发明内容
本发明的目的是提供一种转化效率高、适用于工业规模应用的向水稻细胞导入外源基因的方法,适用于实施该方法的转化体系,利用该方法制备转基因水稻植株的方法,以及利用上述方法获得的转化水稻细胞、植株部分和植株。本发明提供了下列技术方案来实现该目的。
在一个方面,本发明提供一种将外源基因导入水稻细胞的方法,包括下述步骤:
(1)将水稻谷粒去壳、灭菌后将胚分离出来;
(2)取步骤(1)所得的分离的胚置于愈伤组织诱导培养基上在30℃左右暗培养约2周,以产生次生愈伤组织;
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带外源基因和磷酸甘露糖异构酶(PMI)标记基因的农杆菌接触20分钟左右;
(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到共培养基上,于约23℃培养约48小时;
(5)将步骤(4)的愈伤组织置于恢复培养基上培养5天左右;
(6)将步骤(5)的愈伤组织转移到含有蔗糖和甘露糖的选择培养基上,在约30℃暗培养3周左右以获得出芽的愈伤组织;
(7)将出芽的愈伤组织转移到再生培养基中继续培养;和任选地
(8)在再生培养基中培养约3周的愈伤组织转移至生根培养基中继续培养。
在一个实施方案中,所述步骤(1)中的谷粒是成熟谷粒。
在一个实施方案中,所述步骤(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的NB培养基。
在一个实施方案中,所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将所述愈伤组织浸泡在所述农杆菌的悬液中。
在一个实施方案中,所述步骤(4)中的共培养基是说明书表1所列出的固体共培养基或液体共培养基。
在一个实施方案中,所述步骤(5)中的恢复培养基是说明书表1所列出的NBREC培养基。
在一个实施方案中,所述步骤(6)中的选择培养基是说明书表1所列出的NBPMI培养基。
在一个实施方案中,所述步骤(7)中的再生培养基不含有甘露糖。
在一个实施方案中,其中所述步骤(7)中的再生培养基是选自包含如说明书表1所述成分的NBKN、NBKA、NBIZ或NBIK培养基中的任一种,优选NBKN或NBKA培养基。
在一个实施方案中,所述任选步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的1/2MB培养基。
在一个实施方案中,农杆菌的悬液是在侵染当天将农杆菌以OD660约0.05-0.25悬浮包含如说明书表1所示成分的液体滤纸培养基中而制备的。
在上述各实施方案的进一步优选的实施方案中,所述选择培养基中含有约5-12.5g/L的蔗糖和约5-25g/L的甘露糖,优选含有约5g/L的蔗糖和约12.5g/L的甘露糖。更优选地,其中所述选择培养基中不含抗生素或除草剂。
在上述各实施方案的进一步优选的实施方案中,所述农杆菌是根瘤农杆菌EHA105菌株。
在上述各实施方案的进一步优选的实施方案中,其中所述水稻是粳稻。优选地,水稻是日本晴(Nipponbare)品种;或者,优选地,所述水稻是皖粳97(Wanjing 97)品种。
在一个优选的方面,本发明提供一种将外源基因导入水稻细胞的方法,包括下述步骤:
(1)将水稻谷粒去壳、灭菌后将胚分离出来;
(2)取步骤(1)所得的分离的胚置于愈伤组织诱导培养基上在约30℃暗培养约2周以产生次生愈伤组织;
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带外源基因和磷酸甘露糖异构酶(PMI)标记基因的农杆菌接触20分钟左右;
(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到共培养基上,约23℃培养约48小时;
(5)将步骤(4)的愈伤组织置于恢复培养基上培养5天左右;
(6)将步骤(5)的愈伤组织转移到含有蔗糖和甘露糖的选择培养基上,在约30℃暗培养3周以获得出芽的愈伤组织;
(7)将出芽的愈伤组织转移到再生培养基中继续培养;和
(8)在再生培养基中培养约3周的愈伤组织转移至生根培养基中继续培养;
其中所述步骤(1)中的谷粒是成熟谷粒,所述步骤(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的NB培养基,所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将所述愈伤组织浸泡在所述农杆菌的悬液中,所述步骤(4)中的共培养基是说明书表1所列出的固体共培养基或液体共培养基,所述步骤(5)中的恢复培养基是说明书表1所列出的NBREC培养基,所述步骤(6)中的选择培养基是说明书表1所列出的NBPMI培养基,其中含有约5g/L的蔗糖和约12.5g/L的甘露糖,并且不含抗生素或除草剂,所述步骤(7)中的再生培养基是选自包含如说明书表1所述成分的NBKN、NBKA、NBIZ或NBIK培养基中的任一种,所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的1/2MB培养基。
在一个优选的实施方案中,其中所述农杆菌是根瘤农杆菌EHA105菌株。在一些优选的实施方案中,本发明所用的PMI标记基因的核苷酸序列选自:
(1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列;或
(2)编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
在特别优选的实施方案中,本发明所用的PMI标记基因序列如SEQ ID NO:1所示。在本方面的优选实施方案中,所述水稻是粳稻,更优选地,所述水稻是日本晴品种。或者更优选地,其中所述水稻是皖粳97品种。
在另一个方面,本发明提供一种用于转化水稻的培养基套组,包括如下所述的组分:
(1)愈伤组织诱导培养基;
(2)固体共培养培养基或液体滤纸共培养培养基;
(3)恢复培养基;
(4)选择培养基;
(5)再生培养基;和任选地
(6)生根培养基;
其中所述(1)-(3),(5),(6)分别包含如本说明书表1所示的成分,所述(3)包含选自说明书表1所示的NBKN、NBKA、NBIZ或NBIK培养基中的任一种的成分。
本方面还涉及这样的培养基套组用于将外源基因导入水稻细胞的程序的用途。所述的水稻优选粳稻,包括但不限于日本晴、皖粳97等品种。
在一个方面中,本发明提供根据本发明的方法的任一实施方案获得的携带外源基因的水稻细胞。
在一个方面中,本发明提供一种生产转基因水稻的方法,包括使用前述的任一方法将外源基因导入水稻细胞,并从获得的水稻细胞培育出水稻植株。
通过本发明,可以实现对水稻尤其是粳稻的高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化;另一方面,通过本发明无需使用抗生素或除草剂选择,只需要进行一轮甘露糖选择就能够获得转化植株,与常规的使用抗生素或除草剂选择相比选择过程可以缩短近3周的时间,不但能够大大缩短选择过程的耗时,还降低了其环境压力,为开发工业规模的、环境友好的转基因水稻制备工艺提供了可能。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来进一步说明本发明。应当理解这里描述的具体实施方式只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明,而不对本发明的范围构成任何限制。
在没有其他具体说明的情况下,下述具体实施方式中的实验方法和操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导,例如可以参照教科书Sambrook andDavid Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Vols 1,2;Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira,PlantTransformation Technologies等。
本文中所述的“约”或“左右”,除非另有特别说明或与上下文明显冲突,表示其所指的参数可以取在所述的具体数值的基础上在一定范围内,例如在所述具体数值的基础上±5%的值,只要能保证能够获得预期的结果即可。本领域技术人员在实施本发明的方法时,结合本说明书的教导,很容易在这里给出的具体实施方式中所用的具体参数数值的基础上,对参数数值加以适当调整以适应具体的实验条件和材料,而不偏离本发明的范围。
1.材料和方法
1.1.植物材料、外植体制备和生长条件
选取水稻品种日本晴(Nipponbare)和皖粳97(Wanjing97)(来自中国安徽省)的饱满、外观正常的谷粒(种子),去壳、灭菌后,在30℃的双蒸水中黑暗浸泡过夜。用刮刀沿糊粉层分离盾片,朝上放置在NB培养基(成分如下所述)上30℃暗培养以诱导愈伤组织。两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织,可以用作经预培养的外植体来进行下面的侵染。生长条件为:愈伤组织诱导、预培养、恢复和选择均在30℃左右的黑暗中进行;共培养在约23℃的黑暗中进行;再生和生根在约30℃光照下进行,光强度为约6000lx,光周期为约16h日/8h夜。
1.2.试剂和培养基
除非另有说明,本文所述具体实施方式中使用的化学品购自Sigma(美国Saint Louis)。使用的各种培养基的组成如表1所示。除非另有说明,培养基的pH值为5.8。
表1
本研究中使用的培养基的示例性配方
1.3.质粒构建体、农杆菌菌株和侵染体的制备
本具体实施方式使用本领域广泛使用的农杆菌菌株EHA105(Hood EE,Gelvin SB,Melchers LS,Hoekema A.New Agrobacterium helper plasmids forgene transfer to plants.Transgenic Research.1993;2:208-218),通过本领域常用的农杆菌转化方法导入了除草剂抗性基因pat(基因序列如SEQ ID NO:3所示)、绿色荧光蛋白编码基因gfp(基因序列如SEQ ID NO:5所示)和大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶pmi(基因序列如SEQ ID NO:1所示),分别由35S启动子(序列如SEQ ID NO:7所示)、玉米泛素蛋白启动子Ubi(序列如SEQ IDNO:8所示)、和水稻肌动蛋白启动子Act1驱动(序列如SEQ ID NO:9所示)(见图1)。应当理解的是,本具体实施方案虽然是以绿色荧光蛋白基因作为外源基因的示例,但本发明不限于特定的外源基因。这里所说的“外源”表示相关基因是从对象细胞的外部导入的,而不限制基因的任何具体的来源。任何适于在水稻细胞中表达的、对要导入基因的水稻细胞而言为固有或非固有的基因都可以作为外源基因,适当地与农杆菌T-DNA连接后根据本发明的方法导入水稻细胞。同样,本发明也不限于使用农杆菌EHA105菌株,任何能够将基因导入受体细胞的农杆菌菌株都可用于本发明。关于用农杆菌导入基因、构建所用质粒等一般性知识为本领域技术人员所熟知,例如可见Hiei etal.,1994;Riva et al,1998.(Agrobacterium tumefaciens:a natural tool for planttransformation,Electronic Journal of Biotechnology 19981(3)118-133.)
侵染前2-4天,当愈伤组织在预培养培养基上培养时,取农杆菌EHAl05的甘油冻存液在YEP平板上划线后在约28℃暗培养来活化菌种。在侵染前一天,将经过活化的农杆菌在新鲜的YEP平板上再次划线来扩繁菌种。在侵染当天,用一次性小药匙收集YEP平板上的农杆菌并悬浮在液体滤纸共培养培养基中(其配方如表1所示),制成密度为2.5×107-1.25×108cfu(OD660为约0.05-0.25)的侵染液。
1.4.侵染和恢复
制备好侵染液20分钟后,从预培养培养基上刮下经过预培养的愈伤组织,并转移到盛有侵染液的50ml灭菌离心管中,使侵染液浸没愈伤组织。充分混合后静置15分钟。然后,将愈伤组织在新滤纸上沥干,然后分别用滤纸转移到固体共培养培养基(33ml培养基)上或转移到液体共培养培养基上(用3.2ml培养基润湿3层经灭菌的Whatman 3MM滤纸)。将平板用3MMicropore Surgical Tape密封,23℃培养40-48小时。在共培养过程中观察GFP信号来检测转化效率。共培养后,将愈伤组织从共培养培养基上刮下,并置于恢复培养基(NBREC)上3-5天,或直接置于选择培养基PAT或PMI上,以进行比较实验来考察恢复培养对基于PAT和PMI选择培养基的T-DNA整合的影响。
1.5.选择和再生
将经过恢复培养的愈伤组织置于NBPAT选择培养基(3mg/L双丙胺磷)或含有不同含量组合的蔗糖与甘露糖的NBPMI培养基(5g/L蔗糖分别与7.5、12.5、17.5和22.5g/L甘露糖组合,或10g/L蔗糖分别与7.5、12.5、17.5和22.5g/L甘露糖组合)。每个平板上放30粒愈伤组织。对选择培养基上的愈伤组织计数作为外植体数,并把从每一个愈伤组织发生的抗性愈伤组织视为一个事件。3周后,肉眼观察到用双丙胺磷和甘露糖选择的一些抗性愈伤组织,将它们标记用于GFP测定,以比较选择效率。然后使用甘露糖抗性的愈伤组织,用4种不同的再生培养基:NBIK、NBKN、NBKA和NBIZ(配方见表1)进行再生实验。每个平板包含5个事件,将来自一个事件的2-3个浅黄色球状抗性愈伤组织结节分配到平板上的一个特定区域。3周后计算出芽的愈伤组织的数目并观察芽的质量,以进行测试的4种再生培养基的比较实验。将来自每个事件的一个芽转移到生根培养基中培养。一周后当高度增加且生长旺盛时移栽到温室中。
1.6T1种子的分子分析和甘露糖抗性的鉴定
在移栽到温室中之前,采取水稻叶片样品,用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析和Taqman测定。用于扩增pmi基因的PCR引物为5’-CCGCCGGAGATATCGTTTCACTG-3’及5’-CACGGTTCACCCTGCTGGCTATC-3’,产生长度为490bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟,然后进行30个循环:94℃45秒、56℃45秒、72℃45秒,最后在72℃延伸10分钟。进行Taqman测定作为相对定量分析,以参照标准曲线确定转基因植株的拷贝数。Taqman分析中对于每一个测试样品,使用两对引物来检测右T边界附近的pmi基因和左T边界附近的35S启动子。
PMI种子试纸条测试根据制造商(Strategic Diagnostic Inc.)的说明来进行。每个植株取0.2g嫩叶浸没在试纸条反应缓冲液中10min以产生目标线。
对于甘露糖抗性鉴定实验,使用T1转基因种子如上文所述通过萌发和在不含羧苄西林的NB和NBPMI培养基上进行愈伤组织诱导来测试它们的愈伤组织形成能力。同时用野生型种子作为阴性对照。观察并记录萌发和愈伤组织形成能力。
1.7利用该系统进行大规模转基因水稻植株生产
使用本项研究中确立的转化方案已经转化了超过400个构建体并且对所有的事件进行了Taqman测定。这里分析了113个构建体(日本晴91个,皖粳9722个)的Taqman测定数据。
2.结果和分析
2.1.高质量愈伤组织的产生
使用成熟种子诱导愈伤组织时,日本晴和皖粳97的愈伤组织形成能力不同。在含有2.0mg/L 2,4-D的NB培养基上,日本晴种子正常萌发和产生愈伤组织,而皖粳97种子仅仅萌发和生长(图2-A)。在4.0或6.0mg/L 2,4-D的条件下成熟皖粳97种子成功地产生了愈伤组织,但更高浓度的生长素可能阻碍后续的再生。除去种子的胚乳后,皖粳97的成熟胚也可以在2.0mg/L 2,4-D条件下产生愈伤组织(图2.B)。
因此发明人使用分离的胚(盾片)来作为诱导愈伤组织的外植体。培养后一周内从盾片产生了初级愈伤组织,培养14-18天后回收了直径2-4mm的次级愈伤组织,即可用于预培养(图2-C)。皖粳97和日本晴的愈伤组织诱导效率都达到了90%。
2.2恢复培养是甘露糖选择所必需的
利用GFP表达来确定恢复培养是否为甘露糖选择或双丙氨磷选择所必需。结果显示在双丙氨磷选择中有无恢复培养时的GFP表达几乎无区别,但对于甘露糖选择,只有在选择之前将愈伤组织转移到一段恢复期的情况下才能观察到愈伤组织中的GFP表达(图3)。这提示恢复培养对于甘露糖选择系统是不可缺少的。
2.3液体滤纸共培养显著改善了抗性愈伤组织的恢复效率
在固体共培养培养基上培养的愈伤组织在培养后48小时呈现褐变和坏死。对于皖粳97和日本晴,在使用液体滤纸共培养培养基时,在含有5g/L蔗糖和10g/L甘露糖的选择培养基上培养3周后的抗性愈伤组织回收率分别从使用固体共培养培养基时的39.92%和41.92%提高到66.94%和64.59%。
表2使用不同共培养方法的抗性愈伤组织回收效率
2.4不同蔗糖-甘露糖组合对于选择率的影响,以及PMI和PAT的选择效率比较
转移到选择培养基上10天后,新的球状甘露糖抗性愈伤组织开始出现,并且大部分的抗性愈伤组织在选择3周后达到了5mm直径,适合用于再生。
对于日本晴和皖粳97,蔗糖-甘露糖组合对于抗性愈伤组织的回收效率的影响是不同的(图5)。对于测试的所有8种不同的蔗糖-甘露糖浓度梯度,根据邓肯氏新复极差检验(MRT)将日本晴中愈伤组织的选择效率分为四组。结果显示在日本晴中在5g/L或10g/L蔗糖存在下12.5g/L甘露糖的条件下抗性愈伤组织的选择效率较高(P<0.05)。有趣的是,将甘露糖升高到22.5g/L,蔗糖升高到10g/L时,选择效率达到68%,与5g/L或10g/L蔗糖加12.5g/L甘露糖的差别不显著。这可能是由于过高渗透压可严重影响未转化细胞的生理状态,而对于能够代谢甘露糖的转化细胞的影响较小。从选择效率和节约成本两方面考虑,选择了5g/L蔗糖和10g/L甘露糖的组合用于日本晴的选择。
和日本晴不同,基于MRT结果皖粳97的选择效率仅包含两个组。在5g/L或10g/L蔗糖存在下,当向培养基中添加7.5g/L甘露糖时选择效率达到最优,而在其他所有处理中的选择效率明显较低(P<0.05)。因此,选择5g/L蔗糖和7.5g/L甘露糖用于皖粳97的选择。
为了用可视的标记基因gfp验证PMI选择的有效性,利用双丙氨磷和甘露糖作为选择剂进行了比较实验。选择3周时,基于可视GFP表达观察通过肉眼观察选出的抗性愈伤组织(表3)。将抗性愈伤组织分成3个类型:1)在荧光显微镜下表达GFP的愈伤组织;2)部分表达GFP的愈伤组织;和3)不表达GFP的愈伤组织。如表3所示,基于肉眼观察的抗性愈伤组织回收效率在PMI和PAT选择之间没有统计学意义上的差异,但使用PMI或PAT选择时表达GFP的愈伤组织的比例有显著的差异。
选择后3周时,超过60%的双丙氨磷抗性愈伤组织未显示GFP表达或部分显示GFP表达,后者很可能是PAT选择中的假阳性。相反,多达80%的甘露糖抗性愈伤组织表达了GFP,只有不到5%为GFP阴性。这确证了PMI选择的有效性。
表3PAT与PMI的选择效率的比较
2.5.再生培养基的优化
选择后3周时,将来源于一个愈伤组织,生长状态良好的2个或3个愈伤组织颗粒(大小为2-4mm)作为一个独立事件转移到培养皿中的再生培养基上标定的分区中。每个培养皿包含5个事件。将再生培养基上的愈伤组织暗培养一周后转移到光亮下以进行芽再生和伸长。在黑暗中愈伤组织呈现膨胀并变成乳白色,2周后绿色的芽开始冒出,即可转移到生根培养基。大部分愈伤组织在1周内产生了幼苗。对于日本晴而言四种再生培养基的再生效率没有显著差异((P>0.05)(图6)。对于皖粳97,再生培养基NBKN和NBIK的再生效率均高于NBIZ和NBKA(P<0.05)。除了再生效率之外,芽的质量也是再生培养基性能的考虑因素。两个品种的用NBKN和NBKA再生的芽均健壮且有生长的根,而用NBIZ和NBIK再生的芽瘦小且没有根(图7)。此外,NBKN和NBKA的移栽成功率几乎为100%。因此NBKA和NBKN可以用作日本晴和皖粳97二者的再生培养基。
2.6.转基因植株的分析
对于具有发达根系的幼苗进行荧光镜检以实施GFp测定(图8)。在所观察的941株中,43株为GFP阴性,阳性率达到95.4%。PCR扩增检出了PMI目标片段(图9)。通过PMI试纸条测试在T1苗中检出了PMI蛋白表达(表4,图10)。在甘露糖抗性实验中,在不含抗生素的PMI选择培养基上未转化的种子没有萌发或产生愈伤组织,而转基因T1种子正常地萌发并产生愈伤组织。
表4本研究中开发的PMI选择系统的转化频率
2.7.本系统在转基因植物生产中的应用
本发明人建立了一套转化方案,并在优化了上述参数后将其应用到大规模生产。实施的转化过程如下:(1)将饱满、健康的去壳种子(每个构建体36粒)灭菌后在双蒸水中浸泡过夜;(2)分离盾片并将它们置于NB愈伤组织诱导培养基上(16-18天);(3)预培养愈伤组织并将携带感兴趣的基因(GOI)的农杆菌在YEP平板上划线(2-4天);(4)制备侵染液并实施侵染(15分钟);(5)将愈伤组织在滤纸上沥干后,转移到共培养培养基上(2天);(6)将愈伤组织刮取到恢复培养基上(3-5天);(7)将愈伤组织转移到选择培养基上并统计这里的愈伤组织数目作为外植体数目(30个愈伤组织/平板,21-24天);(8)将来自每个事件的2-3个抗性愈伤组织转移到再生培养基上(每个平板5个事件,21-24天);(9)从每个事件分离一个芽到生根培养基中(10天);(10)取样进行分子分析并转移到温室中。
根据共产生10546个事件的113个构建体(日本晴91个,皖粳9722个)的统计结果,转基因事件的低拷贝率在日本晴中为31.5%,在皖粳97中为45.2%,尽管在两个探针PMI和35S启动子之间有一些差异(表5)。在所分析的测试载体和GOI之间拷贝数的分布没有不同。利用该方案,转化从侵染到移栽可以在57-60天内完成。
表5转基因植物的Taqman分析结果
表型观察结果提示,大多数转基因植物没有显示异常表型(图11-A)并可以正常结实,除了某些受GOI影响者外(图11-B)。
3讨论和结论
3.1.植物外植体与农杆菌之间的相互作用
基因转移涉及植物外植体与农杆菌之间的相互作用。因此用于转化的植物外植体应当处于最优的状态,而农杆菌应当处于适于投递T-DNA,而不是适于其自身增殖的状态。一般而言用作外植体的愈伤组织处于胚阶段,能够经受通过3-5天预培养与农杆菌感染的相互作用。在本研究中,发明人使用衍生自初级愈伤组织的直径2-4mm的愈伤组织作为转化用外植体,并在23℃左右,而非更适于农杆菌增殖的25-28℃实施共培养。发明人将常规的在固体培养基上平板上共培养的方法与在3层润湿滤纸上培养的方法进行了比较,发现用3.2ml液体共培养培养基润湿的滤纸显著地降低了组织坏死,并且改善了转化频率。这不同于Ozawa得到的结果,后者建议使用5.5ml的体积(Ozawa 2009)。可能是由于使用的材料和培养皿不同所致。
3.2.PMI的选择效率
PMI优于NPTII及HPT等抗生素选择标记。它作用的方式是赋予转化的植物细胞以代谢甘露糖的能力,同时利用碳饥饿使其他细胞保持休眠。发明人采用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因监测体内转化效率,并在不影响后续的实验的条件下,优化了用于选择两个受试品种的甘露糖浓度及其与蔗糖的联合作用。与先前报道的结果,即在水稻转化中使用超过25g/L甘露糖进行两轮以上的选择(Lucca et al.2001;Ding et al.2006;He et al.2004)不同,发明人发现,相对较低的蔗糖-甘露糖组合(皖粳97为5-7.5g/L,日本晴为5-12.5g/L)提供了最高的选择频率。该选择频率与甘露糖浓度,而不是所测试的5g/L或10g/L蔗糖相关,提示甘露糖浓度对选择频率的影响更大。基于在一轮选择后产生的纯的甘露糖抗性愈伤组织,发明人从再生培养基中去除了甘露糖,发现超过95%的植株是阳性的,提示在PMI选择系统中再生培养基和生根培养基中添加甘露糖不是必要的。在本项研究中开发的转化系统中,只使用了7.5g/L(皖粳07)和12.5g/L(日本晴)甘露糖,且一轮选择即可产生纯的抗性愈伤组织。加之选择过程中蔗糖用量从30g/L降低到5g/L,本发明的方案比使用潮霉素或者双丙氨磷等的其他方案更节约成本。
3.3转化频率
利用本项研究中建立的方案,转化频率在日本晴中高达47.5%,在皖粳97中高达54.7%,且在转基因水稻的大规模生产中转化可以在从侵染到移栽57-60日内完成。此外,本发明通过农杆菌介导的转化提供了高频率的低拷贝转基因水稻植株,根据统计学意义的大数据量的Taqman分析结果,日本晴中为31.5%,皖粳97中为45.2%。
本发明提供了利用pmi作为选择基因,利用农杆菌介导,用于将外源基因导入水稻,尤其是粳稻细胞的简化方法。该方法使得大规模、高效率、低成本、快速地生产转基因水稻植株成为可能。
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