CN111593135A

CN111593135A - 一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源基因的检测引物和方法

Info

Publication number: CN111593135A
Application number: CN202010378788.5A
Authority: CN
Inventors: 龙湍; 李燕群; 李佳林; 曾翔; 吴永忠; 李新鹏; 安保光; 黄培劲
Original assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Current assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2040-05-07
Also published as: CN111593135B

Abstract

本发明提供了一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源基因的检测引物和方法，属于植物生物技术领域。本发明的检测引物包含一条正向引物SEQ ID NO.1和两条反向引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。利用本发明的引物，只需通过常规的PCR和PAGE胶电泳即可区分转基因材料及其自交、杂交、回交后代中的内、外源基因，以及各种内、外源基因组成的基因型，从而在转基因材料当代和后代的繁殖及转育过程中，提高对目标基因型的选择效率。本发明提供的方法操作简便、分型快速、结果直观准确，在植物育种技术领域中应用前景广阔。

Description

一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源基因的检测引物和方法

技术领域

本发明涉及植物分子遗传育种技术领域，具体地涉及一种鉴别转基因水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因型的分子标记及其应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的主要粮食作物。雄性不育是指雄性生殖器官无法产生正常花粉，而雌性生殖器官发育正常，能接受正常花粉而受精结实的现象。水稻是自花授粉作物，利用雄性不育迫使水稻接受外来花粉，既可以利用杂种优势提高水稻的产量、品质和抗性，又可以实现大规模杂交种制备，在杂交水稻产业中具有十分重要的意义。海南波莲水稻基因科技有限公司于2013 年用钴60对籼稻材料9311进行辐射，筛选获得一份隐性核雄性不育材料，命名为1907。该突变性状由CYP704B2基因在基因编码区第794 个碱基后的GGG被替换为T导致(龙湍，安保光，李新鹏，等.籼稻9311 辐射诱变突变体库的创建及其筛选.中国水稻科学，2016，30(1)： 44-52)。

利用隐性核雄性不育系进行水稻杂交育制种被袁隆平院士誉为第三代杂交水稻技术，能够克服目前生产上广泛应用的三系和两系杂交水稻种质资源利用率低和制种风险高的缺陷(袁隆平.杂交水稻发展的战略.杂交水稻,2018,33(5):1–2.)。其基本原理是将紧密连锁的育性恢复基因、花粉败育基因和筛选标记基因导入隐性核雄性不育突变体中获得该不育突变体的保持系，再利用保持系生产不育系用于杂交种生产(邓兴旺,王海洋,唐晓艳等.杂交水稻育种将迎来新时代.中国科学:生命科学,2013,43:864–868.)。在将上述1907突变体及相应的CYP704B2突变基因用于第三代杂交水稻技术的研发过程中，如何有效区分转基因植株及其自交、杂交、回交后代中外源 CYP704B2转基因(即育性恢复基因)、内源野生型CYP704B2基因和内源突变型CYP704B2基因成为一个需要克服的问题。

转基因检测大致分为基于转基因植物的核酸水平检测和蛋白水平检测两类(Querci M,Van den Bulcke M(2010)New approaches in GMO detection.Anal BioanalChem 396(6):1991-2002)。其中，基于核酸水平的检测具有检测方便、体系成熟、可检测范围广及通量高等特点，因此使用较为广泛(Elenis D,Kalogianni D(2008)Advances inmolecular techniques for the detection and quantification of geneticallymodified organisms.Anal Bioanal Chem 392(3):347-54)。基于核酸水平的检测方法按具体应用又可以分为以下几种：1、传统定性PCR 检测技术；2、荧光定量PCR检测技术；3、多重PCR检测技术；4、核酸杂交检测技术；5、基因芯片检测技术等。

为了解决在转基因植株及其自交、杂交、回交后代中有效区分外源CYP704B2转基因、内源野生型和突变型CYP704B2基因及其组合的问题，本发明通过在外源CYP704B2转基因中引入SNP，并结合1907 中CYP704B2基因的突变位点，设计引物，通过传统定性PCR即实现了对转基因材料及其后代中内、外源基因的基因分型。本鉴定方法操作简便，成本低廉，通量可控，特别适合小、微企业的研究和生产需要。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种鉴别转基因水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2 基因的分子标记和引物组合。

本发明的第二个目的是提供利用上述标记和引物组合区分转基因水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因并鉴定植株基因型的方法及其应用。

本发明的第三个目的是提供利用上述分子标记预测转基因水稻材料及其自交、杂交、回交后代的花粉育性。

本发明提供的一种鉴别转基因水稻中内、外源CYP704B2基因的分子标记，其通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。

本发明提供了上述分子标记在鉴定转基因水稻中内、外源 CYP704B2基因型中的应用。

本发明提供了利用上述分子标记预测转基因水稻材料及其自交、杂交、回交后代的花粉育性的应用。

本发明提供了前述分子标记、引物组合或试剂盒在作物育种或种质资源改良中的应用。

所述的作物包括但不限于水稻、玉米、大豆、小麦、大麦、小米、高粱。

本发明提供的一种用于检测转基因水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因型的引物组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。

含有所述引物组合的试剂盒属于本发明的保护范围。

本发明的SEQ ID NO.1所示的正向引物GY-1F： GTCGGGTTTGGGGTTGAGATC，SEQ IDNO.2所示的反向引物 HF-1R:CGACGTGCAAGAACTTCCTG，和SEQ ID NO.3所示的反向引物NY-1R:GTAACGATGATGTTGGCAGCGTAGTAT。

本发明上述引物组合是针对野生型CYP704B2基因(其序列信息记载于文献中，龙湍，安保光，李新鹏，等.籼稻9311辐射诱变突变体库的创建及其筛选.中国水稻科学，2016，30(1)：44-52)的编码区第794位碱基后GGG被替换为T的突变，以及基因编码区第839位与外源CYP704B2转基因(即育性恢复基因)的SNP多态性(A/C)、第896位与外源基因的SNP多态性(G/C)设计、筛选后获得。外源 CYP704B2转基因中的两个C的SNP为人为引入，是同义突变，其中第 839位的突变产生了一个Stu I/Hae III切点，第896位的突变删除了一个 Xmn I的切点。由于野生型品种中含有该转基因对应的内源基因，本申请在不改变所编码的氨基酸序列的条件下，做这样SNP的引入进行基因修饰，是为了区分植物基因组本身的内源基因与导入的外源基因。本发明引入SNP的位置确保在引起功能变化的序列差异位点(即 1907突变位点)的200bp范围内，便于设计引物和控制PCR产物大小。

引物HF-1R只能与修饰过密码子的外源CYP704B2转基因配对，引物NY-1R可以与野生型和突变型内源基因配对。此外，HF-1R的3’端第三个碱基引入T→C的突变。NY-1R的3’端第三个碱基引入A→T 的突变和第五个碱基引入C→A的突变，5’端第三个碱基引入G→A的突变，以便于提高HF-1R和NY-1R对目标序列的相对识别能力。GY-1F 为公共正向引物，位于第794位碱基后GGG被替换为T的突变前21个碱基，同HF-1R配对只能以外源基因为模板扩增出142bp的PCR产物。 GY-1F同NY-1R配对可分别以突变型和野生型内源基因为模板扩增出90bp和92bp的PCR产物。

进一步地，本发明提供了一种检测转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因及基因型的方法，首先对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1所示的正向引物、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，根据电泳条带确定待测样品的基因型。

若扩增产物只出现90bp条带，则表明待测样品为不含外源基因的纯合突变基因型cyp704b2；若只出现92bp条带，则表明待测样品为不含外源基因的纯合野生基因型CYP704B2；若出现90bp和92bp两条带，则表明待测样品为不含外源基因的杂合基因型。若出现90bp和142bp 两条带，则表明待测样品为含外源基因的纯合突变基因型cyp704b2；若出现92bp和142bp的两条带，则表明待测样品为含外源基因的纯合野生基因型CYP704B2；若出现90bp、92bp和142bp的三条带，则表明待测样品为含外源基因的杂合基因型。

90bp条带的参考序列如SEQ ID NO.4所示，92bp条带的参考序列如SEQ ID NO.5所示，142bp条带的参考序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的实施例中采用的转基因材料为转基因水稻。本领域技术人员应当理解，由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但这种差异通常不会影响标记的使用。

进一步地，PCR的反应体系为：Biomiga的2×Bench Top^TM Taq master mix 6μL，10μM的一个正向、两个反向引物各0.3μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH₂O至10μL；

PCR反应条件为：94℃，3min；94℃、20s，61℃、25s，72℃、 35s，共35个循环；接着72℃、5min，最后20℃，1min。

在本发明的实施例中，是通过PAGE胶电泳对PCR扩增产物长度进行判断，PAGE胶电泳条件为：10％PAGE胶，U＝2000V，I＝200mA， P＝85W，电泳2h。

本发明还提供了利用上述标记预测转基因水稻及其自交、杂交、回交后代花粉育性的方法。采用前述的检测转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因及基因型的方法鉴定转基因植株中CYP704B2基因的基因型，凡带有外源CYP704B2基因和/或内源野生型CYP704B2基因的转基因植株花粉可育，凡只带有内源突变型CYP704B2基因的转基因植株花粉不育。即采用本发明提供的SEQ ID NO.1-3所述的引物在同一个PCR反应体系中扩增待测样本，若扩增产物只出现90bp条带，则表明对应植物花粉不育；若扩增带型中出现92bp或142bp条带，则表明对应植株花粉可育。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明设计并开发了一种扩增片段短、特异性强的三引物分子标记。利用该标记只需通过简单的一次PCR反应和PAGE凝胶电泳，不但可用于转基因材料及其后代的内、外源CYP704B2基因型鉴定，还可用于育种过程中将上述转基因材料中的内、外源CYP704B2基因转育至其它水稻种质中，并可用于各种水稻种质中相应内、外源基因的追踪、剔除。此鉴定方式操作简便，同时通量可控；实验结果准确、直观；所需实验设备和引物合成成本低廉。

附图说明

图1是本发明分子标记的引物设计示意图。GY-1F是正向引物，可以分别与CYP704B2的1907突变基因、野生型基因和外源转基因匹配。HF-1R是反向引物，只能与外源CYP704B2转基因匹配。NY-1R 也是反向引物，能与突变基因和野生型基因匹配。箭头所指为各引物中引入的错配碱基。GGG突变位点和内、外源转基因的SNP位点用方框标出。

图2是中花11背景的1907纯合突变体转CYP704B2外源基因的T1 代植株的基因型鉴定PAGE胶电泳图。泳道1为1907纯合突变株，泳道 2-6为T1代分离群体。PCR产物大小标记在胶图右侧。

图3是中花11背景的1907纯合突变体转CYP704B2外源基因的T1 代植株的花粉育性鉴定图。

图4是中花11背景的1907纯合突变体转CYP704B2外源基因的T0 代植株与C815S杂交产生的F2群体的基因型鉴定PAGE胶电泳图。泳道1-3分别为1907纯合株、1907杂合株和中花11，4-9泳道为F2单株。 PCR产物大小标记在胶图右侧。

图5是图4中4-9泳道对应的F2植株的育性鉴定图。A是中花11野生型植株的花粉碘染结果。B-G分别依次对应于图4中4-9泳道植株的花粉碘染结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1转基因材料的获得

在外源基因即CYP704B2转基因的编码区第839位引入了一个A 到C的同义突变，从而产生了一个Stu I/Hae III切点；在第896位引入G 到C的同义突变，从而删除了一个XmnI的切点。酶切位点的引入和删除可帮助外源CYP704B2转基因作为育性恢复基因元件用于第三代杂交育制种技术中的载体的构建。两个SNP均位于1907中CYP704B2 基因(MSU Osa1Release 7Annotation，LOC_Os03g07250)的GGG 到T突变的200bp范围内，便于引物设计和产物检测。(见图1)。以遗传背景为中花11的1907(CYP704B2基因第794个碱基之后的3个G碱基替换为1个T碱基)不育突变体作为遗传转化受体材料，将携带外源CYP704B2转基因的载体，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻愈伤组织，利用潮霉素抗性筛选，经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例2一种鉴别转基因水稻中内、外源基因的PCR引物及方法

1、引物设计

根据9311基因组序列中野生型CYP704B2(SEQ ID NO.7所示) 和1907突变型CYP704B2基因序列与CYP704B2转基因序列(即实施例1所述的在编码区第839位和第896位分别引入A到C和G到C的SNP 的CYP704B2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)的差异，设计了三引物组合：

GY-1F:GTCGGGTTTGGGGTTGAGATC(SEQ ID NO.1)，

HF-1R:CGACGTGCAAGAACTTCCTG(SEQ ID NO.2)，

NY-1R:GTAACGATGATGTTGGCAGCGTAGTAT(SEQ ID NO.3)。

2、扩增片段分析

用上述引物组合对水稻材料进行扩增，不含外源基因的纯合突变基因型cyp704b2待测样品只出现一条90bp条带；不含外源基因的纯合野生基因型CYP704B2待测样品只出现一条92bp条带；不含外源基因的杂合基因型待测样品出现90bp和92bp两条带；含外源基因的纯合突变基因型cyp704b2测样品出现90bp和142bp两条带；含外源基因的纯合野生基因型CYP704B2待测样品出现92bp和142bp的两条带；含外源基因的杂合基因型待测样品若出现90bp、92bp和142bp的三条带。 90bp、92bp和142bp条带的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

实施例3用本发明分子标记鉴定转基因材料自交后代的基因型

1、实验材料

实施例1中获得的单拷贝转基因植株的T1代分离群体。

2、水稻基因组DNA的提取

采用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下：在苗期取3cm 长的水稻叶片，在800μL抽提缓冲液[1.5％(w/v)CTAB，1.05mol/L NaCl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/L EDTA(pH 8.0)] 中磨碎，收集到一个1.5mL离心管中。65℃水浴30min，间或颠倒混匀。加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24:1)，颠倒混匀15min。 12000r/min室温离心10min。吸上清450μL，转移到一个新的1.5mL离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后-20℃沉淀30min。12000r/min 离心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μL灭菌ddH₂O溶解DNA。

3、PCR扩增及检测

利用实施例2筛选得到的特异性引物组合(GY-1F，HY-1R， NY-1R)对本实施例所述材料的DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系为：Biomiga的2×BenchTop^TM Taq master mix 6μL，10μM的一个正向、两个反向引物各0.3μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH₂O 至10μL；

PCR反应条件为：94℃，3min；94℃，20s，61℃，25s，72℃， 35s，共35个循环；72℃，5min，20℃，1min。

扩增产物经10％PAGE胶电泳检测，电泳条件为：U＝2000V，I ＝200mA，P＝85W，电泳2h。电泳完成后用0.1％AgNO3染色，观片灯上观察拍照。

4、花粉碘染

取成熟小穗中的花药置于载玻片上夹破，滴碘-碘化钾溶液(0.6％ KI，0.3％I2)染色后，在普通台式显微镜下镜检。

5、结果与分析

如图2所示，2-6号泳道的5株T1代植株被区分为了两种基因型。其中1号泳道为对照1907突变体的带型，只扩增出一条90bp带。2-4号泳道只扩增出一条90bp带，表明这3株T1代植株只带有1907纯合突变基因。5-6号泳道扩增出了90bp和142bp两条带，表明这2株T1代植株同时带有1907突变基因和外源转基因。如图3所示，对照1907突变体不能形成正常的花粉(图3的A)，带有1907纯合突变基因的单株不能形成正常的花粉(图3的B)，同时带有1907突变基因和外源恢复基因的单株育性正常(图3的C)。

实施例4用本发明分子标记进行CYP704B2转基因和1907突变基因的转育

1、实验材料实施例1中获得的单拷贝T0转基因植株与两系不育系C815S的F2分离群体

2、水稻基因组DNA的提取参见实施例3的提取方法。

3、PCR扩增及检测

利用实施例2筛选得到的特异性引物组合(GY-1F，HY-1R，NY-1R)对本实施例所述材料的DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系和PCR反应条件、电泳条件均参见实施例3。

4、花粉碘染参见实施例3的提取方法。

5、结果与分析

如图4所示，4-9号泳道的6株F2植株被区分为了六种基因型。其中1号泳道为1907突变体的带型，2号泳道为1907杂合型植株的带型， 3号泳道为C815S的带型。4号泳道只扩增出一条90bp条带，表明该植株只带有1907纯合突变基因；7号泳道扩增出了90bp和142bp两条带，表明该植株同时带有1907突变基因和外源转基因；5号泳道扩增出 90bp和92bp条带，表明该植株带有1907突变基因和CYP704B2野生型基因；8号泳道植株扩增出了90bp、92bp和142bp三条带，表明该植株同时带有1907突变基因、CYP704B2野生型基因和外源转基因；6号泳道只扩增出一条92bp条带，表明该植株只带有CYP704B2野生型基因； 9号泳道扩增出了92bp和142bp两条带，表明该植株同时带有 CYP704B2野生型基因和外源恢复基因。这一结果表明本发明分子标记、引物组合在鉴别转基因水稻中内、外源基因的直观性和准确性。

对上述6个F2植株的花粉进行碘染观察。对照野生型中花11植株的花粉被碘-碘化钾溶液染成了黑色(图5的A)。与对照相比，4号泳道对应的植株花粉极少，不能染色(图5的B)，其它泳道对应的植株的花粉均能染色(图5的C-G)，说明凡带有外源CYP704B2转基因和/或内源野生型CYP704B2基因的植株花粉可育，凡只带有内源突变型 CYP704B2基因的植株花粉不育。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源基因的检测引物和方法

<130> KHP191114023.2

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcgggtttg gggttgagat c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgacgtgcaa gaacttcctg 20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaacgatga tgttggcagc gtagtat 27

<210> 4

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcgggtttg gggttgagat ctacgctgtc acctgatctc ccggagaaca gctttgccca 60

ggcatactac gctgccaaca tcatcgttac 90

<210> 5

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgggtttg gggttgagat cgggacgctg tcacctgatc tcccggagaa cagctttgcc 60

caggcatact acgctgccaa catcatcgtt ac 92

<210> 6

<211> 142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcgggtttg gggttgagat cgggacgctg tcacctgatc tcccggagaa cagctttgcc 60

caggccttcg acgctgccaa catcatcgtc acgctgcggt tcatcgatcc tctgtggcgt 120

ctcaggaagt tcttgcacgt cg 142

<210> 7

<211> 1930

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaagagcc ccatggagga agctcatgca atgccagtga catcattctt cccagtagca 60

ggaatccaca agctcatagc tatcttcctt gttgtcctct catggatctt ggtccacaag 120

tggagcctga ggaaccagaa agggccaaga tcatggccaa tcatcggcgc gacagtggag 180

caactgaaga actaccacag gatgcatgac tggcttgtcg agtacttgtc gaaggacagg 240

acggtgaccg tcgacatgcc tttcacctcc tacacctaca ttgccgaccc ggtgaacgtc 300

gagcatgtcc tgaagaccaa cttcaccaat taccccaagg taaaagaacc ataggatctt 360

cagtgtactg taaaatgtgc cttgcacagt actaacactg acacaaaaaa tgtctgaaaa 420

tatgcagggt gaagtgtaca ggtcttacat ggatgtgctg ctcggtgatg gcatattcaa 480

tgccgacggc gagatgtgga ggaagcaaag gaagacggcg agcttcgagt ttgcctccaa 540

gaacttgaga gacttcagca ctgtggtgtt cagggagtac tccctgaagc tatcaagcat 600

tctgagccaa gcatgcaagg ccggcagagt tgtagacatg caggtaacca actgaattcc 660

ttgcctaata cctaaacatt tcttgagaaa ccaaattgtt cagaattctg atgcaagaac 720

taaccaaaat tcaggaattg ttcatgagga tgacactgga ctcgatctgc aaggtcgggt 780

ttggggttga gatcgggacg ctgtcacctg atctcccgga gaacagcttt gcccaggcat 840

tcgacgctgc caacatcatc gtcacgctgc ggttcatcga tcctctgtgg cgtctgaaga 900

agttcttgca cgtcggatca gaggctctcc tcgagcagag catgaagctg gttgatgact 960

tcacctacag cgtgatccgc cgccgcaagg ctgagatctt gcaggctcga gccagcggca 1020

agcaagagaa ggtgatcctt cctctcttgc tcaaagaatc agtagaactg aactgacatg 1080

gtaatggtga tgatcagatc ggaaaaggtt ttgtttcttg atatcgttga tttgtaatgg 1140

cgagcagatc aagcacgaca tactgtcgcg gttcatcgag ctcggggagg ccggcggcga 1200

cgaggggggc ggcagcttcg gggacgacaa gagcctccgc gacgtggtgc tcaacttcgt 1260

gatcgccggg cgtgacacga cggcgacgac gctgtcgtgg ttcacgtaca tggcgatgac 1320

gcacccggcc gtcgccgaca agctccggcg cgagctggcc gcgttcgagg atgagcgcgc 1380

gcgcgaggag ggcgtcgcgc tcgccgacgc cgccggcgag gcgtcgttcg cggcgcgcgt 1440

ggcgcagttc gcgtcgctgc tgagctacga cgcggtgggg aagctggtgt acctgcacgc 1500

gtgcgtgacg gagacgctcc gcctctaccc ggcggtgccg caggacccca aggggatcgt 1560

ggaggacgac gtgctccccg acggcaccaa ggtgcgcgcc ggcgggatgg tgacgtacgt 1620

gccctactcc atggggagga tggagtacaa ctggggcccc gacgcggcga gcttccggcc 1680

ggagcggtgg ctcagcggcg acggcggcgc gttccggaac gcgtcgccgt tcaagttcac 1740

cgcgttccag gccgggccgc ggatctgcct cggcaaggac tccgcctacc tccagatgaa 1800

gatggcgctc gccatcctct tccgcttcta caccttcgac ctcgtcgagg accaccccgt 1860

caagtaccgg atgatgacca tcctctccat ggctcacggc ctcaaggtcc gcgtctccac 1920

ctccgtctga 1930

<210> 8

<211> 1930

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaagagcc ccatggagga agctcatgca atgccagtga catcattctt cccagtagca 60

ggaatccaca agctcatagc tatcttcctt gttgtcctct catggatctt ggtccacaag 120

tggagcctga ggaaccagaa agggccaaga tcatggccaa tcatcggcgc gacagtggag 180

caactgaaga actaccacag gatgcatgac tggcttgtcg agtacttgtc gaaggacagg 240

acggtgaccg tcgacatgcc tttcacctcc tacacctaca ttgccgaccc ggtgaacgtc 300

gagcatgtcc tgaagaccaa cttcaccaat taccccaagg taaaagaacc ataggatctt 360

cagtgtactg taaaatgtgc cttgcacagt actaacactg acacaaaaaa tgtctgaaaa 420

tatgcagggt gaagtctaca ggtcttacat ggatgtgctg ctcggtgatg gcatattcaa 480

tgccgacggc gagatgtgga ggaagcaaag gaagacggcg agcttcgagt ttgcctccaa 540

gaacttgaga gacttcagca ctgtggtgtt cagggagtac tccctgaagc tatcaagcat 600

tctgagccaa gcgtgcaagg ccggcagagt tgtagacatg caggtaacca actgatttcc 660

ttgcctaata tctaaacatt tcttgagaaa ccaaattgtt cagaattgtg atgcaagaac 720

taaccaaaat tcaggaattg ttcatgagga tgacactgga ctcgatctgc aaggtcgggt 780

ttggggttga gatcgggacg ctgtcacctg atctcccgga gaacagcttt gcccaggcct 840

tcgacgctgc caacatcatc gtcacgctgc ggttcatcga tcctctgtgg cgtctcaaga 900

agttcttgca cgtcggatca gaggctctcc tcgagcagag catgaagctg gttgatgact 960

tcacctacag cgtgatccgc cgccgcaagg ctgagatctt gcaggctcga gccagcggca 1020

agcaagagaa ggtgatcctt cctctcttgc tcaaagaatc agtagaactg aactgacatg 1080

gtaatggcga tgatcagatc ggaaaaggtt ttgtttcttg atatggttga tttgtaatgg 1140

cgagcagatc aagcacgaca tactgtcgcg gttcatcgag ctgggggagg ccggcggcga 1200

cgaggggggc ggcagcttcg gggacgacaa gagcctccgc gacgtggtgc tcaacttcgt 1260

gatcgccggg cgtgacacga cggcgacgac gctgtcgtgg ttcacgtaca tggcgatgac 1320

gcacccagcc gtcgccgaca agctccggcg cgagctggcc gcgttcgagg ctgagcgcgc 1380

gcgcgaggag ggcgtcgcgc tcgccgacgc cgccggcgag gcgtcattcg cggcgcgcgt 1440

ggcgcagttc gcgtcgctgc tgagctacga cgcggtgggg aagctggtgt acctgcacgc 1500

ctgcgtgacg gagacgctcc gcctctaccc ggcggtgccg caggacccca aggggatcgt 1560

ggaggacgac gtgctccccg acggcaccaa ggtgcgcgcc ggcgggatgg tgacgtacgt 1620

gccctactcg atggggagga tggagtacaa ctggggcccc gacgcggcga gcttccggcc 1680

ggagcggtgg ctcagcggcg acggcggcgc gttccgcaac gcctcgccgt tcaagttcac 1740

cgcgttccag gccgggccgc ggatctgcct cggcaaggac tccgcctacc tccagatgaa 1800

gatggcgctc gccatcctct tccgcttcta caccttcgac ctcgtcgagg accaccccgt 1860

caagtaccgg atgatgacca tcctctccat ggctcacggc ctcaaggtcc gcgtctccac 1920

ctccgtctga 1930

Claims

1.一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因的分子标记，其特征在于，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。

2.一种用于检测转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源CYP704B2基因的基因型的引物组合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。

3.含有权利要求2所述引物组合的试剂盒。

4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在作物育种或种质资源改良中的应用。

5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在鉴别转基因作物及其自交、杂交、回交后代中内源基因CYP704B2和外源基因CYP704B2及内、外源基因不同基因型组合中的应用。

6.权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的作物包括水稻、玉米、大豆、小麦、大麦、小米、高粱。

7.检测转基因材料CYP704B2基因型的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1-3所示的引物组合进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，根据电泳条带确定转基因材料的基因型。

8.鉴别转基因材料中内、外源CYP704B2基因的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1-3所示的引物组合进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，根据电泳条带大小确定转基因材料中的CYP704B2基因是内源还是外源基因。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，PCR的反应体系为：Biomiga的2×BenchTop^TM Taq master mix 6μL，10μM的一个正向、两个反向引物各0.3μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH₂O至10μL；

PCR反应条件为：94℃，3min；94℃、20s，61℃、25s，72℃、35s，共35个循环；接着72℃，5min，最后20℃，1min。

10.预测转基因植株花粉育性的方法，其特征在于，采用权利要求7-9任一所述的方法鉴定转基因植株中CYP704B2基因的基因型，凡带有外源CYP704B2基因和/或内源野生型CYP704B2基因的转基因植株花粉可育，凡只带有内源突变型CYP704B2基因的转基因植株花粉不育。