CN104892759B - 由杂交瘤细胞系分泌的抗Ki67单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可以识别人Ki67蛋白质分子的单克隆分子及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系，本发明选择一段Ki67蛋白质特征性的多肽抗原免疫小鼠后筛选获得了制得了一种保藏编号为10402的杂交瘤细胞系73043‑24E8，该细胞可分泌针对Ki67分子的单克隆抗体，并可特异性识别Ki67蛋白及肿瘤组织，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中Ki67的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。

Description

由杂交瘤细胞系分泌的抗Ki67单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种可以识别人Ki67蛋白质分子的单克隆抗体及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞核内Ki67分子的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中Ki67的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。

背景技术

Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可缺少，但其确切机制尚不清楚，Ki67作为标记细胞增殖状态的抗原，阳性说明癌细胞增殖活跃。

作为一种存在于增殖细胞中的核抗原，Ki67的确切功能目前尚不清楚，但通过研究它的表达及在核内分布的情况，认为它的功能与染色质相连与细胞有丝分裂有关，因此是目前应用最广泛的增殖细胞标记之一。Gerdes等研究表明Ki67免疫的反应与细胞周期密切相关，在G1、S、G2、M期均表达，但G0期无表达，而且还发现Ki67在G1晚期/S早期微量表达，S期聚集，尤其在后半期表达率明显增高，有丝分裂后期迅速降解或失去抗原决定簇，故认为Ki67是检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标之一。目前有研究表明在多种实体恶性肿瘤中Ki67的表达远高于正常组织，并与恶性肿瘤的发展，转移及预后有关。国外有报道Ki67在乳腺癌组织中阳性率为78.0％。有报道Ki67的表达与乳腺癌肿瘤的生长和浸润以及淋巴结转移之间存在着密切相关性，即Ki67表达阳性的乳腺癌肿瘤细胞的恶性程度大，细胞增殖活跃，因此肿瘤生长速度快，侵袭性大，转移的机会高，预后差。但其机制目前尚不清楚。关于乳腺癌组织中Ki67表达对于乳腺癌的预后判断以及指导治疗价值有待进一步研究，但近来有文献报道Ki67可作为乳腺癌化疗敏感性指标，肿瘤细胞增殖率降低，比肿瘤的肿块缩小更能反映肿瘤对化疗敏感程度，而且还有研究表明Ki67的表达比T分期能更好预测肿瘤的放射敏感性。应用免疫组化技术检测乳腺癌组织中多项生物指标简单、易行，为乳腺癌患者的临床评估提供参考，并有助于临床个体化治疗。Ki67与PCNA这类增殖标记及c-erbB-2、p53等一同被列为仅次于激素受体、组织学级别的乳腺癌第二类预后指标，由于Ki67 在G0期以外各增殖周期均有表达，更具可用性。两者具有一定的互补性。Ki-67在低分化腺癌组织中的表达较在中高分化腺癌组织的表达明显升高，表明Ki67 染色阳性程度与组织学分级的相关性。表明Ki67表达与乳腺癌发生、发展有关，是一个不良预后因素，对乳腺癌的诊断治疗及预后评价有重要的参考价值。与Ki67不同的是，PCNA的表达可能是DNA多倍体形式表达的一个标记，也成为肿瘤细胞失调状态下的一个标记，检测PCNA可以评价肿瘤细胞增殖状态，也有研究显示PCNA与某些肿瘤的预后及诊断有一定关系。在乳腺癌的预后研究中，PCNA在肿瘤的良恶性的区分、恶性程度的确定及评估预后等方面有较广泛的应用。

Ki67抗原是目前多种恶性肿瘤尤其是乳腺癌研究中的热门生物指标，可以通过对抗原的检测，了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。公开号为CN 101896819 A的发明专利“对癌症的诊断测试、预测测试和预后测试”的发明专利描述了一种利用孪蛋白、Aurora A、Plk1、Ki67 和H3S10ph几种蛋白标志物，采用点印迹分析、狭线印迹分析、RIA、肽微阵列和ELISA方法进行肿瘤预后评估的方法。申请号为CN201110088864的发明专利“蛋白组合物及其在制备肺癌诊断试剂盒中的应用”则公开了一种利用p53、p63、Ki67、MCM7及EGFR五种蛋白的组合物配体，如单克隆抗体对肺癌进行诊断的方法。

目前在肿瘤诊断中使用最多的Ki67抗体为克隆号MIB1的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供由杂交瘤细胞系分泌抗Ki67单克隆抗体及其应用。提供一种设计和制备Ki67抗原肽的方法，该抗原由Ki67分子中具有特征性序列的多肽经化学合成后与载体蛋白偶联制备而来。本发明的第二个目的是提供一种特异性好，亲和力高的Ki67单克隆抗体的制备方法，该抗体能特异结合Ki67重组抗原和天然抗原。本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测的使用方法。

所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系73043-24E8，已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路一号院3号，保藏号为CGMCC No.10402。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明对在乳腺癌和其他恶性肿瘤中细胞核表达的Ki67分子，按照公布的序列进行分析，依据其内在重复序列的氨基酸组成、抗原性以及序列的亲疏水性、二级结构以及序列的特异性等特征选择适宜合成又具有良好免疫原性的第1213-1232位肽段用于化学合成，为提高其免疫原性，在N端增加一个Cys用于和载体蛋白偶联作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组Ki67筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1亚型的单克隆抗体，亲和常数为7.68×10⁹。免疫印记（Western blotting）实验显示该抗体能特异识别重组的Ki67蛋白。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系分泌。

所述抗体特异识别由SEQ ID No.1所示的DNA编码的Ki67蛋白，该蛋白具有SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。

所述的单克隆抗体，其免疫原为按照SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经化学合成多肽后，通过其N末端的半胱氨酸与钥孔虫戚血蓝素蛋白（(keyhole limpet hemocyanin，KLH）的自由巯基偶联而成的蛋白质。

单克隆抗体，所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系73043-24E8，已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCCNo.10402。

其分泌抗体的重链和轻链可变区序列，重链可变区由SEQ ID No.4所示的DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.5，轻链可变区由SEQ ID No.6所示的DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.7。

所述的单克隆抗体，其可识别重组蛋白和肿瘤细胞的Ki67分子。

单克隆抗体，其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检测肿瘤及正常组织细胞Ki67蛋白的表达情况。可独立或与其他抗体组合应用于肿瘤细胞制备物、肿瘤组织切片的免疫组织化学、免疫印迹或酶联免疫检测方法。

所述的单克隆抗体，在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。

本发明的优点及有益效果

（1）本发明获得的小鼠杂交瘤细胞系（73043-24E8）分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白Ki67和表达Ki67的淋巴细胞，能够检测高表达Ki67蛋白的乳腺癌等多种肿瘤组织。

（2）本发明获得的小鼠杂交瘤细胞系（73043-24E8）所分泌的单克隆抗体为一种IgG1类抗体，与Ki67蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

（3）本发明获得的杂交瘤细胞系（73043-24E8）所分泌的的单克隆抗体可应用于免疫组织化学（IHC）、免疫印记（Western blotting）、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。在以目前普遍使用的商品化抗体MIB1的对比实验中，本发明细胞株制备的抗体在乳腺癌的诊断中特异性同对照抗体相当，敏感度优于已有的抗体。因此，本发明的Ki67单克隆抗体具有更广的应用范围，可显著提高诊断的准确度。

附图说明

图1：73043-24E8抗体的识别特性和实际应用效果

应用纯化的73043-24E8单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出Ki67重组蛋白，重组GST-Ki67片段融合的重组蛋白上样10微升， HRP酶标羊抗鼠按照1:5000稀释，目标蛋白为38kDa左右。

图2：Ki67单克隆抗体73043-24E8的免疫组织化学检测结果

应用纯化的Ki67抗体同商品化抗体MIB-1在组织芯片上进行免疫组织化学检测，左为对照抗体MIB1，右为纯化抗体73043-24E8。

具体实施方式

下面结合图表和具体实施方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1 多肽合成和重组抗原制备

一、抗原多肽选择

依据Uniprot及Genbank中登录号为P46013和GI:118572663的蛋白质序列进行序列和二级结构分析，全长为3256个氨基酸长度的Ki67蛋白由N端的FHA结构域（Forkheadassociated domain，FHA)以及多个长度为110个氨基酸左右的重复序列构成，其分子量约为359kDa左右，依据通过在线服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/ 预测的蛋白的二级结构（secondary structure）和表面可及性（Surface Accessibility）参数，并通过对其抗原性指数（Jameson BA, Wolf H. The antigenic index: a novelalgorithm for predicting antigenic determinants. Comput Appl Biosci. 1988,4(1):181-6.）的分析结果，选择此重复序列靠近C末端的氨基酸序列TPKEKAQALEDLAGFKELFQ作为抗原进行化学合成（南京金斯瑞生物科技有限公司），为便于偶联，在该多肽的氨基端添加了一个半胱氨酸用于提供巯基偶联。

二、多肽的偶联及纯化

选择Thermo Scientific(货号：77653)的马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒，按照试剂盒提供的流程操作。对于待偶联的多肽，首先以Ellman试剂（ThermoScientific，货号：22582）检测多肽中自由巯基：在96孔板中加入100 μL Ellman试剂储备液，再加入10μL多肽溶液，用Nano Drop分光光度计在λ=412 nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。开始偶联时，在每个mcKLH包装中加入200μL去离子水，配制成10mg/mL的KLH溶液，在500μL的Imject EDC偶联缓冲液中溶解2mg半抗原，将500μL多肽溶液加入到200μL的载体蛋白溶液中，将1mL去离子水加入到一个包装的EDC（10mg）中，缓慢振摇至完全溶解，取50μL加入到mcKLH多肽溶液中，反应2小时后，经脱盐柱处理除去未偶联的交联剂和盐类。

三．重组Ki67蛋白片段的表达和纯化

为便于对获得的抗体进行筛选和评价，选择Ki67蛋白中第1063至1157位氨基酸区域，长度为95个氨基酸的片段与GST蛋白融合表达，此段氨基酸的编码序列由南京金斯瑞生物科技有限公司直接合成并克隆进克隆载体质粒pUC57。该DNA片段5’端和3’端分别带有EcoRI和XhoI酶切位点，取5μL（约1微克）带有Ki67片段的质粒pUC57-Ki67和用作载体的pET30（Merck）5μL（约1微克）分别进行双酶切，酶切体系为：EcoRI（TakaRa）1μL，XhoI（TaKaRa）1μL，5μL 10×buffer H，38μL ddH₂O，37℃酶切三小时。酶切产物经1%琼脂糖电泳，柱离心式DNA回收试剂盒（北京华大蛋白质研发中心有限公司）切胶回收基因和载体片段。取2μL回收的线性化载体，3μL 酶切回收的Ki67基因片段，5μL 2×EZ-lig T4DNA快连试剂（北京华大蛋白质研发中心有限公司），混匀，室温连接三十分钟。取出-80℃保存的感受态细胞（BL21），解冻后加入连接产物，冰上放置30 min。42℃热激90秒后冰浴2 min后，加入800μL 无抗性的LB培养基。37℃复苏培养20 min，涂板。从转化的平板挑单克隆到1.5 mlLB液体培养基中，37℃，200 rpm培养，DNA测序（北京华大基因）。将测序正确的克隆菌液进行活化，取50μL活化的菌液到5 ml LB液体培养基中，37℃，200 rpm，培养。将培养的菌液转接到500 ml LB液体培养基混合，37℃，200 rpm，培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5 mM）低温过夜诱导。400 ml大离心筒，6000 rpm，离心5 min收集菌体，弃上清。沉淀用20-30 ml 10 mMTris-HCl（pH 8.0）和终浓度为0.5 M的NaCl溶液吹散，超声破碎菌体。12000rpm离心20分钟，取离心上清上样到Ni-NTA镍柱（QIAGEN）进行纯化，之后分别用含15 mM咪唑、60 mM咪唑、300 mM咪唑的10 mM Tris-HCl（pH 8.0）（含0.5 M氯化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳检测，备用。

实施例2 杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂（Sigma公司，F5881）乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60µg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司，F5506）乳化，剂量为30µg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA（波长450nm）检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50µg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0（ATCCNumberCRL-8287）以5:1比例混合，离心1500 rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500（Roche公司），并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM（Sigma公司），混匀，离心1000 rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清（PAA公司）小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT（Sigma公司）的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1%硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃ 5%CO₂培养箱中培养。

三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃ 5% CO₂培养箱中培养。

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100µL上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200µL含饲养细胞和1%HT（Sigma公司）的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基（含饲养细胞和HT）的24孔板培养。五天后取100µl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3 腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000 rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF（GE公司）亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4 单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS（pH7.4）稀释包被羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）至0.5 µg/ml,每孔加100µl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05% Tween的PBS（PBS-T）洗3次，每孔加入200µl封闭液（含2%BSA和3%蔗糖的PBS），37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠（κ,λ）抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA）抗体（Southern Biotech公司）0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50µL 含0.15% ABTS（Southern Biotech公司）和0.03% H₂O₂的柠檬酸缓冲液（PH4.0）进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组Ki67蛋白，包被浓度为2µg/ml, 100µL/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200µl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100µL，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100µl含0.1% TMB（Sigma公司）和0.03%H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50µL 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为7.68×10⁹。

亲和常数

四、单抗反应特异性和应用效果

选择重组的Ki67蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore 公司）。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体73043-24E8（1：1000稀释）4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液（北京普利莱基因技术有限公司），以ChemiDoc MP多色荧光成像系统（Bio-Rad）进行化学发光图像数据的采集。

实施例5 抗体的可变区序列测定

取培养新鲜的杂交瘤细胞系，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9 μL总RNA，加入2.5 μL oligo(dT)12–18 primer (10 mM)，及5 μLdNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5 μL RT buffer (5X)，2.5 μL DTT (0.1 M) 及 1 μL逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA 保存在-20℃。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50 μL反应体系中加入引物各25 pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠单抗引物序列设计和合成。用于扩增重链可变区的引物如下，其中MHV.B1直至MHV.B12的11条引物为上游引物，可分别与重链下游引物MHC.F组合用于扩增重链可变区基因。

MHV.B1:5’ -GATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3’

MHV.B2:5’ -CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3’

MHV.B3:5’ -CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3’

MHV.B4:5’ -AGGTTACTCTGAAAGAGTC-3’

MHV.B5:5’ -GAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3’

MHV.B6:5’ -GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3’

MHV.B7:5’ -CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3’

MHV.B8: 5’ -GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3’

MHV.B9: 5’ -GAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3’

MHV.B10: 5’ -GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3’

MHV.B12: 5’ -GAGGTGCAGCTGGAGGAGTC-3’

MHC.F:5’-GGCCAGTGGATAGTCAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3’

用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV.B1直至MKV. B10的10条引物为上游引物，可分别与轻链下游引物MKC.F组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。

MKV.B1: 5’ -GATGTTTTGATGACCCAAACT -3’

MKV.B2: 5’ -GATATTGTGATGACGCAGGCT-3’

MKV.B3: 5’ -GATATTGTGATAACCCAG-3’

MKV.B4: 5’ -GACATTGTGCTGACCCAATCT-3’

MKV.B5: 5’ -GACATTGTGATGACCCAGTCT-3’

MKV.B6: 5’ -GATATTGTGCTAACTCAGTCT-3’

MKV.B7: 5’ -GATATCCAGATGACACAGACT-3’

MKV.B8: 5’ -GACATCCAGCTGACTCAGTCT-3’

MKV.B9: 5’ -CAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3’

MKV.B10: 5’ -GACATTCTGATGACCCAGTCT-3’

MKC.F: 5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’

其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5% 琼脂糖凝胶上分离，轻链（κ 轻链）的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。

实施例6. 组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡（熔点在66～68 ℃）倒入模具，冷却至室温后将模具放入- 20 ℃冰箱6 min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1.5mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4 mm，用另一直径1.5mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入70 ℃烤箱内10min , 使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30 min，再放入-20 ℃ 冰箱冷冻6 min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4 ℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂在凉水中, 让其自然展开，再将分开的切片转移到45 ℃的温水中展片30秒，用经2 % APES 丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入70 ℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入- 4℃ 冰箱保存。

二． IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3%H₂O₂孵育10分钟 ，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加封闭液（动物非免疫血清）室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗（首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例）室温（25℃）孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。 苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85%（3分钟）-95%（3分钟）-100%（3分钟）-100%（3分钟）的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

三．数据统计

根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率（着色样本数/样本总数），见表1。

表1 Ki67同Ki67（MIB-1）在肿瘤组织中的表达差异比较

SEQUENCE LISTING

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 由杂交瘤细胞系分泌的抗Ki67单克隆抗体及其应用

<130> 30

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9771

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtggccca cgagacgcct ggttactatc aaaaggagcg gggtcgacgg tccccacttt 60

cccctgagcc tcagcacctg cttgtttgga aggggtattg aatgtgacat ccgtatccag 120

cttcctgttg tgtcaaaaca acattgcaaa attgaaatcc atgagcagga ggcaatatta 180

cataatttca gttccacaaa tccaacacaa gtaaatgggt ctgttattga tgagcctgta 240

cggctaaaac atggagatgt aataactatt attgatcgtt ccttcaggta tgaaaatgaa 300

agtcttcaga atggaaggaa gtcaactgaa tttccaagaa aaatacgtga acaggagcca 360

gcacgtcgtg tctcaagatc tagcttctct tctgaccctg atgagaaagc tcaagattcc 420

aaggcctatt caaaaatcac tgaaggaaaa gtttcaggaa atcctcaggt acatatcaag 480

aatgtcaaag aagacagtac cgcagatgac tcaaaagaca gtgttgctca gggaacaact 540

aatgttcatt cctcagaaca tgctggacgt aatggcagaa atgcagctga tcccatttct 600

ggggatttta aagaaatttc cagcgttaaa ttagtgagcc gttatggaga attgaagtct 660

gttcccacta cacaatgtct tgacaatagc aaaaaaaatg aatctccctt ttggaagctt 720

tatgagtcag tgaagaaaga gttggatgta aaatcacaaa aagaaaatgt cctacagtat 780

tgtagaaaat ctggattaca aactgattac gcaacagaga aagaaagtgc tgatggttta 840

cagggggaga cccaactgtt ggtctcgcgt aagtcaagac caaaatctgg tgggagcggc 900

cacgctgtgg cagagcctgc ttcacctgaa caagagcttg accagaacaa ggggaaggga 960

agagacgtgg agtctgttca gactcccagc aaggctgtgg gcgccagctt tcctctctat 1020

gagccggcta aaatgaagac ccctgtacaa tattcacagc aacaaaattc tccacaaaaa 1080

cataagaaca aagacctgta tactactggt agaagagaat ctgtgaatct gggtaaaagt 1140

gaaggcttca aggctggtga taaaactctt actcccagga agctttcaac tagaaatcga 1200

acaccagcta aagttgaaga tgcagctgac tctgccacta agccagaaaa tctctcttcc 1260

aaaaccagag gaagtattcc tacagatgtg gaagttctgc ctacggaaac tgaaattcac 1320

aatgagccat ttttaactct gtggctcact caagttgaga ggaagatcca aaaggattcc 1380

ctcagcaagc ctgagaaatt gggcactaca gctggacaga tgtgctctgg gttacctggt 1440

cttagttcag ttgatatcaa caactttggt gattccatta atgagagtga gggaatacct 1500

ttgaaaagaa ggcgtgtgtc ctttggtggg cacctaagac ctgaactatt tgatgaaaac 1560

ttgcctccta atacgcctct caaaagggga gaagccccaa ccaaaagaaa gtctctggta 1620

atgcacactc cacctgtcct gaagaaaatc atcaaggaac agcctcaacc atcaggaaaa 1680

caagagtcag gttcagaaat ccatgtggaa gtgaaggcac aaagcttggt tataagccct 1740

ccagctccta gtcctaggaa aactccagtt gccagtgatc aacgccgtag gtcctgcaaa 1800

acagcccctg cttccagcag caaatctcag acagaggttc ctaagagagg agggagaaag 1860

agtggcaacc tgccttcaaa gagagtgtct atcagccgaa gtcaacatga tattttacag 1920

atgatatgtt ccaaaagaag aagtggtgct tcggaagcaa atctgattgt tgcaaaatca 1980

tgggcagatg tagtaaaact tggtgcaaaa caaacacaaa ctaaagtcat aaaacatggt 2040

cctcaaaggt caatgaacaa aaggcaaaga agacctgcta ctccaaagaa gcctgtgggc 2100

gaagttcaca gtcaatttag tacaggccac gcaaactctc cttgtaccat aataataggg 2160

aaagctcata ctgaaaaagt acatgtgcct gctcgaccct acagagtgct caacaacttc 2220

atttccaacc aaaaaatgga ctttaaggaa gatctttcag gaatagctga aatgttcaag 2280

accccagtga aggagcaacc gcagttgaca agcacatgtc acatcgctat ttcaaattca 2340

gagaatttgc ttggaaaaca gtttcaagga actgattcag gagaagaacc tctgctcccc 2400

acctcagaga gttttggagg aaatgtgttc ttcagtgcac agaatgcagc aaaacagcca 2460

tctgataaat gctctgcaag ccctccctta agacggcagt gtattagaga aaatggaaac 2520

gtagcaaaaa cgcccaggaa cacctacaaa atgacttctc tggagacaaa aacttcagat 2580

actgagacag agccttcaaa aacagtatcc actgcaaaca ggtcaggaag gtctacagag 2640

ttcaggaata tacagaagct acctgtggaa agtaagagtg aagaaacaaa tacagaaatt 2700

gttgagtgca tcctaaaaag aggtcagaag gcaacactac tacaacaaag gagagaagga 2760

gagatgaagg aaatagaaag accttttgag acatataagg aaaatattga attaaaagaa 2820

aacgatgaaa agatgaaagc aatgaagaga tcaagaactt gggggcagaa atgtgcacca 2880

atgtctgacc tgacagacct caagagcttg cctgatacag aactcatgaa agacacggca 2940

cgtggccaga atctcctcca aacccaagat catgccaagg caccaaagag tgagaaaggc 3000

aaaatcacta aaatgccctg ccagtcatta caaccagaac caataaacac cccaacacac 3060

acaaaacaac agttgaaggc atccctgggg aaagtaggtg tgaaagaaga gctcctagca 3120

gtcggcaagt tcacacggac gtcaggggag accacgcaca cgcacagaga gccagcagga 3180

gatggcaaga gcatcagaac gtttaaggag tctccaaagc agatcctgga cccagcagcc 3240

cgtgtaactg gaatgaagaa gtggccaaga acgcctaagg aagaggccca gtcactagaa 3300

gacctggctg gcttcaaaga gctcttccag acaccaggtc cctctgagga atcaatgact 3360

gatgagaaaa ctaccaaaat agcctgcaaa tctccaccac cagaatcagt ggacactcca 3420

acaagcacaa agcaatggcc taagagaagt ctcaggaaag cagatgtaga ggaagaattc 3480

ttagcactca ggaaactaac accatcagca gggaaagcca tgcttacgcc caaaccagca 3540

ggaggtgatg agaaagacat taaagcattt atgggaactc cagtgcagaa actggacctg 3600

gcaggaactt tacctggcag caaaagacag ctacagactc ctaaggaaaa ggcccaggct 3660

ctagaagacc tggctggctt taaagagctc ttccagactc ctggtcacac cgaggaatta 3720

gtggctgctg gtaaaaccac taaaataccc tgcgactctc cacagtcaga cccagtggac 3780

accccaacaa gcacaaagca acgacccaag agaagtatca ggaaagcaga tgtagaggga 3840

gaactcttag cgtgcaggaa tctaatgcca tcagcaggca aagccatgca cacgcctaaa 3900

ccatcagtag gtgaagagaa agacatcatc atatttgtgg gaactccagt gcagaaactg 3960

gacctgacag agaacttaac cggcagcaag agacggccac aaactcctaa ggaagaggcc 4020

caggctctgg aagacctgac tggctttaaa gagctcttcc agacccctgg tcatactgaa 4080

gaagcagtgg ctgctggcaa aactactaaa atgccctgcg aatcttctcc accagaatca 4140

gcagacaccc caacaagcac aagaaggcag cccaagacac ctttggagaa aagggacgta 4200

cagaaggagc tctcagccct gaagaagctc acacagacat caggggaaac cacacacaca 4260

gataaagtac caggaggtga ggataaaagc atcaacgcgt ttagggaaac tgcaaaacag 4320

aaactggacc cagcagcaag tgtaactggt agcaagaggc acccaaaaac taaggaaaag 4380

gcccaacccc tagaagacct ggctggcttg aaagagctct tccagacacc agtatgcact 4440

gacaagccca cgactcacga gaaaactacc aaaatagcct gcagatcaca accagaccca 4500

gtggacacac caacaagctc caagccacag tccaagagaa gtctcaggaa agtggacgta 4560

gaagaagaat tcttcgcact caggaaacga acaccatcag caggcaaagc catgcacaca 4620

cccaaaccag cagtaagtgg tgagaaaaac atctacgcat ttatgggaac tccagtgcag 4680

aaactggacc tgacagagaa cttaactggc agcaagagac ggctacaaac tcctaaggaa 4740

aaggcccagg ctctagaaga cctggctggc tttaaagagc tcttccagac acgaggtcac 4800

actgaggaat caatgactaa cgataaaact gccaaagtag cctgcaaatc ttcacaacca 4860

gacccagaca aaaacccagc aagctccaag cgacggctca agacatccct ggggaaagtg 4920

ggcgtgaaag aagagctcct agcagttggc aagctcacac agacatcagg agagactaca 4980

cacacacaca cagagccaac aggagatggt aagagcatga aagcatttat ggagtctcca 5040

aagcagatct tagactcagc agcaagtcta actggcagca agaggcagct gagaactcct 5100

aagggaaagt ctgaagtccc tgaagacctg gccggcttca tcgagctctt ccagacacca 5160

agtcacacta aggaatcaat gactaacgaa aaaactacca aagtatccta cagagcttca 5220

cagccagacc tagtggacac cccaacaagc tccaagccac agcccaagag aagtctcagg 5280

aaagcagaca ctgaagaaga atttttagca tttaggaaac aaacgccatc agcaggcaaa 5340

gccatgcaca cacccaaacc agcagtaggt gaagagaaag acatcaacac gtttttggga 5400

actccagtgc agaaactgga ccagccagga aatttacctg gcagcaatag acggctacaa 5460

actcgtaagg aaaaggccca ggctctagaa gaactgactg gcttcagaga gcttttccag 5520

acaccatgca ctgataaccc cacgactgat gagaaaacta ccaaaaaaat actctgcaaa 5580

tctccgcaat cagacccagc ggacacccca acaaacacaa agcaacggcc caagagaagc 5640

ctcaagaaag cagacgtaga ggaagaattt ttagcattca ggaaactaac accatcagca 5700

ggcaaagcca tgcacacgcc taaagcagca gtaggtgaag agaaagacat caacacattt 5760

gtggggactc cagtggagaa actggacctg ctaggaaatt tacctggcag caagagacgg 5820

ccacaaactc ctaaagaaaa ggccaaggct ctagaagatc tggctggctt caaagagctc 5880

ttccagacac caggtcacac tgaggaatca atgaccgatg acaaaatcac agaagtatcc 5940

tgcaaatctc cacaaccaga cccagtcaaa accccaacaa gctccaagca acgactcaag 6000

atatccttgg ggaaagtagg tgtgaaagaa gaggtcctac cagtcggcaa gctcacacag 6060

acgtcaggga agaccacaca gacacacaga gagacagcag gagatggaaa gagcatcaaa 6120

gcgtttaagg aatctgcaaa gcagatgctg gacccagcaa actatggaac tgggatggag 6180

aggtggccaa gaacacctaa ggaagaggcc caatcactag aagacctggc cggcttcaaa 6240

gagctcttcc agacaccaga ccacactgag gaatcaacaa ctgatgacaa aactaccaaa 6300

atagcctgca aatctccacc accagaatca atggacactc caacaagcac aaggaggcgg 6360

cccaaaacac ctttggggaa aagggatata gtggaagagc tctcagccct gaagcagctc 6420

acacagacca cacacacaga caaagtacca ggagatgagg ataaaggcat caacgtgttc 6480

agggaaactg caaaacagaa actggaccca gcagcaagtg taactggtag caagaggcag 6540

ccaagaactc ctaagggaaa agcccaaccc ctagaagact tggctggctt gaaagagctc 6600

ttccagacac caatatgcac tgacaagccc acgactcatg agaaaactac caaaatagcc 6660

tgcagatctc cacaaccaga cccagtgggt accccaacaa tcttcaagcc acagtccaag 6720

agaagtctca ggaaagcaga cgtagaggaa gaatccttag cactcaggaa acgaacacca 6780

tcagtaggga aagctatgga cacacccaaa ccagcaggag gtgatgagaa agacatgaaa 6840

gcatttatgg gaactccagt gcagaaattg gacctgccag gaaatttacc tggcagcaaa 6900

agatggccac aaactcctaa ggaaaaggcc caggctctag aagacctggc tggcttcaaa 6960

gagctcttcc agacaccagg cactgacaag cccacgactg atgagaaaac taccaaaata 7020

gcctgcaaat ctccacaacc agacccagtg gacaccccag caagcacaaa gcaacggccc 7080

aagagaaacc tcaggaaagc agacgtagag gaagaatttt tagcactcag gaaacgaaca 7140

ccatcagcag gcaaagccat ggacacacca aaaccagcag taagtgatga gaaaaatatc 7200

aacacatttg tggaaactcc agtgcagaaa ctggacctgc taggaaattt acctggcagc 7260

aagagacagc cacagactcc taaggaaaag gctgaggctc tagaggacct ggttggcttc 7320

aaagaactct tccagacacc aggtcacact gaggaatcaa tgactgatga caaaatcaca 7380

gaagtatcct gtaaatctcc acagccagag tcattcaaaa cctcaagaag ctccaagcaa 7440

aggctcaaga tacccctggt gaaagtggac atgaaagaag agcccctagc agtcagcaag 7500

ctcacacgga catcagggga gactacgcaa acacacacag agccaacagg agatagtaag 7560

agcatcaaag cgtttaagga gtctccaaag cagatcctgg acccagcagc aagtgtaact 7620

ggtagcagga ggcagctgag aactcgtaag gaaaaggccc gtgctctaga agacctggtt 7680

gacttcaaag agctcttctc agcaccaggt cacactgaag agtcaatgac tattgacaaa 7740

aacacaaaaa ttccctgcaa atctccccca ccagaactaa cagacactgc cacgagcaca 7800

aagagatgcc ccaagacacg tcccaggaaa gaagtaaaag aggagctctc agcagttgag 7860

aggctcacgc aaacatcagg gcaaagcaca cacacacaca aagaaccagc aagcggtgat 7920

gagggcatca aagtattgaa gcaacgtgca aagaagaaac caaacccagt agaagaggaa 7980

cccagcagga gaaggccaag agcacctaag gaaaaggccc aacccctgga agacctggcc 8040

ggcttcacag agctctctga aacatcaggt cacactcagg aatcactgac tgctggcaaa 8100

gccactaaaa taccctgcga atctccccca ctagaagtgg tagacaccac agcaagcaca 8160

aagaggcatc tcaggacacg tgtgcagaag gtacaagtaa aagaagagcc ttcagcagtc 8220

aagttcacac aaacatcagg ggaaaccacg gatgcagaca aagaaccagc aggtgaagat 8280

aaaggcatca aagcattgaa ggaatctgca aaacagacac cggctccagc agcaagtgta 8340

actggcagca ggagacggcc aagagcaccc agggaaagtg cccaagccat agaagaccta 8400

gctggcttca aagacccagc agcaggtcac actgaagaat caatgactga tgacaaaacc 8460

actaaaatac cctgcaaatc atcaccagaa ctagaagaca ccgcaacaag ctcaaagaga 8520

cggcccagga cacgtgccca gaaagtagaa gtgaaggagg agctgttagc agttggcaag 8580

ctcacacaaa cctcagggga gaccacgcac accgacaaag agccggtagg tgagggcaaa 8640

ggcacgaaag catttaagca acctgcaaag cggaagctgg acgcagaaga tgtaattggc 8700

agcaggagac agccaagagc acctaaggaa aaggcccaac ccctggaaga tctggccagc 8760

ttccaagagc tctctcaaac accaggccac actgaggaac tggcaaatgg tgctgctgat 8820

agctttacaa gcgctccaaa gcaaacacct gacagtggaa aacctctaaa aatatccaga 8880

agagttcttc gggcccctaa agtagaaccc gtgggagacg tggtaagcac cagagaccct 8940

gtaaaatcac aaagcaaaag caacacttcc ctgcccccac tgcccttcaa gaggggaggt 9000

ggcaaagatg gaagcgtcac gggaaccaag aggctgcgct gcatgccagc accagaggaa 9060

attgtggagg agctgccagc cagcaagaag cagagggttg ctcccagggc aagaggcaaa 9120

tcatccgaac ccgtggtcat catgaagaga agtttgagga cttctgcaaa aagaattgaa 9180

cctgcggaag agctgaacag caacgacatg aaaaccaaca aagaggaaca caaattacaa 9240

gactcggtcc ctgaaaataa gggaatatcc ctgcgctcca gacgccaaaa taagactgag 9300

gcagaacagc aaataactga ggtctttgta ttagcagaaa gaatagaaat aaacagaaat 9360

gaaaagaagc ccatgaagac ctccccagag atggacattc agaatccaga tgatggagcc 9420

cggaaaccca tacctagaga caaagtcact gagaacaaaa ggtgcttgag gtctgctaga 9480

cagaatgaga gctcccagcc taaggtggca gaggagagcg gagggcagaa gagtgcgaag 9540

gttctcatgc agaatcagaa agggaaagga gaagcaggaa attcagactc catgtgcctg 9600

agatcaagaa agacaaaaag ccagcctgca gcaagcactt tggagagcaa atctgtgcag 9660

agagtaacgc ggagtgtcaa gaggtgtgca gaaaatccaa agaaggctga ggacaatgtg 9720

tgtgtcaaga aaataagaac cagaagtcat agggacagtg aagatatttg a 9771

<210> 2

<211> 3256

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 2

Met Trp Pro Thr Arg Arg Leu Val Thr Ile Lys Arg Ser Gly Val Asp

1 5 10 15

Gly Pro His Phe Pro Leu Ser Leu Ser Thr Cys Leu Phe Gly Arg Gly

20 25 30

Ile Glu Cys Asp Ile Arg Ile Gln Leu Pro Val Val Ser Lys Gln His

35 40 45

Cys Lys Ile Glu Ile His Glu Gln Glu Ala Ile Leu His Asn Phe Ser

50 55 60

Ser Thr Asn Pro Thr Gln Val Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Pro Val

65 70 75 80

Arg Leu Lys His Gly Asp Val Ile Thr Ile Ile Asp Arg Ser Phe Arg

85 90 95

Tyr Glu Asn Glu Ser Leu Gln Asn Gly Arg Lys Ser Thr Glu Phe Pro

100 105 110

Arg Lys Ile Arg Glu Gln Glu Pro Ala Arg Arg Val Ser Arg Ser Ser

115 120 125

Phe Ser Ser Asp Pro Asp Glu Lys Ala Gln Asp Ser Lys Ala Tyr Ser

130 135 140

Lys Ile Thr Glu Gly Lys Val Ser Gly Asn Pro Gln Val His Ile Lys

145 150 155 160

Asn Val Lys Glu Asp Ser Thr Ala Asp Asp Ser Lys Asp Ser Val Ala

165 170 175

Gln Gly Thr Thr Asn Val His Ser Ser Glu His Ala Gly Arg Asn Gly

180 185 190

Arg Asn Ala Ala Asp Pro Ile Ser Gly Asp Phe Lys Glu Ile Ser Ser

195 200 205

Val Lys Leu Val Ser Arg Tyr Gly Glu Leu Lys Ser Val Pro Thr Thr

210 215 220

Gln Cys Leu Asp Asn Ser Lys Lys Asn Glu Ser Pro Phe Trp Lys Leu

225 230 235 240

Tyr Glu Ser Val Lys Lys Glu Leu Asp Val Lys Ser Gln Lys Glu Asn

245 250 255

Val Leu Gln Tyr Cys Arg Lys Ser Gly Leu Gln Thr Asp Tyr Ala Thr

260 265 270

Glu Lys Glu Ser Ala Asp Gly Leu Gln Gly Glu Thr Gln Leu Leu Val

275 280 285

Ser Arg Lys Ser Arg Pro Lys Ser Gly Gly Ser Gly His Ala Val Ala

290 295 300

Glu Pro Ala Ser Pro Glu Gln Glu Leu Asp Gln Asn Lys Gly Lys Gly

305 310 315 320

Arg Asp Val Glu Ser Val Gln Thr Pro Ser Lys Ala Val Gly Ala Ser

325 330 335

Phe Pro Leu Tyr Glu Pro Ala Lys Met Lys Thr Pro Val Gln Tyr Ser

340 345 350

Gln Gln Gln Asn Ser Pro Gln Lys His Lys Asn Lys Asp Leu Tyr Thr

355 360 365

Thr Gly Arg Arg Glu Ser Val Asn Leu Gly Lys Ser Glu Gly Phe Lys

370 375 380

Ala Gly Asp Lys Thr Leu Thr Pro Arg Lys Leu Ser Thr Arg Asn Arg

385 390 395 400

Thr Pro Ala Lys Val Glu Asp Ala Ala Asp Ser Ala Thr Lys Pro Glu

405 410 415

Asn Leu Ser Ser Lys Thr Arg Gly Ser Ile Pro Thr Asp Val Glu Val

420 425 430

Leu Pro Thr Glu Thr Glu Ile His Asn Glu Pro Phe Leu Thr Leu Trp

435 440 445

Leu Thr Gln Val Glu Arg Lys Ile Gln Lys Asp Ser Leu Ser Lys Pro

450 455 460

Glu Lys Leu Gly Thr Thr Ala Gly Gln Met Cys Ser Gly Leu Pro Gly

465 470 475 480

Leu Ser Ser Val Asp Ile Asn Asn Phe Gly Asp Ser Ile Asn Glu Ser

485 490 495

Glu Gly Ile Pro Leu Lys Arg Arg Arg Val Ser Phe Gly Gly His Leu

500 505 510

Arg Pro Glu Leu Phe Asp Glu Asn Leu Pro Pro Asn Thr Pro Leu Lys

515 520 525

Arg Gly Glu Ala Pro Thr Lys Arg Lys Ser Leu Val Met His Thr Pro

530 535 540

Pro Val Leu Lys Lys Ile Ile Lys Glu Gln Pro Gln Pro Ser Gly Lys

545 550 555 560

Gln Glu Ser Gly Ser Glu Ile His Val Glu Val Lys Ala Gln Ser Leu

565 570 575

Val Ile Ser Pro Pro Ala Pro Ser Pro Arg Lys Thr Pro Val Ala Ser

580 585 590

Asp Gln Arg Arg Arg Ser Cys Lys Thr Ala Pro Ala Ser Ser Ser Lys

595 600 605

Ser Gln Thr Glu Val Pro Lys Arg Gly Gly Arg Lys Ser Gly Asn Leu

610 615 620

Pro Ser Lys Arg Val Ser Ile Ser Arg Ser Gln His Asp Ile Leu Gln

625 630 635 640

Met Ile Cys Ser Lys Arg Arg Ser Gly Ala Ser Glu Ala Asn Leu Ile

645 650 655

Val Ala Lys Ser Trp Ala Asp Val Val Lys Leu Gly Ala Lys Gln Thr

660 665 670

Gln Thr Lys Val Ile Lys His Gly Pro Gln Arg Ser Met Asn Lys Arg

675 680 685

Gln Arg Arg Pro Ala Thr Pro Lys Lys Pro Val Gly Glu Val His Ser

690 695 700

Gln Phe Ser Thr Gly His Ala Asn Ser Pro Cys Thr Ile Ile Ile Gly

705 710 715 720

Lys Ala His Thr Glu Lys Val His Val Pro Ala Arg Pro Tyr Arg Val

725 730 735

Leu Asn Asn Phe Ile Ser Asn Gln Lys Met Asp Phe Lys Glu Asp Leu

740 745 750

Ser Gly Ile Ala Glu Met Phe Lys Thr Pro Val Lys Glu Gln Pro Gln

755 760 765

Leu Thr Ser Thr Cys His Ile Ala Ile Ser Asn Ser Glu Asn Leu Leu

770 775 780

Gly Lys Gln Phe Gln Gly Thr Asp Ser Gly Glu Glu Pro Leu Leu Pro

785 790 795 800

Thr Ser Glu Ser Phe Gly Gly Asn Val Phe Phe Ser Ala Gln Asn Ala

805 810 815

Ala Lys Gln Pro Ser Asp Lys Cys Ser Ala Ser Pro Pro Leu Arg Arg

820 825 830

Gln Cys Ile Arg Glu Asn Gly Asn Val Ala Lys Thr Pro Arg Asn Thr

835 840 845

Tyr Lys Met Thr Ser Leu Glu Thr Lys Thr Ser Asp Thr Glu Thr Glu

850 855 860

Pro Ser Lys Thr Val Ser Thr Ala Asn Arg Ser Gly Arg Ser Thr Glu

865 870 875 880

Phe Arg Asn Ile Gln Lys Leu Pro Val Glu Ser Lys Ser Glu Glu Thr

885 890 895

Asn Thr Glu Ile Val Glu Cys Ile Leu Lys Arg Gly Gln Lys Ala Thr

900 905 910

Leu Leu Gln Gln Arg Arg Glu Gly Glu Met Lys Glu Ile Glu Arg Pro

915 920 925

Phe Glu Thr Tyr Lys Glu Asn Ile Glu Leu Lys Glu Asn Asp Glu Lys

930 935 940

Met Lys Ala Met Lys Arg Ser Arg Thr Trp Gly Gln Lys Cys Ala Pro

945 950 955 960

Met Ser Asp Leu Thr Asp Leu Lys Ser Leu Pro Asp Thr Glu Leu Met

965 970 975

Lys Asp Thr Ala Arg Gly Gln Asn Leu Leu Gln Thr Gln Asp His Ala

980 985 990

Lys Ala Pro Lys Ser Glu Lys Gly Lys Ile Thr Lys Met Pro Cys Gln

995 1000 1005

Ser Leu Gln Pro Glu Pro Ile Asn Thr Pro Thr His Thr Lys Gln

1010 1015 1020

Gln Leu Lys Ala Ser Leu Gly Lys Val Gly Val Lys Glu Glu Leu

1025 1030 1035

Leu Ala Val Gly Lys Phe Thr Arg Thr Ser Gly Glu Thr Thr His

1040 1045 1050

Thr His Arg Glu Pro Ala Gly Asp Gly Lys Ser Ile Arg Thr Phe

1055 1060 1065

Lys Glu Ser Pro Lys Gln Ile Leu Asp Pro Ala Ala Arg Val Thr

1070 1075 1080

Gly Met Lys Lys Trp Pro Arg Thr Pro Lys Glu Glu Ala Gln Ser

1085 1090 1095

Leu Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Gly

1100 1105 1110

Pro Ser Glu Glu Ser Met Thr Asp Glu Lys Thr Thr Lys Ile Ala

1115 1120 1125

Cys Lys Ser Pro Pro Pro Glu Ser Val Asp Thr Pro Thr Ser Thr

1130 1135 1140

Lys Gln Trp Pro Lys Arg Ser Leu Arg Lys Ala Asp Val Glu Glu

1145 1150 1155

Glu Phe Leu Ala Leu Arg Lys Leu Thr Pro Ser Ala Gly Lys Ala

1160 1165 1170

Met Leu Thr Pro Lys Pro Ala Gly Gly Asp Glu Lys Asp Ile Lys

1175 1180 1185

Ala Phe Met Gly Thr Pro Val Gln Lys Leu Asp Leu Ala Gly Thr

1190 1195 1200

Leu Pro Gly Ser Lys Arg Gln Leu Gln Thr Pro Lys Glu Lys Ala

1205 1210 1215

Gln Ala Leu Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr

1220 1225 1230

Pro Gly His Thr Glu Glu Leu Val Ala Ala Gly Lys Thr Thr Lys

1235 1240 1245

Ile Pro Cys Asp Ser Pro Gln Ser Asp Pro Val Asp Thr Pro Thr

1250 1255 1260

Ser Thr Lys Gln Arg Pro Lys Arg Ser Ile Arg Lys Ala Asp Val

1265 1270 1275

Glu Gly Glu Leu Leu Ala Cys Arg Asn Leu Met Pro Ser Ala Gly

1280 1285 1290

Lys Ala Met His Thr Pro Lys Pro Ser Val Gly Glu Glu Lys Asp

1295 1300 1305

Ile Ile Ile Phe Val Gly Thr Pro Val Gln Lys Leu Asp Leu Thr

1310 1315 1320

Glu Asn Leu Thr Gly Ser Lys Arg Arg Pro Gln Thr Pro Lys Glu

1325 1330 1335

Glu Ala Gln Ala Leu Glu Asp Leu Thr Gly Phe Lys Glu Leu Phe

1340 1345 1350

Gln Thr Pro Gly His Thr Glu Glu Ala Val Ala Ala Gly Lys Thr

1355 1360 1365

Thr Lys Met Pro Cys Glu Ser Ser Pro Pro Glu Ser Ala Asp Thr

1370 1375 1380

Pro Thr Ser Thr Arg Arg Gln Pro Lys Thr Pro Leu Glu Lys Arg

1385 1390 1395

Asp Val Gln Lys Glu Leu Ser Ala Leu Lys Lys Leu Thr Gln Thr

1400 1405 1410

Ser Gly Glu Thr Thr His Thr Asp Lys Val Pro Gly Gly Glu Asp

1415 1420 1425

Lys Ser Ile Asn Ala Phe Arg Glu Thr Ala Lys Gln Lys Leu Asp

1430 1435 1440

Pro Ala Ala Ser Val Thr Gly Ser Lys Arg His Pro Lys Thr Lys

1445 1450 1455

Glu Lys Ala Gln Pro Leu Glu Asp Leu Ala Gly Leu Lys Glu Leu

1460 1465 1470

Phe Gln Thr Pro Val Cys Thr Asp Lys Pro Thr Thr His Glu Lys

1475 1480 1485

Thr Thr Lys Ile Ala Cys Arg Ser Gln Pro Asp Pro Val Asp Thr

1490 1495 1500

Pro Thr Ser Ser Lys Pro Gln Ser Lys Arg Ser Leu Arg Lys Val

1505 1510 1515

Asp Val Glu Glu Glu Phe Phe Ala Leu Arg Lys Arg Thr Pro Ser

1520 1525 1530

Ala Gly Lys Ala Met His Thr Pro Lys Pro Ala Val Ser Gly Glu

1535 1540 1545

Lys Asn Ile Tyr Ala Phe Met Gly Thr Pro Val Gln Lys Leu Asp

1550 1555 1560

Leu Thr Glu Asn Leu Thr Gly Ser Lys Arg Arg Leu Gln Thr Pro

1565 1570 1575

Lys Glu Lys Ala Gln Ala Leu Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Glu

1580 1585 1590

Leu Phe Gln Thr Arg Gly His Thr Glu Glu Ser Met Thr Asn Asp

1595 1600 1605

Lys Thr Ala Lys Val Ala Cys Lys Ser Ser Gln Pro Asp Pro Asp

1610 1615 1620

Lys Asn Pro Ala Ser Ser Lys Arg Arg Leu Lys Thr Ser Leu Gly

1625 1630 1635

Lys Val Gly Val Lys Glu Glu Leu Leu Ala Val Gly Lys Leu Thr

1640 1645 1650

Gln Thr Ser Gly Glu Thr Thr His Thr His Thr Glu Pro Thr Gly

1655 1660 1665

Asp Gly Lys Ser Met Lys Ala Phe Met Glu Ser Pro Lys Gln Ile

1670 1675 1680

Leu Asp Ser Ala Ala Ser Leu Thr Gly Ser Lys Arg Gln Leu Arg

1685 1690 1695

Thr Pro Lys Gly Lys Ser Glu Val Pro Glu Asp Leu Ala Gly Phe

1700 1705 1710

Ile Glu Leu Phe Gln Thr Pro Ser His Thr Lys Glu Ser Met Thr

1715 1720 1725

Asn Glu Lys Thr Thr Lys Val Ser Tyr Arg Ala Ser Gln Pro Asp

1730 1735 1740

Leu Val Asp Thr Pro Thr Ser Ser Lys Pro Gln Pro Lys Arg Ser

1745 1750 1755

Leu Arg Lys Ala Asp Thr Glu Glu Glu Phe Leu Ala Phe Arg Lys

1760 1765 1770

Gln Thr Pro Ser Ala Gly Lys Ala Met His Thr Pro Lys Pro Ala

1775 1780 1785

Val Gly Glu Glu Lys Asp Ile Asn Thr Phe Leu Gly Thr Pro Val

1790 1795 1800

Gln Lys Leu Asp Gln Pro Gly Asn Leu Pro Gly Ser Asn Arg Arg

1805 1810 1815

Leu Gln Thr Arg Lys Glu Lys Ala Gln Ala Leu Glu Glu Leu Thr

1820 1825 1830

Gly Phe Arg Glu Leu Phe Gln Thr Pro Cys Thr Asp Asn Pro Thr

1835 1840 1845

Thr Asp Glu Lys Thr Thr Lys Lys Ile Leu Cys Lys Ser Pro Gln

1850 1855 1860

Ser Asp Pro Ala Asp Thr Pro Thr Asn Thr Lys Gln Arg Pro Lys

1865 1870 1875

Arg Ser Leu Lys Lys Ala Asp Val Glu Glu Glu Phe Leu Ala Phe

1880 1885 1890

Arg Lys Leu Thr Pro Ser Ala Gly Lys Ala Met His Thr Pro Lys

1895 1900 1905

Ala Ala Val Gly Glu Glu Lys Asp Ile Asn Thr Phe Val Gly Thr

1910 1915 1920

Pro Val Glu Lys Leu Asp Leu Leu Gly Asn Leu Pro Gly Ser Lys

1925 1930 1935

Arg Arg Pro Gln Thr Pro Lys Glu Lys Ala Lys Ala Leu Glu Asp

1940 1945 1950

Leu Ala Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Gly His Thr Glu

1955 1960 1965

Glu Ser Met Thr Asp Asp Lys Ile Thr Glu Val Ser Cys Lys Ser

1970 1975 1980

Pro Gln Pro Asp Pro Val Lys Thr Pro Thr Ser Ser Lys Gln Arg

1985 1990 1995

Leu Lys Ile Ser Leu Gly Lys Val Gly Val Lys Glu Glu Val Leu

2000 2005 2010

Pro Val Gly Lys Leu Thr Gln Thr Ser Gly Lys Thr Thr Gln Thr

2015 2020 2025

His Arg Glu Thr Ala Gly Asp Gly Lys Ser Ile Lys Ala Phe Lys

2030 2035 2040

Glu Ser Ala Lys Gln Met Leu Asp Pro Ala Asn Tyr Gly Thr Gly

2045 2050 2055

Met Glu Arg Trp Pro Arg Thr Pro Lys Glu Glu Ala Gln Ser Leu

2060 2065 2070

Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Asp His

2075 2080 2085

Thr Glu Glu Ser Thr Thr Asp Asp Lys Thr Thr Lys Ile Ala Cys

2090 2095 2100

Lys Ser Pro Pro Pro Glu Ser Met Asp Thr Pro Thr Ser Thr Arg

2105 2110 2115

Arg Arg Pro Lys Thr Pro Leu Gly Lys Arg Asp Ile Val Glu Glu

2120 2125 2130

Leu Ser Ala Leu Lys Gln Leu Thr Gln Thr Thr His Thr Asp Lys

2135 2140 2145

Val Pro Gly Asp Glu Asp Lys Gly Ile Asn Val Phe Arg Glu Thr

2150 2155 2160

Ala Lys Gln Lys Leu Asp Pro Ala Ala Ser Val Thr Gly Ser Lys

2165 2170 2175

Arg Gln Pro Arg Thr Pro Lys Gly Lys Ala Gln Pro Leu Glu Asp

2180 2185 2190

Leu Ala Gly Leu Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Ile Cys Thr Asp

2195 2200 2205

Lys Pro Thr Thr His Glu Lys Thr Thr Lys Ile Ala Cys Arg Ser

2210 2215 2220

Pro Gln Pro Asp Pro Val Gly Thr Pro Thr Ile Phe Lys Pro Gln

2225 2230 2235

Ser Lys Arg Ser Leu Arg Lys Ala Asp Val Glu Glu Glu Ser Leu

2240 2245 2250

Ala Leu Arg Lys Arg Thr Pro Ser Val Gly Lys Ala Met Asp Thr

2255 2260 2265

Pro Lys Pro Ala Gly Gly Asp Glu Lys Asp Met Lys Ala Phe Met

2270 2275 2280

Gly Thr Pro Val Gln Lys Leu Asp Leu Pro Gly Asn Leu Pro Gly

2285 2290 2295

Ser Lys Arg Trp Pro Gln Thr Pro Lys Glu Lys Ala Gln Ala Leu

2300 2305 2310

Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Gly Thr

2315 2320 2325

Asp Lys Pro Thr Thr Asp Glu Lys Thr Thr Lys Ile Ala Cys Lys

2330 2335 2340

Ser Pro Gln Pro Asp Pro Val Asp Thr Pro Ala Ser Thr Lys Gln

2345 2350 2355

Arg Pro Lys Arg Asn Leu Arg Lys Ala Asp Val Glu Glu Glu Phe

2360 2365 2370

Leu Ala Leu Arg Lys Arg Thr Pro Ser Ala Gly Lys Ala Met Asp

2375 2380 2385

Thr Pro Lys Pro Ala Val Ser Asp Glu Lys Asn Ile Asn Thr Phe

2390 2395 2400

Val Glu Thr Pro Val Gln Lys Leu Asp Leu Leu Gly Asn Leu Pro

2405 2410 2415

Gly Ser Lys Arg Gln Pro Gln Thr Pro Lys Glu Lys Ala Glu Ala

2420 2425 2430

Leu Glu Asp Leu Val Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Gly

2435 2440 2445

His Thr Glu Glu Ser Met Thr Asp Asp Lys Ile Thr Glu Val Ser

2450 2455 2460

Cys Lys Ser Pro Gln Pro Glu Ser Phe Lys Thr Ser Arg Ser Ser

2465 2470 2475

Lys Gln Arg Leu Lys Ile Pro Leu Val Lys Val Asp Met Lys Glu

2480 2485 2490

Glu Pro Leu Ala Val Ser Lys Leu Thr Arg Thr Ser Gly Glu Thr

2495 2500 2505

Thr Gln Thr His Thr Glu Pro Thr Gly Asp Ser Lys Ser Ile Lys

2510 2515 2520

Ala Phe Lys Glu Ser Pro Lys Gln Ile Leu Asp Pro Ala Ala Ser

2525 2530 2535

Val Thr Gly Ser Arg Arg Gln Leu Arg Thr Arg Lys Glu Lys Ala

2540 2545 2550

Arg Ala Leu Glu Asp Leu Val Asp Phe Lys Glu Leu Phe Ser Ala

2555 2560 2565

Pro Gly His Thr Glu Glu Ser Met Thr Ile Asp Lys Asn Thr Lys

2570 2575 2580

Ile Pro Cys Lys Ser Pro Pro Pro Glu Leu Thr Asp Thr Ala Thr

2585 2590 2595

Ser Thr Lys Arg Cys Pro Lys Thr Arg Pro Arg Lys Glu Val Lys

2600 2605 2610

Glu Glu Leu Ser Ala Val Glu Arg Leu Thr Gln Thr Ser Gly Gln

2615 2620 2625

Ser Thr His Thr His Lys Glu Pro Ala Ser Gly Asp Glu Gly Ile

2630 2635 2640

Lys Val Leu Lys Gln Arg Ala Lys Lys Lys Pro Asn Pro Val Glu

2645 2650 2655

Glu Glu Pro Ser Arg Arg Arg Pro Arg Ala Pro Lys Glu Lys Ala

2660 2665 2670

Gln Pro Leu Glu Asp Leu Ala Gly Phe Thr Glu Leu Ser Glu Thr

2675 2680 2685

Ser Gly His Thr Gln Glu Ser Leu Thr Ala Gly Lys Ala Thr Lys

2690 2695 2700

Ile Pro Cys Glu Ser Pro Pro Leu Glu Val Val Asp Thr Thr Ala

2705 2710 2715

Ser Thr Lys Arg His Leu Arg Thr Arg Val Gln Lys Val Gln Val

2720 2725 2730

Lys Glu Glu Pro Ser Ala Val Lys Phe Thr Gln Thr Ser Gly Glu

2735 2740 2745

Thr Thr Asp Ala Asp Lys Glu Pro Ala Gly Glu Asp Lys Gly Ile

2750 2755 2760

Lys Ala Leu Lys Glu Ser Ala Lys Gln Thr Pro Ala Pro Ala Ala

2765 2770 2775

Ser Val Thr Gly Ser Arg Arg Arg Pro Arg Ala Pro Arg Glu Ser

2780 2785 2790

Ala Gln Ala Ile Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Asp Pro Ala Ala

2795 2800 2805

Gly His Thr Glu Glu Ser Met Thr Asp Asp Lys Thr Thr Lys Ile

2810 2815 2820

Pro Cys Lys Ser Ser Pro Glu Leu Glu Asp Thr Ala Thr Ser Ser

2825 2830 2835

Lys Arg Arg Pro Arg Thr Arg Ala Gln Lys Val Glu Val Lys Glu

2840 2845 2850

Glu Leu Leu Ala Val Gly Lys Leu Thr Gln Thr Ser Gly Glu Thr

2855 2860 2865

Thr His Thr Asp Lys Glu Pro Val Gly Glu Gly Lys Gly Thr Lys

2870 2875 2880

Ala Phe Lys Gln Pro Ala Lys Arg Lys Leu Asp Ala Glu Asp Val

2885 2890 2895

Ile Gly Ser Arg Arg Gln Pro Arg Ala Pro Lys Glu Lys Ala Gln

2900 2905 2910

Pro Leu Glu Asp Leu Ala Ser Phe Gln Glu Leu Ser Gln Thr Pro

2915 2920 2925

Gly His Thr Glu Glu Leu Ala Asn Gly Ala Ala Asp Ser Phe Thr

2930 2935 2940

Ser Ala Pro Lys Gln Thr Pro Asp Ser Gly Lys Pro Leu Lys Ile

2945 2950 2955

Ser Arg Arg Val Leu Arg Ala Pro Lys Val Glu Pro Val Gly Asp

2960 2965 2970

Val Val Ser Thr Arg Asp Pro Val Lys Ser Gln Ser Lys Ser Asn

2975 2980 2985

Thr Ser Leu Pro Pro Leu Pro Phe Lys Arg Gly Gly Gly Lys Asp

2990 2995 3000

Gly Ser Val Thr Gly Thr Lys Arg Leu Arg Cys Met Pro Ala Pro

3005 3010 3015

Glu Glu Ile Val Glu Glu Leu Pro Ala Ser Lys Lys Gln Arg Val

3020 3025 3030

Ala Pro Arg Ala Arg Gly Lys Ser Ser Glu Pro Val Val Ile Met

3035 3040 3045

Lys Arg Ser Leu Arg Thr Ser Ala Lys Arg Ile Glu Pro Ala Glu

3050 3055 3060

Glu Leu Asn Ser Asn Asp Met Lys Thr Asn Lys Glu Glu His Lys

3065 3070 3075

Leu Gln Asp Ser Val Pro Glu Asn Lys Gly Ile Ser Leu Arg Ser

3080 3085 3090

Arg Arg Gln Asn Lys Thr Glu Ala Glu Gln Gln Ile Thr Glu Val

3095 3100 3105

Phe Val Leu Ala Glu Arg Ile Glu Ile Asn Arg Asn Glu Lys Lys

3110 3115 3120

Pro Met Lys Thr Ser Pro Glu Met Asp Ile Gln Asn Pro Asp Asp

3125 3130 3135

Gly Ala Arg Lys Pro Ile Pro Arg Asp Lys Val Thr Glu Asn Lys

3140 3145 3150

Arg Cys Leu Arg Ser Ala Arg Gln Asn Glu Ser Ser Gln Pro Lys

3155 3160 3165

Val Ala Glu Glu Ser Gly Gly Gln Lys Ser Ala Lys Val Leu Met

3170 3175 3180

Gln Asn Gln Lys Gly Lys Gly Glu Ala Gly Asn Ser Asp Ser Met

3185 3190 3195

Cys Leu Arg Ser Arg Lys Thr Lys Ser Gln Pro Ala Ala Ser Thr

3200 3205 3210

Leu Glu Ser Lys Ser Val Gln Arg Val Thr Arg Ser Val Lys Arg

3215 3220 3225

Cys Ala Glu Asn Pro Lys Lys Ala Glu Asp Asn Val Cys Val Lys

3230 3235 3240

Lys Ile Arg Thr Arg Ser His Arg Asp Ser Glu Asp Ile

3245 3250 3255

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 3

Thr Pro Lys Glu Lys Ala Gln Ala Leu Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys

1 5 10 15

Glu Leu Phe Gln

20

<210> 4

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagctgcagg agtctggacc tgagctggtg aagcctgggg cttcaatgaa gatttcctgc 60

aagacttctg gatacacatt cagttcatat tccatacact gggtgaaact gagccttgga 120

aagagccttg agtggatggg atttattaat cctaagaatg gtggttctca cttcaatcag 180

aagttcaagg acaaggccac attgactgta gactcgtcct ctgcctcagc cttcatggag 240

ctccgcaccc tgacatctga tgattctgca gtctattact gtacaagagt tggcgacggg 300

caaatctact ggggccaggg caccgctctc acagtctcct cagccaaaac gacacccaag 360

ctt 363

<210> 5

<211> 121

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 5

Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met

1 5 10 15

Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Ile

20 25 30

His Trp Val Lys Leu Ser Leu Gly Lys Ser Leu Glu Trp Met Gly Phe

35 40 45

Ile Asn Pro Lys Asn Gly Gly Ser His Phe Asn Gln Lys Phe Lys Asp

50 55 60

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Ala Ser Ala Phe Met Glu

65 70 75 80

Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg

85 90 95

Val Gly Asp Gly Gln Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu

115 120

<210> 6

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatatcgtga taacacagga tgaactctct ttgtcggtta ttataggaca accaacctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcccctta gatagtgatg ggaagacata tttgaattgg 120

ttgtttcaga ggccaggcca gtctctaaag cgcctaatct atcaggtgtc taaactggat 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga caagttttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgaaga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac tctttttccg 300

tccacgtccg gagcggggac caagctggaa ataaaacgag ctgatgctgc accaactgga 360

tcc 363

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 7

Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Leu Ser Leu Ser Val Ile Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Thr Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Pro Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Leu Lys Arg Leu Ile Tyr Gln Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr Leu Phe Pro Ser Thr Ser Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Gly Ser

115 120

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgtgaagc ttcaggagtc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caggtgcagc tgaaggagtc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caggtgcagc tgaagcagtc 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aggttactct gaaagagtc 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaggtccagc tgcaacaatc t 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaggtccagc tgcagcagtc 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caggtccaac tgcagcagcc t 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaggtgaagc tggtggagtc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaggtgaagc tggtggaatc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatgtgaact tggaagtgtc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gaggtgcagc tggaggagtc 20

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggccagtgga tagtcagatg ggggtgtcgt tttggc 36

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gatgttttga tgacccaaac t 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gatattgtga tgacgcaggc t 21

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gatattgtga taacccag 18

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gacattgtgc tgacccaatc t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gacattgtga tgacccagtc t 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gatattgtgc taactcagtc t 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gatatccaga tgacacagac t 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gacatccagc tgactcagtc t 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

caaattgttc tcacccagtc t 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gacattctga tgacccagtc t 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggatacagtt ggtgcagcat c 21

Claims (4)

1.一种单克隆抗体，其特征在于由小鼠杂交瘤细胞系分泌；其免疫原为按照SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列经化学合成多肽后，通过其N末端的半胱氨酸与钥孔虫戚血蓝素蛋白（(keyhole limpet hemocyanin，KLH）的自由巯基偶联而成的蛋白质；

所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系73043-24E8，已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.10402。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体特异识别由SEQ ID No.1所示的DNA编码的Ki67蛋白，该蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的的单克隆抗体，其特征在于：其分泌抗体的重链和轻链可变区序列，重链可变区由SEQ ID No.4所示的DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为SEQID No.5，轻链可变区由SEQ ID No.6所示的DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.7。

4.一种如权利要求1所述的单克隆抗体在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。