CN103866036B - 一种鉴别水稻千粒重基因tgw6的分子标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴别水稻千粒重基因<i>TGW6</i>的分子标记方法，属于生物工程技术领域。设计合成一对正、反引物，对不同水稻植株DNA进行扩增，扩增产物经过限制性内切酶酶切，如果能够切成217bp、372bp的特征条带即为含<i>TGW6</i>千粒重基因的纯合体；如果不能够酶切，只含有590bp的特征条带即为不含<i>TGW6</i>千粒重基因的纯合体；如果同时存在590bp、217bp和372bp的三条特征条带，则为<i>TGW6</i>千粒重基因的杂合体。本发明不仅能快速、准确地鉴定水稻种质资源或其育种群体中是否含有水稻千粒重<i>TGW6</i>基因，同时能进一步区分<i>TGW6</i>基因的纯合体和杂合体，预测后代基因型，大大提高对水稻粒重的选择效率，加速育种进程。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种鉴别水稻千粒重基因TGW6的分子标记方法，属于生物技术工程领域，专用于含TGW6基因型水稻种质资源鉴定以及品种选育。
二、背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物，全国有一半以上的人口以稻米为主食。随着我国人口的不断增加和耕地面积的相对减少，提高水稻产量成为保障我国粮食安全最重要的手段。水稻的产量是由单位面积的有效穗数、每穗实粒数和粒重共同决定的（水稻粒重一般以千粒重表示）。其中，粒重的遗传比较稳定，其变异系数为40％～60％，国际水稻研究所研究认为，增加粒重可提高水稻产量30％以上，是提高产量的有效途径（马丽莲等，植物学通报，2006，23(4)：395-401；姚国新等，安徽农业科学，2007，35((27)：8468，8478）。
粒重相关基因（QTL）的挖掘和鉴定是开展水稻粒重改良的重要基础，前人研究结果表明，水稻粒重是由多基因控制的数量性状位点（Quantitativetraitlocus，QTL），遗传机制复杂。截至目前，国内外的不同的研究者利用F2、BCl、DHs和RILs等群体定位了315个水稻千粒重相关的QTL位点，分布在水稻的全部12条染色体上（http://www.gramene.org/）。水稻品种的粒重表型是由多个QTL共同作用的结果，小粒重的水稻品种中也可能含有高千粒重的QTL（王军等，华北农学报，2013，28（6）：11-17）。Ishimaru等人克隆了一个水稻千粒重相关的重要基因TGW6，来自Kasalath的TGW6基因，能增加日本晴在抽穗前的籽粒碳水化合物的积累，使日本晴产量增加15%，同时不影响稻米品质。测序发现该基因仅有一个外显子，相对日本晴，在kasalath背景中有6个核苷酸的替换，且在该基因的第313核苷酸位置中有一个1bp的缺失，该碱基缺失会造成移码突变，翻译提前终止，不能形成成熟蛋白，而功能丧失会通过对源器官的多效影响增加籽粒重量从而使水稻增产。进一步分析发现，kasalath和日本晴的千粒重均为21g左右，且kasalath的千粒重比日本晴略小，无法直接通过表型对TGW6基因进行直接的选择（Ishimaruetal.，NatGenet，2013，45(6):707-711）。
因此，在TGW6基因克隆的基础上，进一步设计得到与目标基因共分离的PCR分子标记来快捷、准确鉴定TGW6基因的不同基因型，将有利于高千粒重水稻新品种的选育，从而提高高千粒重育种的技术水平。
三、发明内容
技术问题：本发明针对水稻千粒重在改良选育过程呈连续分布且易受气候条件影响造成鉴定不准确的技术难题，根据高千粒重和低千粒重在TGW6位点存在的单碱基缺失，设计、合成与目的基因共分离的功能标记，并通过简单的检测方法，快速鉴定含高千粒重的TGW6基因的水稻种质资源，同时还能进一步应用于分子标记辅助育种。
技术方案：
一种鉴别水稻千粒重基因TGW6的分子标记方法，其特征在于：
用TGW6粒重基因特异性引物CAPs6-1:
正向引物CAPs6-1-F序列为5'-CCACAGCCACAACGAGAAT-3'
反向引物CAPs6-1-R序列为5'-ACCGTTCGGGTAGGTTATGT-3'
扩增水稻植株的基因组DNA，扩增产物经过限制性内切酶酶切，如果能够切成217bp、372bp的特征条带即为含TGW6千粒重基因的纯合体；如果不能够酶切，只含有590bp的特征条带即为不含TGW6千粒重基因的纯合体；如果同时存在590bp、217bp和372bp的三条特征条带，则为TGW6千粒重基因的杂合体。
有益效果
本发明提供的一种鉴别水稻千粒重基因TGW6的分子标记方法，具有以下优点：
（1）本发明提供的分子标记是根据基因的功能区域差异设计的基于PCR扩增和限制性内切酶的功能性标记，其基因型能直接反映植株的表型，不仅不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定，而且在操作上准确、高效、快捷。
（2）本发明提供的分子标记方法能实现对水稻基因资源的快速鉴定，能从大量水稻资源中准确筛选出高千粒重基因TGW6的品种，这些具有高千粒重的水稻品种在育种中可以作为优异亲本来应用于水稻千粒重改良育种中。
（3）本发明提供的分子标记方法能有效用于水稻千粒重改良的辅助育种。可以有效地对分离群体中高千粒重控制基因TGW6进行基因型选择，并且能够区分杂合基因型和纯合基因型，大大提高育种工作的预见性。
四、附图说明
图1检测千粒重基因TGW6的标记设计策略
（阴影部分表示引物所在位置，黑框部分表示单碱基缺失产生的BssHII的酶切位点）
图2筛选到的3对引物PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖胶电泳结果（M:DNA分子标记；a：100bp；b：250bp；c：500bp；d：750bp；e；1kb，f；2kb；1-8：Kasalath、Nipponbare、9311、南粳40、南粳45、南粳49、南粳51、南粳9108）
图3CAPs6-1PCR扩增产物经酶切后在1.5%的琼脂糖胶电泳结果（M:DNA分子标记；a：100bp；b：250bp；c：500bp；d：750bp；e；1kb，f；2kb；1-8：Kasalath、Nipponbare、9311、南粳40、南粳45、南粳49、南粳51、南粳9108；M左侧为PCR扩增产物；M右侧为酶切后的产物）
图4部分水稻品种TGW6基因位点功能区的序列比对结果
图5CAPs6-1对部分水稻品种的分子检测结果（M:DNA分子标记；a：100bp；b：250bp；c：500bp；d：750bp；e；1kb，f；2kb；1-24：Kasalath、Nipponbare、广恢128、镇恢084、明恢63、明恢78、圭630、蜀恢527、多恢1号、绵恢725、乐恢188、绵恢501、内香恢1号、浙恢7954、中恢8006、盐恢559、宁恢288、BG90-2、IRBB21、Basmati370、粤晶丝苗、粤泰B、华丰B、II-32B）
五、具体实施方式
为充分公开本发明一种鉴别水稻千粒重基因TGW6的分子标记方法，以下结合方法验证和实施实例加以说明。其具体实施步骤如下：
（一）试验材料
均为水稻生产推广品种Kasalath(美国)、Nipponbare（日本）、93-11（江苏）、南粳40（江苏）、南粳45（江苏）、南粳49（江苏）、南粳51（江苏）、南粳9108（江苏）、广恢128（广东）、镇恢084（江苏）、明恢63（福建）、明恢78（福建）、圭630（圭亚那）、蜀恢527（四川）、多恢1号（四川）、绵恢725（四川）、乐恢188（四川）、绵恢501（四川）、内香恢1号（四川）、浙恢7954（浙江）、中恢8006（浙江）、盐恢559（江苏）、宁恢288（江苏）、BG90-2（斯里兰卡）、IRBB21（菲律宾）、Basmati370（泰国）、粤晶丝苗（广东）、粤泰B（广东）、华丰B（广东）、II-32B（湖南）。
以上材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为：王维旭等，籼稻品种Kasalath遗传转化条件的研究安徽农业科学，安徽农业科学，2010，38(4):1735-1737，1856；蒋云洪，日本晴水稻高产栽培技术，山东农业科学，1981，2：28-29；徐卯林等，优质高产抗病中籼新品种扬稻6号的选育及利用，中国稻米，2001，1：24-26；杨杰等，中粳稻新品种南粳40的选育与利用，江苏农业科学，2002，5：21，28；仲维功等，粳稻新品种南粳45的选育及栽培技术，江苏农业科学，2009，5：123-125；仲维功等，水稻新品种南粳49的选育与应用，2012，40（11）：103-104；王才林等，优良食味粳稻新品种南粳9108的选育与利用，2013，41（9）：86-88；郭国强等，广恢128与不同类型不育系测配F1代表现研究，广西农业科学，2004，35（4）：279-281；盛生兰等，籼稻恢复系镇恢084的选育及利用，杂交水稻，2002，17（2）：6-7；吴方喜等，籼型杂交稻恢复系明恢63的利用与创新，福建农业科学，2011，26（6）：1101-1112；郑家团，恢复系“明恢78”的选育及其特征特性的研究，福建农业科技，1995，2：2-3；王德师，圭630及其配组的杂交水稻品种，福建农业科技，1979，357-59；王玉平等，高配合力优质水稻恢复系蜀恢527的选育与利用，杂交水稻，2004，19（4）：12-14；郭福泰等，特优多系1号，杂交水稻，1998,13（4）：32；黄廷友等，绵恢725及其相关亲本的ISSR分析，西南科技大学学报，2008，23（1）：87-90；李乾安等，高产稳产杂交水稻新组合蓉18优188，杂交水稻，2013,28（3）：77-78；谢崇华等，水稻恢复系绵恢501的选育及系列组合的应用，杂交水稻，1997，12（3）：8-10；肖培村，内香优3号与内香优13号，作物研究，2004，4：263-264；黄益峰等，浙恢7954实现高产制种的关键技术，浙江农业科学，2009，2：339-340；方金旭等，超级杂交稻国稻6号亲本特征特性初探，杂交水稻，2010，25（1）：26-28；姚立生等，广谱性恢复系盐恢559及其系列杂交稻组合选育，江苏农业学报，2009，25（3）：469-473；李育红等，水稻骨干亲本BG90-2在扬稻系列培育中的作用及对白叶枯病抗性，2011，25（4）：439-442；曾列先等IRBB21(Xa21)对广东稻白叶枯病菌5个小种的抗性反应，植物保护学报，2002，29（2）：97-100；BughioH.,R.,ImprovementofgrainyieldinricevarietyBasmati-370(OryzasativaL.),throughmutagenesis,Pak.J.Bot.,2007,39(7):2463-2466；何秀英等，特优质抗病水稻新品种粤晶丝苗的选育，广东农业科学，2007，8：7-8；周杰等，籼稻粤泰B成熟胚愈伤组织诱导培养条件初探，湖北农业科学，2007，47（11）：1224-1227；新质源不育系Ⅱ-32A的开发利用研究，杂交水稻，1992，3：24-25。
（二）鉴别千粒重基因TGW6基因型分子标记的获得
1分子标记的开发
（1）水稻千粒重基因TGW6变异位点的核苷酸序列分析
根据Ishimaru（NatureGeNetics,2013,45(6):707-711）等的研究结果，高千粒重基因在TGW6位点的第313核苷酸位置中有一个1bp（G）的缺失，该碱基缺失会造成移码突变，翻译提前终止，不能形成成熟蛋白，而功能丧失会通过对源器官的多效影响增加籽粒重量从而使水稻增产。对该功能区域进行生物信息学分析，发现这1bp的缺失产生了一个BssHII限制内切酶位点（G⊥CGCGC），而不缺失的等位基因不含有BssHII酶切位点（GCGCGGC），且TGW6基因其他位置不含有BssHII酶切位点（图1）。
（2）引物设计
利用TGW6基因的核苷酸序列在水稻基因组网站（GeneBank,www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载其位于水稻第6染色体所在PAC克隆（P1-derivedartificialchromosome，PAC）的核酸序列（OSJNBa0029G06，AP004680），并对相关序列进行分析；利用PrimerPremier5.0（http://www.premierbiosoft.com）在1bp缺失区域的的两侧设计包含该缺失位点的引物，本研究所合成引物见表1。引物由Invitrogen中国公司合成。
表1基于SNP位点设计的CAPs引物
2分子标记的验证
（1）水稻植物基因组DNA提取
水稻植株基因组DNA的提取参照SDS法（DellaportaSL,etal.,PlantMolBiolRep,1983,1(1):19221.）。具体步骤为：取水稻分蘖期叶片1克左右，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入2.0mL离心管；加入600uL提取液（20%SDS，1MTris-HCl，0.5MEDTA，5MNaCl，65℃预热），摇匀，65℃温浴30min，中间振荡3~4次；加入1/4体积5MKAC,摇匀后置冰上30min；加入氯仿-异戊醇（24:1）300~400uL，在摇床上充分振荡，120rpm，30min；8,000~10,000rpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清（400uL左右）至另一离心管；加入等体积氯仿-异戊醇（24:1），摇床上充分振荡，80~90rpm，30min；8,000rpm离心15分钟，转移上清（400uL左右）至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12,000rpm离心6min；弃无水乙醇，加入4℃70%乙醇，放置10min，弃上清，超净工作台上风干1h；加入100~200uLTE，-20℃保存。
（2）分子标记的扩增和电泳检测
20μLPCR反应体系包括：10×PCRBuffer(Mg2+)2.0mL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，正向引物(10pmol/L)1.0μL，反向引物(10pmol/L)1.0μL，DNA2.0μL，ddH2O13.3μL。
PCR反应条件包括：94℃预变性5min,然后94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1.5min,32个循环,最后72℃延伸10min,10℃冷却10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。
反应结束后扩增产物加入指示剂（0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液），将扩增产物在1.5%琼脂糖上进行电泳，DuRed染色，紫外凝胶成相系统保存图像。
（3）分子标记的筛选和验证
以SDS方法提取Kasalath（Kas）、Nipponbare（Nip）、9311、南粳40（NJ40）、南粳45（NJ45）、南粳49（NJ49）、南粳51（NJ51）和南粳9108的DNA为模板，利用表1设计的引物进行PCR扩增，扩增产物在1.5%琼脂糖电泳分析（图2）。由图2可以看CAPs6-1扩增的PCR产物条带最为清晰、单一且没有杂带。
对CAPs6-1扩增的PCR产物进行BssHII酶切。酶切反应体系为10μL，分别为PCR反应产物5μL，10×BufferR1μL，BssHII（10U/μL）0.25μL，ddH2O3.75μL。混匀后再在37℃恒温水浴锅酶切5h-8h，酶切产物在1.5%琼脂糖上进行电泳，DuRed染色，经紫外凝胶成相系统成像（图3）。图3中M左侧为CAPs6-1扩增的PCR产物，M右侧为PCR产物的酶切结果，由图3可以看出含有千粒重基因TGW6的水稻品种Kasalath能够被BssHII酶切，分别形成217bp、372bp的特征条带；而不含有千粒重基因TGW6的水稻品种Nipponbare不能被BssHII酶切，只形成590bp的特征条带；9311、南粳40、南粳45、南粳49、南粳51和南粳9108等6个品种均不能被BssHII酶切，说明这些品种中均不含有TGW6基因。
为了进一步验证不能被BssHII酶切的水稻品种即使不含有TGW6基因的准确性，我们对南粳40、南粳45、南粳49、南粳51等4个水稻品种进行了TGW6基因位点的全长测序，通过序列比对发现，这些品种TGW6基因位点与Nipponbare完全一致，在313核苷酸位置处不存在G碱基的缺失（图4），因此，利用CAPs6-1标记的PCR扩增结合BssHII酶切的方法可以准确的鉴定出水稻品种中是否含有千粒重基因TGW6。
（4）对水稻资源的TGW6基因型鉴定
利用分子标记CAPs6-1对来自不同地区的22份水稻品种进行PCR扩增、PCR扩增经BssHII酶切后电泳检测。结果显示：17个水稻品种明恢78、圭630、蜀恢527、多恢1号、绵恢725、绵恢501、内香恢1号、浙恢7954、中恢8006、盐恢559、宁恢288、BG90-2、IRBB21、Basmati370、粤晶丝苗、粤泰B、华丰B的CAPs6-1PCR产物不能够被BssHII酶切，形成590bp的特征条带，因此这些材料部含有千粒重基因TGW6；而其他5个水稻品种广恢128、镇恢084、明恢63、乐恢188、II-32B的CAPs6-1PCR产物能够被BssHII酶切，形成217bp、372bp的征条条特，说明这5个水稻品种中含有千粒重基因TGW6，这些水稻品种在育种中可以作为优异亲本用于水稻水稻千粒重性状的改良（图5）。因此，通过CAPs6-1标记的PCR扩增结合BssHII酶切能准确鉴定千粒重基因种质资源。
SEQUENCELISTING
<110>江苏省农业科学院
<120>一种鉴别水稻千粒重基因TGW6的分子标记方法
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1.一种鉴别水稻千粒重基因TGW6的分子标记方法，其特征在于：
用TGW6粒重基因特异性引物CAPs6-1
正向引物CAPs6-1-F序列为5'-CCACAGCCACAACGAGAAT-3'
反向引物CAPs6-1-R序列为5'-ACCGTTCGGGTAGGTTATGT-3'
扩增水稻植株的基因组DNA，扩增产物经过限制性内切酶BssHII酶切，如果能够切成217bp、372bp的特征条带即为含TGW6千粒重基因的纯合体；如果不能够酶切，只含有590bp的特征条带即为不含TGW6千粒重基因的纯合体；如果同时存在590bp、217bp和372bp的三条特征条带，则为TGW6千粒重基因的杂合体。
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| CN101265497A (zh) * | 2008-04-02 | 2008-09-17 | 江苏省农业科学院 | 一种鉴别水稻暗胚乳突变基因Wx-mq的分子标记方法 |
| CN101643784A (zh) * | 2009-09-15 | 2010-02-10 | 江苏省农业科学院 | 一种鉴别水稻低谷蛋白基因Lgc1的分子标记方法 |
-
2014
- 2014-04-02 CN CN201410132185.1A patent/CN103866036B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101265497A (zh) * | 2008-04-02 | 2008-09-17 | 江苏省农业科学院 | 一种鉴别水稻暗胚乳突变基因Wx-mq的分子标记方法 |
| CN101643784A (zh) * | 2009-09-15 | 2010-02-10 | 江苏省农业科学院 | 一种鉴别水稻低谷蛋白基因Lgc1的分子标记方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "标记辅助选择在作物育种中的应用";尹长斌;《现代农业科学》;20080531;第15卷(第5期);第1页右栏最后1段，第2页左栏第1段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103866036A (zh) | 2014-06-18 |
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