CN105001328B - 由杂交瘤细胞株分泌抗ttf-1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种由杂交瘤细胞株分泌抗TTF‑1单克隆抗体及其应用。甲状腺转录因子‑1（thyroid transcription factor‑1，TTF‑1）是一种可调节甲状腺球蛋白基因的特异性表达的转录因子，也是一种肺腺癌高敏感性及特异性的分子标记物。为制备其特异性抗体，通过序列分析，选择包含其N端123位氨基酸测定片段与GST蛋白融合为重组蛋白，由大肠杆菌表达和纯化后免疫动物，筛选获得了可分泌抗TTF‑1单克隆，保藏号为CGMCC NO.10399的杂交瘤细胞，通过基因克隆的方法确定了其重链和轻链可变区的序列。对多种肿瘤组织的免疫组织化学检测发现，该抗体可以很好的鉴别肿瘤的发生，可用于这些肿瘤的免疫学诊断。

Description

由杂交瘤细胞株分泌抗TTF-1单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种由杂交瘤细胞株分泌抗TTF-1单克隆抗体及其应用。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞TTF-1蛋白质分子的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中p63的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。

背景技术

甲状腺转录因子-1（ thyroid transcription factor-1），即TTF-1 表达于甲状腺腺上皮和肺的上皮细胞中。在肺肿瘤研究中发现，大多数肺的小细胞癌、原发性和转移性肺腺癌、少部分大细胞未分化肺癌、大多数非典型神经内分泌肿瘤免疫组化结果显示为TTF-1阳性，在甲状腺乳头状腺癌中TTF-1也呈阳性，而 TTF 在其它组织中无表达，据此，TTF-1被认为可用来鉴别肺腺癌与鳞癌，并有助于与肺转移性腺癌的鉴别。TTF-1 与血清TSH 的活性有关，活性的TSH-R可增强 TTF-1 的表达。在良恶性甲状腺组织中，TTF-1表达的情形不同，正常甲状腺和良性腺瘤表达高，而甲状腺乳头状癌与滤泡癌中表达量低，在未分化癌中则不表达。75%的肺非小细胞癌（ NSCLCs)中的TTF-1呈阳性表达，在腺癌 (ACs)中的表达明显高于鳞癌 (SCC) ， 90% 以上的原发性小细胞肺癌 (SCLC) 表达阳性 ,TTF-1在非小细胞肺癌（ NSCLCs) 阳性表达强度与病人的预后成呈负相关，可作为一项独立的预后指标，肺的典型性类癌 (TCS) 均为阴性，表明小细胞肺癌和非小细胞肺癌可能有一个不同于 TCS 的共同起源的理论。

因此，TTF-1可以作为诊断甲状腺、肺肿瘤的一个重要标记，其阳性染色位置在胞核。TTF-1的抗体可应用在肺、甲状腺及一些神经内分泌来源的肿瘤诊断及鉴别诊断中，并且在判断预后方面也有着非常显著的应用前景。

最近发现TTF-1抗体在肝细胞癌内呈现较高比率的阳性表达，只是这种染色方式与一般的TTF-1染色不同，主要在细胞质表达。国内外已有学者证实TTF-1抗体在肝细胞癌内的胞质染色阳性率达到64-93%，而在肝胆管细胞癌、转移性腺癌、肾透明细胞癌等染色率均较低，故认为TTF-1抗体可作为一个辅助指标用于HCC的诊断及鉴别诊断。文献日本临床细胞学会杂志，47（2）:146-147描述了以免疫组化法测定肺癌的方法，在该方法中首先使用甲状腺转录因子1(TTF-1，Thyroid Transcription Factor 1)、天冬氨酸蛋白酶A(Napsin-A) 以及p63区别高级神经内分泌肿瘤、腺癌以及鳞状细胞癌，然后再以细胞角蛋白18(CK18) 来鉴别大细胞神经内分泌癌(LCNEC，Large Cell Neuroendocrine Carcinoma)和小细胞癌。公开号为CN102405238A的发明专利“测定癌症组织学类型的抗体鸡尾酒测定试剂盒及测定方法”公开了一种利用Napsin-A和腺癌细胞核中的TTF-1的抗体构成鸡尾酒检测方式对肺癌组织类型进行鉴别的方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种制备TTF-1重组蛋白片段的方法，该重组蛋白由N端融合的GST标签、Gly4Ser连接肽、TTF-1的第1位至123位片段及用于纯化的组氨酸标签组成。

本发明的第二个目的是提供一种特异性好，亲和力高的TTF-1单克隆抗体的制备方法，该抗体由杂交瘤细胞分泌，能特异结合TTF-1重组抗原和天然抗原。所述的小鼠杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系600662-18F7，已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路一号院3号，保藏号为CGMCC No.10399。

本发明的第三个目的是提供一种可用于肺肿瘤免疫组化诊断的抗体。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明针对TTF-1蛋白，按照Uniprot及Genbank公布的序列进行分析，依据其抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的第1位到第123位N端区域用于重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，改善其表达行为，且便于纯化，在重组蛋白的N端融合有GST蛋白及便于折叠的甘氨酸-丝氨酸连接肽，在其C端融合有便于纯化和检测的组氨酸标签。经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-30a中进行重组表达，对表达的包涵体蛋白纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组TTF-1蛋白筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

利用该杂交瘤细胞系对小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为3.84×10⁹。免疫印记（Western blotting）实验显示该抗体能特异识别重组的TTF-1蛋白以及表达TTF-1蛋白的肿瘤细胞。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系分泌。所述的小鼠杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系600662-18F7，已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.10399。

所述单克隆抗体是一种可识别SEQ ID NO.1所示序列的完整TTF-1蛋白序列，其亲和力常数为3.84×10⁹。

所述的单克隆抗体，其制备中所用的抗原是将具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的具有SEQ ID NO.3所示序列的TTF-1第1为至第123位氨基酸序列片段。

所述的单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示的DNA序列所编码。

所述的单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示的氨基酸序列。

所述的单克隆抗体，其为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

所述的单克隆抗体，其识别重组TTF-1和病理组织细胞的TTF-1分子。

所述的单克隆抗体在免疫组化病理诊断剂上的应用。

本发明的优点及有益效果

（1）本发明获得的杂交瘤（60662-18F7）分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白TTF-1分子和表达TTF-1的肿瘤细胞，能够检测高表达TTF-1蛋白的肺腺癌、肺支气管肺泡癌、肺小细胞癌、肺胚层细胞瘤、肺泡腺瘤、肺乳头状腺瘤、甲状腺腺瘤、甲状腺滤泡性癌、甲状腺乳头状癌、甲状腺髓样癌等多种肿瘤组织。

（2）本发明获得的杂交瘤（60662-18F7）为一种IgG1类抗体，与TTF-1蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

（3）本发明获得的杂交瘤（60662-18F7）产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学（IHC）、免疫印记（Western blotting）、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。在以目前普遍使用的商品化SPT24抗体的对比实验中，本发明细胞株制备的抗体60662-18F7染色强度更强，对肺癌的检测敏感性更高，具有更广的应用范围，可显著提高诊断的准确度。

附图说明

图1：TTF1-pET30a-GST-codonplus的表达和纯化

电泳条件：12%，SDS-PAGE凝胶电泳。样本说明： 1:诱导表达的全菌经超声处理后样本； 60mM咪唑洗脱的GST-融合TTF-1片段重组蛋白，大小约为45kDa；Marker：蛋白质分子量标记，上样量20μL。

图2：抗体的识别特性和实际应用效果

应用纯化的60662-18F7单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出TTF-1重组蛋白，TTF-1重组蛋白上样10微升， 60662-18F7单克隆抗体1：1000稀释，酶标羊抗鼠1:5000稀释，目标蛋白约为45kDa。

图3：TTF-1单克隆抗体的免疫组织化学检测结果

应用纯化的TTF-1抗体同商品化抗体SPT24在组织芯片上进行免疫组织化学检测，左为对照抗体SPT24，右为纯化抗体TTF-1。

具体实施方式

下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1 重组TTF-1蛋白片段的制备

一．基因克隆

针对TTF-1的蛋白序列，经过对二级结构、抗原性指数和表面可及性的分析，确定选择其N末端用于表达。按照Uniprot数据库中登录号为P43699.1的蛋白质序列（SEQ IDNO.1）及对应Genbank中NM_001079668.2的核酸序列，选择其N末端的第1至123位氨基酸对应的DNA序列进行基因合成，DNA的序列如SEQ ID NO.2所示（南京金斯瑞生物科技有限公司），合成的基因经上游引物TTF-1F：CCTGAATTCGGCGGTGGCGGCAGTATG（EcoRI）和下游引物TTF-1R：CTTGCTCGAGGGGGAAGCGCGGG （XhoI）进行扩增，并在扩增的基因两端分别加入EcoRI和XhoI酶切位点，该片段编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。选择pET30a（USA，Invitrogen）作为表达载体，该载体带有GST融合蛋白，pET30a质粒也用EcoRI和XhoI进行酶切，电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21 codonplus，挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆即采用。

二．小量表达

从转化的平板挑单克隆到1.5 ml LB液体培养基中，37℃，200 rpm培养，培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5 mM）诱导，37℃，200 rpm培养2 h。 取1 ml诱导的菌液，12000 rpm，离心1 min，弃上清，沉淀用50-100 μl 10 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液吹散（加入缓冲液的量视菌体量而定），加入与缓冲液等体积的 2×loading buffer，100℃煮5 min，电泳检测。

三．大量表达和纯化

将2 μL活化的菌液转接到5 ml LB液体培养基中，37℃，200 rpm，培养，将培养的菌液转接到500 ml LB液体培养基混合，37℃，200 rpm，培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5 mM）诱导4 h。用400 ml大离心筒，6000 rpm，离心5 min收集菌体，弃上清。沉淀用20-30 ml 10mM Tris-HCl（pH 8.0）溶液吹散，超声。取100 μL超声（500 W ,30次，每次10 s，间隔15 s）后的菌悬液，12000 rpm，离心10 min，取50 μl上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50μl 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）溶液吹散，加入50 μl 2×上样缓冲液，100℃煮5 min，电泳检测。

纯化包涵体蛋白时，将含终浓度为0.5mol/L NaCl的样本上样至镍柱，上样结束后，用含0.5 M氯化钠的10 mM Tris-HCl（pH 8.0）溶液洗柱。然后分别用含15 mM咪唑、60mM咪唑、500 mM咪唑的10 mM Tris-HCl（pH 8.0）（含0.5 M氯化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳检测，备用。

实施例2 杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂（Sigma公司）乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60µg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司）乳化，剂量为30µg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA（波长450nm）检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50µg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0（ATCC）以5:1比例混合，离心1500 rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500（Roche公司），并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM（Sigma公司），混匀，离心1000 rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清（PAA公司）小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT（Sigma公司）的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1%硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃ 5%CO₂培养箱中培养。

三、挑克隆

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃ 5% CO₂培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100µl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200µl含饲养细胞和1%HT（Sigma公司）的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基（含饲养细胞和HT）的24孔板培养。五天后取100µl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3 腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000 rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF（GE公司）亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4 单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS（pH7.4）稀释包被羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）至0.5 µg/ml,每孔加100µl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05% Tween的PBS（PBS-T）洗3次，每孔加入200µl封闭液（含2%BSA和3%蔗糖的PBS），37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠（κ,λ）抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA）抗体（Southern Biotech公司）0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50µl 含0.15% ABTS（Southern Biotech公司）和0.03% H₂O₂的柠檬酸缓冲液（PH4.0）进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组TTF-1蛋白，包被浓度为2µg/ml, 100µl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200µl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100µl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100µl含0.1% TMB（Sigma公司）和0.03% H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50µl 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为3.84×10⁹。

亲和常数

一、 单抗反应特异性和应用效果

选择重组的TTF-1蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore 公司）。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体60662-18F7（1：1000稀释）4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液（北京普利莱基因技术有限公司），以ChemiDoc MP多色荧光成像系统（Bio-Rad）进行化学发光图像数据的采集。

实施例5 抗体的可变区序列测定

取培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9 μL总RNA，加入2.5 μL oligo(dT)12–18 primer (10 mM)，及5 μLdNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5 μL RT buffer (5X)，2.5 μL DTT (0.1 M) 及 1 μL逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA 保存在-20℃。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50 μL反应体系中加入引物各25 pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠单抗引物序列设计和合成。用于扩增重链可变区的引物如下，其中MHV.B1直至MHV.B12的11条引物为上游引物，可分别与重链下游引物MHC.F组合用于扩增重链可变区基因。

MHV.B1:5’ -GATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3’

MHV.B2:5’ -CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3’

MHV.B3:5’ -CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3’

MHV.B4:5’ -AGGTTACTCTGAAAGAGTC-3’

MHV.B5:5’ -GAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3’

MHV.B6:5’ -GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3’

MHV.B7:5’ -CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3’

MHV.B8: 5’ -GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3’

MHV.B9: 5’ -GAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3’

MHV.B10: 5’ -GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3’

MHV.B12: 5’ -GAGGTGCAGCTGGAGGAGTC-3’

MHC.F:5’-GGCCAGTGGATAGTCAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3’

用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV.B1直至MKV. B10的10条引物为上游引物，可分别与轻链下游引物MKC.F组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。

MKV.B1: 5’ -GATGTTTTGATGACCCAAACT -3’

MKV.B2: 5’ -GATATTGTGATGACGCAGGCT-3’

MKV.B3: 5’ -GATATTGTGATAACCCAG-3’

MKV.B4: 5’ -GACATTGTGCTGACCCAATCT-3’

MKV.B5: 5’ -GACATTGTGATGACCCAGTCT-3’

MKV.B6: 5’ -GATATTGTGCTAACTCAGTCT-3’

MKV.B7: 5’ -GATATCCAGATGACACAGACT-3’

MKV.B8: 5’ -GACATCCAGCTGACTCAGTCT-3’

MKV.B9: 5’ -CAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3’

MKV.B10: 5’ -GACATTCTGATGACCCAGTCT-3’

MKC.F: 5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’

其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5% 琼脂糖凝胶上分离，轻链（κ 轻链）的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。

实施例6. 组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡（熔点在66～68 ℃）倒入模具，冷却至室温后将模具放入- 20 ℃冰箱6 min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1.5mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4 mm，用另一直径1.5mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入70 ℃烤箱内10min , 使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30 min，再放入-20 ℃ 冰箱冷冻6 min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4 ℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂在凉水中, 让其自然展开，再将分开的切片转移到45 ℃的温水中展片30秒，用经2 % APES 丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入70 ℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入- 4℃ 冰箱保存。

二．IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3%H₂O₂孵育10分钟 ，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加封闭液（动物非免疫血清）室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗（首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例）室温（25℃）孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。 苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85%（3分钟）-95%（3分钟）-100%（3分钟）-100%（3分钟）的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

三．数据统计

根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率（着色样本数/样本总数），见表1。

表1 TTF-1同TTF-1（SPT24）在肿瘤组织中的表达差异比较

SEQUENCE LISTING

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 由杂交瘤细胞株分泌抗TTF-1单克隆抗体及其应用

<130> 30

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 371

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 1

Met Ser Met Ser Pro Lys His Thr Thr Pro Phe Ser Val Ser Asp Ile

1 5 10 15

Leu Ser Pro Leu Glu Glu Ser Tyr Lys Lys Val Gly Met Glu Gly Gly

20 25 30

Gly Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Tyr Arg Gln Gly Gln Ala Ala Pro

35 40 45

Pro Thr Ala Ala Met Gln Gln His Ala Val Gly His His Gly Ala Val

50 55 60

Thr Ala Ala Tyr His Met Thr Ala Ala Gly Val Pro Gln Leu Ser His

65 70 75 80

Ser Ala Val Gly Gly Tyr Cys Asn Gly Asn Leu Gly Asn Met Ser Glu

85 90 95

Leu Pro Pro Tyr Gln Asp Thr Met Arg Asn Ser Ala Ser Gly Pro Gly

100 105 110

Trp Tyr Gly Ala Asn Pro Asp Pro Arg Phe Pro Ala Ile Ser Arg Phe

115 120 125

Met Gly Pro Ala Ser Gly Met Asn Met Ser Gly Met Gly Gly Leu Gly

130 135 140

Ser Leu Gly Asp Val Ser Lys Asn Met Ala Pro Leu Pro Ser Ala Pro

145 150 155 160

Arg Arg Lys Arg Arg Val Leu Phe Ser Gln Ala Gln Val Tyr Glu Leu

165 170 175

Glu Arg Arg Phe Lys Gln Gln Lys Tyr Leu Ser Ala Pro Glu Arg Glu

180 185 190

His Leu Ala Ser Met Ile His Leu Thr Pro Thr Gln Val Lys Ile Trp

195 200 205

Phe Gln Asn His Arg Tyr Lys Met Lys Arg Gln Ala Lys Asp Lys Ala

210 215 220

Ala Gln Gln Gln Leu Gln Gln Asp Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Thr Gly Cys Pro Gln Gln Gln Gln Ala Gln Gln Gln Ser Pro Arg

245 250 255

Arg Val Ala Val Pro Val Leu Val Lys Asp Gly Lys Pro Cys Gln Ala

260 265 270

Gly Ala Pro Ala Pro Gly Ala Ala Ser Leu Gln Gly His Ala Gln Gln

275 280 285

Gln Ala Gln His Gln Ala Gln Ala Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ile

290 295 300

Ser Val Gly Ser Gly Gly Ala Gly Leu Gly Ala His Pro Gly His Gln

305 310 315 320

Pro Gly Ser Ala Gly Gln Ser Pro Asp Leu Ala His His Ala Ala Ser

325 330 335

Pro Ala Ala Leu Gln Gly Gln Val Ser Ser Leu Ser His Leu Asn Ser

340 345 350

Ser Gly Ser Asp Tyr Gly Thr Met Ser Cys Ser Thr Leu Leu Tyr Gly

355 360 365

Arg Thr Trp

370

<210> 2

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtcgatga gtccaaagca cacgactccg ttctcagtgt ctgacatctt gagtcccctg 60

gaggaaagct acaagaaagt gggcatggag ggcggcggcc tcggggctcc gctggcggcg 120

tacaggcagg gccaggcggc accgccaaca gcggccatgc agcagcacgc cgtggggcac 180

cacggcgccg tcaccgccgc ctaccacatg acggcggcgg gggtgcccca gctctcgcac 240

tccgccgtgg ggggctactg caacggcaac ctgggcaaca tgagcgagct gccgccgtac 300

caggacacca tgaggaacag cgcctctggc cccggatggt acggcgccaa cccagacccg 360

cgcttcccc 369

<210> 3

<211> 123

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 3

Met Ser Met Ser Pro Lys His Thr Thr Pro Phe Ser Val Ser Asp Ile

1 5 10 15

Leu Ser Pro Leu Glu Glu Ser Tyr Lys Lys Val Gly Met Glu Gly Gly

20 25 30

Gly Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Tyr Arg Gln Gly Gln Ala Ala Pro

35 40 45

Pro Thr Ala Ala Met Gln Gln His Ala Val Gly His His Gly Ala Val

50 55 60

Thr Ala Ala Tyr His Met Thr Ala Ala Gly Val Pro Gln Leu Ser His

65 70 75 80

Ser Ala Val Gly Gly Tyr Cys Asn Gly Asn Leu Gly Asn Met Ser Glu

85 90 95

Leu Pro Pro Tyr Gln Asp Thr Met Arg Asn Ser Ala Ser Gly Pro Gly

100 105 110

Trp Tyr Gly Ala Asn Pro Asp Pro Arg Phe Pro

115 120

<210> 4

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caggtcggcc tgcagcagtc tgggcctgaa ctggtgaggc ctggggtctc agtgacgatt 60

tcctgcaagg gttccggcta cacattcact ggttatgcta tgaactgggt gaagcagagt 120

catgcaaaga gtctagagtg gattgggctt atcagcactt actctggtaa taaaaattac 180

aaccagaagt ttaaggtcaa ggccacaacg actgtaggca aatccttcag cacagcctat 240

atggaacttg ccatactgac atctgaggat tctgccatct acaactgtgc gctggtacgt 300

cgcggactac tggggccaag gcaccagtct cacagtctcc tcagccaaaa cgacacccaa 360

gct 363

<210> 5

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatatcgtga tgacccaaga tgaactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcgagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctacaga agccaggcct gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaactag acttgttccg 300

tggacgttcg ctggaggcac caagctggaa atcaaacgag ctgatgctgc accaactgga 360

tcc 363

<210> 6

<211> 121

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 6

Gln Val Gly Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Lys Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Val Lys Ala Thr Thr Thr Val Gly Lys Ser Phe Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Ile Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Asn Cys

85 90 95

Ala Leu Val Arg Arg Gly Leu Leu Gly Pro Arg His Gln Ser His Ser

100 105 110

Leu Leu Ser Gln Asn Asp Thr Gln Ala

115 120

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Glu Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Leu Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr

85 90 95

Arg Leu Val Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Gly Ser

115 120

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgtgaagc ttcaggagtc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caggtgcagc tgaaggagtc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caggtgcagc tgaagcagtc 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aggttactct gaaagagtc 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaggtccagc tgcaacaatc t 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaggtccagc tgcagcagtc 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caggtccaac tgcagcagcc t 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaggtgaagc tggtggagtc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaggtgaagc tggtggaatc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatgtgaact tggaagtgtc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gaggtgcagc tggaggagtc 20

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggccagtgga tagtcagatg ggggtgtcgt tttggc 36

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gatgttttga tgacccaaac t 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gatattgtga tgacgcaggc t 21

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gatattgtga taacccag 18

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gacattgtgc tgacccaatc t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gacattgtga tgacccagtc t 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gatattgtgc taactcagtc t 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gatatccaga tgacacagac t 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gacatccagc tgactcagtc t 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

caaattgttc tcacccagtc t 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gacattctga tgacccagtc t 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggatacagtt ggtgcagcat c 21

Claims (7)

1.一种单克隆抗体，其特征在于：由小鼠杂交瘤细胞系分泌；所述的小鼠杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系600662-18F7，已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.10399；所述单克隆抗体是一种可识别SEQID NO.1所示序列的完整TTF-1蛋白的 序列，其亲和力常数为3.84×10⁹。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：其制备中所用的抗原是将具有SEQID NO.2所示的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的具有SEQ ID NO.3所示序列的TTF-1第1位 至第123位氨基酸序列片段。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：其重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的DNA序列所编码。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：其重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：其为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：其识别重组TTF-1和病理组织细胞的TTF-1分子。

7.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。