CN104774267A - 一种抗gus蛋白质的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可特异性识别GUS(β-葡糖苷酸酶)的单克隆抗体的制备方法和其在转基因生物检测中的应用方法。目的是提供一种可检测GUS蛋白质的单克隆抗体和将该抗体用于转基因植物、动物和细胞等生物体的高灵敏度免疫学检测方法。GUS蛋白质被广泛用于基因转移报告基因，它可催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，传统方式是以分光光谱、荧光等进行检测，依赖于酶的活性，易受温度变化及加工过程的影响，一直以来缺乏一种快速有效、灵敏度高的检测方法。制备该抗体所用抗原为大肠杆菌表达的可溶性的全长GUS重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG1a亚型，可以检测转基因植物(水稻、棉花、玉米等)、转基因动物和细胞中存在的GUS蛋白质的表达，从而对转基因生物做出鉴定。

Description

一种抗GUS蛋白质的单克隆抗体及其应用

 

技术领域

 本发明涉及一种可以识别人GUS（β-葡糖苷酸酶）蛋白质的单克隆分子及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗GUS分子的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以流式细胞术、免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测转基因植物( 水稻、棉花、玉米等)、动物、细胞及微生物中的GUS蛋白，也可用于含GUS蛋白的生物样本富集和分离，属于生物检测和分析领域。

 

背景技术

GUS基因编码β-D-葡萄糖苷酶，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测，是目前常用的一种报告基因。但这种基于酶活性的检测方法，易受温度变化及加工过程的影响。报告基因在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位，它是作为外源目的基因能否转化生物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，现已应用到真核生物的基因调控领域中。随着基因工程技术日新月异的发展，报告基因这一探路者的作用会更明显。

随着转基因植物的不断发展及其商品化的种类不断增加，转基因生物本身的安全性以及它们对人类健康和生态环境的潜在威胁成为国际社会和广大民众广泛关注的热点问题之一。包括我国在内的越来越多的国家制定并实施了转基因食品的强制标识制度。因此，转基因产品的科学管理和应用需要得到转基因产品及其成分检测技术的支持。

目前，转基因产品及成分检测最常用的方法有两类：一类是针对其外源核酸成分的检测技术；另一类是针对其外源蛋白质成分的免疫学分析方法。基于DNA 的检测方法只能在核酸水平上反映转基因样品是否含有外源DNA，不能检测其外源基因是处于沉默还是表达状态，此类检测技术对判读外源蛋白质丰度无指导性意义。对于某些转基因植物的产品，DNA在加工过程中会降解掉而难以检测，此时，需要利用免疫分析法来检测转基因的组分。基于外源蛋白质的免疫学分析方法，采用高度特异性的抗原抗体反应，实现对转基因植物样本快速、准确、高效的检测，其技术关键是制备具有高度特异性的抗体。目前虽有抗GUS兔单克隆抗体制备的报道（沈金儿  倪庚  郑晓冬，抗β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS)兔单克隆抗体的制备和鉴定。中国食品学报，2012，第11期），但该抗体对重组蛋白的检测限仅为50ng/mL，且并未对转基因生物进行检测而验证其应用能力。

 

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能针对转基因植物中常见的GUS蛋白质的广谱单克隆抗体杂交瘤及其制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种特异性好的单克隆抗体的制备方法，该抗体 能特异结合GUS重组抗原和转基因生物。

本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于以水稻为代表的转基因生物检测方法。

本发明的第四个目的是提供一种利用GUS单克隆抗体与抗原的结合能力，完成表达GUS报告基因在转基因植物、转基因动物、转基因微生物、细胞或其他材料中的分选和富集方法。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明制备了一株杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：

1）对在对转基因植物中常用的GUS基因的抗原表位分析后，选按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达可溶表达，表达在含有pET-GUS质粒的大肠杆菌BL21（DE3）中表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠；

2）获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B 细

胞，按常规方法，将B 细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 株融合，然后利用常规的融合细胞HAT 筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

3）应用ELISA 法和Western 印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

上述技术方案中，步骤1）中，制备重组GUS蛋白的方法可以按照本领域技术人员熟知的DNA和蛋白质表达操作技术进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养，重组蛋白的纯化。具体地，可参考《分子克隆实验指南（第三版）》（J.萨姆布鲁克，D.W. 拉塞尔 著，黄培堂等译，2009年，科学出版社）。

本发明同时要求保护采用上述技术方案制备得到的杂交瘤细胞株，该细胞株所分泌的抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的DNA序列所编码，分别具有SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示的氨基酸序列， 为一种鼠源IgG1a亚型单克隆抗体，亲和常数为1.1×10⁹，能特异识别重组的GUS蛋白以及转基因生物中的GUS报告基因。

采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体的方法有以下两种：

1）在体外用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收获培养上清经免疫亲和层析法分离

纯化所需单克隆抗体；

2）在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，收获动物腹水后分离纯化所需单克隆抗

体。

本发明同时要求保护该抗GUS抗体在对含GUS生物样本的免疫学检测中的应用。可以检测的生物样本包括转基因植物、转基因动物、转基因微生物和转基因动物细胞。可以应用的免疫学检测方法包括但不限于利用抗体直接和抗原结合的酶联免疫吸附检测（ELISA）、免疫印迹（Western Blot）、流式细胞术（FACS）、免疫组织化学（IHC）检测或者免疫PCR检测方法。在免疫学检测中，该抗体可单独或与通过化学键偶联，静电吸附或者亲疏水性吸附，而连接缀合物包括辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（AP），生物素（Biotin），异硫氰酸荧光素（FITC），Cy3、Cy5、磁珠和琼脂糖等缀合物连接。

本发明还要求保护该抗GUS抗体在对含GUS生物样本进行基于免疫学的生物分离中的应用。该基于免疫学的分离方法包括但不限于利用琼脂糖免疫、免疫磁珠吸附或流式细胞术完成生物分离方法或阳性细胞分选。

本发明的优点及有益效果

（1）        本发明获得的杂交瘤(71381s-2) 分泌产生的单克隆，能识别GUS重组蛋白质，具有检测多种转基因植物的GUS蛋白的特性，具有广阔的用途。

本发明获得的杂交瘤（71381s-2）为一种IgG1a类抗体，与GUS蛋白的结合有极强特异性和敏感性，最低检测限为4ng，

（2）  可对转基因材料中的GUS蛋白质含量进行定量分析

（3）  可对单粒水稻种子进行分析，确定种子中GUS蛋白质的有无。

可检出GUS含量仅为0.02‰的生物样本。

（4）        本发明获得的杂交瘤（71381s-2）产生的单克隆抗体可独立或与生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等偶联，用于免疫印记(Western b1otting)、双抗体夹心ELISA、间接ELISA、免疫组织化学、免疫PCR等方法对转基因生物进行检测和筛查，特异性和灵敏度高，具有很高的使用价值。

（5）       本发明的抗体可以通过与琼脂糖、磁珠结合，进行生物样本的亲和富集和分离。

（6）       通过将本发明的抗体与FITC、Cy3、Cy5等荧光分子偶联，用于转基因细胞的流式细胞术分析与分选，进而完成qPCR、ELISpot或单细胞分析。

 

附图说明

图1：纯化的GUS重组抗原蛋白所纯化的重组GUS蛋白为可溶状态，可以部分保留天然构象，其纯度在90%左右，浓度高于1.5mg/ml。

图2：71381s-2抗体的识别特性和实际应用效果应用纯化的71381s-2单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出GUS重组蛋白及转基因水稻中的GUS蛋白。

图3：71381s-2抗体的检测灵敏度纯化的71381s-2单克隆抗体的最低检测限为4ng，可对GUS蛋白质含量进行定量分析。

图4：71381s-2抗体的检测适应性应用纯化的71381s-2单克隆抗体检测不同部位的水稻样本，均具有很高的特异性。

图5：71381s-2抗体在检测转基因大米中的应用应用纯化的71381s-2单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出大米中的转基因GUS蛋白。

 

具体实施方式

        下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

 

实施例1 重组GUS蛋白质的制备

一、 基因克隆

按照Genbank中AAC53706的氨基酸序列，参照质粒pBI101中公布的gus基因编码序列U12639，分别设计特异性上游引物GUS-F： G GAATTC ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCC和下游引物GUS-R：CCG CTCGAG TTGTTTGCCTCCCTGCTGCGG，从细菌基因组中扩增完整的gus编码基因。在PCR的过程中在基因5’和3’端分别加入EcoR I和XhoI酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体pET30a进行EcoR I和XhoI酶切，再次电泳回收，以T₄ DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用

二、  蛋白表达和纯化

按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100ml LB培养基，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6~0.8。加入0.1 mol/L的IPTG，25℃震荡培养8h，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样进行SDS-PAGE分离检测，图1为在pET30a中融合组氨酸标签的重组GUS蛋白的表达和纯化结果。重组GUS蛋白的纯度在90%以上，浓度约为1-1.5 mg/mL，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。

 

实施例2 杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂（Sigma公司）乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司）乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA（波长450nm）检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

       无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0（ATCC）以5:1比例混合，离心1500 rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500（Roche公司），并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM（Sigma公司），混匀，离心1000 rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清（PAA公司）小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT（Sigma公司）的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1%硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃ 5%CO₂培养箱中培养。

三、挑克隆

       融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃ 5%CO₂培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

       3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1%HT（Sigma公司）的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基（含饲养细胞和HT）的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

 

实施例3  腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000 rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

       用HiTrap rProtein A FF（GE公司）亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

 

实施例4 单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS（pH7.4）稀释包被羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）至0.5 μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05% Tween的PBS（PBS-T）洗3次，每孔加入200μl封闭液（含2%BSA和3%蔗糖的PBS），37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠（κ,λ）抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA）抗体（Southern Biotech公司）0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl 含0.15% ABTS（Southern Biotech公司）和0.03% H₂O₂的柠檬酸缓冲液（PH4.0）进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组GUS蛋白，包被浓度为2μg/ml, 100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1% TMB（Sigma公司）和0.03% H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为1.1×10⁹。

亲和常数

三、 单抗反应特异性

选择重组的GUS蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5ng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore 公司）。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体71381s-2（1：1000稀释）4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液（北京普利莱基因技术有限公司），以ChemiDoc MP多色荧光成像系统（Bio-Rad）进行化学发光图像数据的采集。

图2 显示的是单克隆抗体71381s-2对重组蛋白和转GUS基因水稻的免疫印记结果。该抗体可以识别重组及转基因水稻的GUS蛋白质，对非转基因水稻没有显示，对转基因水稻中只有特异的识别条带。

 

实施例4 抗体的可变区序列测定

     培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，要证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，证实完成后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。 Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9 μL总RNA, 加入2.5 μL oligo(dT)12–18 primer (10 mM), 及5 μL dNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5 μL RT buffer (5X), 2.5 μL DTT (0.1 M) 及 1 μL逆转录酶，42℃反应1小时。 70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA 保存在-20℃。. 将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50 μL反应体系中加入引物各25 pmol，引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠单抗引物序列设计和合成。其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板加入1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序，通常为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25各循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5% 琼脂糖凝胶上分离切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。

 

实施例5 本发明单克隆抗体在免疫学检测中的应用

用实施例3 中所述的免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体在检测转基因植物中的应用效果。

首先检测单克隆抗体71381s-2的检测灵敏度。用Bradford法进行了重组GUS蛋白质的定量分析，并对上样量依次为2、4、8、16、32和64ng的GUS蛋白质进行WB分析（图3A），采集WB信号，计算3次重复实验的平均值及方差，绘制了标准曲线并获得了线性回归方程（图3B）。从图3可见，WB可检测到约4ng 的重组GUS蛋白质。同时，将鲜重为0.017g转基因水稻苗期叶片加裂解液和上样缓冲液获得500μl的蛋白质样品，分别上样5μl和15μl，与重组蛋白质同时进行WB检测，采集的水稻样品的信号值分别为4682和9019，带入方程式计算出对应GUS蛋白质含量分别为3.12ng和11.4ng，取两者平均得到电泳水稻样品中GUS蛋白质含量约为0.7ng／μl，折合在该转基因水稻苗期叶片中GUS蛋白质的含量约为鲜重的0.02‰。纯化的71381s-2单克隆抗体的最低检测限为4ng，可对生物材料中的GUS蛋白质进行定量分析。

随后检测71381s-2抗体的检测适用性。应用纯化的71381s-2单克隆抗体检测多个组织的水稻样品，包括苗期的地上部、地下部，分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶枕、叶片上部、叶片中部和叶片下部，孕穗期的茎、穗轴、叶鞘、叶枕、叶片、幼穗（长度分别为1cm、2cm、10cm和20cm），开花期的茎、穗轴、叶鞘、叶片、穗子，成熟期的茎、叶片、授粉后不同时期的种子（分别为授粉后10天、20天、30天、40天），以及乳熟期的胚、胚乳和颖壳，成熟种子的全种子、胚、胚乳和颖壳等（图4）。结果显示该抗体可用于各种组织来源的转基因材料中GUS蛋白的检测。

然后还建立了针对食用稻米的检测方法。将稻米用研钵磨碎后，提取单粒稻米的蛋白质，然后对单粒稻米的10%、5%、2.5%和1.25%样品进行免疫印迹分析（图5）。结果表明，该方法可以从单粒稻米的10%、5%和2.5%的样品中，检测到清晰的GUS信号。

Claims (10)

1.一种单克隆抗体，其特征在于由小鼠杂交瘤细胞系71381s-2分泌。

2.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其免疫小鼠用的免疫原具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，该抗原由大肠杆菌重组表达，经纯化后获得。

3.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其重链和轻链可变区为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的DNA序列所编码，分别具有SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示的氨基酸序列。

4.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其为小鼠IgG1a亚型单克隆抗体。

5.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于可单独或与其他缀合物连接完成含GUS生物样本的免疫学检测和生物分离。

6.权利要求5所述的连接方式，包括化学键偶联、静电吸附或者亲疏水性吸附。

7.权利要求5所述生物样本，包括转基因植物、转基因动物、转基因微生物和转基因动物细胞。

8.权利要求5所述连接缀合物包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、生物素（Biotin）、异硫氰酸荧光素（FITC）、荧光染料Cy3、荧光染料Cy5、磁珠和琼脂糖。

9.权利要求6所述的免疫学检测方法包括利用抗体直接和抗原结合的酶联免疫吸附检测（ELISA）、免疫印迹（Western Blot）、流式细胞术（FACS）、免疫组织化学（IHC）检测或者免疫PCR检测方法。

10.权利要求5所述的生物分离方法包括琼脂糖免疫、免疫磁珠吸附和流式细胞分选方法。