CN116286851A - 玉米隐性核不育ms13-6060突变体序列及其分子鉴定方法和应用 - Google Patents

玉米隐性核不育ms13-6060突变体序列及其分子鉴定方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种玉米Ms13基因突变体序列、分子鉴定方法及其应用。Ms13基因编码一种ABCG转运蛋白，ms13‑6060突变体中Ms13等位基因的突变位点发生在第4外显子上，由于3个核苷酸（ATA）的缺失导致一个氨基酸（I311）缺失，进而导致其编码蛋白的ATP酶活性丧失。根据突变体与野生型的DNA序列差异，开发设计了ms13‑ 6060突变体的功能标记和鉴定方法。ms13‑6060隐性纯合突变体完全雄性不育，不产生花粉粒，在玉米杂种优势利用和不育化杂交制种过程中具有重要理论和应用价值。

Description

玉米隐性核不育ms13-6060突变体序列及其分子鉴定方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种玉米ms13-6060突变体及其分子鉴定方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
植物雄性器官发育在植物生长发育和繁殖过程中发挥着重要作用，花药在发育过程中经历造孢细胞到成熟生殖细胞等十几个复杂的过程，在其中任何一个阶段出现异常都可能导致雄性不育。雄性不育材料对深入解析花粉发育的细胞学和分子机制发挥重要作用，并且在杂交制种过程中提高制种质量和提高制种效率方面发挥重要的作用。
玉米是杂交种应用最广泛，杂种优势利用最成功的作物。玉米杂种一代综合农艺性状、抗旱耐涝等抗性能力以及光合作用强度等方面，都比亲本优越得多，产量也大大提高。在常规杂交种制种过程中，需要经过人工去雄的过程，不仅耗费大量的人力物力和财力，还容易对植株造成机械损伤，并且去雄不彻底会有假杂种出现。玉米雄性不育系的出现，可以省去人工去雄的环节，使制种成本大大降低，提高玉米产量。雄性不育系是研究玉米花粉和花药发育以及作物杂种优势利用和杂交制种的重要材料。目前，国内外利用化学诱变、基因编辑等手段获得大量的雄性不育系。
本发明是以玉米自交系Mo17和雄性不育突变体ms13-6060为材料，通过精细定位和图位克隆等手段鉴定了一个控制玉米雄花育性的Ms13基因，并深入解析了该突变体败育的细胞学机制，为解析玉米雄花发育的分子机制研究提供了有重要价值的遗传材料，并对玉米杂种优势利用，提供优异的基因和种质资源。
发明内容
本发明提供了一种玉米Ms13基因突变体ms13-6060及其分子鉴定方法和应用。
本发明第一个目的是：提供一种由于育性相关基因Ms13的突变获得的完全雄性不育材料ms13-6060。
本发明第二个目的是：提供这种突变材料的ms13-6060基因序列（SEQ ID NO.1），cDNA序列（SEQ ID NO.2）和氨基酸序列（SEQ ID NO.3）。
本发明的第三个发明目的是：鉴定一个导致MS13蛋白ATP酶活性降低的关键核苷酸位点（I311）。
本发明的第四个目的是：提供根据上述ms13-6060突变位点开发ms13-6060突变基因的功能性分子标记的方法。
本发明第五个目的是：提供根据上述突变位点开发的一组功能性分子标记，包括但不限于ms13-IN1标记。
进一步地，开发的分子标记ms13-IN1以及其它类似的功能性共分离标记包括但不限于以下2条引物序列：
ms13-IN-1F：CAACCCGTCGGACCATTTC
ms13-IN-1R：ACCTTTCGAACCTCGCCTTC
本发明第六个目的是：提供根据上述基因Ms13其它位点突变获得的雄性不育材料开发的功能性分子标记。
本发明第七个目的是：提供一种利用上述突变材料或利用包括但不限于诱变或基因编辑等技术获得的ZmMs13基因突变的材料开发和选择不同遗传背景下的玉米雄性不育材料的方法。具体的，利用带有上述突变基因ms13-6060的材料做母本，不同优良遗传背景的自交系作为父本，杂交后代与父本自交系连续回交多代，每次回交之前用标记选择带有ms13-6060基因位点的单株，以获得不同遗传背景下的玉米ms13雄性不育材料，提高玉米的杂种优势利用效率。
本发明第八个目的是：在开发和选择不同遗传背景ms13-6060雄性不育材料过程中，利用上述开发的分子标记进行分子标记辅助选择，加快玉米不育材料的选育进程和提高选育效率。
本发明第九个目的是：利用上述开发的分子标记在上一批种子收获后或下一代苗期快速检测玉米Ms13等位基因，筛选特定ms13-6060雄性不育单株。
附图说明
图1为玉米WT和ms13-6060突变体的表型
A和B，野生型（WT）和突变体（ms13-6060）的植株表型；C和D，野生型（WT）和突变体（ms13-6060）的雄穗表型；E和F，野生型（WT）和突变体（ms13-6060）的花药表型；G和H野生型（WT）和突变体（ms13-6060）的花药I2-KI染色表型。标尺=20cm（A-D），1mm（E-F），500μm（G-H）。
图2为WT和ms13-6060突变体S5-S13时期花药的半薄切片分析
玉米WT(A-E, K-O)及ms13突变体(F-J, P-T)不同发育时期（stage 5-13）花药的半薄切片分析。CMsp, 降解的小孢子；Dy，二分体细胞；E，上皮；En，内皮；ML，中间层；MMC，小孢子母细胞；MP，成熟花粉粒；Msp，小孢子；Sp, 造孢细胞；T，绒毡层；Tds，四分体。比例尺=50μm。
图3为玉米Ms13基因的精细定位和图位克隆
A，不育ms13群体DNA与可育群体DNA的多态性分子标记的分离比；B，F2群体中48个雄性不育株和48个雄性可育株用于玉米Ms13基因的初定位，初步将ms13基因定位于5号染色体SSR标记 umc1705和bnlg557之间；C，ms13基因精细定位于SSR标记 M3和M5之间约375.6kb的区间；D，精细定位区间内预测的8个基因模型；E，区间内8个候选基因通过玉米花药RNA-Seq数据进行表达谱分析，其中Zm00001d013960在S5、S8b和S10期的花药中有表达峰，其它基因表达量很低或没有明显的表达峰。
图4为WT和ms13-6060玉米中Zm00001d013960基因的氨基酸序列分析
玉米ms13-6060突变体在+1393位置缺失3个碱基（ATA），导致第312个氨基酸（I）缺失。
图5为玉米Ms13基因的表达模式分析
图6为WT和ms13-6060中MS13蛋白ATP酶活性分析
图7为ms13-6060突变基因的分子标记开发
图8为利用分子标记ms13-IN1对ms13-6060姊妹交材料ms13-6060/ms13-6060×Ms13/ms13-6060的后代中Ms13等位基因的电泳检测
图9为利用分子标记辅助选择的方法对回交转育创制新遗传背景的玉米ms13- 6060不育系的过程示意图。
具体实施方式
下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由睿博兴科生物技术有限公司份有限公司完成。其它生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：ms13-6060玉米雄性不育突变体的获得、表型描述
玉米雄性不育突变体ms13-6060是本专利申请人北京科技大学和北京首佳利华科技有限公司发明人从玉米遗传资源库（http://maizecoop.cropsci.uiuc.edu/）中获得。突变体ms13-6060的营养生长没有表现出明显差异，后期雄穗干枯，花药表现为变小、萎缩、呈棕褐色，不能生成成熟的花粉粒（图1）。
以自交系Mo17为父本与突变体ms13杂交，F1代育性正常，F2代出现育性分离，如表1所示，F2群体中正常可育株（F）与不育株（S）的分离符合单基因3:1的分离比，即突变体的雄性不育表型表现为明显的单基因隐性遗传。
Figure SMS_1
实施例2：玉米不同发育时期花药的半薄切片观察
1、玉米花药的取样
从野生型和ms13-6060突变体处于不同发育阶段的雄穗中，收集不同长度的花药样品；每份样品采集20个长度相近的新鲜花药，其中3个固定在FAA溶液中（Coolaber，中国），通过树脂半薄切片实验确定具体的发育时期，其余17个花药立即冷冻在液氮中，用于RNA的提取。
2、发育时期的鉴定
利用梯度乙醇（50%、70%、90%、100%）对用于树脂切片的固定花药进行脱水，每步15-30分钟。脱水过程中花药可置于70%乙醇中长期保存；为便于后期包埋，可在90%乙醇中加入0.1%的伊红对材料进行染色；为保证脱水彻底，材料须在无水乙醇中脱水2-3次。随后进行树脂替换，将花药依次置于乙醇与Spurr树脂体积比为3:1、1:1、1:3液体中2-4小时，最后置于纯树脂中过夜。树脂置换完成后，将花药置于模具中，加入200 µL Spurr树脂，置于烘箱中，70℃聚合过夜。随后进行修块，然后可利用德国莱卡切片机进行切片，切片厚度为2µm；用镊子夹取切好的片子，置于载玻片中央的无菌水中，42℃条件下展片过夜。将固定有样品的载玻片浸入0.1%的甲苯胺蓝染液中，染色1分钟，然后用去离子水冲洗，再置于展片台上，烘干后即可用于显微观察；也可以封片后长期保存。分析树脂切片的结果，根据玉米14个不同发育时期（Stage1-Stage14：S1-S14）的细胞学特点，确定每份样品的具体发育时期。
半薄切片观察表明，突变体ms13花药胼胝质延迟降解，绒毡层在S8a时期开始加厚，中间层延迟降解（图2）。
实施例3：玉米Ms13基因的定位、克隆和突变位点分析
选取ms13-6060×Mo17 F2群体中48个雄性不育株和48个雄性可育株，用于玉米ms13基因的初定位研究。所使用的SSR标记如表2所示，基因定位情况如图4所示。
表2 用于Ms13基因定位的SSR标记
引物名称 引物序列 (5'-3') 引物用途
umc1591-F CAACCAACTGGCAACTACTCGAC ZmMs13 mapping
umc1591-R GAGGTCTCTCTCGGTCGACATC ZmMs13 mapping
umc1705-F ATCTCACGTACGGTAATGCAGACA ZmMs13 mapping
umc1705-R CATGACCTGATAAACCCTCCTCTC ZmMs13 mapping
M1-F CAAGAAATATCAGAAGGTCTCAC ZmMs13 mapping
M1-R GCCTACCCCTTAGAGTCTTAAT ZmMs13 mapping
M2-F AGAGATAAGTTGAGAGGTGGAC ZmMs13 mapping
M2-R TTTGTAGCATAACTACCATTAC ZmMs13 mapping
M3-F AGGCTTATGTACCATGCCAC ZmMs13 mapping
M3-R TGCTATTCCAGTCACAATCTC ZmMs13 mapping
M4-F CAACCCGTCGGACCATTTC ZmMs13 mapping
M4-R CGCCTTCATCGACCCTTTG ZmMs13 mapping
M5-F TGATATGAACGATGTCCATAGC ZmMs13 mapping
M5-R ATGTTTCGAACTGTGACGGTAC ZmMs13 mapping
M6-F TGACATCACAATCTGTAGTGG ZmMs13 mapping
M6-R ACATGATTCGTGACTCCTCAG ZmMs13 mapping
M7-F TTCTCGGTAGGGTGGCGGCTG ZmMs13 mapping
M7-R TCAGACAGATCCGACAGCGGTC ZmMs13 mapping
bnlg557-F TCACGGGCGTAGAGAGAGA ZmMs13 mapping
bnlg557-R CGAAGAAACAGCAGGAGATGAC ZmMs13 mapping
umc1468-F CGAAAAGCCCTAGTGCTCCG ZmMs13 mapping
umc1468-R TTTCTGTAAAAGGGATCTGGTGGG ZmMs13 mapping
umc1894-F TTTCTCATGACATTGCAAGCATCT ZmMs13 mapping
umc1894-R TATGCAAAAGGTGAGCCTGCTTAT ZmMs13 mapping
结果表明，Ms13基因初步定位于5号染色体SSR标记 umc1705和bnlg557之间（图3B），进一步精细定位于标记 M3和M5之间约375.6kb的区间 (图3C)，在此区间预测有8个候选基因（图3D）；利用玉米不同发育时期的花药RNA-Seq数据开展基因的表达谱分析，表明仅Zm00001d013960在花药发育的S5、S8b和S10时期有表达峰，其它基因表达量很低或没有表达峰（图3D）。对Ms13（Zm00001d013960）和突变体基因进行克隆、测序分析，发现ms13-6060突变体在+1393位置缺失3个碱基（ATA），导致一个氨基酸（I）缺失 (图3E，图4)。Ms13基因包含3062个核苷酸，包括9个外显子，编码一个ABCG半分子转运蛋白，与水稻OsABCG26和拟南芥AtABCG11同源。
实施例4：Ms13在野生型和ms13-6060突变体中的转录水平分析
利用荧光实时定量PCR（qPCR）方法，检测WT和突变体不同发育时期（S5-S13）花药以及根、茎、叶、幼嫩雌穗和花丝中Ms13基因的表达水平。具体步骤如下：
用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取上述鉴定的处于不同发育时期（S5-S12）的玉米花药总RNA；然后使用5X All-in-One RT Master Mix （ABM，加拿大）合成cDNA；采用TBGreen™PreMix Ex Taq™（TaKaRa，日本）在QuantStudio5Real-Time PCR System（ABI，美国）上进行定量逆转录聚合酶链反应检测，扩增引物为：qMs13-F（5’-GGACTTCGGCTACTACTGGCTC-3’）和qMs13-R（5’- ATGAACGAAGCACACGCG-3’）；ZmUbi2为参照基因，其扩增引物为：Ubi2-F（5’- CGACAACGTGAAGGCGAAGA-3’）和Ubi2-R（5’-ACGCAGATACCCAGGTACAGC-3’）；每个发育时期包括三个生物学重复，每个样品有三个技术重复；数据用2-ΔΔCt方法进行分析，并以均值±标准差（Means±SD）的形式给出定量分析结果。
结果表明，ZmMs13基因呈现花药发育时期特异表达的模式：在玉米花药发育的在花药发育的S5、S8b和S10时期有表达峰（图5）。
实施例5：MS13蛋白的ATP酶活分析
通过测量无机磷的释放来确定ATP酶活性。10 μl蛋白加入140 μl含有50 mMTris-Mes（pH 6.8）、2 mM EGTA、2 mM二硫苏糖醇、50 mM 氯化钾、5 mM叠氮化钠、浓度分别为0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 mM的MgATP和1%的二甲基亚砜溶液中，37℃下反应30 min。添加等体积的5% SDS溶液终止反应。添加560 μl试剂A（含有2.5 M 硫酸、1%钼酸铵和0.014%酒石酸锑钾）、1.4 ml蒸馏水及280 μl 1%抗坏血酸，在880 nm测光吸收。实验设置三次重复。酶活性以每毫克蛋白每分钟释放无机磷的分子数（nmol/mg/min）表示。根据ZmMS13蛋白的三维结构预测，Walker A的保守氨基酸K99和ms13-6060的缺失氨基酸I311位于atp酶活性中心，与野生型ATP-MBP相比，ms13-6060 ATP-MBP和野生型ATP- K99L-MBP的ATP酶活性明显降低，底物脂肪醇(C16:0 OH、C18:0 OH和C20:0 OH)或脂肪酸(C20:0 COOH)显著刺激WTATP-MBP的ATP酶活性，而ms13-6060 ATP-MBP和WT ATP- K99L-MBP的ATP酶活性较WTATP-MBP显著降低（图6）。表明，ZmMS13是一种具有ATP酶和脂质结合活性的ABCG转运蛋白，其结合活性依赖于保守的氨基酸(如K99和I311)。
实施例6：功能标记ms13-IN1的开发
在本发明中，针对ms13-6060突变位点（第四外显子缺失3bp），利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出1对功能性分子标记：ms13-IN1，ms13-IN1能够特异性检测玉米突变体ms13-6060及由其转育的玉米不育材料的突变基因ms13-6060，并能同时区分野生型Ms13基因和突变型ms13-6060基因。功能性标记ms13-IN1的扩增引物的位置示意图如图7所示。
突变体功能标记ms13-IN1包括第一引物ms13-IN-1F和第二引物ms13-IN-1R，能够在野生型Ms13基因中扩增出95bp的条带，而在ms13-6060突变基因ms13中扩增出92bp的条带：
ms13-IN-1F：CAACCCGTCGGACCATTTC
ms13-IN-1R：ACCTTTCGAACCTCGCCTTC
实施例7：功能标记ms13-IN1的实用性分析
对实施例6中开发的功能标记进行验证。
验证功能标记ms13-IN1所用的试验材料包括：纯合ms13-6060突变材料，ms13- 6060（母本）×Mo17（父本）获得的杂交F1代（Ms13/ms13-6060）、纯合野生型材料Mo17（Ms13/ Ms13）。利用ms13-IN1对上述材料进行Ms13等位基因的检测。
其中，玉米叶片DNA提取方法如下。1）剪取适量叶片并剪碎，放入事先写好编号的2.0ml离心管中，加入一颗钢珠。2）按顺序将已放入叶片和钢珠的离心管摆放在打样仪专用的离心管架（8×5）上，整体浸泡在盛有液氮的保鲜盒中1-2min（注：液氮以刚没过离心管架少许为宜）。3）将冷冻好的离心管架放入打样仪（Thmorgan cell killer ck-1000）的卡槽中，拧紧，关盖，1200转/min的速度打样20s。4）用吸铁石吸出离心管中的钢珠。5）加入700μLCTAB提取液（65℃预热），65℃水浴30min，中间取出颠倒1-2次。6）加入700μL氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀，小心标记不要被擦掉（注：氯仿为腐蚀性试剂，需要带PE一次性手套在通风橱中操作）。7）12000 rpm离心5min至清晰分相。吸取上清液400μL，转入新的1.5mL微量离心管中（预先加入800μl预冷的无水乙醇），弃枪头，盖紧盖子，写好编号并检查无误，上下颠倒混匀。-20℃冰箱中放置30min）12000 rpm离心10min至沉淀附于离心管底部，弃上清液。9）70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5mL微量离心管倒置于平铺于桌上的纸上，自然干燥。10）加入100-200μL的1×TE缓冲液或ddH2O溶解沉淀。11）样品置于-20℃冰箱中保存备用。
利用设计的引物对所获得的DNA进行PCR扩增，方法和程序如下：1）先打开制冰机的水源开关，再打开制冰机的电源开关，制冰。2）将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：PCR缓冲液、dNTP溶液、正反向引物溶液以及模板DNA（注：当某一试剂完全解冻，即放置于冰上。经常用的ddH2O、引物工作液、模板DNA 以及少量PCR缓冲液、dNTP溶液可放于4℃冰箱中）。3）所有试剂解冻完毕后，8000 rpm离心数秒，放回冰上待用。4）配制PCR反应的混合液，按照下表依次加入各试剂（反应体系为10μL）。表3同时列出了1个反应（1R´）、10个反应（10R´）、50个反应（50R´）、100个反应（100R´）的混合液配方。配好后将所有试剂放回4℃或-20℃冰箱（注：Taq聚合酶需小心操作，临用前从-20℃冰箱中取出，用时需置于冰上，用完后立即放回-20℃冰箱中）。5）混匀，8000 rpm离心数秒。6）将混合液分装至200μL PCR反应管中，再加入1μL模板DNA，做好标记（注：如果不使用热盖功能，为防止样品蒸干，需最后加入约20μL石蜡油或盖上PCR管盖）。7）将PCR反应板（管）插入PCR扩增仪的200μL 孔中，合上热盖，旋紧。8）打开PCR扩增仪电源开关，选择预设的反应程序（如表4），开始扩增。9）扩增完后，退出反应程序，回到主菜单，关闭电源开关。打开热盖，取出PCR反应管，置于PCR管架上，放入4℃冰箱中，待用。
Figure SMS_2
Figure SMS_3
注：引物的退火温度为58℃。
理论上，ms13-IN1在Ms13/Ms13纯合野生型（Mo17）DNA中能扩增出95bp的条带，在ms13-6060/ms13-6060纯合突变体材料（S）DNA中能扩增出92bp的条带，而在Ms13/ms13- 6060杂合型（H）材料中，则能同时扩增出对应的两个条带。ms13-IN1的验证结果如图8所示。由于Ms13/Ms13纯合型A，Ms13/ ms13-6060杂合型（H）和ms13-6060/ ms13-6060纯合突变型材料（a）中分别扩增出对应大小的条带，表明ms13-IN1可以作为玉米Ms13、ms13-6060等位基因检测的功能分子标记。
实施例8:利用ms13-IN1进行分子标记辅助选择
利用所述玉米核雄性不育突变材料，培育不同遗传背景下的优良不育系，具体方法如下：以具有玉米隐性核雄性不育基因ms13-6060的玉米不育材料为母本，以不同遗传背景可育自交系材料为父本进行杂交，杂交F1代（Ms13/ms13-6060）与父本材料（Ms13/Ms13）进行回交，每一轮回交都利用上述开发的功能标记ms13-IN1选择带有ms13-6060基因位点的后代进行回交，重复回交4-5次后，可获得既带有ms13-6060基因同时又具有轮回亲本遗传背景的新材料（Ms13/ms13-6060），然后再自交一次，利用功能标记ms13-IN1结合表型选择ms13-6060纯合不育系，即可获得新遗传背景下的ms13-6060核雄性不育系（回交转育流程如图9所示）。

Claims (7)

1.一种玉米雄性不育突变基因ms13-6060，其特征在于，该突变是由野生型Ms13基因第四个外显子的+1393位缺失3个碱基（ATA）引起，该突变导致一个氨基酸I311缺失，降低其编码蛋白的ATP酶活性，从而导致由该基因的突变体ms13-6060表现为雄穗干枯，花药变小、萎缩、呈棕褐色，不能产生成熟的花粉粒；该突变基因ms13-6060的全长DNA、cDNA和氨基酸序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
2.含有权利要求1所述的玉米突变基因ms13-6060的表达载体。
3.含有权利要求2所述表达载体的宿主细胞。
4.权利要求1所述ms13-6060突变基因在玉米雄性不育系创制中的应用。
5.一种权利要求1所述ms13-6060突变基因的功能标记ms13-IN1，其特征在于，该功能标记第一引物ms13-IN-1F序列为：CAACCCGTCGGACCATTT，第二引物ms13-IN-1R序列为：ACCTTTCGAACCTCGCCTTC；该功能标记能同时区分野生型Ms13基因和突变型ms13-6060基因。
6.权利要求5所述的ms13-6060突变基因的功能标记ms13-IN1在制备隐性雄性不育转基因玉米中的应用。
7.权利要求5所述的ms13-6060突变基因的功能标记ms13-IN1在玉米分子辅助选择育种中的应用。
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