR扩增的程序是94℃预变性2分钟，94℃变性45秒、60℃退火45秒、68℃延伸2分钟循环20次，72℃最后延伸10分钟。
进一步，所述得到的PCR扩增产物处理为在扩增产物中加入21.3μLAMPure磁珠进行吸附，体积分数80％乙醇清洗两次后，加入30-45μL纯化水洗脱。
本发明中共包含97对引物，如SEQIDNO:1-194所示，将97对引物分在8个管子里面进行扩增，每个管子的引物对数介于1-20对之间，每对引物的浓度介于0.1-25pM之间。其引物序列具体如表1所示。其中序列编号对应相应的SEQIDNO号，即序列编号1对应的是SEQIDNO:1，以此类推；SEQIDNO:1和SEQIDNO:2是一对上下游引物，以此类推。
表197对引物序列表
本发明提供的用于检测BRCA1/2基因突变方法，具体原理详见图1和图2，其中图1为第一步PCR扩增原理图，图2为第二步PCR扩增原理图。其方法包括以下步骤：
根据COSMIC数据公布的人类BRCA1和BRCA2野生型基因序列，针对BRCA1和BRCA2基因的全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区设计特异性引物(SEQIDNO:1-194)，并在特异性上游引物的5’端加上通用引物Tag1，在特异性下游引物的5’端加上通用引物Tag2。
Tag1序列：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTSEQIDNO:195；
Tag2序列：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTSEQIDNO:196。
(1)提取检测样本的DNA，检测样本包括新鲜血液、唾液、新鲜病理组织和石蜡包埋组织。
(2)将97对带有通用序列的特异性引物以不同浓度和不同组合、每个管子的引物对数介于1-20对之间、每对引物的浓度介于0.1-25pM之间，分配至相应的8个单独的管子里，利用多重扩增实现目标区域的PCR放大，并使目标区域的5’端加上特定的Tag1序列，使目标区域的3’端加上特定的Tag2序列。
(3)在第二步PCR过程前将第一步PCR8个管子的产物混合为同一管，用BeckmanCoukter公司的AgencourtAMPureXPKit(货号A63880/A63881/A63882)进行纯化，去除残留的基因组DNA和第一步PCR反应液。
(4)第二步PCR以第一步PCR产物为模板，通过带有与Tag1和Tag2序列互补的特定通用引物使所有目标序列两端加上测序接头序列(即Tag1和Tag2序列SEQIDNO:195-196)和标签序列。其中，不同的标签序列组合(即带有P5序列SEQIDNO:237和SEQIDNO:221-236所示序列的上游引物及带有P7序列SEQIDNO:238和SEQIDNO:197-220所示序列的下游引物)可以使样本带上不同的标签序列，以此实现多样本同批测序时不同样本的测序结果的区分。
(5)上机测序反应：测序仪为IlluminaMiSeq测序仪，测序原理是利用可逆性末端边合成边测序反应，根据4种不同的荧光信号确认碱基种类，保证最终的核酸序列质量，经过多个循环后，完整读取核酸序列。
(6)测序的结果经过数据处理、生物信息学分析之后得到检测基因的突变情况。数据处理过程包括测序数据的转换、质控、序列比对(参考基因组为NCBI137/Hg19)、突变位点分析等过程，通过数据处理分析后得到检测样本的突变信息。
本发明的有益效果是：本发明采用了特异性引物和多重扩增技术，可以特异性地检测人类BRCA1和BRCA2基因突变。此方法：(1)针对BRCA1和BRCA2基因区域设计特异性引物，可以获得BRCA基因特定位置的全部碱基序列，针对性强；(2)涉及目标区域范围广，可在一次反应中检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区的突变情况；(3)检测通量高，根据测序仪MiSeq测序试剂MiSeqReagentKitv2来计算样本量的话，一个样本需要的测序数据量约25M，可保证测序深度在500X以上，最高可以同时进行300个样本的测序；(4)检测能力强，能同时检测单核苷酸变异、小片段的插入和缺失；(5)操作简单，通过两步PCR，每一步PCR过程中只需要加入模板和酶或引物即可，手工操作时间短；(6)检测速度快，整个检测建库过程需要5小时，其中手工操作时间约为30分钟；(7)均一性好，共有97对引物，各引物的均一性为100％；(8)特异性好，准确度高。
附图说明
图1是第一步PCR扩增原理图。
图2是第二步PCR扩增原理图。
图3是文库构建完成后的片段分布图。
图4是Sample1突变位点BRCA1：c.2405_2406delCA标示图。
图5是Sample2突变位点BRCA2：c.8951C>G标示图。
图6是Sample3突变位点BRCA2：c.51_52delAC标示图。
图7是Sample4突变位点BRCA1：c.5470_5477delTGCCCAAT标示图。
图8是Sample5突变位点BRCA1：c.5521delA标示图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：检测BRCA1和BRCA2基因突变
运用本发明体系检测100份健康的无偿献血者全血样本，利用上述两步PCR扩增检测BRCA1/2基因突变的方法如下：
(1)DNA提取和质控
DNA的提取采用AmoyDxBloodDNAKit提取全血基因组DNA，AmoyDxFFPEDNAKit提取石蜡切片基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。所提DNA溶于Tris-HCL，经过紫外分光光度计检测提取质量，用Qubit2.0检测样本DNA浓度后，将各样本稀释到浓度为5ng/μL。
(2)第一步PCR扩增：
第一步PCR扩增反应体系为
说明：带有Tag序列的特异性引物混合物(共8管)是指，SEQIDNO:1-194代表的97对引物，其中上游引物的5’端加上通用引物Tag1，下游引物的5’端加上通用引物Tag2；按照引物列表的顺序，第一管是15对引物(SEQIDNO:1-30代表的15对引物)，第二管是15对引物(SEQIDNO:31-60代表的15对引物)，第三管是10对引物(SEQIDNO:61-80代表的10对引物)，第四管是15对引物(SEQIDNO:81-110代表的15对引物)，第五管是15对引物(SEQIDNO:111-140代表的15对引物)，第六管是10对引物(SEQIDNO:141-160代表的10对引物)，第七管是10对引物(SEQIDNO:161-180代表的10对引物)，第八管是7对引物(SEQIDNO:181-194代表的7对引物)。
以上试剂组分：10XPCRbuffer、MgSO4、dNTPMix、Tag酶均购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
所述PCR的反应条件是94℃预变性2分钟，20个循环(94℃变性45秒，60℃退火45秒，68℃延伸2分钟)，72℃最后延伸10分钟。
(3)第二步PCR模板制备
第一步PCR结束后，在新的1.5mLEP管中混合PCR1扩增产物，从1-8号管里各取4μL的体积混合，共32μL，组成PCR1扩增产物混合物。用BeckmanCoukter公司的AgencourtAMPureXPKit(货号A63880/A63881/A63882)进行纯化。操作步骤如下：
1.提前至少30分钟取出磁珠，平衡至室温；
2.以漩涡混匀器最大转速涡旋磁珠至磁珠均匀悬浮，向PCR1扩增产物混合物中加入35μL磁珠，反复吹打10-20次至完全混匀，室温孵育5分钟，注意避免多余的磁珠附着在移液器吸嘴外侧；
3.将EP管置于磁力架上，待溶液澄清后小心吸取上清丢弃，注意不要碰到磁珠；
4.加入500μL新鲜配制的体积分数80％乙醇，EP管留在磁力架上，缓慢旋转2圈，静置30秒，吸取上清丢弃；
5.重复上一步一次；
6.保持EP管管盖打开，室温晾干磁珠，以磁珠表面无光泽为准，注意不要过分干燥磁珠，以免磁珠飞出管外造成DNA大量损失及影响洗脱效率；
7.从磁力架上取下EP管，加入30μLPCR级纯化水，反复吹打10-20次至完全混匀，室温孵育3分钟；
8.将EP管重新置于磁力架上，待溶液澄清后小心吸取上清至新的1.5mLEP管中，即为该样本的PCR1纯化产物，注意不要吸到磁珠。
9.将PCR1纯化产物稀释500倍，建议采用两步稀释法，即先稀释50倍(2μLPCR1纯化产物+98μLPCR级纯化水)，涡旋混匀后，再稀释10倍(10μL50倍稀释的PCR1纯化产物+90μLPCR级纯化水)。
(4)第二步PCR扩增反应体系为
以上试剂组分：10XPCRbuffer、MgSO4、dNTPMix、Tag酶均购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
所述PCR的反应条件是94℃预变性2分钟，20个循环(94℃变性45秒，60℃退火45秒，68℃延伸2分钟)，72℃最后延伸10分钟。
备注：(1)带有P5序列和标签序列的上游引物是带有P5序列和不同标签序列(又叫Index序列)的引物，为了区分不同的样本，共有16种标签序列。详见表2。
(2)带有P7序列和标签序列的下游引物是带有P7序列和不同标签序列的引物，为了区分不同的样本，共有24种标签序列。详见表2。
其中：上游引物的Index序列选一种、下游引物的Index序列选一种，组合成双端不同标签序列的组合即可。
其中P5所示序列为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACSEQIDNO:237
P7所示序列为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATSEQIDNO:238
表2Index序列表
(5)扩增后纯化
在扩增产物中加入21.3μLAMPure磁珠进行吸附，体积分数80％乙醇清洗两次后，加入30-45μL纯化水洗脱，即为文库。图3为文库构建完成后的片段分布图，横坐标为片段的长度，纵坐标是信号强度(FU)，Lower是最小的Marker，指示25bp、Upper是最大的Marker，指示1500bp。按照实验方案的设定，经两步扩增之后，片段长度应为360-520bp左右，图3说明实际产物与实验设计相符合。
(6)上机测序与结果分析
测序的结果经过数据处理、生物信息学分析之后得到检测基因的突变情况。数据处理过程包括测序数据的转换、质控、序列比对(参考基因组为NCBI137/Hg19)、突变位点分析等过程，通过数据处理分析后得到检测样本的突变信息。
根据收集的样本检测情况，100份健康的无偿献血者全血样本中未检测到易感突变位点。经过与Sanger测序法进行比较，结果一致。充分说明本发明的特异性好。
实施例2：检测乳腺癌或卵巢癌患者实验
5份乳腺癌或卵巢癌患者外周血样本，BRCA1或BRCA2基因阳性细胞系2株，分别为BT474和HCT15(均可购自于ATCC)。
(1)利用2步扩增法检测BRCA1或BRCA2基因突变的方法同实施例1。
(2)5例乳腺癌/卵巢癌患者样本(全血、石蜡切片)如表3所示。表3中，突变名称为基因编号+外显子编号+突变碱基序列+氨基酸变化，基因名称是指被检出位点所在的基因，染色体是指被检出位点所在的染色体位置，起始位置是指被检出位点所在染色体上的起始位置，RS编号为NCBI网址SNP数据库统一编号。
表35例乳腺癌/卵巢癌患者样本(全血、石蜡切片)的检测结果表
从表3可以看出，5例乳腺癌或卵巢癌患者外周血样本结果与Sanger测序得到的结果一致，详见图4至图8。2个细胞系中检测到的位点也与报道的位点一致。其中图4为Sample1突变位点BRCA1：c.2405_2406delCA标示图，图5为Sample2突变位点BRCA2：c.8951C>G标示图，图6为Sample3突变位点BRCA2：c.51_52delAC标示图，图7为Sample4突变位点BRCA1：c.5470_5477delTGCCCAAT标示图，图8为Sample5突变位点BRCA1：c.5521delA标示图。从图中可以看出，图4为样本在箭头位置下CA缺失，与Sample1检测结果一致，图5为样本在箭头位置下C>G，与Sample2检测结果一致，图6为样本在箭头位置下AC缺失，与Sample3检测结果一致，图7为样本在箭头位置下TGCCCAAT缺失，与Sample4检测结果一致，图8为样本在箭头位置下A缺失，与Sample5检测结果一致。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的引物对，其特征在于，所述引物对中的上游引物为上游特异性引物，同时其5’端加上通用引物Tag1；下游引物为下游特异性引物，同时其5’端加上通用引物Tag2；其中上游特异性引物如SEQIDNO:1,3,5,7,9-193所示；下游特异性引物如SEQIDNO:2,4,6,8,10-194所示；所述Tag1序列如SEQIDNO:195所示，所述Tag2序列如SEQIDNO:196所示。
2.权利要求1所述检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的引物对，其特征在于，还包括新的引物对，所述新的引物对中的上游引物为带有P5序列和SEQIDNO:221-236所示序列的上游引物；下游引物为带有P7序列和SEQIDNO:197-220所示序列的下游引物。
3.一种检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。
4.一种检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的方法，其特征在于，步骤为，
文库制备：
第一步PCR扩增：以待检测样本DNA作为模板，分为8管分别进行扩增；引物为权利要求1所示引物对序列；
第二步PCR扩增：以第一步PCR扩增得到的产物为模板，引物为权利要求2所示新的引物对序列；
得到的第二步PCR扩增产物处理后即为文库；
测序与结果分析：对文库进行测序，测序的结果经过数据处理后得到检测基因的突变情况；数据处理为测序数据的转换、质控、与参考基因组NCBI137/Hg19的序列比对、突变位点分析，通过数据处理后得到检测样本的突变信息。
5.根据权利要求1所述检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的方法，其特征在于，所述第一步PCR扩增的8管引物分别为：第一管的引物是SEQIDNO:1-30所示序列，第二管的引物是SEQIDNO:31-60所示序列，第三管的引物是SEQIDNO:61-80所示序列，第四管的引物是SEQIDNO:81-110所示序列，第五管的引物是SEQIDNO:111-140所示序列，第六管的引物是SEQIDNO:141-160所示序列，第七管的引物是SEQIDNO:161-180所示序列，第八管的引物是SEQIDNO:181-194所示序列。
6.根据权利要求1所述检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的方法，其特征在于，所述第一步PCR扩增的程序是94℃预变性2分钟，94℃变性45秒、60℃退火45秒、68℃延伸2分钟循环20次，72℃最后延伸10分钟。
7.根据权利要求1所述检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的方法，其特征在于，所述第二步PCR扩增所用的模板进行了纯化。
8.根据权利要求1所述检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的方法，其特征在于，所述第二步PCR扩增的程序是94℃预变性2分钟，94℃变性45秒、60℃退火45秒、68℃延伸2分钟循环20次，72℃最后延伸10分钟。
9.根据权利要求1所述检测BRCA1和BRCA2全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的方法，其特征在于，所述得到的PCR扩增产物处理为在扩增产物中加入21.3μLAMPure磁珠进行吸附，体积分数80％乙醇清洗两次后，加入30-45μL纯化水洗脱。
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