CN113512551B - 调控大豆籽粒大小基因的克隆及应用 - Google Patents
调控大豆籽粒大小基因的克隆及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113512551B CN113512551B CN202110668553.4A CN202110668553A CN113512551B CN 113512551 B CN113512551 B CN 113512551B CN 202110668553 A CN202110668553 A CN 202110668553A CN 113512551 B CN113512551 B CN 113512551B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- gmmft
- soybean
- vector
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 92
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 title claims abstract description 80
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 71
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 46
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 4
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 37
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 32
- 101150009243 HAP1 gene Proteins 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 102000051624 phosphatidylethanolamine binding protein Human genes 0.000 description 8
- 108700021017 phosphatidylethanolamine binding protein Proteins 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012883 rooting culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000014284 seed dormancy process Effects 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101500028013 Bos taurus Spleen trypsin inhibitor II Proteins 0.000 description 1
- 241001107116 Castanospermum australe Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-SNTJWBGVSA-N LSM-6641 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-SNTJWBGVSA-N 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 235000021279 black bean Nutrition 0.000 description 1
- 229960002727 cefotaxime sodium Drugs 0.000 description 1
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012877 elongation medium Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 210000001113 umbilicus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Abstract
本发明提供了一种培育产量提高的大豆的方法，其包括将GmMFT基因或包含GmMFT基因的载体或宿主细胞转化到大豆植物细胞或组织中并培育，获得产量增加的大豆植株。同时，本发明公开了GmMFT基因或包含GmMFT基因的载体或宿主细胞在培育产量提高的大豆中的用途。本发明对于大豆育种及其相关应用研究将具有重大理论和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一个调控大豆百粒重基因的克隆及应用。
背景技术
大豆是我国重要的经济油料作物，由于我国大豆平均亩产较低，造成我国大豆产量远不能满足我国大豆消费需求，导致每年大豆进口量接近1亿吨，严重威胁我国粮食安全，所以提高我国大豆产量刻不容缓。
PEBP(phosphatidylethanolamine binding protein)家族是植物体内一类保守的蛋白家族，最早被发现具有调控植物开花时间的功能(Banfield et al.,1998；Hengstet al.,2001)。PEBP家族主要分为三类：TFL1(TERMINAL FLOWER1-like)类，FT(FLOWERINGLOCUS T-like)类和MFT(MOTHER OF FT AND TFL1-like)类(Danilevskaya et al.,2008)。大豆中已报道的PEBP家族成员如GmFT系列均与开花时间相关(Cai et al.,2020；Takeshima et al.,2016；Yamanaka et al.,2005；Zhai et al.,2014)，或公开了GmMFT调控大豆种子休眠(Li et al.,2014)。在大豆中未见相关PEBP家族成员参与籽粒发育的报道。
因此，探索研究大豆中PEBP家族成员对大豆籽粒发育的调控机制具有重要意义，对改善提高大豆的产量和品质具有十分重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种PEBP家族的编码基因在提高大豆产量中的应用，具体地，本发明的目的是提供一种PEBP家族的编码基因在提高大豆百粒重中的应用。
本发明通过关联分析法在全基因组水平上对大豆粒重和粒形等复杂产量性状的遗传调控位点进行解析，通过整合单倍型、基因表达谱、同源基因功能注释和以往大豆粒重和粒形相关QTL信息，运用分子生物学和比较基因组学的手段，克隆到了一个调控大豆产量的相关基因SoyZH13_05G229200(W82版本基因号：Glyma.05G244100，在本文中也称为GmMFT或GmMFTHap1)，前人已报道该基因为GmMFT且参与种子休眠生理过程(Li et al.,2014)，但并未报道该基因具有调控大豆种子百粒重的功能，所以本发明首次发现了该基因在调控大豆百粒重中的功能，为后续分子辅助育种和分子设计育种提供理论基础和基因资源。
其中，上述GmMFT基因编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；在本发明的具体实施方案中，所述GmMFT基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。在本发明的具体实施方案中，所述GmMFT基因的gDNA序列如SEQ ID NO:3所示。在本发明的具体实施方案中，所述GmMFT基因的启动子序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明中，可用现有的植物表达载体构建含有目的基因的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述植物表达载体中还可以包含增强子，以增加插入的核苷酸片段的表达。
为实现上述目的，本发明还提供一种获得转基因大豆的方法，其是将前述核酸或包含前述基因的载体或宿主细胞导入目的大豆中，得到与所述目的大豆相比表现为籽粒增大的转基因大豆。
其中，导入目的大豆的方法可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的大豆细胞或组织培育成植株。
为实现上述目的，本发明还提供一种如前所述的蛋白质或如前所述的核酸或包含前述基因的载体或宿主细胞在大豆基因工程中的应用。
其中，所述大豆基因工程优选为以提高大豆产量为目的的大豆基因工程。
本发明提供的大豆粒重相关蛋白及其编码核酸在调控大豆百粒重方面的功能均为申请人的首次发现，且经过转基因植株和野生型植株的表型分析验证说明互补表达本发明的大豆粒重相关蛋白能够使大豆转基因植株粒重增加。本发明对于大豆高产育种及其相关应用研究将具有重大理论和应用价值。
综上所述，本发明提供以下实施方案：
1、培育产量提高的大豆的方法，其包括将GmMFT基因或包含GmMFT基因的载体或宿主细胞转化到大豆植物细胞或组织中并培育，获得产量增加的大豆植株。
2、根据项目1所述的方法，其中所述GmMFT基因编码大豆粒重相关蛋白的基因，其中，所述大豆粒重相关蛋白为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3、根据项目1或2所述的方法，其中，所述GmMFT基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
4、根据项目1或2所述的方法，其中，所述GmMFT基因的gDNA序列如SEQ ID NO:3所示。
5、根据项目1或2所述的方法，其中，所述GmMFT基因的启动子序列如SEQ ID NO:4所示。
6、根据项目1或2所述的方法，其中，所述载体为植物表达载体，包括双元农杆菌载体和/或可用于植物微弹轰击的载体。
7、根据项目1或2所述的方法，其中，所述载体还包含增强子。
8、根据项目1或2所述的方法，其中，所述宿主细胞为农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)细胞。
9、GmMFT基因或包含GmMFT基因的载体或宿主细胞在培育产量提高的大豆中的用途。
10、根据项目9所述的用途，其中所述GmMFT基因编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；优选地，所述GmMFT基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
附图说明
图1显示了SoyZH13_05G229200(W82版本基因号：Glyma.05G244100，也称为GmMFT或GmMFTHap1)基因的克隆。其中，a:大豆粒厚性状的全基因关联分析。b:粒厚性状的QQ点图。c:粒厚候选区间内SNPs的连锁不平衡(p<1×10-5)展示。d:候选区间内所有基因的表达量分析。
图2显示了SoyZH13_05G229200(W82版本基因号：Glyma.05G244100，也称为GmMFT或GmMFTHap1)基因的单倍型分析示意图。其中，a:GmMFT的两种主要单倍型结构(其中，Hap1为高表达GmMFT基因的单倍型；Hap2为低表达GmMFT基因的单倍型)。b-c:自然群体中两种单倍型品种间百粒重和粒厚的t-test检测。d:GmMFT的两种主要单倍型启动子活性比较(n＝8个生物学重复)。e:不同单倍型背景的大豆品种中GmMFT的表达量检测。
图3显示了SoyZH13_05G229200(W82版本基因号：Glyma.05G244100，也称为GmMFT或GmMFTHap1)基因转化载体pTF101.1-gGmMFT-Hap1的图谱示意图。
图4显示了DN50(东农50)野生型和转染pTF101.1-gGmMFT-Hap1质粒获得的转基因植株(gGmMFTHap1 pro::gGmMFTHap1)的表型统计比较。其中，a：DN50野生型和转染pTF101.1-gGmMFT-Hap1质粒获得的转基因植株的籽粒及植株表型比较。b:DN50野生型和转染pTF101.1-gGmMFT-Hap1质粒获得的转基因植株的GmMFT表达量检测。c-d：DN50野生型和转染pTF101.1-gGmMFT-Hap1质粒获得的转基因植株中百粒重及粒厚统计比较。
图5显示了TL(天隆一号)野生型和转染pTF101.1-gGmMFT-Hap1质粒获得的转基因植株(gGmMFTHap1 pro::gGmMFTHap1)的表型统计。其中，a：TL及转基因植株的籽粒表型比较。b：TL及转基因植株中GmMFT表达量检测。c-d:TL及转基因植株的百粒重及粒厚统计。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
以下的实施例是为了便于更好地理解本发明，但并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或按照商品说明书选择。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可市购获得的常规生化试剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
在下述实施例中，转化受体为东农50(DN50)和天隆一号(TL)，其中DN50为黑龙江省审品种(黑审豆2007022)，TL为国家审定品种(国审豆2008023)，均可以从市面购买得到。pTF101.1载体和农杆菌菌株EHA101购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心(BiovectorScience Lab,Inc)。
酶切回收试剂盒等耗材购自New England Biolabs和天根生化科技(北京)有限公司。
实施例1、GmMFT蛋白及其编码基因的发现
本发明人通过GWAS关联分析，并集合转录组数据(参见图1)在大量序列分析和功能验证的基础上，从大豆品种DN50中发现一种大豆粒重相关蛋白质，将其命名为GmMFT蛋白(简称为GmMFT)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将编码GmMFT蛋白的基因命名为GmMFT(或称为GmMFTHap1)基因，其启动子序列如SEQ ID NO.4所示，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明进一步提供了SoyZH13_05G229200(W82版本基因号：Glyma.05G244100，即GmMFT)基因在大豆基因组中的InDel/SNP位点的核苷酸多态性，如图2所示，其可用于检测大豆品种背景。例如，通过杂交，将GmMFT的单倍型1(Hap1)(即，高表达GmMFT基因的单倍型)导入单倍型2(Hap2)(即，低表达GmMFT基因的单倍型)背景的大豆品种中可提高SoyZH13_05G229200(W82版本基因号：Glyma.05G244100，即GmMFT)基因的表达量，并提高单倍型2大豆品种的产量。
实施例2GmMFT蛋白的功能验证
一、重组质粒的构建
从野生型东农50(DN50)中将GmMFTHap1基因的完整基因(其为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，包含GmMFTHap1基因以及GmMFTHap1基因gDNA的上游启动子序列和部分下游核酸序列)进行PCR扩增，然后酶切连接到PTF101.1载体，获得重组质粒pTF101.1-gGmMFT-Hap1。具体操作如下：
1、将大豆品种DN50的叶片从植株上分离下来，提取DNA，获得大豆品种DN50的叶片DNA(具体操作方法可参见Murray and Thompson,1980)。
2、以步骤1获得的总DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(SEQ ID NO.5)。
F：5’-GACTGTGTTTCTCGATCCGTGG-3’(SEQ ID NO.6)；
R：5’-GTTCAGGAATCCTGGTGCATGG-3’(SEQ ID NO.7)。
3、用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切PTF101.1载体(购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心)，回收约9138bp的载体骨架。
4、将步骤2的PCR产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pTF101.1-gGmMFT-Hap1(其图谱见图3)。
二、GmMFTHap1过表达转基因植物的获得
1、将重组质粒pTF101.1-gGmMFT-Hap1导入农杆菌菌株EHA101(购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心)，得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌采用子叶节转化方法(具体操作方法参见Margieetet al.,2004)转化受体植株DN50和TL，收获T0代种子。具体操作步骤如下：
(1)种子灭菌与萌发
挑选圆粒饱满、表面光洁无病斑的DN50(TL)大豆种子于120mm的培养皿中。将培养皿放入干燥器，在干燥器中放入一个250ml烧杯加入100ml次氯酸钠溶液，然后沿着烧杯缓缓加入4ml浓盐酸，立即盖好干燥器的盖子，利用氯气对大豆种子灭菌18h，灭菌后在超净台中开盖吹掉残余的氯气。将灭过菌的大豆种子种脐朝下均匀摆放于萌发培养基(购自Coolaber公司，PM1062)中，每皿30-35粒种子。然后用保鲜袋包好，剪好透气口，放入暗培养箱中，萌发条件为22℃，萌发16小时以上。
(2)农杆菌的侵染及外植体共培养
取萌发好的种子，先切掉一部分子叶，然后沿着下胚轴将种子纵切为对称的两部分，在显微镜下轻轻刮去子叶节处的一对真叶，最后在子叶节处用手术刀轻轻点刺几下即为用于转化的外植体。取冻存于-80℃的甘油保存的重组农杆菌置于冰上解冻后，在超净台中用灭菌枪头蘸取少量菌液画线培养于含有Kan(卡那霉素)和Spe(壮观霉素)的YEP固体培养基上，28℃活化培养2天，然后再用涂布器涂布于新的含有Kan与Spe的YEP固体培养基上，培养过夜，最后将培养过夜的农杆菌用液体共培养基重悬至OD600值为0.6即可。将前述制备好的用于转化的外植体放入重悬好的农杆菌菌液中，置于22℃暗培养箱中侵染过夜，然后用无菌滤纸吸干表面多余的菌液后，将子叶节平铺于铺有无菌滤纸的固体共培养基上，22℃黑暗侵染5天。
其中，液体共培养基的组分为：
(3)转基因苗获得
将共培养5天后的子叶节斜插入芽诱导培养基I(SI-I)中，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，恢复培养7天，剪掉过长的下胚轴后转入含8mg/ml的PPT(草铵膦)的芽诱导培养基II(SI-II)中，继续培养14-20天。将丛生芽从下胚轴切下移入含4mg/mlPPT的芽伸长培养基(SEM)中，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，每10天继代培养一次，直至芽伸长至5cm左右为止。将伸长至5cm左右的幼芽切下，直插入生根培养基，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，直至根伸长至3-4cm，准备移栽。
该步骤中，芽诱导培养基I的组成为B5盐(北京西美杰科技有限公司)，B5维生素(北京西美杰科技有限公司)，30g/L蔗糖，0.6g/L MES(Sigma)，1.6mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤,生工生物工程(上海)股份有限公司,A600743-0025)，50mg/L Cef(头孢噻肟钠,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，150mg/L Tim(特美汀/特美丁,北京西美杰科技有限公司)，4g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶(Sigma)，pH 5.7；芽诱导培养基II的组成为B5盐，B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L MES，1.6mg/L 6-BA，50mg/L Cef，150mg/L Tim，8g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.7；芽伸长培养基的组成为MS盐，B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L MES，0.5mg/L赤霉素GA3(生工生物工程(上海)股份有限公司)，1mg/L ZR(北京西美杰科技有限公司)，50mg/L L-Glu(Sigma)，50mg/L Asp(Sigma)，0.1mg/LIAA(Sigma)，50mg/L Cef，100mg/L Tim，4g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.8；生根培养基的组成为MS盐，B5维生素，20g/L蔗糖，0.6g/L MES，50mg/L L-Glu，50mg/L Asp，1.5mg/L IBA(Sigma)，25mg/LTim，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.8。
(4)炼苗移栽及筛选
将准备移栽的组培苗去掉封口膜，加入少量无菌水，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，培养两天后移苗，将蛭石与草炭土等量混合均匀，放入加水的托盘中，然后将组培苗从生根培养基中拔出冲洗掉根部残余的培养基，移入充分吸饱水分的营养土中。用0.1％ Basta除草剂涂抹大豆叶片，3天后无黄化反应的为转基因阳性植株。
后续T1代及以后传代转基因株系均喷洒0.1％ Basta除草剂筛选，获得成功转入重组质粒pTF101.1-gGmMFT-Hap1的转基因植株(即过表达GmMFT的植株)，并通过使用天平和游标卡尺测量种子的粒重及大小。
实施例3GmMFT的转基因表型统计
本实施例验证了在DN50和TL中成功转入重组质粒pTF101.1-gGmMFT-Hap1之后，所获得的转基因植株的百粒重，粒长，粒宽和粒厚均显著增加(图4-5)。
具体为按照实施例2所示的步骤获得转基因株系并常规培养，对于转基因株系的测量结果见图4-5所示。其中，图4中的#1，#4，#8指的是转基因株系名称，即共获得了3个转基因株系(也叫转基因line),其中，gGmMFTHap1 pro::gGmMFTHap1是指用pTF101.1-gGmMFT-Hap1质粒转染获得的转基因植株，DN50是指野生型DN50植株；图4b为转基因植株中GmMFT基因的表达量，表明转基因株系中GmMFT的表达量升高了(其中，大豆品种东农50(DN50)是野生型，也就是未转基因的本体)；图4c表示转基因株系的百粒重(100-seed weight)相对DN50显著增加；图4d表示粒厚(seed thickness)显著增加。
另外，本实施例还验证了在天隆一号(TL)中成功转入重组质粒pTF101.1-gGmMFT-Hap1之后，所获得的转基因植株的百粒重和粒厚均显著增加。如图5所示。
以上结果说明了，GmMFT基因是调节大豆产量的关键基因，在大豆植株中过表达GmMFT基因可促进大豆百粒重、粒厚的增加，从而提高大豆产量。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
参考文献
Banfield,M.J.,Barker,J.J.,Perry,A.C.,and Brady,R.L.(1998).Functionfrom structure？The crystal structure of human phosphatidylethanolamine-binding protein suggests a role in membrane signal transduction.Structure 6,1245-1254.
Cai,Y.,Wang,L.,Chen,L.,Wu,T.,Liu,L.,Sun,S.,Wu,C.,Yao,W.,Jiang,B.,andYuan,S.(2020).Mutagenesis of GmFT2a and GmFT5amediated by CRISPR/Cas9contributes for expanding the regional adaptability of soybean.Plantbiotechnology journal 18,298-309.
Danilevskaya,O.N.,Meng,X.,Hou,Z.L.,Ananiev,E.V.,and Simmons,C.R.(2008).A genomic and expression compendium of the expanded PEBP gene familyfrom maize.Plant Physiology 146,250-264.
Hengst,U.,Albrecht,H.,Hess,D.,and Monard,D.(2001).Thephosphatidylethanolamine-binding protein is the prototype of a novel familyof serine protease inhibitors.Journal of Biological Chemistry 276,535-540.
Li,Q.,Fan,C.,Zhang,X.,Wang,X.,Wu,F.,Hu,R.,and Fu,Y.(2014).Identification of a soybean MOTHER OF FT AND TFL1 homolog involved inregulation of seed germination.PLoS One 9,e99642.
Margie M.P.et al 2004Assessment of conditions affectingAgrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary nodeexplant.Euphytica 136:167–179
Murray,M.,and Thompson,W.(1980).Rapid isolation of high molecularweight plant DNA.Nucleic Acids Res 8,4321-4325.
Takeshima,R.,Hayashi,T.,Zhu,J.,Zhao,C.,Xu,M.,Yamaguchi,N.,Sayama,T.,Ishimoto,M.,Kong,L.,and Shi,X.(2016).A soybean quantitative trait locus thatpromotes flowering under long days is identified as FT5a,aFLOWERING LOCUS Tortholog.Journal of experimental botany 67,5247-5258.
Xi,W.,and Yu,H.(2010).MOTHER OF FT AND TFL1 regulates seedgerminationand fertility relevant to the brassinosteroid signaling pathway.Plantsignaling&behavior 5,1315-1317.
Yamanaka,N.,Watanabe,S.,Toda,K.,Hayashi,M.,Fuchigami,H.,Takahashi,R.,and Harada,K.(2005).Fine mapping of the FT1 locus forsoybean flowering timeusing a residual heterozygous line derived from arecombinant inbredline.Theoretical and applied genetics 110,634-639.
Zhai,H.,Lü,S.,Liang,S.,Wu,H.,Zhang,X.,Liu,B.,Kong,F.,Yuan,X.,Li,J.,and Xia,Z.(2014).GmFT4,a homolog of FLOWERING LOCUS T,ispositively regulatedby E1 and functions as a flowering repressor in soybean.PLoS One 9,e89030.
Zhang,B.,Li,C.,Li,Y.,and Yu,H.(2020).Mobile TERMINALFLOWER1determines seed size in Arabidopsis.Nature Plants,1-12.
Claims (9)
1.培育百粒重提高的大豆的方法，其包括将GmMFT基因或包含GmMFT基因的载体转化到大豆植物细胞或组织中并培育，获得百粒重增加的大豆植株；
其中所述GmMFT基因编码大豆粒重相关蛋白的基因，其中，所述大豆粒重相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.培育百粒重提高的大豆的方法，其包括将GmMFT基因或包含GmMFT基因的宿主细胞转化到大豆植物组织中并培育，获得百粒重增加的大豆植株；
其中所述GmMFT基因编码大豆粒重相关蛋白的基因，其中，所述大豆粒重相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
其中，宿主细胞为农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述GmMFT基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述GmMFT基因的gDNA序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述GmMFT基因的启动子序列如SEQ ID NO:4所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体为植物表达载体，包括双元农杆菌载体和/或可用于植物微弹轰击的载体。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体还包含增强子。
8.GmMFT基因或包含GmMFT基因的载体或宿主细胞在培育百粒重提高的大豆中的用途，其中所述GmMFT基因编码大豆粒重相关蛋白的基因，其中，所述大豆粒重相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；并且，所述宿主细胞为农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述GmMFT基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110668553.4A CN113512551B (zh) | 2021-06-16 | 2021-06-16 | 调控大豆籽粒大小基因的克隆及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110668553.4A CN113512551B (zh) | 2021-06-16 | 2021-06-16 | 调控大豆籽粒大小基因的克隆及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113512551A CN113512551A (zh) | 2021-10-19 |
| CN113512551B true CN113512551B (zh) | 2023-12-12 |
Family
ID=78065663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110668553.4A Active CN113512551B (zh) | 2021-06-16 | 2021-06-16 | 调控大豆籽粒大小基因的克隆及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113512551B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103288942A (zh) * | 2013-05-02 | 2013-09-11 | 东北林业大学 | 百子莲开花相关基因ApFT蛋白编码基因和探针 |
| CN105567818A (zh) * | 2016-01-06 | 2016-05-11 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒脂肪含量的方法及其应用 |
| CN108795953A (zh) * | 2018-07-06 | 2018-11-13 | 华中农业大学 | 一种悬铃木开花调控基因及其在控制植物开花中的应用 |
-
2021
- 2021-06-16 CN CN202110668553.4A patent/CN113512551B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103288942A (zh) * | 2013-05-02 | 2013-09-11 | 东北林业大学 | 百子莲开花相关基因ApFT蛋白编码基因和探针 |
| CN105567818A (zh) * | 2016-01-06 | 2016-05-11 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒脂肪含量的方法及其应用 |
| CN108795953A (zh) * | 2018-07-06 | 2018-11-13 | 华中农业大学 | 一种悬铃木开花调控基因及其在控制植物开花中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Glycine max phosphatidyl ethanolamine-binding family protein MFT (MFT), mRNA，NCBI Reference Sequence: NM_001249965.3;Li Q;《NCBI Genbank database》;20210421;全文 * |
| Increased BnaMFT-transcript level is associated with secondary dormancy in oilseed rape(Brassica napus L.);LIU Lei等;《Journal of Integrative Agriculture》;20200620(第06期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113512551A (zh) | 2021-10-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Polowick et al. | Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of chickpea (Cicer arietinum L.): gene integration, expression and inheritance | |
| CN102803291B (zh) | 具有增强的产量相关性状和/或增强的非生物胁迫耐受性的植物和制备其的方法 | |
| CN104357535A (zh) | 植物无选择转化 | |
| CN106868021B (zh) | 控制水稻种子大小基因OsNAC1及其应用 | |
| CN112226455B (zh) | 一种水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN107475210B (zh) | 一种水稻白叶枯病抗性相关基因OsABA2及其应用 | |
| CN104592373B (zh) | Myb28蛋白及其编码基因在调控植物对aba耐受性中的应用 | |
| CN107988236B (zh) | 水稻生长素运输蛋白基因OsPIN9的基因工程应用 | |
| CN108642067A (zh) | 一种水稻胚乳粉质相关的基因OsHsp70cp-2及其编码蛋白质和应用 | |
| CN102337293B (zh) | 水稻细胞转化方法 | |
| CN102337294B (zh) | 水稻细胞转化方法 | |
| CN114540529B (zh) | 一种半矮秆增产的玉米基因型、功能性分子标记InDel-K2及其应用 | |
| CN113512551B (zh) | 调控大豆籽粒大小基因的克隆及应用 | |
| CN103348009B (zh) | 一种制备育性减低植物的方法 | |
| CN112980874B (zh) | GhCIPK6D1基因在提高棉花抗旱性中的应用 | |
| CN112430604B (zh) | 基因OsPIN10b的基因工程应用 | |
| CN1952144A (zh) | 利用水稻基因OsRRG1促进植物根的生长和/或提高植物抗旱能力 | |
| CN105950598B (zh) | 一个水稻休眠性相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN114958866B (zh) | 调控大豆分枝数的基因及其用途 | |
| Raj et al. | Genetic transformation of lowland rice variety GR11 for drought tolerance and its ratification for upland paddy cultivation | |
| CN104673803A (zh) | 基因甲基化在调控基因表达方面的应用 | |
| CN112342218B (zh) | Boc1蛋白在调控水稻愈伤组织褐化中的应用 | |
| CN111304359B (zh) | 一种与水稻种子萌发耐盐紧密连锁的分子标记及应用 | |
| CN112521470B (zh) | 植物淀粉合成相关蛋白OsFLO18及其编码基因与应用 | |
| Jin et al. | Techniques for the regeneration and genetic transformation of Arabidopsis pumila: An ephemeral plant suitable for investigating the mechanisms for adaptation to desert environments |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |