CN111304359B

CN111304359B - 一种与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记及应用

Info

Publication number: CN111304359B
Application number: CN202010331535.2A
Authority: CN
Inventors: 解丽霞; 郑崇珂; 谢先芝; 李稳; 周冠华; 蒲梦琳; 周晋军; 和亚男; 彭永彬; 李亚萍; 张治振
Original assignee: SHANDONG RICE RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: SHANDONG RICE RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2040-04-24
Also published as: CN111304359A

Abstract

本发明公开了一种与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记及应用。本发明研究发现，相比日本晴，海稻86的基因组存在一处缺失359bp的变异(Deletion)，为分子标记M324。经QTL定位发现，水稻种子萌发耐盐QTL定位于物理距离约900kb的区间内，与分子标记M324紧密连锁，利用上述变异位点上下游序列设计了分子标记M324的扩增引物，采用该引物对水稻基因组DNA进行PCR扩增，得到清晰且明亮的3种条带，可以用于水稻种子耐盐萌发的早期筛选。

Description

一种与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记及应用

技术领域

本发明涉及一种与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记及应用，属于植物生物技术领域。

背景技术

水稻是世界上重要粮食作物之一，全球约一半的人口以稻米为主食。随着人口的不断增长，对稻米的需求也日益增长，据估计到2050年粮食缺口将达到1.37亿吨，而稻米缺口将达到1.03亿吨(顾国达，尹靖华，2014，华中农业大学学报(社会科学版)，6:6-16)。然而，盐胁迫严重制约着作物产量，是植物非生物胁迫的重要因子。全球大约有2.3亿公顷的灌溉用地，其中4500万公顷受到盐胁迫(FAO,2008)。据估计，高盐胁迫造成了全球大约20％农作物产量的降低(Botella等，2005，Plant adaptive responses to salinity stress，37-70)。水稻是盐敏感植物，盐对水稻幼苗建成、生长发育、产量都有严重影响(Letts等，1995,J Exp Bot,46,(12),1843-1852)。我国的盐碱土地面积达到了一亿公顷，受盐侵害的稻田约占栽培面积的五分之一，并且土壤盐渍化有日益扩大和加剧的趋势，造成的产量损失已难以估算。

植物对盐的耐性是个典型的数量性状，由多基因控制，涉及分子、生理、生化等多方面机制(Gain等，2019,Theor Appl Genet,2019,132,(4),851-870)。目前对这种数量性状的研究多采用遗传连锁图谱结合表型的QTL定位方法(Quantitative trait locimapping)。到目前为止，水稻中已定位的耐盐QTL多达几百个，分别调控水稻种子萌发(Shi等，2017，BMC Plant Biol,17,(1),92)、幼苗(Sun等，2019，Euphytica,215,(9))、成熟期(Mondal等，2019，Plant Breeding and Biotechnology,7,(4),302-312)的耐盐性。

海稻86是在广东湛江红树林中发现的耐盐水稻品种，在2014年审请了农业植物新品种。该品种耐盐、耐淹，抗逆性强，因此是培育耐盐水稻优良的种质资源，具有研究潜在的利用价值。为此，我们利用海稻86和日本晴构建了F₂分离群体及以日本晴为背景的海稻86BC₄F₂回交群体，用种子萌发作为鉴定耐盐指标，鉴定到一个与耐盐QTL紧密连锁的分子标记。

发明内容

本发明研究发现，相比日本晴，海稻86的基因组存在一处缺失359bp的变异(Deletion)，根据这个变异设计了分子标记M324扩增引物。经QTL定位发现，水稻种子萌发耐盐QTL定位于物理距离约900kb的区间内，与分子标记M324紧密连锁。利用上述变异位点上下游序列设计了分子标记M324的扩增引物，采用该引物对水稻基因组DNA进行PCR扩增，得到清晰且明亮的3种条带，可以用于水稻耐盐性的鉴定。

本发明的技术方案是：一种与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记，其为分子标记M324，其在种子萌发耐盐的水稻DNA片段中表现出缺失359bp的变异；它包括Seq No.1和Seq No.2所示的DNA片段组成，其中Seq No.1所示的DNA片段与水稻种子萌发耐盐连锁，Seq No.2所示的DNA片段与水稻种子萌发不耐盐连锁。

海稻86M 324分子标记的上下游碱基序列如下所示(Seq No.1)：

TGTTGACATTTTGAGATTTACTTGGTCACCACAGAATTACTTACCCTTGTATGTATACATTCCAAGGATGGCAATGCTTCGAACCCAACATGCACAAAATTCAATGGTGGACTCAATCCACTAGACTACATTAGAATTAAGTATAATGTGCAAACTACCGTATTTAATATGGCATAATAGAGAATAGGCACCCAAATAAATCAATCCTTGTAAATGAGATCATATCTAAAACGCTAAGGGCTTATTCGGATCGGAGGGTAAACTCAGGAAAAACATAGGATCTGCATTCCTATGGATTCGGGTACTGTAGCAGCCTAAGATTTTTGAAACTGGAGAGTACTTCTCACTCCAACTACTGCCAATTTAAATCTCTTCTCCTTACTACTTCTCAACCACCCTCTCTCTTCCAAACACTGCTTGTTTAACGAGGACGTACTTCCTTCCCAATTTGTCTTATACTTTTTTTTAGATAAGGGTATTTTTACCCGGCCTCTACATCTAACCGGATATATACGGCCATTGAAATAGGGAACTTAGCCCCGCAAACAACCCAATCT

日本晴M324分子标记上下游的碱基序列如下所示(Seq No.2)：

TGTTGACATTTTGAGATTTACTTGGTCACCACAGAATTACTTACCCTTGTATGTATACATTCCAAGGATGGCAATGCTTCGAACCCAACATGCACAAAATTCAATGGTGGACTCAATCCACTAGACTACATTAGAATTAAGTATAATGTGCAAACTACCGTATTTAATATGGCATAATAGAGAATAGGCACCCAAATAAATCAATCCTTGTAAATGAGATCATATCTAAAACGCTAAGGGCTTATTCGGATCGGAGGGTAAACTCAGGAAAAACATAGGATCTGCATTCCTATGGATTCGGGTACTGTAGCAGCATTCGGATCAAAGGAATCCCCTGTAGGAAAATCAGAGGAAATTCGAAGGAAAATTTCC TTGGCCATCCATTCCACAGGAAAACAAACAATCCACTCCAACCTCTTTTTATTTTTCCTGTGCATGGGAACGAGGC AATCAACAAACTAATCTTCACAAGCTTCACTCCTCTGACACATGATGATTTTAGTTAGTGGGTAGGTTCTTTAAAA ATTCCTATGTTTTTCCTACGCTCTATCCGAACGCATGTTTATATAGTATTCCTATGTTTTTCAATTCTCTGTTTTA CACGTGCATTCCTATCATATTCCTATGATTTTCCTATTCCTGTGTTTTTTCAATCCTCCATTCCGAATAAGCCCTAAGATTTTTGAAACTGGAGAGTACTTCTCACTCCAACTACTGCCAATTTAAATCTCTTCTCCTTACTACTTCTCAACCACCCTCTCTCTTCCAAACACTGCTTGTTTAACGAGGACGTACTTCCTTCCCAATTTGTCTTATACTTTTTTTTAGATAAGGGTATTTTTACCCGGCCTCTACATCTAACCGGATATATACGGCCATTGAAATAGGGAACTTAGCCCCGCAAACAACCCAATCT(下划线字体部分为海稻86缺失的359bp)

本发明还利用上述变异位点上下游序列设计了一种分子标记M324的扩增引物，具体为：

上游引物M324-F：5’-TGTTGACATTTTGAGATTTACTTGGTCACC-3’(Seq No.3)；

下游引物M324-R：5’-AGATTGGGTTGTTTGCGGGGCTA-3’(Seq No.4)。

上述的分子标记M324的扩增引物可用于水稻种子耐盐萌发的早期筛选，也可以用于鉴定日本晴和海稻86及二者的杂合体(如BC₄F₂群体)。

本发明还公开了应用上述引物鉴定水稻耐盐(日本晴基因型、海稻86基因型及二者的杂合体)的方法，具体包括以下步骤：

(1)利用上游引物M324-F和下游引物M324-R对水稻基因组DNA进行PCR扩增；

(2)对步骤(1)得到的PCR扩增产物进行电泳分析，扩增出916bp大小条带的为日本晴基因型(不耐盐)，扩增出557bp大小条带的为海稻86基因型(耐盐)；同时扩增出916bp和557bp大小条带的为水稻日本晴基因型和海稻86基因型的杂合体。

步骤(1)中所述的PCR扩增体系可以利用普通PCR buffer进行扩增，也可以用PCRmix进行扩增，优选体系为20μL体系，用PCR mix进行扩增。

本实验所用PCR mix为全式金公司2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)，PCR反应体系包括如下组分：基因组DNA(50ng/μL)2μL；上游引物M324-F(10μM)0.3μL；下游引物M324-R(10μM)0.3μL；2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL；ddH₂O补足20μL。

步骤(1)所述的PCR扩增反应程序优选为：94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃后延伸5min。

本发明的有益效果是：

(1)本发明开发了一种与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记M324，从而可以对水稻耐盐基因进行有效、快速、可靠的鉴定，便于水稻种子耐盐萌发的早期筛选。

(2)本发明的分子标记M324扩增引物利用普通PCR技术，能够特异性的检测耐盐基因。与已有标记相比，本标记扩增更加简单、快速，且条带清晰、明亮，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短。

附图说明

图1为日本晴和海稻86分子标记M324扩增出的序列比对结果；HD86-M324，Nip-M324分别表示海稻86和日本晴分子标记M324扩增出的序列；

图2为利用本标记引物M324-F/M324-R，PCR mix进行PCR扩增的结果；其中M:2000bp DNA ladder；1：日本晴PCR产物；2：海稻86PCR产物；3：杂合体PCR产物；

图3为部分BC₄F₂群体M324标记基因型电泳图；

图4为日本晴和海稻86杂交群体耐盐QTL定位图；其中，A.日本晴和海稻86杂交F2群体耐盐QTL初定位图及分子标记与表型的连锁分析；B.BC₄F₂群体基因型及耐盐QTL精细定位图；C.BC₄F₂群体耐盐表型。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：一种鉴定水稻种子萌发耐盐分子标记的建立

(1)引物设计

我们对海稻86进行了基因组重测序，与日本晴参考基因组对比发现：海稻86存在一个359bp的缺失变异，如图1所示。

根据序列差异，用Primer 5设计引物序列如下：

上游引物M324-F：5’-TGTTGACATTTTGAGATTTACTTGGTCACC-3’(Seq No.3)；

下游引物M324-R：5’-AGATTGGGTTGTTTGCGGGGCTA-3’(Seq No.4)。

(2)扩增片段理论分析

日本晴和海稻86基因组DNA分别能扩增出一条916bp和557bp的片段(Seq No.1-2)。

实施例2：利用M324分子标记分析日本晴、海稻86及以日本晴为轮回亲本携带海稻86片段的BC₄F₂分离群体的基因型

(1)水稻叶片基因组DNA的提取

试验材料包括日本晴、海稻86及以36株BC₄F₂分离群体

选取水稻单株的幼嫩叶片，采用SDS法提取水稻的基因组DNA，具体步骤如下：

①取适量叶片置于2mL离心管中，加入DNA提取液300μL，加入钢珠一枚，用组织破碎研磨仪震荡30s左右；

②将离心管置于65℃水浴30min，期间上下颠倒混匀2-3次；

③静置至室温，加入等体积的氯仿，上下剧烈摇动，充分混匀；

④12000rpm离心10min，吸上清约200μL到新的灭菌的1.5mL离心管中；

⑤加入等体积的预冷的异丙醇上下颠倒混匀，-20℃放置30min左右，使DNA充分沉淀；

⑥12000rpm离心10min，倒掉上清，加入500μL 75％乙醇漂洗一次；

⑦12000rpm瞬间离心，倒掉上清后将离心管倒置在纸巾上，静置2min；

⑧通风厨内干燥DNA后加入适量1×TE buffer溶解DNA；

⑨置于-20℃保存，备用。

(2)利用分子标记M324分析日本晴、海稻86及BC₄F₂分离群体的基因型

利用鉴定引物M324-F(Seq No.3)/M324-R(Seq No.4)进行PCR扩增，20μL 2×PCRMix(TRANSGEN)体系为：DNA模板(50ng/μL)2μL，10μM引物(M324-F和M324-R)各0.3μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL，用ddH₂O补足20μL；PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃后延伸5min。

(3)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测、酶切和基因型判定

PCR扩增产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳(1×TAE,120V,时间20min)，利用君意凝胶成像系统观察，结果发现本引物能够在群体中扩增清晰的、非常明亮的3种条带，片段大小与预期一致(如图2-3所示)。扩增出916bp大小条带的为日本晴基因型；扩增出557bp大小条带的为海稻86基因型；同时扩增出916bp和557bp大小条带的为水稻日本晴基因型和海稻86基因型的杂合体。

实施例3：海稻86和日本晴分离群体种子耐盐萌发率的QTL定位

海稻86、日本晴及群体F_2:3家系(BC₄F₂群体)各选取籽粒饱满、大小均匀一致的50粒种子，用70％乙醇表面消毒1分钟，放置于铺有一张灭过菌滤纸的玻璃平皿中，加入20ml2％NaCl溶液，放于30℃黑暗培养箱中，每天更换新的NaCl溶液10ml，10天后统计萌发率。试验重复三次，平均值为每个株系的种子萌发率。

我们前期研究结果表明耐盐QTL定位与分子标记CHR1-30M和CHR1-36M之间(图4A)，基于36株在此区间有交换的BC₄F₂群体单株的表型进行单因素方差分析，结果表明耐盐QTL定位与分子标记M324与M334之间，物理距离约900kb(图4B和4C)。单个标记的基因型与表型进行t-test检验分析发现CHR1-M30，M324，M329标记的基因型与种子耐盐萌发率紧密连锁，p值分别为0.018，0.004，0.010(图4B)，其中M324连锁最紧密，故M324为种子萌发耐盐的分子标记。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省水稻研究所

<120> 一种与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记及应用

<130> 0

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 557

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 海稻86 M324分子标记的上下游碱基序列

<400> 1

tgttgacatt ttgagattta cttggtcacc acagaattac ttacccttgt atgtatacat 60

tccaaggatg gcaatgcttc gaacccaaca tgcacaaaat tcaatggtgg actcaatcca 120

ctagactaca ttagaattaa gtataatgtg caaactaccg tatttaatat ggcataatag 180

agaataggca cccaaataaa tcaatccttg taaatgagat catatctaaa acgctaaggg 240

cttattcgga tcggagggta aactcaggaa aaacatagga tctgcattcc tatggattcg 300

ggtactgtag cagcctaaga tttttgaaac tggagagtac ttctcactcc aactactgcc 360

aatttaaatc tcttctcctt actacttctc aaccaccctc tctcttccaa acactgcttg 420

tttaacgagg acgtacttcc ttcccaattt gtcttatact tttttttaga taagggtatt 480

tttacccggc ctctacatct aaccggatat atacggccat tgaaataggg aacttagccc 540

cgcaaacaac ccaatct 557

<210> 2

<211> 916

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 日本晴M324分子标记上下游的碱基序列

<400> 2

tgttgacatt ttgagattta cttggtcacc acagaattac ttacccttgt atgtatacat 60

tccaaggatg gcaatgcttc gaacccaaca tgcacaaaat tcaatggtgg actcaatcca 120

ctagactaca ttagaattaa gtataatgtg caaactaccg tatttaatat ggcataatag 180

agaataggca cccaaataaa tcaatccttg taaatgagat catatctaaa acgctaaggg 240

cttattcgga tcggagggta aactcaggaa aaacatagga tctgcattcc tatggattcg 300

ggtactgtag cagcattcgg atcaaaggaa tcccctgtag gaaaatcaga ggaaattcga 360

aggaaaattt ccttggccat ccattccaca ggaaaacaaa caatccactc caacctcttt 420

ttatttttcc tgtgcatggg aacgaggcaa tcaacaaact aatcttcaca agcttcactc 480

ctctgacaca tgatgatttt agttagtggg taggttcttt aaaaattcct atgtttttcc 540

tacgctctat ccgaacgcat gtttatatag tattcctatg tttttcaatt ctctgtttta 600

cacgtgcatt cctatcatat tcctatgatt ttcctattcc tgtgtttttt caatcctcca 660

ttccgaataa gccctaagat ttttgaaact ggagagtact tctcactcca actactgcca 720

atttaaatct cttctcctta ctacttctca accaccctct ctcttccaaa cactgcttgt 780

ttaacgagga cgtacttcct tcccaatttg tcttatactt ttttttagat aagggtattt 840

ttacccggcc tctacatcta accggatata tacggccatt gaaataggga acttagcccc 900

gcaaacaacc caatct 916

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 上游引物M324-F

<400> 3

tgttgacatt ttgagattta cttggtcacc 30

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> artidicial

<400> 4

agattgggtt gtttgcgggg cta 23

Claims

1.一种与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记，其为分子标记M324，所述分子标记的序列为SEQ IDNO：1或者SEQ ID NO：2，其中SEQ ID NO：1所示的DNA片段与水稻种子萌发耐盐连锁，SEQ ID NO：2所示的DNA片段与水稻种子萌发不耐盐连锁；所述水稻为海稻86和日本晴的分离群体。

2.权利要求1所述的与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记的扩增引物在海稻86和日本晴分离群体种子耐盐萌发的早期筛选方面的应用；所述扩增引物的上游引物M324-F：5’- TGTTGACATTTTGAGATTTACTTGGTCACC -3’；下游引物M324-R：5’-AGATTGGGTTGTTTGCGGGGCTA -3’。

3.权利要求1所述的与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记的扩增引物在鉴定水稻日本晴、海稻86及二者的杂合体方面的应用；所述扩增引物的上游引物M324-F：5’-TGTTGACATTTTGAGATTTACTTGGTCACC -3’；下游引物M324-R：5’- AGATTGGGTTGTTTGCGGGGCTA-3’。

4.一种鉴定水稻日本晴、海稻86及二者的杂合体的方法，其特征是，

（1）利用权利要求1所述的与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记的扩增引物的上游引物M324-F和下游引物M324-R对水稻基因组DNA进行PCR扩增；所述上游引物M324-F：5’-TGTTGACATTTTGAGATTTACTTGGTCACC -3’；下游引物M324-R：5’- AGATTGGGTTGTTTGCGGGGCTA-3’；

（2）对步骤（1）得到的PCR扩增产物进行电泳分析，

扩增出916bp大小条带的为日本晴基因型；

扩增出557bp大小条带的为海稻86基因型；

同时扩增出916bp和557bp大小条带的为水稻日本晴基因型和海稻86基因型的杂合体。

5.如权利要求4所述的鉴定水稻日本晴、海稻86及二者的杂合体的方法，其特征是，

所述步骤（1）PCR扩增的反应体系包括如下组分：50ng/μL基因组DNA 2μL；10μM的上游引物M324-F 0.3μL；10μM的下游引物M324-R 0.3μL；2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL；ddH₂O 补足20μL。

6.如权利要求5所述的鉴定水稻日本晴、海稻86及二者的杂合体的方法，其特征是，所述步骤（1）所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃后延伸5min。