CN108396026A

CN108396026A - 十倍体长穂偃麦草蓝粒性状专化分子标记和荧光原位杂交探针的开发及应用

Info

Publication number: CN108396026A
Application number: CN201810399771.0A
Authority: CN
Inventors: 郑琪; 刘利勤; 张静; 罗巧玲; 李宏伟; 李滨; 李振声
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2018-08-14
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: CN108396026B

Abstract

本发明公开了十倍体长穂偃麦草蓝粒性状专化分子标记和荧光原位杂交探针的开发及应用。本发明利用特异性位点扩增片段测序技术对普通小麦、蓝粒小麦(蓝58)和长穗偃麦草进行测序，通过序列数据比对分析获得长穗偃麦草4Ag染色体特异DNA序列，以长穗偃麦草4Ag染色体特异序列为基础，开发出来源于长穂偃麦草4Ag染色体的蓝粒性状的专化分子标记和专化荧光探针。本发明提供的分子标记和探针可用于长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中蓝粒表型的鉴定，不仅为蓝粒基因的定位及克隆奠定基础，也为蓝粒性状的分子标记辅助选择提供依据。

Description

十倍体长穂偃麦草蓝粒性状专化分子标记和荧光原位杂交探针的开发及应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及十倍体长穂偃麦草蓝粒性状专化分子标记和荧光原位杂交探针的开发及应用。

背景技术

长穂偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70)是多年生草本植物，属于禾本科偃麦草属，是小麦重要的野生近缘种。它具有长穗多花、适应性广、耐逆性强等优良性状，蕴藏着许多普通小麦所不具备的优良基因(Shannon，1978；Cox，1991)，且易与小麦杂交结实，是改良现有小麦品种的宝贵资源库。通过远缘杂交及染色体工程，李振声等从普通小麦与长穗偃麦草的杂交后代中选育出了蓝粒小麦(蓝58)。蓝粒小麦外部形态像普通小麦，突出特点是种子为深蓝色，蓝色色素存在于胚乳细胞糊粉层中。该特性呈胚乳直感、显性遗传，并有明显的剂量效应，是小麦细胞遗传学研究的理想形态学特征(Li et al.,1986)。经分子细胞遗传学分析，蓝粒小麦染色体数目为42条，是一对携带蓝粒基因的长穗偃麦草4Ag染色体代换了一对小麦4D染色体后形成的异代换系(Zheng et al.,2006)。利用花粉辐射将携带蓝粒性状的染色体打断，并通过杂交和连续回交转移至普通小麦背景下，创制出蓝粒易位系，不仅可以用于蓝粒基因的物理定位，而且也为利用蓝粒标记进行小麦细胞遗传学研究提供工具材料。

蓝粒小麦籽粒表型鉴定需要到籽粒灌浆后期才能进行，无法在小麦生长发育早期进行选择。虽然一些遗传学手段，如染色体分带、基因组原位杂交(Genomic in situhybridization，GISH)等技术，能够用于小麦遗传背景下长穂偃麦草遗传物质的检测，但这些技术费时、费力，对操作技巧或仪器设备的要求也较高，且这些实验手段难以实现高通量筛选与规模化鉴定。分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记，在杂交后代中准确鉴别不同个体基因型，并据此进行辅助选择的育种技术。利用长穂偃麦草染色体专化分子标记进行标记辅助选择(MAS)对于利用偃麦草优异基因，加速小麦分子育种进程具有重大意义。例如，利用来源于长穂偃麦草抗秆锈病基因Sr24、Sr25、Sr26及Sr43的连锁标记，能够开展抗病种质资源的筛选、外源遗传物质的鉴定及抗病基因的定位，有效地提高了分子标记辅助选择育种的效率(Ayala-Navarrete et al.,2007；Margo et al.,2005；Niu et al.,2014；Yu et al.,2010；Zhenget al.,2014)。

截止目前，科学家已经利用多种技术手段开发了长穗偃麦草特异性分子标记，如限制片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)(Autrique etal.,1995；Liu et al.,1999)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)(Prins et al.,2001；Zhang et al.,2008)、随机扩增多态性(RandomAmplified PolymorphicDNA，RAPD)(Liu et al.,1998；You et al.,2002)、简单重复序列(Simple sequence repeats，SSR)(Li et al.,2005；Jauhar et al.,2009；Shen et al.,2004；You et al.,2002；You et al.,2003；Niu et al.,2014)、序列标志位点(SequenceTagged Sites,STS)(Mago et al.,2005；Zhang et al.,2008)、抗病基因类似物标记(Resistance Gene Analogs Polymorphism，RGAP)(Chen et al.,2007)、靶位区域扩增多态性(TargetRegion Amplified Polymorphism，TRAP)(Jauhar et al.,2009)、抑制消减杂交(Suppression Subtraction Hybridization,SSH)(Ge et al.,2012)、酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplification Polymorphism Sequence，CAPS)(Shen et al.,2004；Li etal.,2007)、序列特异性扩增区(Sequence—characterized Amplified Region，SCAR)(Youet al.,2002；Prabhu et al.,2004；Yan et al.,2009)。然而，在分子生物学飞速发展的今天，长穂偃麦草分子标记的开发工作仍然相对滞后，标记来源也主要集中于二倍体种。由于十倍体长穂偃麦草基因组庞大，加之其基因组与小麦基因组具有高度同源性，又缺乏基因组全序列信息，致使十倍体长穂偃麦草分子标记的开发研究存在耗时长、成本高和效率低等缺点，严重阻碍了长穗偃麦草基因资源的开发和应用。

SLAF-seq(Specific-locus Amplified Fragment Sequencing)是基于高通量测序技术发展而来的大规模基因分型技术(Sun et al.,2013)。该技术主要通过生物信息学设计方案，构建SLAF-seq文库，筛选特异性长度片段，高通量测序获得序列信息，通过软件定义和评估等步骤，筛选到海量的序列标签，进一步根据序列开发特异的分子标记。当缺乏物种基因组信息时，同样可以利用该技术降低物种复杂度，获得可靠的序列标签。该方法具有通量高、准确性高、成本低、周期短等优点，在遗传定位、分子育种、种质资源鉴定等研究领域得以应用。SLAF-seq技术适用物种范围广，已在农作物、蔬菜、林木、水产等多个物种中成功实践(Zhang,et al.,2013)。应用SLAF-seq技术，成功获得了20个二倍体长穂偃麦草1E染色体和61个二倍体长穂偃麦草7E染色体的分子标记(陈士强等,2013；Chen et al.,2013)。Qiu等(2016)用SLAF-seq方法对黑麦基因组DNA进行测序，从获得的大量reads中开发出的寡核苷酸序列作探针能够代替黑麦基因组DNA和黑麦特异重复序列签定小麦背景中的黑麦染色体。因此，SLAF-seq技术的发展对长穂偃麦草染色体专化分子标记和专化荧光探针的挖掘带来了新的机遇。

发明内容

本发明的第一个目的是提供长穗偃麦草4Ag染色体分子标记。

本发明提供的长穗偃麦草4Ag染色体分子标记是以长穗偃麦草的基因组DNA为模板，采用引物对M进行扩增得到的DNA分子：

所述引物对M由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成。

本发明的第二个目的是提供用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的探针。

本发明提供的用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的探针为序列3所示的DNA分子。

本发明提供的探针标记有荧光基团。所述荧光基团具体为红色荧光基团。

本发明的第三个目的是提供用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的引物对。

本发明提供的用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的引物对为上述引物对M。所述引物对中的两条引物的摩尔量比为1:1。

本发明的第四个目的是提供用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的PCR试剂。

本发明提供的用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的PCR试剂包括上述引物对M。

上述PCR试剂中，所述引物对中的两条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为10μM。

本发明的第五个目的是提供用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的试剂盒。

本发明提供的用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的试剂盒包括上述引物对或上述PCR试剂。

本发明的第六个目的是提供上述分子标记或探针或引物对或PCR试剂或试剂盒的新用途。

本发明提供了上述分子标记或探针或引物对或PCR试剂或试剂盒在如下1)-12)中任一种中的应用：

1)检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体；

2)制备检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的产品；

3)检测或辅助检测待测小麦中是否含有长穗偃麦草4Ag染色体；

4)制备检测或辅助检测待测小麦中是否含有长穗偃麦草4Ag染色体的产品；

5)检测或辅助检测待测小麦是否为蓝粒小麦；

6)制备检测或辅助检测待测小麦是否为蓝粒小麦的产品；

7)检测或辅助检测待测小麦是否含有长穂偃麦草基因组；

8)制备检测或辅助检测待测小麦是否含有长穂偃麦草基因组的产品；

9)分子标记辅助选择育种；

10)制备分子标记辅助选择育种的产品；

11)小麦分子育种；

12)制备小麦分子育种的产品。

本发明的第七个目的是提供一种检测或辅助检测待测小麦中是否含有长穗偃麦草4Ag染色体的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测小麦中是否含有长穗偃麦草4Ag染色体的方法为如下(a1)或(a2)：

(a1)包括如下步骤：用上述探针对待测小麦进行原位杂交，若出现点状的杂交信号，则表示待测小麦中含有或候选含有长穗偃麦草4Ag染色体；若未出现点状的杂交信号，则表示待测小麦中不含有或候选不含有长穗偃麦草4Ag染色体；所述原位杂交不含有封阻的步骤；

(a2)包括如下步骤：用上述引物对对待测小麦进行PCR扩增，若扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦中含有或候选含有长穗偃麦草4Ag染色体；若未扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦中不含有或候选不含有长穗偃麦草4Ag染色体。

本发明的第八个目的是提供一种检测或辅助检测待测小麦是否为蓝粒小麦的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测小麦是否为蓝粒小麦的方法为如下(b1)或(b2)：

(b1)用上述探针对待测小麦进行原位杂交，若出现点状的杂交信号，则表示待测小麦为或候选为蓝粒小麦；若未出现点状的杂交信号，则表示待测小麦不为或候选不为蓝粒小麦；所述原位杂交不含有封阻的步骤；

(b2)用上述引物对对待测小麦进行PCR扩增，若扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦为或候选为蓝粒小麦；若未扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦不为或候选不为蓝粒小麦。

本发明的第九个目的是提供一种检测或辅助检测待测小麦中是否含有长穗偃麦草基因组的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测小麦中是否含有长穗偃麦草基因组的方法为如下(c1)或(c2)：

(c1)包括如下步骤：用上述探针对待测小麦进行原位杂交，若出现点状的杂交信号，则表示待测小麦中含有或候选含有长穗偃麦草基因组；若未出现点状的杂交信号，则表示待测小麦中不含有或候选不含有长穗偃麦草基因组；所述原位杂交不含有封阻的步骤；

(c2)包括如下步骤：用上述引物对对待测小麦进行PCR扩增，若扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦中含有或候选含有长穗偃麦草基因组；若未扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦中不含有或候选不含有长穗偃麦草基因组。

上述方法中，所述大小为329bp的条带的核苷酸序列为序列3所示的DNA分子。

上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为54℃。

本发明利用特异性位点扩增片段测序技术(Specific-locus AmplifiedFragment Sequencing，SLAF-seq)对普通小麦、蓝粒小麦(蓝58)和长穗偃麦草进行测序，通过序列数据比对分析获得长穗偃麦草4Ag染色体特异DNA序列。以长穗偃麦草4Ag染色体特异序列为基础，开发出来源于长穂偃麦草4Ag染色体的蓝粒性状的专化分子标记和专化荧光探针。本发明提供的分子标记和探针可用于长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中蓝粒表型的鉴定，不仅为蓝粒基因的定位及克隆奠定基础，也为蓝粒性状的分子标记辅助选择提供依据。

附图说明

图1为十倍体长穗偃麦草4Ag染色体专化分子标记4Ag-19在普通小麦中国春(CS)、十倍体长穗偃麦草、蓝58和蓝粒小麦易位系L5、L9和L13中的扩增。M：MarkerII；1：中国春；2：长穂偃麦草(10X)3：蓝58；4：L5；5：L9；6：L13。

图2为蓝58和蓝粒易位系L5、L9、L13根尖体细胞中期染色体原位杂交图。A，C，E，G为十倍体长穗偃麦草全基因组探针；B，D，F，H为十倍体长穗偃麦草来源的蓝粒性状专化荧光探针pThp12.19。A和B为蓝58；C和D为蓝粒易位系L5；E和F为蓝粒易位系L9；G和H为蓝粒易位系L13。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的普通小麦中国春(CS，2n＝6x＝42)、十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum，2n＝10x＝70)和蓝58(Blue 58，2n＝6x＝42)均记载于文献“Q.Zheng,B.Li,S.Mu,H.Zhou,Z.Li,Physical mapping of the blue-grained gene(s)from Thinopyrumponticum by GISH and FISH in a set of translocation lines with different seedcolors in wheat,Genome 49(9)(2006)1109-1114.”中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的蓝粒易位系L5、L9和L13是通过花粉辐射将携带蓝粒性状的4Ag染色体打断，并与普通小麦小偃81杂交、回交的蓝粒易位系。其中，L5携带易位染色体TW-4AgS·4AgL，L9携带易位染色体T4AgL﹒4AgS-W，L13携带易位染色体T4AgL﹒1DL。蓝粒易位系L5、L9和L13的具体创制方法参见专利文献“郑琪，李宏伟，李滨，李振声.一种规模化创制小麦异源易位系的方法，授权号:ZL201410056588.2，授权公告日:2016年2月24日”，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的小偃81品种于2005年通过河北省品种委员会审定，审定编号为：冀审麦2005006，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、十倍体长穂偃麦草蓝粒性状专化分子标记的开发

1、基因组DNA的提取和纯化

利用CTAB法分别提取普通小麦中国春、十倍体长穂偃麦草和蓝58的基因组DNA，具体操作步骤如下：

(1)取适量幼嫩组织，在液氮中冷冻后迅速研磨成粉末并装入2mL离心管中。

(2)加入65℃预热的CTAB提取液800μL，剧烈振荡，65℃水浴40-60min，间或轻轻摇匀。

(3)取出离心管，每管加入800μL氯仿:异戊醇(24:1)，上下颠倒充分混匀，室温，12000rpm/min，离心15min。

(4)吸取上清液约600μL转移至新的1.5mL离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃低温放置30min。

(5)室温，12000rpm/min离心10min，弃上清。

(6)加75％乙醇700μL，上下颠倒洗涤沉淀，4℃，10000rpm离心5min，弃上清。

(7)65℃烘箱干燥3-5min，溶于适量含有RNase(10mg/mL)的1×TE中，37℃消化RNA1h，电泳检测DNA的质量，-20℃保存。

2、基于SLAF-seq技术获得特异序列标签

利用SLAF-seq的方法对普通小麦中国春、十倍体长穂偃麦草和蓝58的基因组DNA进行测序(由北京百迈客生物科技有限公司完成)，得到各样品的序列标签。利用Blast方法将蓝58序列标签与中国春序列标签及已知的小麦基因组序列进行比对，剔除与小麦序列相似度在50％以上的序列标签；余下的序列标签再与十倍体长穂偃麦草序列标签进行比对，获取相似度在50％以上的序列标签为十倍体长穗偃麦草4Ag染色体特异SLAF序列标签。

3、十倍体长穗偃麦草4Ag染色体专化分子标记的开发

根据SLAF-seq技术获得的序列标签，选择1921个特异SLAF序列标签利用PrimerPremier 5.0软件各设计引物1对。引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用HAP方式纯化。

4、PCR反应

以蓝58、普通小麦中国春(CS)、十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum，2n＝10x＝70)的基因组DNA为模板，采用测序获得的长穗偃麦草4Ag染色体特异序列设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系如表1所示，PCR反应程序如表2所示。

表1.PCR反应体系

表2.PCR反应程序

5、琼脂糖凝胶电泳及PCR反应产物的纯化与测序

PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶，120V稳定电压下进行电泳20分钟，电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后，观察结果、拍照分析并对PCR反应产物进行纯化(生工生物工程(上海)股份有限公司试剂盒)与测序。若蓝58及十倍体长穗偃麦草4Ag染色体有扩增条带，而中国春没有扩增条带，则认为此标记为十倍体长穗偃麦草4Ag染色体专化分子标记。

结果表明，1921对引物中有621对引物在蓝58和十倍体长穗偃麦草中均有扩增条带，而普通小麦中国春均没有扩增条带。本发明的621个十倍体长穗偃麦草4Ag染色体专化分子标记均具有良好的准确性、可靠性和专化性。利用三个蓝粒小麦易位系L5、L9和L13对这621个标记进行筛选，结果发现分子标记4Ag-19在所有的蓝粒小麦易位系中均扩增得到大小为329bp的条带，说明它与蓝粒性状紧密连锁。分子标记4Ag-19的扩增引物对由GTGCGGGGTGAAAAATTCGTTT(序列1)和AAATGCCGGTTTTGCCCCTAAT(序列2)组成。

6、分子标记的验证

以蓝58、十倍体长穗偃麦草和蓝粒小麦易位系L5、L9、L13及普通小麦中国春的基因组DNA为模板，采用分子标记4Ag-19进行PCR扩增。结果表明：分子标记4Ag-19在蓝58、十倍体长穗偃麦草和蓝粒小麦易位系L5、L9、L13中均扩增得到大小为329bp的条带，而普通小麦中国春没有扩增条带。

实施例2、十倍体长穗偃麦草4Ag染色体串联重复序列特异探针的开发

以十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum，2n＝10x＝70)为模板，采用实施例1中获得的分子标记4Ag-19进行PCR扩增，得到PCR产物。所得的PCR产物经纯化后标记成FISH探针，对蓝58及蓝粒易位系L5、L9、L13根尖体细胞有丝分裂中期分裂相进行原位杂交。同时以利用十倍体长穂偃麦草全基因组DNA做探针进行GISH分析作为对照，利用十倍体长穂偃麦草全基因组DNA做探针进行GISH分析的步骤参照文献“Zheng Q.,Luo Q.,Niu Z.,Li H.,Li B.,Xu S.S.,Han F.,Li Z.,Variation in Chromosome Constitution of the XiaoyanSeries Partial Amphiploids and Its Relationship to Stripe Rust and Stem RustResistance.J Genet Genomics.42(2015)657-660”中的方法。

1、荧光探针pThp12.19的制备

(1)十倍体长穗偃麦草4Ag染色体串联重复序列特异探针

以十倍体长穗偃麦草为模板，分别采用实施例1中获得的分子标记4Ag-19进行PCR扩增，得到PCR产物，PCR产物纯化后，按照表3中的体系进行标记，制备得到荧光探针，将其命名为pThp12.19。标记的具体步骤如下：

1)按照表3中的浓度和组分配制标记体系，其中，标记的-dNTPs为Texas-red-5-dCTP(红光，购自Perkin Elmer公司)；未标记的-dNTPs购自Invitrogen公司；DNA聚合酶(浓度为10U/μL)购自Invitrogen公司；Dnase(浓度为100mU/μL)购自北京全式金生物技术有限公司；10×Nick translation buffer(溶剂为水)中含有500mM Tris，50mM MgCl₂，pH＝7.8。

2)用枪头反复吹打步骤1)获得的标记体系，混匀，不能涡旋，15℃保温2小时。置于金属浴仪(H₂0³-PRO，中国)中15℃反应2小时。13000rpm离心30-40min，弃上清，收集沉淀。

3)分别用70％乙醇和无水乙醇洗一次步骤2)获得的沉淀，避光晾干。然后向沉淀中加10μL缓冲液(10μL缓冲液由0.3MNaCl，0.03M柠檬酸钠，10mM Tris，1mM EDTA和水组成，化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司)，使探针终浓度为200ng/μL。

表3.标记体系

十倍体长穗偃麦草4Ag染色体专化标记PCR产物DNA	10μL
		10×Nick translation buffer	2μL
标记的-dNTP(1nM)	0.5μL
		未标记的-dNTPs(每种2mM混合)	2μL
DNA聚合酶(10U/μL)	5μL
		DNase(100mU/μL)	0.5μL

表4.长穗偃麦草4Ag染色体专化荧光探针SLAF序列及引物

2、原位杂交

(1)根尖体细胞有丝分裂中期分裂相的制片

1)N₂O处理根尖细胞

选择成熟饱满的种子，放入垫有潮湿滤纸的培养皿中，用水淋湿并保持一定的湿度，在23℃恒温培养箱内培养，待根尖长到1-2厘米时，剪取根尖，放入湿润的离心管中，盖上盖子后放入气室中处理2h，压强为10ATM(1.01Mpa)。

2)根尖固定

90％乙酸固定根尖10分钟，蒸馏水冲洗2次，每次5min。

3)酶解

用滤纸将根尖上的水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入20μL混合酶溶液(1％的果胶酶Y-23和2％纤维素酶Onozuka R-10溶于1×柠檬酸缓冲液，均购于日本JapanYakult公司)，37℃水浴40-60min。

4)滴片镜检

70％酒精冲洗酶解后的根尖2次，余200μL的70％酒精在离心管里，捣碎根尖，低速离心10sec左右，将酒精倒干，根据植物根尖大小加冰乙醇(每个根尖20-40μL)悬浮根尖细胞；将干净的载玻片放入湿盒，将6-7μL的根尖细胞悬浮液滴到载玻片上，盖上盒盖，5分钟以后镜检，将染色体制片标本保存在冰箱中备用。

(2)原位杂交

将待杂交的载玻片放入紫外交联仪(code-No.CL-1000，购自美国UVP公司)中，UV能量为0.125J/cm²。将制片放在冰上，将探针与封阻按合适比例制备杂交液，每张载玻片上加杂交液6μL，盖上盖玻片，90℃变性5min，55℃湿盒内杂交过夜。取出制片，迅速放入2×SSC中使盖玻片滑落，用吸水纸把片子背面擦干，滴加抗褪色剂(含DAPI，H-1200，购自美国Vector Labs公司)，盖上24×50mm的盖玻片后，在荧光显微镜下检测、照相。

杂交结果如图2所示。对pThp12.19在蓝58及蓝粒易位系L5、L9、L13的杂交信号进行分析。当利用十倍体长穗偃麦草基因组DNA做探针，普通小麦中国春DNA做封阻，对蓝58及蓝粒易位系L5、L9、L13进行基因组原位杂交时，探针与封阻的比例为1:200，蓝58中的1对来源于长穂偃麦草完整的4Ag染色体以及三个易位系中的小麦-长穂偃麦草易位染色体上的外源染色体片段均呈现明显的杂交信号(图2A，C，E，G)。当利用蓝粒性状专化荧光探针pThp12.19对蓝58及蓝粒易位系L5、L9、L13进行荧光原位杂交时，4Ag染色体长臂近端部以及三个易位系中易位染色体片段的近端部区域均出现点状的杂交信号(图2B，2D，F，H)。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>十倍体长穂偃麦草蓝粒性状专化分子标记和荧光原位杂交探针的开发及应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

gtgcggggtg aaaaattcgt tt 22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

aaatgccggt tttgccccta at 22

<210>3

<211>329

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

gtgcggggtg aaaaattcgt tttcccgccc aaactctcgc ctccctttgg aaatatcgtc 60

gctcgcccat tattcatccg tggatccctc ccttttgtat ttttcgttcc gtattgtcgg 120

ggagacgcct acgcaagggt gaacaatagc acacccattt ttggcatgcc ggtgaaaatt 180

tcccgcccaa aatggcgaaa aaatgaccac ggcggcgagc gtctcaaagc acccccggag 240

gtgcgaaaac gggtataggc acgtaggagg tagtttggtg gcccccaata ccagggtggt 300

gtcgaaaatt aggggcaaaa ccggcattt 329

Claims

1.长穗偃麦草4Ag染色体分子标记，是以长穗偃麦草的基因组DNA为模板，采用引物对M进行扩增得到的DNA分子：

2.用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的探针，为序列3所示的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述探针标记有荧光基团。

4.用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的引物对，为权利要求1中所述的引物对M。

5.用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的PCR试剂，包括权利要求4所述的引物对。

6.用于检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的试剂盒，包括权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的PCR试剂。

7.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的探针或权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在如下1)-12)中任一种中的应用：

1)检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体；

2)制备检测或辅助检测长穗偃麦草4Ag染色体的产品；

5)检测或辅助检测待测小麦是否为蓝粒小麦；

6)制备检测或辅助检测待测小麦是否为蓝粒小麦的产品；

7)检测或辅助检测待测小麦是否含有长穂偃麦草基因组；

9)分子标记辅助选择育种；

10)制备分子标记辅助选择育种的产品；

11)小麦分子育种；

12)制备小麦分子育种的产品。

8.一种检测或辅助检测待测小麦中是否含有长穗偃麦草4Ag染色体的方法，为如下(a1)或(a2)：

(a1)包括如下步骤：用权利要求2或3所述的探针对待测小麦进行原位杂交，若出现点状的杂交信号，则表示待测小麦中含有或候选含有长穗偃麦草4Ag染色体；若未出现点状的杂交信号，则表示待测小麦中不含有或候选不含有长穗偃麦草4Ag染色体；所述原位杂交不含有封阻的步骤；

(a2)包括如下步骤：用权利要求4所述的引物对对待测小麦进行PCR扩增，若扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦中含有或候选含有长穗偃麦草4Ag染色体；若未扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦中不含有或候选不含有长穗偃麦草4Ag染色体。

9.一种检测或辅助检测待测小麦是否为蓝粒小麦的方法，为如下(b1)或(b2)：

(b1)用权利要求2或3所述的探针对待测小麦进行原位杂交，若出现点状的杂交信号，则表示待测小麦为或候选为蓝粒小麦；若未出现点状的杂交信号，则表示待测小麦不为或候选不为蓝粒小麦；所述原位杂交不含有封阻的步骤；

(b2)用权利要求4所述的引物对对待测小麦进行PCR扩增，若扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦为或候选为蓝粒小麦；若未扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦不为或候选不为蓝粒小麦。

10.一种检测或辅助检测待测小麦中是否含有长穗偃麦草基因组的方法，为如下(c1)或(c2)：

(c1)包括如下步骤：用权利要求2或3所述的探针对待测小麦进行原位杂交，若出现点状的杂交信号，则表示待测小麦中含有或候选含有长穗偃麦草基因组；若未出现点状的杂交信号，则表示待测小麦中不含有或候选不含有长穗偃麦草基因组；所述原位杂交不含有封阻的步骤；

(c2)包括如下步骤：用权利要求4所述的引物对对待测小麦进行PCR扩增，若扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦中含有或候选含有长穗偃麦草基因组；若未扩增得到大小为329bp的条带，则表示待测小麦中不含有或候选不含有长穗偃麦草基因组。