CN103882146B

CN103882146B - 一种鉴定水稻粒长基因gs3不同基因型的四引物分子标记方法

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Publication number: CN103882146B
Application number: CN201410151637.0A
Authority: CN
Inventors: 陈涛; 姚姝; 丁丹; 郑佳; 王才林; 张亚东; 朱镇; 赵庆勇; 周丽慧; 赵凌; 于新; 赵春芳
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-04-15
Filing date: 2014-04-15
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-04-15
Also published as: CN103882146A

Abstract

本发明涉及一种鉴定水稻粒长基因GS3不同基因型的四引物分子标记方法，属农业生物工程技术领域。根据长、大粒品系TD70和短、小粒品种Kasalath在粒长基因GS3核苷酸碱基序列上的差异，设计合成四条标记引物，加入同一PCR反应体系对不同水稻DNA进行扩增，区分GS3不同基因型纯合体和杂合体。本发明不仅能快速、准确的鉴定水稻种质资源或育种群体中粒长基因GS3的不同基因型，而且在育种能提高对长粒基因型GS3-^TGS3-^T的选择效率，加速长粒优质、高产水稻新品种选育进程。

Description

一种鉴定水稻粒长基因GS3不同基因型的四引物分子标记方法

一、技术领域

本发明涉及一种鉴定水稻粒长基因GS3不同基因型的四引物分子标记方法，属于生物技术工程领域，专用于含GS3-^TGS3-^T基因型长粒优质、高产水稻资源的筛选、鉴定和标记辅助育种。

二、背景技术

我国是稻米生产和消费大国，全国有60%以上的人口以大米为主食。近年来，随着人民生活水平的提高和国内外稻米市场竞争的加剧，优质稻米开始展现出广阔的市场前景，并受到越来越多消费者的青睐。因此，在保证水稻单产提高的基础上，改良稻米品质已成为水稻育种的重要课题（易俊良等,分子植物育种,2011,9(19):1134-1151）。

粒长是水稻粒型的重要因素，它不仅与产量构成因子中的千粒重密切相关，同时也影响稻米的外观和碾磨品质。粒型偏长，稻米垩白粒率低、外观品质优、商品性好，一些市场热销的优质大米如泰国和东北香米都具有粒型偏长的特征。因此，粒长性状的选择在品质育种中具有重要作用。然而，从遗传来讲，粒长是一个受多基因控制的典型数量性状，易受到环境条件的影响，采用传统育种的方法很难对稻谷的粒长性状进行有效改良（宫李辉等,植物学报,2011,46(6):597-605）。

近年来，随着水稻功能基因组学研究的深入，水稻粒长性状的遗传解析取得了一系列突破性的进展。许多研究者利用不同的遗传群体和分子标记在水稻12条染色体上定位到70多个和谷粒长度相关的QTL，其中以第2、3、7、l0染色体上检测的QTL数最多，且效应较大（高志强等,遗传,2011,33(4):314-321）。从已定位QTL的数量和位置来看，水稻粒长性状的遗传机制非常复杂，不同来源的亲本和群体类型以及环境条件都会影响QTL定位的准确性，因而目前克隆的粒长基因并不多。GS3是位于水稻第3染色体着丝粒附近的主效粒长QTL，它不仅影响籽粒的长度，同时与粒重也具有相当紧密的关系。完整的GS3基因全长6648bp，有5个外显子，编码232个氨基酸的蛋白，它具有类PEBP的结构域、跨膜区、富半胱氨酸的TNFP/NGFR家族结构域及VWFC组件。核酸序列分析发现，与短、小粒水稻相比，长、大粒品种GS3在第2外显子上存在一个单核苷酸的变异，导致原来编码半胱氨酸的TGC密码子突变为终止密码子TGA，使蛋白翻译提前终止，造成类PEBP结构域等4个保守区域的序列丢失，进而丧失基因功能，使籽粒长度和重量增大，这说明GS3基因编码的蛋白具有负向调控的作用（Fan C C,et al.,Theoretical and Applied.Genetics,2006,112(6):1164-1171;Mao H L,et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(45):19579-19584）。

基因进化研究表明，GS3位点在水稻中具有非常广泛的分布，235个亚洲栽培稻中34%的品种，特别是热带粳稻都具有长粒GS3的纯合基因型，这有利于水稻长粒种质资源的筛选、鉴定和品种改良。从基因效应来看，GS3对水稻粒长的作用非常明显，它在不同的环境条件中都能稳定表达。据估计，在不同遗传群体中GS3基因的加性效应范围变幅为0.23～1.47mm，可解释粒长表型变异的25.0%～95.6%。由此可见，作为水稻中少数效应较大、且分布广泛的粒长基因，GS3在稻米品质和产量改良中具有非常重要的作用（Noriko T K,etal.,Genetics,2009,182(4):1323-1334）。

为提高GS3不同基因型的选择效率，许多研究者进行了大量的尝试。杨梯丰等利用5个连锁的微卫星（Simple Sequence Repeats,SSR）标记RM6146、RM3646、RM16、PSM127和RM347对GS3基因型进行辅助选择，改良华粳籼74的外观品质。然而，由于这些标记仅与目标基因存在连锁关系，而非功能性标记，因此其带型差异不能直接反映GS3基因型的变化，难以保证每个单株基因型鉴定的准确性（杨梯丰等,分子植物育种,2010,8(1):59-66）；Wanget al.根据GS3基因在第2外显子G-A的突变设计了能准确区分三种基因型的酶切扩增多态序列（Cleaved Amplied Polymorphic Sequence CAPS）标记，但涉及限制性内切酶PstI的使用，存在操作烦琐，费用昂贵、效率低下等弊端（Wang C,etal.,Theoretical and Applied Genetics,2011,122(5):905-913）。因此，建立一种新的基于PCR技术的基因分型法来快速、准确的鉴定粒长基因GS3的不同基因型已成为水稻品质、产量育种亟待解决的技术难题。

三、发明内容

技术问题：本发明针对利用连锁微卫星标记和CAPS标记区分粒长基因GS3不同基因型过程中存在的准确性差、试验流程烦琐、费用昂贵等缺陷，根据长、大粒品种GS3位点在第2外显子上存在的C到A的单核苷酸碱基突变，设计四条基因特异性引物并采用一步PCR的方法来快速、准确的鉴定GS3的不同基因型，以达到长粒水稻种质资源筛选、鉴定和标记辅助育种的目的，同时提高对粒长增效基因型的选择效率，加速长粒型优质、高产水稻的品种选育进程。

技术方案：

本发明“一种鉴定水稻粒长基因GS3不同基因型的四引物分子标记方法”，其特征在于：GS3基因的特异性引物

正向外引物GS3-O-F序列：5'-CCTCAGACATCACCTGAAAAGTTGACAGGC-3'

反向外引物GS3-O-R序列：5'-CGGTCAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3'

正向内引物GS3-I-F序列：5'-TCCACGCTGCCTCCAGATGCCGA-3'

反向内引物GS3-I-R序列：5'-AGAAACAGCAGGCTGGCTTACTCTTTG-3'，

利用上述引物快速区分水稻粒长基因GS3不同基因型的四引物分子标记方法为：

（1）水稻植株基因组DNA的提取（SDS法），参照Dellaporta S L,et al.,Plant Mol Biol Rep,1983,1(1):19221；

（2）将所述的四条分子标记引物GS3-O-F、GS3-O-R、GS3-I-F和GS3-I-R加入同一PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；20μLPCR反应体系包括：20ng/μL的DNA2.0μL，4nmol/L的引物2.0μL，其中引物GS3-O-F、GS3-O-R、GS3-I-F和GS3-I-R各0.5μL，含25mmol/LMgCl₂的10×PCRBuffer2.0μL，2.5mmol/L的dNTP0.4μL，2U/μL的Taq0.5μL和ddH₂O13.1μL；

PCR反应程序包括：94℃预变性5min；然后94℃变性30s、63.4℃复性30s、72℃延伸1min，循环33次；然后72℃延伸10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。

（3）反应产物在质量比浓度为2.0%的琼脂糖凝胶上100V电泳50min，经DuRed核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。如果同时含有270bp和145bp两条特征条带，则为含粒长基因型GS3-^TGS3-^T的纯合体；如果同时含有270bp和175bp两条特征条带，则为含粒长基因型GS3-^KGS3-^K的纯合体，如果同时存在270bp、175bp和145bp的三条特征条带，则为含粒长基因型GS3-^TGS3-^K的杂合体。

有益效果

本发明提供的“一种鉴定水稻粒长基因GS3不同基因型的四引物分子标记方法”，具有以下优点：

（1）本发明提供的分子标记并非与粒长基因GS3连锁的分子标记，而是根据基因间的碱基变异设计的功能性标记，它能直接反映植株的基因型和表型，不存在由于标记和基因间的遗传交换而造成基因型鉴定的错误；

（2）本发明提供的分子标记方法能实现对长、大粒水稻种质资源GS3基因型的快速鉴定。由于水稻粒长性状是由多基因控制的数量性状，仅根据粒长表型很难确定水稻中是否具有GS3的目标基因型，而本发明提供的分子标记方法能直接对水稻资源进行鉴定，明确其基因型；

（3）本发明提供的分子标记方法能有效用于长、大粒水稻品种的分子标记辅助选择。由于传统育种中对粒长性状的选择主要依靠肉眼观察和长度测量，这样的方法不仅受植株生长发育阶段的影响，而且耗时、耗力，而利用GS3基因的四引物PCR标记可以在苗期对GS3长粒纯合基因型的单株进行鉴定、选择，淘汰大量非目标单株，这在很大程度上提高了长粒型水稻品种的选择效率，缩短育种周期和减少育种成本；

（4）与现有鉴定粒长基因GS3不同基因型的微卫星标记和CAPS标记相比，本发明采用四引物一步PCR扩增的方法对GS3基因型进行鉴定，不仅能有效区别其纯合和杂合基因型，而且还可以避免检测过程中准确性差、试验流程烦琐、费用昂贵等弊端，更为高效、快捷，适合于对大量水稻资源和育种材料进行鉴定和选择。

四、附图说明

图1长、大粒品系TD70与短、小粒品种Kasalath籽粒长度的比较

（A：含GS3-^TGS3-^T纯合基因型长、大粒水稻品系-TD70；B：含GS3-^KGS3-^K纯合基因型短、小粒水稻品种-Kasalath）

图2用于检测粒长基因GS3不同基因型的四引物PCR分子标记设计策略

（注：序列比较图中方框代表GS3基因在长、大粒品系TD70和短、小粒品种Kasalath中存在的碱基差异；箭头表示引物位置和长度，GS3-O-F表示正向外引物，GS3-O-R表示反向外引物，GS3-I-F表示正向内引物，GS3-I-R表示反向内引物）

图3四引物PCR分子标记对不同水稻品种GS3基因型的检测

（M：DNA分子量标准，100-2,000bp；1：TD70；2：Kasalath；3～17：武粳13、日本晴、苏御糯、桂朝糯、南粳44、武运粳23、9311、明恢63、珍汕97、桂朝2号、龙特甫、蜀恢527、蜀恢158、华占和南京11）

图4四引物PCR分子标记对TD70/Kasalath重组自交系群体（RILs）不同株系GS3基因型的检测

（M：DNA分子量标准，100-2,000bp；1：TD70；2：Kasalath；3：TD70/KasalathF₁；4～7：部分重组自交系植株）

图5本发明分子标记方法用于水稻品种Kasalath粒长性状的改良过程

图6Kasalath和Kasalath-GS3-^T改良系籽粒长度的比较

（A：含GS3-^KGS3-^K纯合基因型短、小粒水稻Kasalath；B：含GS3-^TGS3-^T纯合基因型长、大粒水稻Kasalath-GS3-^T）

五、具体实施方式

通过对江苏省农业种质资源中期库低温保藏的3000余份水稻种质资源进行粒型性状的鉴定、分析，从中筛选到1份来源于天鹅谷///9520//（72-496/御糯）杂交后代的长、大粒粳稻稳定品系TD70。利用TD70与短、小粒印度籼稻品种Kasalath杂交，经单粒传法构建了包含240个株系重组自交系群体，通过分子连锁图谱的绘制和2010-2011连续两年的QTL定位分析，在水稻染色体上定位到多个与粒型相关的QTL，其中在第3染色体上定位到1个粒长QTL-qGL3-1。通过对TD70和Kasalath基因组DNA的测序分析，确定了qGL3-1就是已报道的GS3基因，一个位于水稻第3染色体着丝粒附近控制粒长性状的主效QTL。与短、小粒水稻品种Kasalath相比，长、大粒品系TD70在该基因第2外显子165位核苷酸处存在一个单碱基C-A的变异，由原来编码半胱氨酸的TGC突变成终止密码子TGA，使得蛋白翻译提前终止，造成4个保守区域的丢失，从而表现出粒型变长、变大的表型。根据这一单核苷酸差异设计了四引物PCR分子标记，利用该方法不仅可以有效鉴定水稻种质资源或育种群体中粒长基因GS3的不同基因型，同时也可以提高对粒长增效基因型GS3-^TGS3-^T的选择效率，缩短育种周期、减少育种成本，加速长粒型优质、高产水稻的品种选育。

为充分公开本发明“一种鉴定水稻粒长基因GS3不同基因型的四引物分子标记方法”，以下结合方法验证和实施实例加以说明。其具体实施步骤如下：

（一）试验材料

来源于天鹅谷///9520//（72-496/御糯）杂交后代，长、大粒粳稻品系TD70（粒长13.70±0.10mm，千粒重80.75±2.35g）；短、小粒印度籼稻品种Kasalath，粒长8.09±0.06mm，千粒重20.25±0.12g）以及来源于TD70/Kasalath240个株系（F₈世代）构成的重组自交系群体。

6个常规粳稻品种：武粳13（江苏常州武进稻麦育种场）、日本晴（日本爱知县农试场）、苏御糯（江苏太湖地区农家品种）、桂朝糯（扬州大学农学院）、南粳44（江苏省农业科学院粮食作物研究所）和武运粳23（江苏常州武进水稻研究所）；

9个常规籼稻材料：扬稻6号（江苏里下河地区农业科学研究所）、明恢63（福建三明农业科学研究所）、珍汕97（浙江温州农业科学研究所）、桂朝2号（广西农业科学院）、龙特甫（福建漳州农业科学研究所）、蜀恢527（四川农业大学水稻研究所）、蜀恢158（四川农业大学水稻研究所）、华占（中国水稻所）和南京11（江苏省农业科学院粮食作物研究所）。

以上材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为：张亚东等,中国水稻科学,2013,27(2):122-128;钱金敖等,江苏农业科学,2005,4:305;蒋云洪等,山东农业科学,1981,2:28-29;吴竞伦等,江苏农业科学,1992,3:6-8;王飞华,扬州大学硕士论文,2009,23;王才林等,中国稻米,2007,13(2):33-34;王志明等,中国种业,2011,5:75;戴正元等,江苏农业科学,1997,4:13-14;吴方喜等，福建农业学报,2011,26(6):1101-1112;陈建明等,种子,2002,3:50-51;林世成,闵绍楷,中国水稻品种及其系谱.上海:上海科学技术出版社.1991:312;高明亮等,杂交水稻,2001,16(2):5-6;王玉平等,杂交水稻,2004,19(4):12-14;吴先军等,中国种业,2007,10:70;禹盛苗等,杂交水稻,2009,24(6):42-44;林世成,闵绍楷,中国水稻品种及其系谱.上海:上海科学技术出版社.1991:318。

（二）粒长基因GS3分子标记的开发

（1）长、大粒水稻种质资源的筛选

通过对江苏省农业种质资源中期库低温保藏的3000余份水稻种质资源进行粒型性状的鉴定、分析，从中筛选到1份来源于天鹅谷///9520//（72-496/御糯）杂交后代，长、大粒粳稻稳定品系TD70。通过连续多年粒型表型测定，TD70粒长13.70±0.10mm，千粒重80.75±2.35g，短、小粒印度籼稻品种Kasalath粒长8.09±0.06mm，千粒重20.25±0.12g，两者差异非常显著（图1）。

（2）TD70/Kasalath重组自交系粒长基因的QTL定位研究

利用长、大粒水稻品系TD70与短、小粒籼稻品种Kasalath杂交，经单粒传法构建了包含240个株系的重组自交系群体，利用141个在亲本间存在多态性差异的微卫星标记绘制了该群体的分子连锁图谱，以粒长测定值为试验数据，利用QTL IciMapping3.1软件，以LOD值2.5作为阈值，采用完备区间作图法在全基因组范围内进行扫描，检测粒长性状QTL位点，在水稻第3染色体上定位到1个主效粒长QTL-qGL3-1。分析TD70和Kasalath qGL3-1的基因序列，发现它们之间存在多处碱基差异。其中第2外显子上存在一个单核苷酸C-A的替换，使蛋白翻译提前终止，进而使TD70粒型变长、变大，因此确定qGL3-1就是已报道的粒长基因GS3。

（3）标记的引物设计

根据TD70和Kasalath在GS3位点第2外显子165位核苷酸处存在C到A的单碱基变异，从NCBI网站下载已公布的GS3基因组BAC克隆序列（序列号为：DQ355997），设计了四引物PCR分子标记（图2），其引物序列为：

正向外引物GS3-O-F序列：5'-CCTCAGACATCACCTGAAAAGTTGACAGGC-3'

反向外引物GS3-O-R序列：5'-CGGTCAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3'

正向内引物GS3-I-F序列：5'-TCCACGCTGCCTCCAGATGCCGA-3'

反向内引物GS3-I-R序列：5'-AGAAACAGCAGGCTGGCTTACTCTTTG-3'

（三）分子标记分析

（1）水稻品种基因组DNA的提取

水稻品种基因组DNA的提取（SDS法），参照Dellaporta S L,et al.,Plant Mol Biol Rep,1983,1(1):19221。具体步骤为：取水稻苗期叶片，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入1.5mL离心管；加入600uL提取液（20%SDS，1MTris-HCl，0.5MEDTA，5MNaCl，65℃预热），摇匀，65℃温浴30min，中间振荡3～4次；加入1/4体积5MKAC,摇匀后置冰上30min；加入氯仿-异戊醇（24:1）300～400uL，在摇床上充分振荡，120rpm，30min；8000～10000rpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清（400uL左右）至另一离心管；加入等体积氯仿-异戊醇（24:1），摇床上充分振荡，80～90rpm，30min；8000rpm离心15分钟，转移上清（400uL左右）至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12000rpm离心6min；弃无水乙醇，加入4℃70%乙醇，放置10min，弃上清，超净工作台上风干1h；加入100～200uLTE，-20℃保存。

（2）分子标记的扩增和电泳检测

GS3基因四引物PCR分子标记的引物序列为：

正向外引物GS3-O-F序列：5'-CCTCAGACATCACCTGAAAAGTTGACAGGC-3'

反向外引物GS3-O-R序列：5'-CGGTCAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3'

正向内引物GS3-I-F序列：5'-TCCACGCTGCCTCCAGATGCCGA-3'

反向内引物GS3-I-R序列：5'-AGAAACAGCAGGCTGGCTTACTCTTTG-3'，

将所述四条分子标记引物GS3-O-F、GS3-O-R、GS3-I-F和GS3q-I-R加入同一PCR反应体系，对不同水稻品种和TD70/Kasalath重组自交系群体各株系的DNA进行PCR扩增；

20μL PCR反应体系包括：20ng/μL的DNA2.0μL，4nmol/L的引物2.0μL，其中引物GS3-O-F、GS3-O-R、GS3-I-F和GS3-I-R各0.5μL，含25mmol/L MgCl₂的10×PCR Buffer2.0μL，2.5mmol/L的dNTP0.4μL，2U/μL的Taq0.5μL和ddH₂O13.1μL；

PCR反应程序包括：94℃预变性5min；然后94℃变性30s、63.4℃复性30s、72℃延伸1min，循环33次；然后72℃延伸10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；反应产物在质量比浓度为2.0%的琼脂糖凝胶上100V电泳50min，经DuRed核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。

（四）本发明四引物PCR分子标记对不同水稻品种GS3基因型的检测

以长、大粒品系TD70和短、小粒品种Kasalath为对照，对6个粳稻品种武粳13、日本晴、苏御糯、桂朝糯、南粳44、武运粳23以及9个籼稻品种9311、明恢63、珍汕97、桂朝2号、龙特甫、蜀恢527、蜀恢158、华占、南京11的DNA进行GS3基因型的检测。四引物PCR扩增产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳可显示两种类型的条带。其中被外引物GS3-O-F和GS3-O-R扩增的270bp的条带在每个DNA样品中均出现，它不仅起阳性对照的作用（检测DNA能否得到有效扩增），同时也可以有效降低非特异PCR产物的扩增以及引物二聚体的形成。除270bp的共有条带外，粳稻品种苏御糯和籼稻品种9311、明恢63、蜀恢527、蜀恢158、华占还能扩增出一条约145bp的特征条带，该条带是由正向外引物GS3-O-F和反向内引物GS3-I-R扩增产生的，它扩增的是GS3位点第2外显子165位核苷酸处碱基序列为A的等位位点（即长、大粒品系TD70基因型，GS3-^TGS3-^T），而其它粳稻品种武粳13、日本晴、桂朝糯、南粳44、武运粳23和籼稻品种珍汕97、桂朝2号、龙特甫、南京11则能扩增出除270bp以外的一条175bp的特征条带，该条带是正向内引物GS3-I-F和反向外引物GS3-O-R扩增产生的，它扩增的是GS3位点第2外显子165位核苷酸处碱基序列为C的等位位点（即短、小粒品种Kasalath基因型，GS3-^KGS3-^K）（图3）。

为验证四引物PCR分子标记对粒长基因GS3单碱基变异位点检测的准确性，成熟后对上述水稻材料进行粒长性状的测量。结果表明，与TD70带型相同的品种多为籼稻品种，粒长变异范围在9.67-11.90mm之间，属长粒型品种，而与Kasalath带型相同的品种多为粳稻品种且粒长变异范围在7.24-8.76之间，属短粒型品种（表1）。

表1不同籼、粳稻品种GS3基因型和粒长表型值

（五）本发明四引物PCR分子标记对TD70/Kasalath重组自交系群体GS3基因型的检测和粒长表型值的比较

用GS3基因的四引物功能性标记对来源于TD70/Kasalath重组自交系群体中的240个株系进行基因型检测。结果表明，只具有粒长基因GS3等位性差异的162个株系中，与TD70带型相同的株系（GS3-^TGS3-^T）有48个，与Kasalath带型相同的株系（GS3-^KGS3-^K）有114个（图4）。通过对两种基因型株系粒长变异情况的分析发现，含GS3-^TGS3-^T基因型株系粒长平均值为9.98mm，含GS3-^KGS3-^K基因型株系粒长平均值为8.72mm，两者存在极显著差异（表2）。这说明GS3基因对TD70/Kasalath重组自交系群体中不同株系的粒长有较大影响，是粒长性状重要的主效位点。

表2具有粒长基因GS3差异的不同基因类型株系的粒长表现

（六）本发明分子标记方法用于水稻品种Kasalath粒长性状的改良

选用长、大粒品系TD70为粒长基因GS3-^T的供体，短、小粒品种Kasalath为受体，采用回交育种的策略，定向改良Kasalath的粒长性状。在连续回交和自交的过程中，利用本发明GS3基因的四引物PCR分子标记进行跟踪检测，并结合农艺性状的系统选择，至BC₃F₃代获得粒长基因型为GS3-^TGS3-^T，其它农艺性状与原始Kasalath基本一致的粒长改良品系—Kasalath-GS3-^T，其具体选育过程详见图5。通过对Kasalath-GS3-^T和原始品种Kasalath的粒长和千粒重的比较分析，发现含GS3-^TGS3-^T纯合基因型的改良系粒长为10.24±0.14mm，千粒重26.5±0.15g，含GS3-^KGS3-^K纯合基因型的Kasalath粒长为8.09±0.06mm，千粒重20.25±0.12g，两者间存在极显著差异（图6）。这表明利用本发明的分子标记方法能够对粒长基因GS3的基因型进行选择，进而实现对粒长性状快速、准确的改良。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种鉴定水稻粒长基因GS3不同基因型的四引物分子标记方法

<130> 0

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 1

<220>

<221> GS3-O-F

<222> (1)..(30)

<223>

<400> 1

cctcagacat cacctgaaaa gttgacaggc 30

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> GS3-O-R

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 2

cggtcaaagt tcatgatcaa aaactgggg 29

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> GS3- I -F

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 3

tccacgctgc ctccagatgc cga 23

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 了

<220>

<221> GS3- I -R

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 4

agaaacagca ggctggctta ctctttg 27

Claims

1.一种鉴定水稻粒长基因GS3不同基因型的四引物分子标记方法，其特征在于：

用GS3基因特异性引物：

正向外引物GS3-O-F序列5'-CCTCAGACATCACCTGAAAAGTTGACAGGC-3'

反向外引物GS3-O-R序列5'-CGGTCAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3'

正向内引物GS3-I-F序列5'-TCCACGCTGCCTCCAGATGCCGA-3'

反向内引物GS3-I-R序列5'-AGAAACAGCAGGCTGGCTTACTCTTTG-3'

扩增水稻基因组DNA，如果同时含有270bp和145bp两条特征条带，则为含粒长基因型GS3-^TGS3-^T的纯合体；如果同时含有270bp和175bp两条特征条带，则为含粒长基因型GS3-^KGS3-^K的纯合体，如果同时存在270bp、175bp和145bp三条特征条带，则为含粒长基因型GS3-^TGS3-^K的杂合体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

(1)水稻植株基因组DNA的提取；

(2)将权利要求1中所述的GS3基因特异性引物GS3-O-F、GS3-O-R、GS3-I-F和GS3-I-R加入同一PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；

20μL PCR反应体系包括：20ng/μL的DNA 2.0μL，4nmol/L的引物2.0μL：其中引物GS3-O-F、GS3-O-R、GS3-I-F和GS3-I-R各0.5μL，含25mmol/L MgCl₂的10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 0.4μL，2U/μL的Taq 0.5μL和ddH₂O 13.1μL；

PCR反应程序包括：94℃预变性5min；然后94℃变性30s、63.4℃复性30s、72℃延伸1min，循环33次；然后72℃延伸10min后，将扩增产物加入上样缓冲液终止反应；

(3)反应产物在质量比浓度为2.0％的琼脂糖凝胶上100V电泳50min，经DuRed核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。