CN109402291B - 一种鉴定甜瓜雌花着生部位InDel分子标记及其引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定甜瓜雌花着生部位的InDel分子标记及其引物和应用，该InDel分子标记位于甜瓜的5号染色体1020657bp处，其核苷酸序列为5’‑AGATTTAGT‑3’，该序列在甜瓜基因组中的缺失/插入状态与甜瓜雌花的子蔓/主蔓分布部位密切相关。本发明对甜瓜雌花着生部位性状开发了紧密连锁的InDel分子标记InDel_mpfPr99，设计出扩增该标记的上游引物序列5’‑TATAAATTTGGTCTGAAGAA‑3’，下游引物序列5’‑AAACGACTAACCTCTAACTT‑3’，通过PCR检测InDel分子标记InDel_mpfPr99可在苗期快速准确鉴定出植株的雌花着生部位，筛选相关基因型幼苗，有助于甜瓜分子育种辅助选择，与同类标记技术相比，具有简单准确，快速高效的优点。

Description

一种鉴定甜瓜雌花着生部位InDel分子标记及其引物和应用

技术领域

本发明属于分子辅助育种技术领域，具体涉及一种鉴定甜瓜雌花着生部位的InDel分子标记及其引物和应用。

背景技术

分子标记已广泛应用于农作物的研究，如品种鉴定、遗传多样性分析、进化分析、连锁图谱构建、比较基因组学、数量性状位点构图、分子辅助育种选择等。分子标记辅助选择可以从分子水平上快速准确地检测目标基因或与目标性状基因紧密连锁的位点，进而达到快速准确选择目标性状的目的，提高育种选择效率。

甜瓜(Cucumis melo L.)属葫芦科甜瓜属的甜瓜种,一年生攀援性草本植物，是世界主要水果之一。甜瓜主蔓着生雌花具有早熟、高产和集约化栽培的效果，具有很高的研究利用价值，目前仅在甜瓜全雌系中有相关研究。现有研究结果表明，甜瓜的全雌系主要有三个基因调控a基因、g基因和m基因。Boualem等(2008)利用染色体步移技术克隆到甜瓜a基因,CmACS-7。CmACS-7通过CmACS-7体外酶活性试验验证发现，CmACS-7在雌花发育的两性期抑制雄蕊原基发育。Martin等(2009)通过染色体步移克隆到甜瓜g基因，它是一个编码C2H2型锌指蛋白转录因子的基因，被称为CmWIP1。在全雌系中，CmWIP1的下游1.3kb的位置上插入一段8K的DNA片段，该片段上有一个转座子基因Gyno-hAT,该转座子的插入引起CmWIP1基因启动子的甲基化，进而基因表达沉默，形成雌花。据中国专利文献CN 103866005A研究报道，栾非时等开发出了鉴定甜瓜a基因酶切分子标记和鉴定甜瓜g基因的G、g基因的双引物鉴定分子标记，但技术步骤较为繁琐，鉴定效率低且成本较高，因此，开发一种与甜瓜雌花着生部位性状紧密连锁的、易于操作、成本较低的分子标记，对于促进雌花着生部位的分子辅助育种具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鉴定甜瓜雌花着生部位的InDel分子标记和应用方法，能够在苗期准确快速的筛选出雌花部位在主蔓上的植株，克服现有鉴定技术的不足。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

研究筛选出与甜瓜雌花着生部位紧密连锁的InDel分子标记，其位于甜瓜的5号染色体1020657bp处，其核苷酸序列为5’-AGATTTAGT-3’。

上述InDel分子标记的筛选方法，包括以下步骤：

(1)通过SLAF-seq测序技术开发的SLAF标记构建了高密度遗传连锁图谱，并对该96株F₂群体进行雌花着生部位进行表型鉴定；

(2)结合高密度遗传图谱和F₂群体雌花部位表型鉴定结果，利用rQTL软件(http://www.rqtl.org/)进行关联分析和QTL初定位，在LG5连锁群上检测到一个与甜瓜雌花着生部位相关的主效QTL，对应的LOD值为23.04，可解释53.46％的表型变异，置信区间为0～25.13cM，对应物理位置为260159bp-2115612bp(图1)。

(3)结合两个亲本的重测序，在QTL置信区间筛选出≥5bp的InDel，在甜瓜雌花着生部位相关的主效QTL置信区间内设计InDel引物。

(4)利用设计的InDel引物在16QC43(母本)、11C02(父本)、F₁进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel引物在F₂群体中进行基因型鉴定和引物筛选，逐步缩短甜瓜雌花着生部位的QTL区间，选择与着生部位连锁最紧密的InDel分子标记。

经过分析筛选出与甜瓜雌花着生部位性状紧密InDel分子标记InDel_mpfPr99，该分子标记位于甜瓜的5号染色体1020657bp处，其核苷酸序列为5’-AGATTTAGT-3’，该序列在甜瓜基因组中的缺失/插入状态与甜瓜雌花的子蔓/主蔓分布部位密切相关，依据其上下游序列，设计出InDel分子标记InDel_mpfPr99的PCR引物：

上游引物F1:5’-TATAAATTTGGTCTGAAGAA-3’；

下游引物R1:5’-AAGTTAGAGGTTAGTCGTTT-3’

用上述PCR引物扩增后，扩增序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其中SEQ IDNO.2中双划线部分为InDel分子标记InDel_mpfPr99的插入序列，相应地，该段序列为SEQID NO.1中的InDel分子标记InDel_mpfPr99的缺失序列。

5’-TATAAATTTGGTCTGAAGAAATTTAAAATTTAGTAAATTTAGTCATGTGAGGTTTTAAAATTTAGAACATCTTTTTTAGAATTGCATATATTGCGGATACTAAATTGTAATTATAAACTATAAACGACTAACCTCTAACTT-3’(SEQ ID NO.1)

5’-TATAAATTTGGTCTGAAGAAATTTAAGATTTAGTAAATTTAGTAAATTTAGTCATGTGAGGTTTTAAAATTTAGAACATCTTTTTTAGAATTGCATATATTGCGGATACTAAATTGTAATTATAAACTATAAACGACTAACCTCTAACTT-3’(SEQ ID NO.2)

本发明提供一种甜瓜雌花着生部位的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取甜瓜叶片DNA；

(2)PCR扩增：利用上述InDel分子标记InDel_mpfPr99的PCR引物，对待测样品进行PCR扩增；所述扩增体系为：甜瓜叶片总DNA(100ng/μL)1μL、InDel分子标记上游引物F1(10μM)1μL、InDel分子标记下游引物R1(10μM)1μL、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL；

所述扩增程序为：94℃、5min；94℃、20s，55℃、1min，72℃、30s，共35个循环；72℃、5min；

(3)对PCR产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，显影、染色和带型判读，如果出现141bp大小或如SEQ ID NO.1所示的单一片段，则判定待测甜瓜雌花着生部位为主蔓；如果扩增产物中包含150bp大小或序列如SEQ ID NO.2所示的片段，或则判定待测甜瓜雌花着生部位为子蔓。

将上述InDel分子标记InDel_mpfPr99或上述InDel分子标记InDel_mpfPr99的PCR引物在甜瓜雌花着生部位分子标记辅助育种中的应用。

将上述甜瓜雌花着生部位的鉴定方法在甜瓜雌花着生部位分子标记辅助育种中的应用。

本发明的有益技术效果在于：

1.本发明是根据高通量测序所得到的甜瓜基因组数据开发出来的与雌花着生部位紧密连锁的InDel分子标记InDel_mpfPr99，利用该标记能够在苗期准确快速的鉴定出甜瓜的雌花部位在主蔓或子蔓的植株标记在F₂中的准确率达到92.71％。

经过基因组序列比对可知，该标记与g基因和栾非时等开发的鉴定g基因的G、g的双标记区域一致，在F2群体验证结果(表1)中共分离，说明该InDel分子标记InDel_mpfPr99不仅具有准确性高、而且是单引物，具有简单快速、检测方便的优点，具有更高的应用价值。同时，进一步解析了g基因的功能与甜瓜雌花着生部位有关。

2.本发明的InDel分子标记InDel_mpfPr99的PCR引物，扩增产物稳定，特异性强，在鉴定过程中灵敏度高与Caps标记相比，省去了酶切步骤，操作更简洁，不需要酶切等复杂步骤。

3.本发明用于鉴定甜瓜雌花着生部位的方法，通过PCR的扩增片段大小鉴定甜瓜的雌花部位，不受环境因素的影响，可广泛应用于甜瓜雌花着生部位的鉴定。

4.本发明用于鉴定甜瓜雌花着生部位的InDel分子标记InDel_mpfPr99，可以应用于甜瓜雌花着生部位分子标记辅助选择育种中，早期鉴定雌花部位在主蔓或子蔓的植株。

附图说明

图1：雌花部位QTL定位结果。

图2：为InDel分子标记InDel_mpfPr99的引物在甜瓜16QC43(母本)、11C02(父本)、F₁及部分F₂群体中的PCR扩增结果图；其中，A为母本基因型，B为父本基因型，H为F₁杂合基因型，M为marker的缩写。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：鉴定雌花部位InDel标记的开发

1.试验材料：

以中国农业科学院郑州果树研究所西甜瓜种质资源中期库挑选的16QC43(母本)、11C02(父本)为亲本，二亲本杂交获得F₁，F₁自交获得96个F₂群体。其中16QC43雌花部位在子蔓，11C02雌花部位在主蔓。

2.甜瓜雌花着生部位主效基因QTL初步定位的具有步骤为：

(1)利用16QC43(母本)、11C02(父本)为亲本及两亲本杂交获得96个F₂群体，通过SLAF-seq测序技术开发的SLAF标记构建了高密度遗传连锁图谱，并对该96株F₂群体进行雌花部位表型鉴定；

(2)结合高密度遗传图谱和F₂群体雌花部位表型鉴定结果，利用rQTL软件(http://www.rqtl.org/)进行QTL初定位，在LG5连锁群上检测到一个与甜瓜雌花着生部位相关的主效QTL，对应的LOD值为23.04，可解释53.46％的表型变异，置信区间为0～25.13cM，对应物理位置为260159bp-2115612bp(图1)。

3.16QC43(母本)、11C02(父本)高通量重测序。与甜瓜参考基因组(https://melonomics.net/files/Genome/Melon_genome_v3.5.1/)进行比对，两个亲本共检测到804664个InDel。

4.在QTL置信区间筛选≥5bp InDel。利用Perl自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，并利用Primer 5软件设计InDel引物。在甜瓜雌花着生部位相关的主效QTL置信区间设计InDel引物。

实施例二：甜瓜F₂群体分子标记分析试验

1.实验材料

以实施例1中的16QC43(母本)、11C02(父本)为亲本、杂交组合F₁及96份F₂群体为实验材料。

2.F₂群体基因型鉴定

分别利用设计的InDel引物对16QC43(母本)、11C02(父本)和F₁单株为实验材料进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel引物在F₂群体中进行基因型鉴定。

具体步骤如下：

(1)利用CTAB法提取叶片总DNA

①取1g新鲜叶片放入研钵，加入液氮快速且用力均匀研成粉末状；

②研磨后将叶片粉末随即转入加有1mL CTAB抽取液的离心管中，充分混匀后置于65℃恒温水浴60min，其间颠倒混合2～3次；

③从水浴锅取出后，离心1min，转速为8000rpm；

④取上清液置于新的离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇(25：1，V/V)，混匀；

⑤10000rpm，离心5min，转速为10000rpm；

⑥取上清液到新的离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇(冰上预冷30min)，混匀后置于-20℃冷冻(不超过30min)，让DNA析出；

⑦离心5min，转速为10000rpm；

⑧弃上清液，用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，并置于超净工作台上晾干(10min左右)；

⑨加入200μL的蒸馏水溶解DNA；

⑩用紫外分光光度计测定DNA的浓度，并于-20℃冰箱中保存备用。

(2)引物设计：

①根据实施例1中QTL初定位区域并结合亲本重测序结果，在QTL峰值区域发现多个插入缺失片段≥5bp的InDel；

②利用PERL自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，利用Primer 5软件设计引物。

(3)PCR反应体系如下：甜瓜叶片总DNA(100ng/μL)1μL、Forward primer(10μM)1μL、Reverse primer(10μM)1μL、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL。

(4)PCR反应程序如下：94℃、5min；94℃、20s，55℃、1min，72℃、30s，共35个循环；72℃、5min。

(5)配制电泳缓冲液

5×TBE电泳缓冲液：称取Tris 26.95g，EDTA 1.86g，硼酸13.75g，去离子水定容至500mL。

(6)配胶：

40％聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺77.34g，甲叉双丙烯酰胺2.66g，去离子水定容至200mL。

①量取40％聚丙烯酰胺溶液10mL，加入5×TBE 5mL，10％TBE 200μL配制8％的胶，摇匀。

②倒入制胶板中，并安装梳子，待充分凝固后拔下梳子。

(7)上样：将1μL PCR产物点到制备好的8％聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中，同时另外的点样孔中加入适当的Marker。

(8)电泳：260V，35min。电泳缓冲液为1×TBE。

(9)银染和显影

银染液：硝酸银1g、冰醋酸5ml、无水乙醇50ml，去离子水定容至500ml。

显影液：氢氧化钠15g、甲醛(37％)2.5ml,去离子水定容至500ml。

(10)根据中国专利文献CN103866005A中方法设计g基因的G、g的双标记，对16QC43(母本)、11C02(父本)和F₁单株为实验材料进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel引物在F₂群体中进行基因型分析，检测该分子标记的基因型在96份F₂群体中的分布情况。

(11)观察分析条带的位置差异。可以看出：

①一种实施例2所筛选的InDel分子标记InDel_mpfPr99在F2群体中的基因型鉴定。上游引物序列为:5’-TATAAATTTGGTCTGAAGAA-3’；下游引物序列为:R1:5’-AAGTTAGAGGTTAGTCGTTT-3’。其位于甜瓜的5号染色体1020657bp处，其核苷酸序列为5’-AGATTTAGT-3’。在141bp有条带，表现为雌花部位在主蔓；在150bp有条带，表现为雌花部位在子蔓；141bp+150bp双带型即为雌花部位在子蔓(图2)。

②在96个F₂群体中检测InDel分子标记InDel_mpfPr99(A为母本基因型，B为父本基因型，H为杂合基因型)及G、g双标记(G在所有样品中无显示，g在父本基因型和杂合基因型中有显示)分子标记的基因型分布情况(表1)。其中InDel分子标记InDel_mpfPr99在96份F₂中，24份为A，25份为B，47份为H，其基因型鉴定的准确率达到92.71％。同时可以看出A和G(空白不显示)、B和g共分离，具有相同的准确度。

表1 InDel_mpfPr99和g基因分子标记在F₂群体中的鉴定和验证

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施案例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 一种鉴定甜瓜雌花着生部位的InDel分子标记及其引物和应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 141

<212> DNA

<213> 甜瓜

<400> 1

TATAAATTTGGTCTGAAGAAATTTAAAATTTAGTAAATTTAGTCATGTGAGGTTTTAAAATTTAGAACATCTTTTTTAGAATTGCATATATTGCGGATACTAAATTGTAATTATAAACTATAAACGACTAACCTCTAACTT

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> 甜瓜

<400> 2

TATAAATTTGGTCTGAAGAAATTTAAGATTTAGTAAATTTAGTAAATTTAGTCATGTGAGGTTTTAAAATTTAGAACATCTTTTTTAGAATTGCATATATTGCGGATACTAAATTGTAATTATAAACTATAAACGACTAACCTCTAACTT

<210> 3

<211> 9

<212> DNA

<213> 甜瓜

<400> 3

AGATTTAGT

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

TATAAATTTGGTCTGAAGAA

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

AAGTTAGAGGTTAGTCGTTT

Claims (3)

1.一种鉴定甜瓜雌花着生部位的InDel分子标记InDel_mpfPr99，其特征在于，位于甜瓜的5号染色体1020657bp处一段缺失或插入的InDel标记，其缺失或插入的核苷酸序列为5’-AGATTTAGT-3’；

InDel分子标记InDel_mpfPr99的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5’-TATAAATTTGGTCTGAAGAAATTTAAAATTTAGTAAATTTAGTCATGTGAGGTTTTAAAATTTAGAACATCTTTTTTAGAATTGCATATATTGCGGATACTAAATTGTAATTATAAACTATAAACGACTAACCTCTAACTT-3’；

和SEQ ID NO.2：

5’-TATAAATTTGGTCTGAAGAAATTTAAGATTTAGTAAATTTAGTAAATTTAGTCATGTGAGGTTTTAAAATTTAGAACATCTTTTTTAGAATTGCATATATTGCGGATACTAAATTGTAATTATAAACTATAAACGACTAACCTCTAACTT-3’。

2.用于扩增权利要求1所述的鉴定甜瓜雌花着生部位的InDel分子标记InDel_mpfPr99的PCR引物。

3.权利要求1所述的鉴定甜瓜雌花着生部位的InDel分子标记InDel_mpfPr99在甜瓜雌花着生部位分子标记辅助育种中的应用。

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