CN105330742A - 抗pmi蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了特异性识别转基因植物中非抗生素类安全筛选标记PMI(磷酸甘露糖异构酶)单克隆抗体及其制备方法，目的是为免疫学方法检测天然转基因物种(玉米、水稻、棉花等)中是否存在筛选标记PMI提供关键试剂材料。磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose？isomerase，PMI)基因是一种生物安全标记基因。制备该抗体的抗原为由大肠杆菌表达的可溶性全长PMI重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG1亚型，编码其可变区的序列经基因克隆的方式获得。对天然转基因水稻材料的Western？Blotting检测发现，该抗体具有很好的特异性，可以用于对转基因材料的检测。

Description

抗PMI蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及识别非抗生素类安全筛选标记PMI(磷酸甘露糖异构酶)的单克隆抗体，该抗体可用于制备检测转基因植物中的PMI蛋白的试剂盒，属于生物检测领域。

背景技术

随着转基因产品的不断涌现，随之而来的问题就是转基因产品的安全评价及测定。在转基因品种的培养和后期鉴定中，离不开针对转化的筛选标记和报告基因，最常用的筛选标记包括抗生素抗性类筛选标记基因和抗除草剂基因，这类抗性筛选标记基因有可能会通过基因漂移造成基因污染，对环境产生不利影响(魏伟，马克平.如何面对基因流和基因污染[J].中国农业科技导报，2002，4(4):10-15)。另外，含有该种标记基因的转基因食物有可能不会被人类的肠道系统吸收利用，还很有可能产生毒副作用。所以，为降低生物安全风险，减少对环境和生物的潜在危害，目前对转基因植物的筛选已经逐渐由利用抗生素抗性筛选，过渡到以PMI为代表的非抗生素抗性筛选，最终实现更安全的无标签(Marker-free)筛选鉴定体系。

在糖类代谢中，PMI基因编码的磷酸甘露糖异构酶(phosphomannoseisomerase，PMI)催化甘露糖-6-磷酸转变为果糖-6-磷酸，然后在磷酸果糖激酶的催化作用下生成能进入糖酵解途径的果糖-1，6-二磷酸(MilesJS，GuestJR.Nucleotidesequenceandtranscriptionalstartpointofthephosphomannoseisomerasegene(manA)ofEscherichiacoli[J].Gene，1984，32:41-48)。研究发现几乎所有植物细胞除了肉桂和一些豆类，都没有PMI基因，但在细菌、酵母、动物以及人体中却广泛存在(MalcaI，EndoRM，LongMR.Mechanismofglucosecounteractionofinhibitionofrootelongationbygalactose，mannoseandglucosamine[J].Phytopathology，1967，57:272-278)，目前已从这些生物体中克隆到该基因，并获得纯化蛋白(ProudfootAEI，TurcattiG，WellsTNC，etal..Purification，cDNAcloningandheterologousexpressionofhumanphosphomannoseisomerase[J].Eur.J.Biochem.，1994，219:415-423.)。

自1998年首次报道了将PMI基因作为筛选标记用于甜菜的转基因以来(JoersboM，DonaldsonI，KreibergJ，etal.Analysisofmannoseselectionusedfortransformationofsugarbeet[J].Mol.Breed.，1998，4:111-117)，PMI/甘露糖筛选体系作为一种新型的安全筛选系统已被成功运用于多种单子叶植物和双子叶植物的遗传转化中无论是筛选标签选择、更替的过程，还是在后代选择中通过同源重组将筛选标签从生物体基因组“删除”的过程中都需要对标签蛋白进行跟踪鉴定。此外，对这些标签蛋白进行检测还可以监测品种培育过程中对环境的影响，结合特异功能靶蛋白的鉴定，可以开展农业生产中的种子纯度鉴定，食品、药品加工过程的非转基因身份保持(IP)，从而实现对转基因植物从源头到餐桌的全程监控。

基于外源蛋白的免疫学分析方法，采用高度特异性的抗原抗体反应，可实现对转基因植物样本快速、准确、高效的检测。其技术关键是制备具有高度特异性的抗体，直至目前为止还没有关于PMI抗体的报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种针对转基因植物中常用筛选标记基因PMI蛋白的单克隆抗体杂交瘤的制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种特异性好、亲和力高的抗PMI单克隆抗体，该抗体能特异结合PMI重组抗原和转基因材料。

本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于以水稻为代表的转基因生物的检测方法。

本发明的第四个目的是提供一种利用本抗体与PMI的结合能力，完成表达PMI蛋白在转基因植物、转基因动物、转基因微生物、细胞或其他材料中的分选和富集方法。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明首先制备了两株分泌抗PMI抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：

1)按照公布的PMI编码序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，改善其表达行为，且便于纯化，在重组蛋白的N端和C端分别融合有大肠杆菌果胶酶的PelB信号肽及组氨酸标签，经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-pelB中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。

2)从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

3)以重组PMI蛋白为抗原，应用ELISA法和Western印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

上述技术方案中，步骤1)中，制备重组GUS蛋白的方法可以按照本领域技术人员熟知的DNA和蛋白质表达操作技术进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养，重组蛋白的纯化。具体地，可参考《分子克隆实验指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，2009年，科学出版社)。

本发明同时要求保护采用上述技术方案制备得到的两株杂交瘤细胞株及其抗体60728-35和60728-44。其中60728-35的抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示，60728-44为SEQIDNo：4和SEQIDNo：5所示。两株抗体均为鼠源IgG1亚型单克隆抗体。

本发明从上述杂交瘤细胞株制备了单克隆抗体，所述制备方法有以下两种：

1)在体外用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收获培养上清经免疫亲和层析法分离纯化所需单克隆抗体；

2)在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，收获动物腹水后分离纯化所需单克隆抗体。本发明用腹水法制备的抗体经ProteinA/G柱亲和层析纯化得到的PMI单抗，用ELISA技术测定60728-35和60728-44分泌的抗体亲和常数分别为1.85×10⁹和2.46×10⁹。

本发明的这两株抗体可以共同或单一地对生物样品中的PMI蛋白进行免疫学检测。可以应用的免疫学检测方法包括但不限于利用抗体直接和抗原结合的酶联免疫吸附检测(ELISA)、免疫印迹(WesternBlot)、流式细胞术(FACS)、免疫组织化学(IHC)检测或者免疫PCR检测方法。在免疫学检测中，该抗体可单独或与通过化学键偶联，静电吸附或者亲疏水性吸附，而连接缀合物包括辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)，生物素(Biotin)，异硫氰酸荧光素(FITC)，Cy3、Cy5、磁珠和琼脂糖等缀合物连接。免疫印记(Westernblotting)实验显示这两株抗体均能特异识别重组的PMI蛋白以及天然水稻叶片材料中的转基因筛选标记基因PMI。

本发明中的单克隆抗体，可以用作检测试剂用于转基因植物检测试剂盒的制备。本发明的这两株抗体还可以共同或单一地对含PMI蛋白的生物样品进行基于免疫学的生物分离中。该基于免疫学的分离方法包括但不限于利用琼脂糖免疫、免疫磁珠吸附或流式细胞术完成生物分离方法或阳性细胞分选。

本发明的优点及有益效果

本发明获得的杂交瘤(60728-35和60728-44)分泌产生的单克隆抗体，能识别重组和天然PMI蛋白，具有极强特异性和敏感性。能用于转基因植物的检测与筛查。

附图说明：

图1：在大肠杆菌中表达和纯化的PMI重组蛋白。1为表达产物15mM咪唑洗脱的结果，2为60mM咪唑洗脱的结果，3为300mM咪唑洗脱的结果。Marker为分子量蛋白，表达产物的大小约为43kDa，使用12％SDS-PAGE凝胶。

图2：单克隆抗体60728-35对重组蛋白和天然转基因水稻叶片蛋白的免疫印迹检测结果，TP309为非转基因材料，M2-B4和M3-3为转基因水稻叶片蛋白，菌蛋白为重组PMI蛋白。

图3：单克隆抗体60728-44对重组蛋白和天然转基因水稻叶片蛋白的免疫印迹检测结果，TP309为非转基因材料，M2-B4和M3-3为转基因水稻叶片蛋白，菌蛋白为重组PMI蛋白。

具体实施方式

下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1重组PMI蛋白的制备

一、基因克隆

PMI单克隆Genbank中NC_004088.1的核酸序列，设计特异性上游引物PMI-F：TATGTACATATGCAAAAACTCATTAACTC特异性下游引物PMI-R：AGTGCTCGAGCTTGTTGTAAACACGC，从淋巴细胞中的反转录产物中扩增包括编码第411位至第750氨基酸的基因片段。在PCR的过程中在基因5’和3’端分别加入NdeI和XhoI酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体pET-30a进行NdeI和XhoI酶切，再次电泳回收，以T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于蛋白表达。

二、蛋白表达和纯化

按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mlLB培养基，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6～0.8。加入0.1mol/L的IPTG，25℃震荡培养8h，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样进行SDS-PAGE分离检测，图1为融合有pelB信号肽和组氨酸标签的重组PMI蛋白的表达和纯化结果。重组PMI蛋白的纯度在90％以上，浓度约为1-1.5mg/mL，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。

实施例2杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10×HAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。

三、阳性杂交瘤筛选及保存

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTraprProteinAFF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体亚类鉴定及亲和力测定

一、亚类鉴定

用100mMPBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(SouthernBiotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(SouthernBiotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体60728-35和60728-44均为IgG1型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组PMI蛋白，包被浓度为2μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出60728-35和60728-44分泌的抗体亲和常数分别为1.85×10⁹和2.46×10⁹。

实施例5本发明单克隆抗体的应用效果

从转基因和非转基因水稻叶片中提取蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体识别特异性及在检测转基因植物中的应用效果。免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样5-10ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体60541S-4(1：1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDocMP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。

实验结果如图2和图3所示，60728-35和60728-44均能识别特异性地识别转基因水稻中的PMI蛋白。

实施例6抗体的可变区序列测定

培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实完成后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9μL总RNA,加入2.5μLoligo(dT)12–18primer(10mM),及5μLdNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μLRTbuffer(5X),2.5μLDTT(0.1M)及1μL逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。.将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50μL反应体系中加入引物各25pmol，引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成。其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板加入1μL和1U热启动TaqDNA聚合酶。设置PCR扩增程序，通常为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25各循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μLPCR产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离，轻链(κ轻链)的长度在320－340之间，重链的长度在340－370之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。

Claims (10)

1.一种结合PMI蛋白的免疫组合物，其特征在于包含由小鼠杂交瘤细胞系60728-35和/或60728-44分泌的单克隆抗体。

2.权利要求1所述的单克隆抗体，其免疫小鼠用的抗原是具有SEQIDNo：1所示的氨基酸序列，该抗原由大肠杆菌重组表达，经纯化后获得。

3.权利要求1所述的单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示或SEQIDNo：4和SEQIDNo：5所示的氨基酸序列。

4.权利要求1所述的单克隆抗体，其为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

5.权利要求1所述的单克隆抗体，其可单独或与其它缀合物连接完成含PMI生物样本的免疫学检测和生物分离。

6.权利要求5所述的连接方式，包括经化学键偶联、静电吸附或者亲疏水性吸附。

7.权利要求5所述连接缀合物包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、生物素（Biotin）、异硫氰酸荧光素（FITC）、Cy3、Cy5、磁珠和琼脂糖。

8.权利要求5所述的免疫学检测方法包括利用抗体直接和抗原结合的酶联免疫吸附检测（ELISA）、免疫印迹（WesternBlot）、流式细胞术（FACS）、免疫组织化学（IHC）检测或者免疫PCR检测方法。

9.权利要求5所述的生物分离方法包括利用抗体直接和抗原结合的琼脂糖免疫、免疫磁珠吸附和流式细胞分选方法。

10.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于可作为检测试剂用于转基因植物检测试剂盒的制备。