CN108998557A - 玉米隐性核雄性不育突变基因ms7的功能标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种玉米核雄性不育基因ms7的功能标记、功能标记开发方法及其应用。本发明根据突变体基因ms7的突变位点设计了包括但不限于ms7‑IN1、ms7‑IN2和ms7‑IN3等三个功能标记，其中ms7‑IN1能够特异性检测玉米突变体ms7‑6007及由其转育的玉米不育材料中的突变基因ms7，并能同时区分野生型Ms7基因和突变型ms7基因。功能标记ms7‑IN2为野生型Ms7基因特异的显性标记，ms7‑IN3为突变型ms7基因特异的显性标记。利用本发明设计的功能标记能够准确检测和标记玉米核雄性不育基因ms7或可育基因Ms7的等位基因型，可用于雄性不育株系的鉴定、目标单株的筛选，在玉米雄性不育系培育、不育化杂交制种和分子标记辅助选择中具有重要的应用价值，对提高玉米杂交育种和制种效率、保障制种质量等方面具有重要意义。

Description

玉米隐性核雄性不育突变基因ms7的功能标记及其应用
技术领域
一般地，本发明属于作物分子育种、分子生物学和基因工程领域。具体涉及一种玉米隐性核雄性不育基因ms7的功能标记、功能标记开发方法及与应用。
背景技术
植物雄性不育（male sterility, MS）是指在高等植物中，雄性器官发育异常，无法产生有功能的雄配子（花粉），但雌性器官发育正常，能接受正常雄配子而受精结实，并能将该不育性遗传给后代的现象。
玉米是重要的粮食作物，其雄性不育材料对玉米的雄花发育机理研究、遗传育种应用、杂种优势研究和应用方面都有重要价值。玉米雄性不育按照不育性遗传方式的差异，可分为3类：细胞质雄性不育、细胞核雄性不育和质核互作雄性不育，其中细胞核雄性不育还可分为显性核不育和隐性核不育，而且以后者为主。由于细胞质母体遗传的原因，细胞质不育基因的F1不能自交结实，因而不能在育种和生产上利用；利用常规杂交育种技术，细胞核雄性不育系的保持和繁殖存在困难，也不能在育种和生产上有效利用；质核互作不育基因，理论和实践上都可以被育种利用，但是该类基因的广泛利用会导致杂交种细胞质单一化，易受专一性病原小种的侵染而导致杂交玉米生产存在巨大的风险。因此，目前国内外玉米杂交育种的父母本大多是可育的自交系，杂交制种时需要对母本进行人工或机械除雄，大大增加了制种成本，同时杂交种纯度也难以得到保障。随着现代生物技术的快速发展，利用作物分子设计技术，并结合常规育种方法，有望将隐性核不育基因有效利用起来。为了能够使核不育基因得到育种利用，必须找到核不育后代早期诊断不育性的标记性状从而尽早区分核不育系。因此，从发现玉米隐性核不育材料时起，人们就利用传统育种技术途径，对核不育基因进行了多种标记性状的探索研究，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒色标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试在玉米生产上并没有得到推广应用。分子标记，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，狭义的分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特定DNA片段。随着分子标记技术的发展，通过定位克隆获得与玉米重要性状连锁的分子标记或者功能性共分离分子标记，对玉米的基因型鉴定、品种的遗传背景选择、目标单株筛选、品种的遗传改良和纯度鉴定以及克隆雄性器官分化控制基因等方面有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组能够准确检测和标记玉米隐性核雄性不育基因ms7的分子标记，所提供的分子标记是根据不育突变体ms7-6007的基因突变位点设计，与不育基因ms7共分离，属于功能性共分离分子标记，可用于植株的育性等位基因鉴定、分子标记辅助育种中目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。
本发明的目的之一：在于提供一种由于育性相关基因Ms7突变获得的完全雄性不育材料ms7-6007。
本发明的目的之二：在于提供突变材料ms7-6007的基因突变位点。具体的，其基因突变位点主要包含：（1）+22位点处插入CGA三个碱基；（2）+814位点处插入GCTGCTG七个碱基；（3）在+963位点，有TGTGCAACGCGAACTAC等17个碱基的缺失；（4）在+1426位点处出现终止密码子TAA，基因编码提前终止。
本发明的目的之三：在于提供根据上述ms7突变位点开发ms7功能性分子标记的方法。
本发明的目的之四：在于提供根据上述突变位点开发的一组功能性分子标记，包括但不限于ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3。功能标记ms7-IN1能同时检测突变等位基因ms7和野生型等位基因Ms7，而ms7-IN2和ms7-IN3分别是野生型Ms7基因和突变型ms7基因的特异标记。
进一步地，开发的分子标记ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3以及其它类似的功能性共分离标记包括但不限于以下5条引物序列：
ms7-IN-1F：GGCGACCTCCAGGGGCCACC
ms7-IN-1R：ATCCCAGAGGTCCATGATCTGC
ms7-IN-WF：GTGTGCAACGCGAACTACTG
ms7-IN-2R：GTAGTCCATGGCGGTGACGGAG
ms7-IN-MF：CCACCTGCTGGCTGCTGCAC
其中正向引物序列ms7-IN-1F设计在突变型ms7基因在+814位点插入序列的上游，反向引物序列ms7-IN-1R设计在此插入序列的下游。因此，ms7-IN1从野生型Ms7基因扩增出的条带比从突变型ms7基因中扩增出条带短7bp，分别为130bp和137bp。
正向引物ms7-IN-WF设计在野生型Ms7基因的+963位点处，突变型ms7基因在此位点有17个碱基的缺失，ms7-IN-WF针对突变型ms7基因的缺失序列设计，因此为野生型Ms7基因的特异引物。正向引物ms7-IN-MF针对ms7在+814位点处的插入序列设计，为突变ms7基因的特异引物。ms7-IN-WF/ms7-IN-2R和ms7-IN-MF/ms7-IN-2R分别只能从野生型Ms7基因和突变型ms7基因中扩增出453bp和584bp的条带。
本发明的目的之五：在于提供一种利用上述突变材料开发和选择不同遗传背景下的玉米雄性不育材料的方法。具体的，利用带有上述突变基因ms7的材料做母本，不同优良遗传背景的自交系作为父本，杂交后代与父本自交系连续回交多代，每次回交之前用标记选择带有ms7基因的单株，以获得不同遗传背景下的玉米ms7雄性不育材料，提高杂种优势的利用范围。
本发明的目的之六：在于在开发和选择不同遗传背景下ms7雄性不育材料过程中，利用上述开发的分子标记进行分子标记辅助选择，加快玉米不育材料的选育进程和提高选择效率。
本发明的目的之七：在于利用上述开发的分子标记在上一批种子收获后或下一代苗期快速检测玉米ms7等位基因，筛选特定ms7雄性不育单株。
本发明的目的之八：在于上述开发的功能性分子标记在玉米ms7雄性不育亲本纯度鉴定中的应用，以及检测玉米杂交种是否带有ms7不育等位基因，以判断杂交种的纯度。
附图说明
图1为玉米Ms7野生型（左）和ms7突变体ms7-6007（右）的雄穗、小花（花药）表型比较图及花粉碘-碘化钾染色对比图。
图2为玉米Ms7野生型和ms7-6007突变型基因的结构示意图。ms7-6007的突变基因在+22位点处插入CGA三个碱基；在+814位点处插入GCTGCTG七个碱基；在+963位点有17个碱基的缺失；在+1426位点处，出现终止密码子TAA，基因编码提前终止。
图3为本发明中开发的分子标记ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3涉及到的5条引物在Ms7基因中的位置示意图（3A）、5条引物在玉米Ms7与ms7 DNA序列比对图中的具体位置标识（3B）以及各标记名称对应的引物序列及扩增产物大小（3C）。
图4为分子标记ms7-IN1的可行性验证。利用Ms7/Ms7纯合野生型（B73）、Ms7/ms7杂合型（H）和ms7/ms7纯合突变型材料（S）进行功能性分子标记ms7-IN1的多态性验证。ms7-IN1在Ms7/Ms7纯合野生型（B73）DNA中能够扩增出130bp的条带，在ms7/ms7纯合突变型材料（S）DNA中能够扩增出137bp的条带，而在Ms7/ms7杂合型（H）材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。
图5为分子标记ms7-IN2和ms7-IN3的可行性验证。利用Ms7/Ms7纯合野生型（B73）、Ms7/ms7杂合型（H）和ms7/ms7纯合突变型材料（S）进行功能性分子标记ms7-IN2和ms7-IN3的多态性验证。ms7-IN2只能在Ms7/Ms7纯合野生型（B73）DNA中能够扩增出453bp的条带，ms7-IN3只能在ms7/ms7纯合突变型材料（S）DNA中能够扩增出584bp的条带，而在Ms7/ms7杂合型（H）材料中，ms7-IN2和ms7-IN3都能扩增出对应的条带。
图6为利用分子标记ms7-IN1对ms7的杂合型材料Ms7ms7自交获得的F2群体的Ms7等位基因进行检测的部分电泳结果。图示中，8个材料的DNA中只能扩增出130bp的条带，为纯合可育系（Ms7/Ms7），标记为F；6个材料的DNA中只能扩增出137bp的条带，为纯合不育系（ms7/ms7），标记为S；14个材料的DNA中能同时扩增出130bp和137bp的条带，为杂合可育型（Ms7/ms7）材料，标记为H。经过后期育性鉴定发现，在苗期基因型鉴定为纯合不育的材料检测为完全雄性不育，而其它材料的植株都雄性可育，与基因型鉴定结果一致，证明共分离标记的有效性。
图7为利用分子标记ms7-IN2与ms7-IN3对杂合可育株（基因型Ms7/ms7）自交F2群体部分材料在苗期进行Ms7等位基因的检测结果。其中，每个材料基因组DNA的扩增结果都分别用ms7-IN2与ms7-IN3两个分子标记进行检测，电泳图的左侧泳道为ms7-IN2的扩增结果，右侧为ms7-IN3的扩增结果。只能扩增出584bp条带的材料为纯合不育系（ms7/ms7），标记为S；只能扩增出453bp的材料为纯合可育系（Ms7/Ms7），标记为F；两条带都能扩增出的材料为杂合可育型（Ms7/ms7），标记为H。在苗期分子标记检测为不育的材料在后期育性检测中表现为完全雄性不育，与苗期基因型鉴定结果一致。
图8为利用分子标记辅助选择的方法通过回交转育创制新遗传背景的玉米ms7核雄性不育系的过程示意图。
图9为利用分子标记ms7-IN1检测回交转育过程中带有ms7突变等位基因材料（Ms7/ms7）的部分结果。本发明中，使用开发的分子标记ms7-IN1进行了验证。检测到材料2、4、5、7、9、10、13、15、17、18、21含有ms7等位基因，为带有ms7的杂合型材料(Ms7/ms7)。
图10为利用开发的功能标记进行ms7不育系种子纯度鉴定的部分材料的检测结果。利用本发明开发的功能标记ms7-IN1对每一个材料进行检测，其中，箭头标记的3、4、10、15、和24号材料中都检测到130bp的Ms7基因的特异条带，为不育系（ms7/ms7）种子中混入的杂合型可育种子（Ms7/ms7）。
具体实施方式
下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：获得玉米雄性不育突变材料
本发明的供试材料是玉米正常可育自交系的Ms7基因突变获得的不育株，表现为完全无花粉型雄性不育，如图1所示，其表现具体为：花药变小、发白、花粉不能被碘-碘化钾染色。该不育系材料命名为ms7-6007。
实施例2：ms7突变位点分析及其功能标记的开发
雄性不育材料ms7-6007是Ms7位点突变所致。如图2所示，ms7-6007的突变基因在+22位点处插入CGA三个碱基；在+814位点处插入GCTGCTG七个碱基；在+963位点有17个碱基的缺失；在+1426位点处，出现终止密码子TAA，基因编码提前终止。
根据突变体ms7-6007的突变基因ms7插入碱基的位置，利用引物设计软件，可开发出一系列针对野生型Ms7和突变型ms7基因的特异的功能性共分离分子标记。例如，引物序列设计在突变体插入序列的两侧，从野生型Ms7基因和突变型ms7基因中扩增的条带大小不同，可以同时检测野生型Ms7基因和突变型ms7基因。引物序列针对突变体的插入序列或缺失序列设计，可分别作为突变型ms7基因和野生型Ms7基因的特异标记。
实施例3：功能标记ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3的开发
在本发明中，针对ms7突变位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出三对功能性分子标记：ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3。其中ms7-IN1的正向引物和反向引物分别设计在突变型ms7基因在+814位点的7个碱基插入序列的上、下游，因此，ms7-IN1从野生型Ms7基因扩增出的条带比从突变型ms7基因中扩增出条带短7bp，分别为130bp和137bp。
ms7-IN2的正向引物ms7-IN-WF设计在野生型Ms7基因的+963位点处，突变型ms7基因在此位点有17个碱基的缺失，ms7-IN-WF针对突变型ms7基因的缺失序列设计，因此为野生型Ms7基因的特异引物。ms7-IN3的正向引物ms7-IN-MF针对 ms7在+814位点处的插入序列设计，为突变ms7基因的特异引物。ms7-IN-WF/ms7-IN-2R和ms7-IN-MF/ms7-IN-2R分别只能从野生型Ms7基因和突变型ms7基因中扩增出453bp和584bp的条带。
开发的三对功能性标记ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3的扩增引物的位置示意图如图3A所示，各个标记的扩增引物在Ms7和ms7基因比对序列中对应的具体位置如图3B所示，各标记名称对应的引物序列及扩增产物大小如图3C所示。
突变体功能标记ms7-IN1包括第一引物ms7-IN-1F和第二引物ms7-IN-1R，能够在ms7-6007突变基因ms7中扩增出137bp的条带，而在野生型Ms7基因中扩增出130bp的条带：
ms7-IN-1F：ACGAGCTGATCCAAGGGTAC
ms7-IN-1R：CGTCTCCTCGAACCCTGTAA
突变体功能标记ms7-IN2包括第一引物ms7-IN-WF和第二引物ms7-IN-2R，能够在野生型Ms7基因中扩增出453bp的条带，而在ms7-6007突变基因ms7中无扩增产物：
ms7-IN-WF：AATTGCCCAGCGACTACCGT
ms7-IN-2R：CAGTGCTAAAGGCCATTGAAAA
突变体功能标记ms7-IN3包括第一引物ms7-IN-MF和第二引物ms7-IN-2R，能够在ms7- 6007突变基因ms7中扩增出584bp的条带，而在野生型Ms7基因中无扩增产物：
ms7-IN-MF：AATTGCCCAGCGACTACCGT
ms7-IN-2R：CAGTGCTAAAGGCCATTGAAAA
开发的三个功能标记ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3在Ms7纯合可育株（基因型Ms7/Ms7）、杂合可育株（基因型Ms7/ms7）和纯合不育株（基因型ms7/ms7）基因组DNA的Ms7等位基因位点扩增的条带大小总结如下（表1）。利用PCR和琼脂糖凝胶电泳检测以及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的方法，根据获得的条带及大小情况即可判断Ms7位点等位基因的情况。
表1. 五个功能标记扩增的条带大小总结
Ms7/Ms7 Ms7/ms7 ms7/ms7
Ms7-IN1 130bp 130bp/137bp 137bp
Ms7-IN2 453bp 453bp -
Ms7-IN3 - 584bp 584bp
实施例4：功能标记ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3的可行性验证
验证开发的三个功能标记所用的试验材料包括：纯合ms7突变材料ms7-6007（ms7ms7）、以ms7-6007（母本）×B73（父本）获得的杂交F1代（Ms7ms7）、纯合野生型材料B73（Ms7Ms7）。利用ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3三个功能标记分别对上述材料进行Ms7等位基因的检测。
其中，玉米叶片DNA提取方法如下。1）剪取适量叶片并剪碎，放入事先写好编号的2.0ml离心管中，加入一颗钢珠。2）按顺序将已放入叶片和钢珠的离心管摆放在打样仪专用的离心管架（8×5）上，整体浸泡在盛有液氮的保鲜盒中1-2min（注：液氮以刚没过离心管架少许为宜）。3）将冷冻好的离心管架放入打样仪（Thmorgan cell killer ck-1000）的卡槽中，拧紧，关盖，1200转/min的速度打样20s。4）用吸铁石吸出离心管中的钢珠。5）加入700μLCTAB提取液（65℃预热），65℃水浴30min，中间取出颠倒1-2次。6）加入700μL氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀，小心标记不要被擦掉（注：氯仿为腐蚀性试剂，需要带PE一次性手套在通风橱中操作）。7）12000 rpm离心5min至清晰分相。吸取上清液400μL，转入新的1.5mL微量离心管中（预先加入800μl预冷的无水乙醇），弃枪头，盖紧盖子，写好编号并检查无误，上下颠倒混匀。-20℃冰箱中放置30min。8）12000 rpm离心10min至沉淀附于离心管底部，弃上清液。9）70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5mL微量离心管倒置于平铺于桌上的纸上，自然干燥。10）加入100-200μL的1×TE缓冲液或ddH2O溶解沉淀。11）样品置于-20℃冰箱中保存备用。
利用设计的引物对所获得的DNA进行PCR扩增，方法和程序如下：1）先打开制冰机的水源开关，再打开制冰机的电源开关，制冰。2）将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：PCR缓冲液、dNTP溶液、正反向引物溶液以及模板DNA（注：当某一试剂完全解冻，即放置于冰上。经常用的ddH2O、引物工作液、模板DNA 以及少量PCR缓冲液、dNTP溶液可放于4℃冰箱中）。3）所有试剂解冻完毕后，8000 rpm离心数秒，放回冰上待用。4）配制PCR反应的混合液，按照下表依次加入各试剂（反应体系为10μL）。下表2同时列出了1个反应（1R´）、10个反应（10R´）、50个反应（50R´）、100个反应（100R´）的混合液配方。配好后将所有试剂放回4℃或-20℃冰箱（注：Taq聚合酶需小心操作，临用前从-20℃冰箱中取出，用时需置于冰上，用完后立即放回-20℃冰箱中）。5）混匀，8000 rpm离心数秒。6）将混合液分装至200μL PCR反应管中，再加入1μL模板DNA，做好标记（注：如果不使用热盖功能，为防止样品蒸干，需最后加入约20μL石蜡油或盖上PCR管盖）。7）将PCR反应板（管）插入PCR扩增仪的200μL 孔中，合上热盖，旋紧。8）打开PCR扩增仪电源开关，选择预设的反应程序（如表3），开始扩增。9）扩增完后，退出反应程序，回到主菜单，关闭电源开关。打开热盖，取出PCR反应管，置于PCR管架上，放入4℃冰箱中，待用。
表2. PCR反应体系
表3. PCR扩增条件
理论上，ms7-IN1在Ms7/Ms7纯合野生型（B73）DNA中能扩增出130bp的条带，在ms7/ms7纯合突变型材料（S）DNA中能扩增出137bp的条带，而在Ms7/ms7杂合型（H）材料中，则能同时扩增出对应的两条条带。ms7-IN1的验证结果如图4所示。可见，功能性分子标记ms7-IN1的扩增结果完全符合预期，在Ms7/Ms7纯合野生型（B73）、Ms7/ms7杂合型（H）和ms7/ms7纯合突变型材料（S）中分别扩增出对应大小的条带，可以作为Ms7、ms7等位基因检测的理想标记。
ms7-IN2为Ms7基因的显性标记，能够在Ms7/Ms7纯合野生型（B73）和Ms7/ms7杂合型（H）材料中扩增出453bp的条带，而在ms7/ms7纯合突变型材料（S）中无扩增产物。ms7-IN3为ms7基因的显性标记，能够在ms7/ms7纯合不育型（S）和Ms7/ms7杂合型（H）材料中扩增出584bp的条带，而在Ms7/Ms7纯合野生型（B73）中无扩增产物。ms7-IN2和ms7-IN3等两个功能性分子标记的验证结果如图5所示，可见，和预期一致，功能性分子标记ms7-IN2在Ms7/Ms7纯合野生型（B73）中可扩增出453bp的条带，在ms30/ms30纯合突变型材料（S）中没有产物；功能性分子标记ms7-IN3在ms30/ms30纯合突变型材料（S）中可扩增出584bp的条带，在Ms7/ Ms7纯合野生型（B73）材料中没有产物；二者在Ms7/ms7杂合型（H）材料中都能够扩增出对应的条带。因此，ms7-IN2和ms7-IN3可以作为Ms30、ms30等位基因检测的理想标记。
实施例5：利用功能标记ms30-IN1在苗期鉴定Ms7位点的纯合野生型、杂合型和纯合不育系材料
将ms7的杂合型材料Ms7/ms7自交，理论上可获得分离比为1:2:1的Ms7/Ms7、Ms7/ms7和ms7/ms7单株，其中ms7/ms7为纯合隐性不育系。本发明利用功能性分子标记ms7-IN1对上述材料在苗期进行了基因型鉴定。
对杂合型Ms7/ms7自交获得的F2群体取叶片提取基因组DNA，利用诊断标记ms7-IN1对395份材料进行了PCR鉴定，部分材料的鉴定结果如图6所示，其中将鉴定出的纯合可育材料标记为F，纯合不育材料标记为S，杂合材料标记为H。统计结果发现Ms7/Ms7、Ms7/ms7和ms7/ms7分离比为94:203:98，卡方检验结果X2=0.195，P=0.9017，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms7/Ms7、Ms7/ms7和ms7/ms7分离比符合1：2：1的规律。而且，后期育性检测表明，标记为S的材料的植株表现为完全雄性不育，标记为F和H的植株在后期表现为可育，其表型与苗期基因型检测完全一致。
实施例6：利用功能标记ms7-IN2和ms7-IN3在苗期鉴定Ms7位点的纯合野生型、杂合型和纯合不育系材料
将ms7的杂合型材料Ms7/ms7自交，理论上可获得分离比为1:2:1的Ms7/Ms7、Ms7/ms7和ms7/ms7单株，其中ms7/ms7为纯合隐性不育系。本发明分别利用功能性分子标记ms7-IN2与ms7-IN3对上述材料在苗期进行了基因型鉴定。
杂合型Ms7/ms7自交获得F2群体。取叶片提取基因组DNA，利用诊断标记ms7-IN2与ms7-IN3对544份材料进行了PCR鉴定，图7为部分材料的鉴定结果，只有ms7-IN2标记扩增产物的材料为纯合可育系，标记为F，只有ms7-IN3标记扩增产物的材料为纯合不育系，标记为S，两个标记都能扩增出相应条带的材料为杂合可育系，标记为H。结果，标记鉴定为Ms7/ Ms7、Ms7/ms7和ms7/ms7的材料分别为151:280:113，卡方检验结果X2=3.024，P=0.2205，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms7/Ms7、Ms7/ms7和ms7/ms7分离比符合1：2：1规律。而且，标记为S的单株在后期育性检测中表现为完全雄性不育，标记为F和H的单株在后期表现为可育。
实施例7：利用ms7-IN1进行分子标记辅助选择
利用所述玉米核雄性不育突变材料，培育不同遗传背景下的优良不育系，具体方法如下：以具有玉米隐性核雄性不育基因ms7的玉米材料为母本，以不同遗传背景材料为父本进行杂交，杂交F1代（Ms7/ms7）与父本材料（Ms7/Ms7）进行回交，每一轮回交都利用上述开发的功能标记ms7-IN1选择带有ms7基因的后代进行回交，重复回交4-5次后，可获得既带有ms7基因同时又具有轮回亲本遗传背景的新材料（Ms7/ms7），再进行自交一次，利用功能标记ms7-IN1或ms7-IN3结合表型选择ms7纯合不育系，即可获得新的遗传背景下的ms7核雄性不育系（回交转育示意图如图8所示）。
本发明利用918份优良玉米自交系与不育系ms7/ms7进行杂交，获得的杂交一代Ms7/ms7继续与相应的优良自交系回交。本发明中检测了回交1代BC1F1（包含Ms7/ms7和Ms7/Ms7两种基因型）中186份材料，并利用本发明开发的ms7特异性功能标记ms7-IN1进行了检测。ms7-IN1在Ms7和ms7等位基因中可分别扩增出130bp和137bp的条带。本实施例获得的部分代表结果如图9所示。其中，两条带都能检测到的是带有ms7的杂合可育株Ms7/ms7，只能检测到分子量较小的一条带的是纯合可育株Ms7/Ms7。结果，对检测的186份材料的结果进行数据分析，Ms7ms7和Ms7/Ms7分离比为103:83。卡方检验X2=1.078，P=0.2992，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms7/ms7与Ms7/Ms7分离比符合1：1规律。
实施例8：利用功能标记ms7-IN1进行玉米不育系材料的纯度鉴定
不育系种子中混入可育材料会严重降低杂交制种获得的杂交种纯度。本发明利用开发的ms7功能标记ms7-IN1在苗期对每一个材料进行检测，纯合不育系ms7/ms7只能扩增出137bp的产物，而杂合型可育材料会另外多扩增出一条130bp的Ms7标记产物。部分结果如图10所示。其中，箭头标记的3、4、10、15和24号材料为检出的不育系ms7/ms7中混杂的杂合型Ms7/ms7种子，在这些材料中，分子标记ms7-IN1除了检测出137bp的ms7特征条带，还检测出了130bp的Ms7基因的特征条带。本实施例中共检测了189份不育系种子，检出混入的杂合型可育种子17份，表明该功能标记在种子纯度鉴定中具有重要应用价值。
总之，本发明开发的分子标记为玉米核雄性不育基因ms7的功能性分子标记，结合野生型基因Ms7的分子标记可快速检测Ms7等位基因情况。在回交转育过程中，利用分子标记辅助选择可在苗期直接检测出带有ms7基因的株系，快速筛选到目标单株，以加速回交转育进程，在利用分子标记辅助选择进行杂交种不育化制种中具有重要的应用价值。此外，开发的分子标记还可应用于杂交种不育亲本的纯度鉴定。
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序列表
<110> 北京科技大学
北京首佳利华科技有限公司
<120> 玉米隐性核雄性不育突变基因ms7的功能标记及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcccagagg tccatgatct gc 22
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<212> DNA
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<212> DNA
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gtagtccatg gcggtgacgg ag 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccacctgctg gctgctgcac 20

Claims (11)

1.一种玉米核雄性不育突变体ms7的功能标记ms7-IN1，其特征在于，所述功能标记包括但不限于第一引物ms7-IN-1F和第二引物ms7-IN-1R：
ms7-IN-1F：atcccagaggtccatgatctgc
ms7-IN-1R：ggcgacctccaggggccacc。
2.一种玉米核雄性不育突变体ms7的功能标记ms7-IN2，其特征在于，所述功能标记包括但不限于第一引物ms7-IN-WF和第二引物ms7-IN-2R：
ms7-IN-WF：gtgtgcaacgcgaactactg
ms7-IN-2R：gtagtccatggcggtgacggag。
3.一种玉米核雄性不育突变体ms7的功能标记ms7-IN3，其特征在于，所述功能标记包括但不限于第一引物ms7-IN-MF和第二引物ms7-IN-2R：
ms7-IN-MF：ccacctgctggctgctgcac
ms7-IN-2R：gtagtccatggcggtgacggag。
4.权利要求1、2和3所述的功能标记，是根据一种玉米核雄性不育突变体ms7-6007的突变基因ms7的突变位点设计，是功能性分子标记，其中权利要求1所述的分子标记，能够同时检测Ms7和ms7等位基因，权利要求2所述的分子标记，为野生型Ms7基因的特异性标记，权利要求3所述的分子标记，为突变型ms7基因的特异性标记。
5.权利要求4所述的核雄性不育突变体ms7-6007，其特征在于，其突变基因ms7位于玉米第7号染色体，对应的野生型可育基因Ms7与花粉发育过程中绒毡层细胞及小孢子细胞壁的发育有关，其突变导致雄花败育。
6.与权利要求1、2和3类似的，根据本发明中的Ms7基因的突变位点设计的其它与Ms7基因共分离的功能标记及开发Ms7功能标记的方法。
7.权利要求1、2、3和6所述的玉米雄性发育相关基因Ms7和突变基因ms7的分子标记分别在检测野生型Ms7和突变基因ms7中的作用。
8.权利要求1、2、3和6所述玉米雄性发育相关突变基因ms7的分子标记和权利要求5所述玉米核雄性不育基因ms7在玉米不育系育种和制种中的应用。
9.权利要求1、2、3和6所述玉米雄性发育相关突变基因ms7的分子标记应用于培育新的遗传背景下的玉米核雄性不育新品系的方法，其特征在于，以具有玉米核雄性不育基因ms7的玉米材料为母本，以其它优良性状玉米自交系为父本，通过杂交并经过多轮回交的方法获得新遗传背景下的玉米核雄性不育系，利用权利要求1、3或4中所述的分子标记，在回交后代中选择同时具有玉米核雄性不育基因ms7、并且具有轮回亲本遗传背景的植株，经过多轮回交，最后通过自交和分子标记辅助筛选获得目标遗传背景下的ms7/ms7纯合隐性不育系，并利用该不育系与父本杂交培育玉米新品种。
10.权利要求1、2、3和6所述玉米雄性发育相关突变基因ms7的分子标记在快速检测玉米核不育基因ms7的等位基因中的应用。
11.权利要求1、2、3和6所述玉米雄性发育相关突变基因ms7的分子标记在玉米亲本纯度鉴定中的应用。
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