CN116574182B - 一种抗人Ki-67抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体基因工程技术领域，特别是涉及一种抗人Ki‑67抗体及其制备方法和用途。本发明提供的抗人Ki‑67抗体包含轻链和重链，所述轻链包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或所述重链包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。本发明提供的Ki‑67诊断抗体染色性能强、敏感度高，在癌症中的研究有广阔的前景，其不仅对癌症的发生、发展有很好的预见与诊断性，而且对其在基因水平的研究使其在癌症肿瘤的治疗和预后上都有很高的价值。

Description

一种抗人Ki-67抗体及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及抗体基因工程技术领域，特别是涉及一种抗人Ki-67抗体及其制备方法和用途。
背景技术
Ki-67抗原是一种与细胞增殖有关的核蛋白，分子量大小为320kDa或359kDa。Ki-67抗原代表细胞增殖水平，是一个可靠而迅速地反映恶性肿瘤增值率的指标，其高表达是细胞增殖活跃的重要标记。细胞周期调节机制和细咆凋亡在多数恶性肿瘤的进程中有一定的内在联系，许多研究表明Ki-67蛋白表达的精确调控、分布是细胞增殖、完成细胞周期所不可或缺的。此外，Ki-67还与核糖体RNA转录有关。Ki-67存在于细胞分裂周期G1、S、M和G2期，但在细胞静止期G0期不表达。此抗体已被证明可用于标记正常和肿瘤细胞中的Ki-67抗原，包括软组织肉瘤、前列腺腺癌和乳腺癌。
作为一种核增殖抗原，对于Ki-67在癌症中的研究有广阔的前景，其不仅对癌症的发生、发展有很好的预见与诊断性，而且对其在基因水平的研究使其在癌症肿瘤的治疗和预后上都有很高的价值。因此，开发出一种染色性能强、敏感度高的ki-67诊断抗体对于肿瘤的诊断和研究具有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗人Ki-67抗体及其制备方法和用途，用于解决现有技术中染色性能强、敏感度高的ki-67诊断抗体的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抗人Ki-67抗体，所述抗人Ki-67抗体包含轻链和重链，所述轻链包含如下特征的一项或多项：
1)所述轻链包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
2)与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有90％以上同一性、且具有1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。
优选地，所述重链包含如下特征的一项或多项：
3)所述轻链包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
4)与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有90％以上同一性、且具有3)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。
本发明还提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码前述抗人Ki-67抗体的核苷酸序列。
本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含前述多核苷酸。
本发明还提供一种分离的细胞，所述细胞包含前述多核苷酸或前述核酸构建体。
本发明还提供一种制备所述抗人Ki-67抗体的抗原，所述抗原为多肽；编码所述多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供前述抗人Ki-67抗体在制备Ki67抗原检测产品中的用途。
本发明还提供前述抗原在制备抗人Ki-67抗体中的用途。
本发明还提供一种肿瘤诊断试剂盒，所述肿瘤诊断试剂盒包含诊断有效剂量的所述抗人Ki-67抗体或其免疫偶联物。
本发明还提供一种制备Ki-67抗体的产品，所述产品中包含所述抗原和/或佐剂。
本发明还提供前述抗人Ki-67抗体的制备方法，所述制备方法选自下列的任一项：
A)将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的多核苷酸编码的多肽与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合，注入免疫动物体内，分离、纯化免疫动物的血清以获得所述抗人Ki-67抗体；
B)培养并裂解前述的细胞，分离、纯化以获得所述抗人Ki-67抗体。
如上所述，本发明的一种抗人Ki-67抗体及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
作为一种针对核增殖抗原Ki-67的抗体，在癌症中的研究有广阔的前景，其不仅对癌症的发生、发展有很好的预见与诊断性，而且对Ki-67在基因水平的研究使抗人Ki-67抗体在癌症肿瘤的治疗和预后上都有很高的价值。本发明提供的Ki-67诊断抗体染色性能强、敏感度高的对于肿瘤的诊断和研究具有重要意义。
附图说明
图1显示为本发明的Ki-67抗原肽段长度与区域的分布示意图。
图2显示为本发明的Ki-67抗原考马斯亮蓝染色结果示意图。
图3显示为本发明的Ki-67抗原表达载体结构示意图。
图4显示为本发明的噬菌体文库酶切载体结构示意图。
图5显示为本发明的细胞固定实验流程示意图。
图6显示为本发明的PCR反应产物积累规律示意图。
图7显示为本发明的BCR序列文库示意图。
图8显示为本发明的Ki-67抗体重链表达载体结构示意图。
图9显示为本发明的Ki-67抗体轻链表达载体结构示意图。
图10显示为本发明的ELISA抗体验证结果。
图11显示为本发明的Ki-67抗体等电点分析结果。
图12显示为本发明的Ki-67糖型分析结果。
图13显示为本发明的Ki-67抗体与市售抗体在免疫组化染色食管癌样本的对比结果图。
图14显示为本发明的Ki-67抗体与市售抗体在免疫组化染色结肠癌样本的对比结果图。
图15显示为本发明的Ki-67抗体与市售抗体在免疫组化染色扁桃体样本的对比结果图。
图16显示为本发明的Ki-67抗体与市售抗体在免疫组化染色胎盘样本的对比结果图。
具体实施方式
本发明提供一种抗人Ki-67抗体，所述抗人Ki-67抗体包含轻链和重链，所述轻链包含如下特征的一项或多项：
1)所述轻链包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
2)与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有90％以上同一性、且具有1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，所述2)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列功能的氨基酸序列。所述2)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.2具有90％、93％、95％、97％、或99％以上的同一性。
进一步地，所述重链包含如下特征的一项或多项：
3)所述轻链包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
4)与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有90％以上同一性、且具有3)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，所述4)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列功能的氨基酸序列。所述4)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.3具有90％、93％、95％、97％、或99％以上的同一性。
本发明还提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码抗人Ki-67抗体的核苷酸序列。
在一些具体实施方式中，编码码所述抗人Ki67抗体中轻链的核苷酸序列包含如下特征的一项或多项：
5)编码所述轻链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
6)编码2)中氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些具体实施方式中，编码所述抗人Ki67抗体中重链的核苷酸序列包含如下特征的一项或多项：
7)编码所述重链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
8)编码4)中氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含所述多核苷酸。
在本发明中，所述核酸构建体可以由所述多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。表达载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。所述构建体为病毒载体或非病毒载体。例如，非病毒载体包括：质粒，噬菌粒，柯斯质粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)，噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。病毒载体包括：逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。
本发明还提供一种分离的细胞，所述细胞含有所述核酸构建体或所述多核苷酸。
本发明中，将前述的核酸构建体导入宿主细胞可获得所述细胞，或基因组中整合有外源的前述多核苷酸的细胞即为所述细胞。
任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞等；或是低等真核细胞，如酵母细胞等；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞等。所述的宿主细胞包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。
本发明还提供用于制备前述抗人Ki-67抗体的抗原，所述抗原为多肽；编码所述多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供前述抗人Ki-67抗体的制备方法，所述制备方法选自下列的任一项：
A)将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的多核苷酸编码的多肽与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合，注入免疫动物体内，分离、纯化免疫动物的血清以获得所述抗人Ki-67抗体；
B)培养并裂解前述分离的细胞，分离、纯化以获得所述抗人Ki-67抗体。
在一些具体实施方式中，编码A)中多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供前述抗人Ki-67抗体在制备Ki67抗原检测产品中的用途。
在一些具体实施方式中，所述Ki-67抗原检测产品为肿瘤检测产品；进一步地，所述肿瘤选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤；优选的，选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、肺癌、肛门癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤中的一种或多种。
本发明还提供一种肿瘤诊断试剂盒，包含诊断有效剂量的前述抗人Ki-67抗体或其免疫偶联物。有效量通常指能够提供诊断效益的量。
所述肿瘤诊断试剂盒通常可以针对作用靶标Ki-67抗原，以Ki-67抗原作为生物标志物进行诊断。所述肿瘤诊断试剂盒还可以包括抗Ki-67抗体的标记物，所述抗Ki-67抗体的标记物通常可以用于标记抗Ki-67抗体，可选用的标记物的种类包括但不限于荧光标记物、放射性标记物、酶标标记物、化学发光性标记物等中的一种或多种的组合。根据试剂盒的检测原理，所述试剂盒通常还可包含检测所需的一种或多种试剂。此外，所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
本发明还提供前述抗原在制备抗人Ki-67抗体中的用途。
本发明还提供一种制备Ki-67抗体的产品，所述产品中包含前述抗原和/或佐剂。
在一些具体实施方式中，所述佐剂选自无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂或油剂。更具体地，无机佐剂含有氢氧化铝或明矾；有机佐剂含有分岐杆菌、结核杆菌、卡介苗、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素或胞壁酰二肽；合成佐剂含有双链多聚腺苷酸、尿苷酸、左旋咪唑或异丙肌苷；油剂含有完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油或植物油。
本发明中，分离、纯化的方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明中，同一性意为：如两个或多于两个序列具有相同的核苷酸或氨基酸长度和顺序，则所述序列为同一的。同一性百分比通常描述两个序列相同的程度，即，通常描述在序列位置上与参考序列的相同核苷酸相对应的核苷酸的百分比。为了确定同一性程度(同一性％)，通常将要比较的序列是为具有相同的长度，即，要比较的序列中最长序列的长度。举例说明则为：由8个核苷酸组成的第一序列与由10个核苷酸组成的包含第一序列的第二序列80％相同。因此可以理解为，在本发明的上下文中，序列的同一性优选地涉及在两个或两个以上具有相同长度的序列中具有相同位置的序列的核苷酸或氨基酸的百分比。具体地，可以通过将序列对其以达到最佳比较目的并比较对应位置的氨基酸或核苷酸，来确定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的“同一性％”，例如，可在任一序列中引入空位以与另一序列进行最佳对齐。空位通常被视为不相同的位置，而不管其在对其中的实际位置如何。“最佳对齐”通常是产生最高同一性百分比的两个序列的对齐。同一性百分比由所比较的序列中相同核苷酸的数目确定，即同一性％＝相同位置的数目/位置的总数×100。本领域技术人员也可采用其他已知的数学算法来确定两个序列之间的同一性百分比。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1Ki67抗原制备
1.蛋白序列调取：
调取UNIPROT数据库中P46013编号对应蛋白的mRNA序列。由于该蛋白氨基酸序列对应的mRNA序列无法导入有效表达载体，为了精选该蛋白中具有免疫原性的部分肽段区域，以表达具有免疫原性的多肽，使用Antheprot软件分析出该蛋白的免疫原性肽段。具有免疫原性的肽段位置分布如下：
为了精选表达区域，我们根据上表构建了肽段长度与区域的分布图，如图1。通过图1可知，2418-2832区域该氨基酸具有4段9肽以上的免疫原性区域，为此使用真核表达载体表达该区域多肽即本发明的Ki67抗体的抗原。该区域的cDNA序列即表达序列如SEQ IDNo.1所示。
2.Ki67抗原载体制备：
PCR：
1)在表达序列两端引入EcoRI和HindIII酶切位点，表达序列设计引物原则如下：
a)引物扩增区域为单一引物结合位点，无引物的其他结合位点，从而能形成唯一的结合序列；
b)引物区域和扩增区域无EcoRI和HindIII酶切位点；
c)在5＇端起始密码子ATG前添加EcoRI酶切位点序列，3＇端终止碱基前添加6个His标签，其后添加HindIII酶切位点序列。
F端引物为：5’-GAATTCGCACCGGGCAGCAAACGTCAGCCGCAGACCCCG-3’，SEQ ID No.6
R端引物为：5’-CATCATCACCATCACCACAAGCTTTTCCAGTTCCGGGCTGCT-3’,，SEQIDNo.7
2)引物和由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，按照说明书用去离子水配置成50uM的浓度。
3)PCR体系及反应条件：根据前述表达序列，合成模板DNA，基因合成来源于上海桑尼生物科技有限公司，PCR体系如表1。
表1
反应条件为:
首次循环前模板预变性94℃,5min；
变性94℃,30sec；
退火64℃，45sec；
延伸72℃,45sec；
反应30个循环,在末次循环后,样品仍需72℃继续延伸10min以补平末端,4℃保存。使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,分别在相应的长度处回收目的片段。
载体连接：
1)上述PCR反应产物连接至pCMV-Entry载体:取7ulPCR反应产物，加入1ulpCMV-Entry载体，10×连接缓冲液1ulT4DNA连按酶1ul，16℃连接过夜。连接后的载体命名为：pCMV-Entry-Ki67。连接后的载体结构见附图蛋白载体图“
2)制备TG1感受态：
a)挑取单一TG1菌落于5ml液体LB培养基，37℃振荡培养过夜；
b)按1：100将过夜菌接种于LB培养基中，37℃振荡培养，OD260值为0.5时停止培养；
c)菌液加入1.5mlEppendorf管，1000rpm离心1min，弃上清；
d)加入冰预冷的100mMCaCl2溶液，200ul/管，冰浴30min；
e)1000rpm离心1min沉淀细菌，弃上清，加入冰预冷的100mMCaCl2溶液，100ul/管；
f)冰浴1h以上，备用。
3)转化：
a)取重组表达质粒pCMV-Entry-Ki67质粒30-50ng，感受态细菌100ul，混合冰浴30min；
b)42℃热休克90sec，冰浴2min；
c)加液体LB培养基500ul，37℃振荡200r/min培养45min；
d)低速离心后重悬细菌于100u1，将之涂布于含50ug/mlKanR的LB固体平板；
e)37℃平放20min，恒温培养箱倒置培养12～14h。
f)挑取单个菌落于2mLLB液体培养基(含卡那霉素)中37℃180rpm摇床培养12～14h。
4)鉴定阳性克隆：
a)各载体挑取3个单克隆菌落，接种于3ml含50ug/mlKanR的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜；
b)10000rpm离心1min收获细菌，提取质粒DNA；
c)测OD260/OD280决定质粒含量。
d)取Eppendorf管，依次加入如表2的物质置于37℃，1h；1％琼脂糖凝胶电泳检测。
表2
5)测序：取50μl酶切鉴定正确的克隆菌液送测序，测序反应由上海桑尼生物工程有限公司完成。
3.抗原制备
重组质粒的大量提取：质粒构建成功的菌种接种进200mLLB液体培养基的试管中，37℃恒温180rpm摇床培养12～14h。
用无内毒素质粒大提试剂盒对菌液提取质粒DNA。
重组质粒瞬时转染HEK293E细胞：
采用PEI转染法，将其重组质粒DNA瞬时转染HEK293E细胞：
转染前准备，转染前12h～24h时间内，将HEK293E细胞在含胎牛血清的10％DMEM培养基悬液中进行传代培养，细胞进行的传代密度为4×105mL。
转染前将无血清DMEM培养基，含有目的基因质粒载体和PEI试剂和室温放置备用。
转染时制备质粒DNA-PEI混合物，物质组成如表3。
表3
按照PEI与DNA为3:1的比例将PEI滴加至DNA溶液中立即涡旋混合均匀。
室温下静置孵育15min。
无血清的DMEM培养基去润洗待转染的HEK293E细胞，来去除用于传代的残留的培养基，接着移入无血清培养基，将DNA-PEI混合物滴加至其中。
细胞转染3h后，换用等体积的含有10％胎牛血清的10％DMEM的培养基。
在37℃并且含有5％CO2培养箱中培养细胞36～48h后，将收获的细胞上清液进行分离与纯化。
4.抗原的分离和纯化：
Ni-NTA装柱，1.6cm×20cm，柱床体积为10mL；
用缓冲液1平衡2～5个柱床体积，流速为2mL/min；
将20mL细胞破碎液(50mMPBS，pH7.4，0.5MNaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1mL/min；
用缓冲液1再洗2～5个柱床体积，流速为2mL/min；
用分别含10、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，流速为2mL/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
用纯水流洗5个柱床体积，再用20％的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mL/min，柱子置于低温环境中保存。
5.抗原鉴定：
SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色
表4 不同分离胶浓度与蛋白分离线性范围
分离胶浓度 线性分离范围
6％ 50-150kDa
8％ 30-90kDa
10％ 20-80kDa
12％ 12-60kDa
15％ 10-40kDa
根据表4组分，制备分离胶和浓缩胶：
根据样本数量制作分离胶和浓缩胶(一般情况下不用小孔梳子，以10孔使用居多)；
提前用清水洗好制胶板及玻璃片并放入鼓风机中风干，然后将制胶板玻璃片放置在制胶板上；
将配制好的分离胶用1ml移液枪吸取分离胶沿玻璃面左右吹打，待液面至制胶板卡槽出停止加液；
吸取100％无水乙醇缓慢均匀的加到分离胶液面上，室温静置15min，待分离胶凝固后，去除无水乙醇，室温放置5min，准备配制浓缩胶；
移液枪吸取浓缩胶缓慢加入到制胶板中，注意加满后去除上面多余液体及气泡，然后将洗好的梳子缓慢放置在浓缩胶上，缓慢下压至不再移动，室温放置30min，待浓缩胶凝固后，准备上样。
蛋白电泳：
表5
按表5配制电泳缓冲液，制备电泳装置；
向样本中加入适量上样loadingbuffer，移液器轻微吹打混匀。
打开恒温加热器，温度调至98℃，待温度恒定后，将样本放置在加热器上，变性5min，震荡混匀，重新加热一次，使蛋白充分变性。然后震荡混匀，10000rpm离心2min，开始上样，同时加入蛋白maker作为蛋白大小对比标准。(注意：若样本为多蛋白结合复合物，可不需进行热变性)
盖上盖子，电压调至80v，开始电泳，待loadingbuffer完全进入分离胶后，将电压调至120v，直至loadingbuffer刚好从底部跑出，停止电泳。
电泳buffer冲洗胶面，使胶从制胶板中取出，去离子水冲洗胶面，放置在干净的实验皿中，准备考马斯亮蓝染色。
比对蛋白大小是否与实际一致，准备纯化步骤。
考马斯亮蓝染色：
取出电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，用双蒸水清洗振荡凝胶3次，每次5min。
加入20mL蒸馏水，置于摇床上振荡清洗5min，重复3次。
在干净的盛胶器中加入20mL已稀释一倍的染色液A和1.2mL染色液B充分混合，将胶放入器皿中，置于摇床上振荡染色30min。
将胶转移至另一个干净的器皿中用双蒸水冲洗凝胶，再加入20mL已稀释一倍的脱色液，置于摇床上，振荡清洗15min，重复3次。
待背景脱至无色后(可延长脱色时间)，即可进行蛋白条带的观察，照相和分析。
染色图结果如图2所示，蛋白大小与实际是一致的。
实施例2 Ki抗体获取及鉴定
1.含抗体血清的获取
免疫小鼠：小鼠挑选，选择6-8周龄,雌性,体重18-22g,毛色光泽,活动自如的健康BALB/c小鼠5只进行免疫。
小鼠标记:将选择用于免疫的小鼠,剪趾标记。
抗原准备:将抗原按照首免、二免、三免等分装EP管,首免抗原用PBS稀释至1mg/ml,随后免疫抗原均稀释至0.5mg/ml,按照100uL/每只小鼠剂量准备抗原,将抗原置于20℃备用。
免疫方式：首免：将抗原与弗氏完全佐剂按1:1体积比混匀,使用自动抗原乳化器使抗原完全乳化。乳化标准以免疫原滴入37℃水中不分散为合格。免疫方式为背部皮下8点注射免疫；二免或三免，将抗原与弗氏不完全佐剂按1:1体积比混匀,并使之完全乳化。免疫方式为皮下多点注射免疫。首免与二免间隔3周,随后二免、三免间隔时间为2周。
最后一次免疫完成后7天ELISA检测小鼠血清效价,3天后进行尾静脉注射免疫终加强,第2天取脾脏。
包被：分别以各Ki67作为包被抗原，将包被抗原稀释至6ug/ml,按50ul/孔加入到酶标板中，4℃包被过夜。
封闭：甩干酶标板孔中液体，按100uL/孔向酶标板中加入1％BSA,37℃封闭1h。
加入一抗：甩干酶标板孔中液体，将免疫小鼠血清用PBS按1：300、：900、1:2700、1:8100、1:24300、1：72900、1：218700、1：656100梯度稀释，然后按50uL/孔加入酶标板中，同时加入BSA作为阴性对照，每稀释梯度做一个复孔。置于37℃恒温孵育30分钟。
加入二抗：1×TBST洗涤酶标板2次，用1％BSA将GAM-HRP(GoatAnti-Mouse-HorseradishPeroxidase,羊抗鼠-辣根过氧化物酶)稀释至工作浓度(1:3000),按50ul/孔加入到酶标板中，37℃恒温孵育30分钟。
显色、终止并读数：弃去酶标板孔中液体，按180uL/孔向酶标板中加入洗涤液洗涤3次。然后在各反应孔中加入100ul新配制的TMB显色底物，37℃恒温孵育5分钟，随后90uL/孔加入终止液终止反应，并在酶标仪上测定OD450读数。
2.Ki67抗体信息获取
RNA抽提及其反转录
将Ki67抗原免疫的所有小鼠脾细胞均等混合，混合时每种抗原免疫小鼠的脾细胞悬液含量为1x107，浓度为1x106/ml。使用E.Z.N.AHP Total RNA提取试剂盒,对前期免疫小鼠脾脏组织进行RNA抽提。
(1)取免疫小鼠脾脏组织20-30mg,加入700ulGTC裂解液,对小鼠脾脏进行裂解。使用手持电动匀浆器,对样品匀浆化。
(2)匀浆化后将匀浆化组织转移到1.5ml离心管,室温14,000xg离心5分钟。
(3)转移上清液至放在2ml收集管中的DNA去除滤柱中,室温13,000g离心1分钟。
(4)将收集液转移至新的1.5mlEP管中,向裂解产物中加入同等体积的70％乙醇,涡旋混匀。
(5)然后将已混匀样品溶液转移至HiBand RNA离心滤柱中,室温10,000xg离心60秒,弃滤液；重复使用收集管,重复上一步骤,以将所有样品液均收集到收集管中。
(6)加入500μL RNA wash buffer I,10,000xg室温离心30s,弃滤液。
(7)将HiBand RNA离心柱放回收集管,加入500μL RNA wash buffer II,10,000xg室温离心30s,弃滤液；再次重复上一步骤。
(8)然后将柱子放回收集管,室温14,000xg离心2min。
(9)将HiBand RNA离心柱转移至1个新的1.5mL无菌EP管中,加入70μL DEPC水洗脱柱子,室温放置2min后,14,000g离心2min,收集RNA保存于-70℃备用。RNA提取完成后使用Agilent4200生物分析仪对RNA提取质量进行鉴定。
RNA反转录：
使用ThermoFisherScientific公司ThermoScriptTMRT-PCRSystem反转录试剂盒。按以下方案在0.5m反应管中加入模板、随机引物、dNTP:
50μMOligo(dT)20引物1ul
RNA 1ug
10mM dNTP 2uL
DEPC H2O 4μL
总反应体积12μL
65℃变性反应5分钟，反应结束后立即置冰上。涡旋5xcDNASynthesisBuffer5秒钟。按以下配方，在冰上配制总反应混合液并轻轻涡旋混匀。
5x cDNA Synthesis Buffer 4μL
0.1MDTT1μL
Rnase OUTTM(40U/μL)1μL
DEPC H2O 1μL
ThermoScriptTMRT(15units/μL)1μL
将反应管置冰上,加入以上总反应混合液8μL,上机于50℃扩增反应60min。后85℃加热5min终止反应,加入luL RNaseH于37℃孵育20min。产物储存于-20℃。
抗体基因扩增及产物鉴定：
以cDNA为模板，使用抗体V区基因扩增引物，对抗体重链及轻链基因序列进行扩增。该引物系列共包括25对抗体轻链基因引物及50对抗体重链基因引物，对抗体轻链基因及重链基因分别进行扩增。
2xPrime Buffer Mixtrue 25ul
98℃预变性60秒：98℃变性10秒、55℃退火10秒、72℃延伸15秒，35个循环：72℃延伸5分钟。扩增之后，取PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察结果进行切胶纯化。
扩增产物回收：
抗体基因扩增琼脂糖凝胶电泳完成后,使用E.Z.N.ARGelExtractionKit回收,试剂盒,切胶回收:
使用洁净刀片紫外灯下切胶,曝光时间勿超30秒,称重。
将胶条放入干净的1.5ml的离心管中称重,每1g回收胶加入1mlBinding Buffer,56℃-60℃孵育7～10分钟直至凝胶完全溶化,期间每隔2-3分钟摇动混匀,期间注意并调整其pH值。
将HiBind DNA Mini Column装在收集管内,加入700ul凝胶混合液,室温10,000xg离心1分钟,弃去离心液。将剩余凝胶液重复加柱,离心收集。
加入300plBinding Buffer到离心柱内,室温最大转速(或213,000xg)离心1分钟冲洗离心柱,弃去离心液。
加入700ulSPW WashBuffer洗液冲洗离心柱,室温10,000xg离心1分钟,共洗涤2遍。弃去离心液。
将空离心柱全速(213,000xg)离心2min,甩干去除乙醇。
将离心柱置于干净的1.5mL离心管内,加入50lElutionBuffer洗脱液,室,温孵育1分钟,全速(>＝13,000xg)离心1分钟洗脱DNA,用于后续酶切反应。
抗体基因酶切：
抗体基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳完成后,将抗体基因凝胶回收产物进行酶切。轻链(LC)基因使用ThermoScentific FastDigestApaLI和AscI内切酶进行双酶切:取5ug轻链基因,分别加入5ul相应的内切酶,37℃酶切25分钟。酶切完成后,琼脂糖电泳并进行酶切条带鉴定,切胶回收。
重链(HC)基因使用NotI和SfiI内切酶进行双酶切:取5ug重链基因,首先NotI内切酶37℃酶切25分钟。然后加入SfiI内切酶50℃酶切25分钟。酶切完成后,琼脂糖电泳鉴定酶切条带,切胶回收酶切产物。
Fab抗体库构建载体信息：
构建轻链子库所用载体为pHD3质粒。抗体库构建完成之后，载体图如图4所示，所示,BsmI和BspMI之间为轻链序列,PshAI和EcoNI之间为重链的VH+CHI序列。
质粒载体酶切、连接：
首先构建轻链子库，使用ThermoScentificFastDigest BsmI和BspMI内切酶，对构建轻链子库所用pHD3载体质粒进行双酶切：每1ug载体质粒分别加入1ul对应的BsmI和BspMI，37℃酶切25分钟。酶切完成后琼脂糖凝胶凝胶电泳并鉴定。胶回收后用于连接反应，进行轻链子库构建。
轻链基因酶切片段与载体质粒连接,使用TaKaRa DNA Ligation Kit连接酶试剂盒。按照插入酶切轻链基因片段与载体质粒DNA为3:1的摩尔比,将需插入的已酶切轻链基因片段与载体质粒DNA进行连接。
将质粒载体DNA与插入DNA片段混合制备成体积为10ul的DNA溶液,加入2x连接酶Buffer10ul及连接酶lul,25℃反应30分钟。将轻链基因酶切片段与载体质粒DNA进行连接。脱盐纯化：
使用E.Z.N.ACyclePureKit纯化试剂盒,对连接产物进行纯化:
将HiBindDNA结合柱放入集合管中,加入100ul Equilibration Buffer,室温孵育4分钟,13,000xg最大转速离心20秒甩干。
将连接产物加入5倍体积BufferCP,充分混匀后,加入HiBindDNA结合柱中。10,000xg离心1分钟,弃去滤液。
加入700ulWash Buffer,10,000xg离心1分钟,弃去滤液。
再次加入500ulWash Buffer,10,000xg离心1分钟,弃去滤液。
最大转速13,000xg离心2分钟,甩干HiBind DNA柱。
在HiBind DNA柱中加入35ul去离子水,室温静置2分钟,13,000xg离心1分钟,洗脱收集DNA。
转化：
轻链子库电转感受态细胞使用SS320细胞。
连接产物脱盐纯化后，按每次电转1μg连接产物进行电转化。
在每个1.5ml无菌离心管中加入70ul电转感受态细胞，然后加入1ug连接产物，轻轻吹吸混匀。
将感受态细胞沿侧壁缓慢加入电击杯，然后轻轻敲击电击杯，使感受态细孢均匀的沉到电片杯底，放入电转仪，以电转参数：25kv进行电转。电转导入后37℃孵有1～2h。
电转结束后，取10μ进行稀释法测定和计算库容。同时涂布单克隆平板，用以测序。
剩余菌液涂2xYT固体平板，37℃过夜培养。第天刮取平板菌苔，加甘油，冻存于-80℃保存。
轻链子库库容测定：
电转之后，取10ul产物进行稀释法测定库容。过夜培养之后，计数培养板上的菌落数，并折算出最终的轻链子库库容。
轻链子库单克隆测序鉴定：
电转过夜培养之后，计数培养板上的菌落数计算轻链子库库容的同时，挑取轻链子库菌落进行单克隆测序分析。通过其酶切位点序列分析，分析其克隆正确插入率，是否符合子库建库质量预期，可否进行下一步Fab建库实验。
轻链子库建库质量检测合格后，进行下一步Fab抗体文库建库实验。
轻链子库质粒提取：
轻链子库建库质量检测合格后，使用E.Z.N.A.Plasmid Mini KitI质粒提取试剂盒，对已构建的轻链子库质粒DNA进行抽提：
构建轻链子库2×YT培养基，平板利取500u1菌液，置于1.51nl离心管中，5000×g离心1分钟，弃去.上清液，用滤纸充分吸干。
加入350ulSolutionI/RNaseA溶液，充分涡旋振荡混匀，进行重悬。
加入250ul的SolutionII进行碱裂解，缓慢上下颠倒，轻轻混匀，使溶液变澄清。
3.5分钟后加入SolutionII进行酸中和，析出蛋白等杂质；16000g离心10分钟。
将上清转移至HiBindDNA结合滤柱中,16000xg离心1分钟,倒掉收集管中的液体。
向滤柱中加入500ulHBbuffer,16000xg离心1分钟,弃掉收集管中的液体。
加入700ulDNAWashBuffer,16000xg离心1分钟,弃滤液；重复洗涤两次。
将滤柱16000xg离心2分钟,弃去剩余滤液。加入75ulElutionBuffer,静置2分钟,16000xg离心1分钟,洗脱DNA。
轻链子库质粒酶切：
轻链子库质粒提取完成后，使用ThermoScentificFastDigest PshAI和EcoNI，对轻链子库质粒进行双酶切。按每1ug载体分别加入1ul对应的两种限制性内切酶，首先PshA内切酶37℃酶切25分钟。然后加入EcoNI内切酶50℃酶切25分钟。酶切完成后，琼脂糖电泳鉴定酶切条带，切胶回收酶切产物。
装配重链基因和重链基因导入：
将已使用PshAI和EcoNI双酶切之重链(HC)基因,与双酶切轻链子库质粒载体导入连接:按照插入重链基因与轻链子库载体质粒为3:1的摩尔比,将重链基因片段与已酶切轻链子库质粒载体,混合制备成10ul体积的DNA溶液,加入连接酶Buffer10ul及连接酶lul,25℃反应30分钟进行连接。
连接产物脱盐纯化后,按1ug连接产物/每次电转,再次电转导入感受态细胞。
电转结束后,同样取10ul进行稀释法测定和计算库容。同时涂布单克隆平板,用以测序。剩余菌液涂2xjYT固体平板,37℃过夜培养。第二天刮取平板菌苔,加甘油,冻存于-80℃保存。
Fab抗体库库容测定：
轻链子库质粒经重链基因装配导入，连接电转之后，按与轻链子库相同方法，取10μl产物进行稀释法测定库容。过夜培养之后，计数培养板上的菌落数，并计算最终的Fab(Fragment of antigen binding,抗原结合片段)抗体义库库容。
Fab抗体库单克隆测序鉴定:
轻链子库质粒经重链基因装配导入，连接电转之后，在测定库谷的同时，桃取Fab抗体文库菌落，进行单克隆测序验证分析。
Fab抗体库和Fc端载体融合：
将片段Fab抗体库从克隆载体上切下，分别形成含有ApaLI/AscI和NotI/SfiI的双酶切位点的线性质粒片段，与预先经过ApaLI/SfiI双酶切的线性pcDNA3.1(+)Fc载体进行二片段连接，转化TG1后挑取克隆，抽提质粒，酶切鉴定挑选阳性克隆，柱纯法得到大量pcDNA3.1(+)Fab2Fc纯化质粒，O.D法确定浓度以备细胞转染。
重组噬菌体展示抗体库构建流程：
抗体库菌株复苏准备：预热500ml含有Carbenicillin羧苄青霉素(50μg/ml)、Tetracycline四环素(12μg/ml)与2％葡萄糖的2YT培养基。将储存于EP管中的抗体库菌种SS320细胞1管(1ml菌液)，放置冰上30分钟融化。
抗体库菌株接种：将抗体库菌株细胞接种到50ml含有12μg/ml四环素，50gml羧苄青霉素和2％Glucose的2YT培养基中。初始OD600值约为0.1左右。
抗体库培养：将培养基放入37℃摇床中，220pm培养2小时。至OD600为0.50～0.6。
辅助噬菌体(HelperPhage)侵染：加入50μl辅助噬菌体，噬菌体浓度约为SS320细胞浓度的50倍。helperPhage辅助噬菌体。
抗体库培养：培养箱中37℃静止培养30分钟，然后37℃220pm摇床中培养1小时。
抗体库菌种离心：培养完成后12000×g离心5分钟，将上清倒入废液，将离心管倒扣在干净的纸巾上，以去除管中剩余液体。
抗体库菌株筛选：用50ml含有50μg/ml羧苄青霉素和40μg/ml卡那霉素的2YT培养基重悬细胞。225rpm转速30℃摇床培养过夜培养。
SS320菌种复苏：从2YT固体平板上挑取SS320单克隆，接种于2l含有12μg/ml四环素的2YT培养基中。225rpm转速37℃摇床中培养过夜。
抗体库沉淀：培养第二天13,500×g离心5分钟，将40ml上清转移到50ml无菌聚丙烯离心管中，向每管中加入10mlPEG6000/NaCl,冰上孵育1～2小时或冰上过夜。
噬菌体沉淀：
噬菌体与菌体分离:13,500xg,低温4℃离心10分钟,将上清倒入废液缸中,将离心管倒扣在干净的纸巾上0.5～1分钟,以去除剩余液体。
噬菌体重悬:向离心管中加入10ml冰上预冷的PBS溶液,重悬白色的噬菌体沉淀。
噬菌体转移:转移10ml噬菌体上清到15ml无菌聚丙烯离心管中。
噬菌体沉淀:13.500xg,4℃低温离心5分钟,以去掉剩余细菌碎片,将上清倒入到含有2.5mlPEG6000/NaCl的15ml离心管中,充分混匀。然后平躺放置冰上,孵育1～2小时或冰上过夜。加入2.5mlPEG6000/NaCl,冰上孵育1～2小时或冰上过夜。4℃低温13,500xg离心10分钟,倒掉上清,倒扣离心管在干净的纸巾上0.5～1分钟以去除剩余液体。
噬菌体重悬:加入5ml冰上预冷的PBS溶液,重悬白色的噬菌体沉淀。
噬菌体保存:转移4ml噬菌体上清到15ml无菌聚丙烯离心管中。保存在4℃进行海选准备。剩余噬菌体加入甘油,使其终浓度为15％,分装1ml每管保存于-80℃。
噬菌体淘选(Panning)：
免疫管抗原包被:以76种Ki67,包被免疫管。每个Ki67包被液体积为4ml,每种Ki67终浓度100ug/ml,以PBS作为包被缓冲液。将抗原包被液加入免疫管中,4℃旋转混合仪混合过夜。
CK空白对照:准备1个空免疫管,加入4mlPBS,4℃旋转混合仪混合过夜。
封闭:第二天,将前两步骤中准备的免疫管用PBS清洗2-3次加入5％MPBS(PBS-牛奶溶液)5ml到免疫管管口边缘,室温封闭2-3小时。倒掉MPBS溶液。
噬菌体-抗原结合:将包被过抗原的免疫管中的MPBS倒掉,清洗免疫管。
加入4ml已沉淀好的噬菌体溶液到免疫管中,封口膜封口,室温旋转混合仪结合90分钟。
清洗免疫管:先用PBST溶液润洗免疫管2-3次,然后用PBS溶液润洗2-3次。
洗脱噬菌体:加入0.8ml0.25％胰蛋白酶(0.25％Trypsin胰蛋白酶保存于-20℃,使用前在冰上或4℃冰箱融化)。室温,旋转混合仪上孵育10分钟。
收集洗脱下的噬菌体。检测output/input比。
洗脱后的噬菌体的扩增：
培养:接种SS320过夜菌液到50ml2YT培养基,初始浓度为OD600:0.05.37℃220rpm摇床培养到OD600:0.5-0.6,大约培养150分钟。
噬菌体侵染SS320细胞:转移0.3ml洗脱后噬菌体溶液到3mlSS320菌液,中,充分混合后37℃静置培养30分钟。涂布在Car+-Tet+2YT-平板上,37℃培养箱过夜培养。
侵染后细胞营救:加入5mlCar+-Tet+2YT液体培养基到平板中。收集菌液到15mL离心管中,充分混合,检测OD600。转移0.8mL菌液到1.5ml无菌EP管中,加入0.2ml50％甘油,充分混合后-80℃冰箱冻存。
噬菌体titer检测：
SS320菌株培养：在2YT平板上划线单克隆E.coli菌株SS320.37℃过夜培养。
SS320菌株转接：挑取SS320单克隆菌落，接种到2YT液体培养基中，过夜培养。
Titer检测侵染：将噬菌体稀释10-101倍，分别加入到10倍体积的SS320菌液中，37℃培养30分钟。
侵染后细胞培养：将上一步骤中的菌液噬菌体混合液分别涂布在2YT平板上。
噬菌体titer计算：第二天，记录单克隆菌落数量与稀释度。
output洗脱后噬菌体titer效价＝菌落数×稀释倍数。
Input噬菌体titer效价＝菌落数×稀释倍数。
噬菌体初筛文库与单B细胞测序文库共同实施BCR测序，与单B细胞测序的共同克隆，用于后续抗体表达。
细胞固定实验：
细胞固定实验流程如图5所示。
将所有Ki67疫小鼠的B细胞悬液分别编号，后续按照编号标记Ki67barcode。
对每个B细胞悬液进行500g，4℃离心3min，小心弃上清(弃掉上清时不要触碰到细胞沉淀，为了避免吸到沉淀可以留少许上清)。
加入200ulICBPRIsolution重悬细胞并将B细胞悬液转移到1.5mlEP管中(细胞总量少于1*106时，可在1.5ml的EP管中重悬，若细胞量较多建议在15ml管中加入800ul重悬细胞)
轻柔缓慢加入800ul预冷的ICBFPSolution(15ml离心管加入3.2mlICBFPSolution)。轻微吹打混匀10次，使细胞充分固定。放置于-20℃固定30min。固定15min时，可用枪头上下轻微吹打，使细胞充分固定，避免细胞成团。(细胞数量只有10万级别时，可将重悬液和固定液按照比例稀释后操作
将与实验细胞匹配直径的细胞筛倾斜放入15mL离心管中，将上步重悬的细胞慢慢倒入到细胞筛上，待细胞滤过后，收集滤过B细胞悬液。
细胞计数以及细胞活力检测，取10ul0.4％台盼蓝于200ulBCR-PCR管中，大枪头轻微吹打固定细胞使细胞均匀分散，取10ul固定细胞于BCR-PCR管中，吹打混匀，取10ul于血球计数板上，显微镜下开始计数。(0.4％台盼蓝使用前12000rpm离心2min)
细胞计数及镜检合格后，将细胞稀释至约1,000,000cells/mL。稀释后细胞放在1.5mL离心管中保存在-80℃冰箱，建议将样本等体积分装保存，后期实验避免反复冻融带来的干扰。(若细胞数量较少可保存在1.5ml的EP管中)
细胞通透：
取不小于5倍用量的固定细胞，终浓度为0.1％的TritonX-100冰上通透10min。
4℃，500g，离心5min，弃上清，注意不要碰触细胞沉淀，1*PBSwith0.04％BSA重悬细胞并计数。(严格控制升降速度)
计算好每孔加入细胞量，即cell/孔。
取10ul固定细胞加入到反转录对应的孔径中。
固定后细胞内反转录：
选择合适数量的Barcode1组合数，每一个取2ul分配到96孔板中备用；
配制反转录体系(一般多于步骤1中的孔数)体系如下：
将B细胞悬液均匀分散至孔中，每孔加入10ul；
RTBCR-PCR程序如下：
将RT产物回收至同一1.5ml离心管中(falcontube)。
500g，4℃缓慢离心5min，小心去除上清(注意尽量不要洗到细胞)。(严格控制升降速度，参数为7、7)
按照每孔加入20ul计算，用ICBRTsuspendbuffer重悬细胞。
Round2与Round3连接：
Round2与Round3退火引物准备：
Round2 96孔板：
Round3 96孔板：
二、三轮组合Barcode连接及子文库生成：
配制连接体系，如下表所示：
Round2 Ligase：
将配制的2.04mL ICB2x ligase buffer和2ml ICB RT suspend buffer中重悬的B细胞悬液混匀成4.04mL的连接混合细胞，并转移至反应槽中备用(上述连接体系按照100孔进行配制，可根据实验设计调整)
用排枪将40μL连接混合细胞分别加入到ICB Barcode2 96孔板中(每个孔中已包含10μL DNA barcodes)。
800rpm水平离心机简短离心2min。
37℃，300rpm恒温混匀仪孵育30min进行Round2连接。
简短离心，使用排枪轻微混匀96孔板管内成分，合并96孔细胞，同时转移至反应槽中，并向反应槽中加入50μL ICB T4 DNAligase。
血球计数板计数、记录。
Round3 ligase：
使用1ml移液器轻微吹打混匀，排枪吸取50ulR2细胞连接混合液，均匀加入Round3中(每个孔中包含10μL ICB Round3 DNA barcodes)(每个孔的总体积到60μL)
800rpm水平离心机简短离心2min。
37℃，300rpm恒温混匀仪孵育30min进行ICB Round3连接。
简短离心，使用排枪轻微混匀96孔板管内成分，合并96孔细胞于15ml离心管中，1000g，4℃离心5min。(严格控制升降速度，参数为7、7)
子文库生成：
小心取出样本，放置于管架上，1ml移液器小心移除上清，注意不要碰触管底沉淀，可留少许反应体系，不超过50ul。
用2ml含有ICB PR1 solution重悬细胞，洗涤一次，1000g，4℃离心5min。(严格控制升降速度，参数为7、7)
小心移除上清，注意不要碰触沉淀，用50μL ICB PR1 solution重悬。
血球计数板计数，均分细胞于子文库中。
裂解和解交联：
细胞裂解，体积不足50ul，加入1xPBS将体系补足50μL。
细胞裂解：(加入50μL ICB 2X lysis buffer和10μL ICB ProteinaseK，20mg/mL)
300rpm，55℃孵育2h，逆转甲醛交联。
-20℃保存解交联产物。
cDNA纯化：
使用前，先取出ICB DMS beads室温平衡30min。
每个子文库对应加入40μL ICB DMS beads于1.5mlEP管中。
用800μL ICB beads wash buffer重悬清洗磁珠三次。
用100μL ICB 2x beads Binding buffer重悬磁珠。
每个子文库(提前从冰箱取出解冻)加入5μL100μM ICB ProteinK inhibitor。
室温孵育10min，抑制蛋白酶K活性。
每个文库加入100μL ICB 2x beads Binding buffer重悬磁珠。
300rpm，恒温混匀仪27℃混匀60min。
从恒温混匀仪取下，磁力架上静置5min，待澄清后，弃上清，注意不要碰触磁珠，用800μL ICB beads wash buffer重悬清洗一次。
恒温混匀仪27℃洗脱5min。
再用800μL ICB TT wash buffer重悬清洗一次。
恒温混匀仪27℃混匀5min，磁力架收集磁珠，弃上清，注意不要碰触磁珠，用TSO体系重悬磁珠。
TSO反应(二链合成)：
用以下溶液体系重悬束缚有cDNA分子的ICB DMS beads。
体系如下：
将上述体系重悬磁珠，分装至200ulBCR-PCR管中，恒温混匀仪室温孵育30min。
42℃孵育90min，将磁珠转移至1.5mlEP管中。
磁力架上静置5min，待澄清后，弃上清，注意不要碰触磁珠。
BCR-PCR全长文库富集：
将上述磁珠放置于磁力架上，ICB TT wash buffer重悬洗脱一次。
重悬磁珠，所用试剂体系如下：
50ul均分至八联排管中。
BCR-PCR程序如下：
95℃ for 3mins,
5cycles：
98℃ for 20s,
65℃ for 45s,
72℃ for 3mins.
72℃ for 5minutes。
合并磁珠mix于1.5mlEP管中，放置磁力架上5min，收集上清，从BCR-PCR溶液中移除免疫磁珠，加入20x ICB Green mix染液(终浓度为1x)，20ul分装至适用于荧光定量BCR-PCR仪的八联排管中，进行平台期检测。
qBCR-PCR反应程序：
95℃for3minutes,
Cycling：(once the qBCR-PCR signal began to plateau,reactions wereremoved)
98℃ for 20seconds,
65℃ for 20seconds,
72℃ for 3minutes,
72℃ for 5minutes。
如图6所示达到平台期后，停止反应。
片段化及index BCR-PCR文库富集：
BCR-PCR产物(平台期)用0.6X ICB purify Beads纯化，Qubit定量。
cDNA稀释至600pg/5μL(每次取1ng文库样本)。
加入10μLICB4*Tagement buffer、5μL ICB Tagement enzyme，吹打混匀。
用枪吹打混匀，55℃孵育5mins。
Index扩增体系如下：
BCR-PCR反应程序：
72℃for 3min
95℃for 30s,
12cycles：
95℃ for 10s,
55℃ for 30s,
72℃ for 30s,
72℃ for 5min。
移出50μLBCR-PCR产物用0.7xICBpurifyBeads纯化，以产生Illumina兼容的测序文库，文库要求长度大于400bp。所有BCR序列文库图如图7，方可测序。
原始数据质控：
由于原始测序数据中会包含测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列，这将严重影响后续分析的质量。为保证后续的生物信息分析的准确性，首先对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据(clean data)以保证后续分析的顺利进行。采用SOA Pnuke(version1.6.0)(ChenY2017)软件进行数据质控，具体质控内容如下：
a)过滤接头污染的reads；
b)过滤低质量reads(当低于Phredscore＝20的碱基在reads中比例大于0.5时，弃掉)；
c)过滤测序读N的reads(当raeds读N比例大于0.05时，弃掉)。
Ki67分子标签去重和纠错：
根据UID文库建库方法，识别并提取read1中的Ki67UID序列；
把带有相同UID序列的reads作为一个聚类(cluster)。在建库过程中，同一UID序列会连接到不同分子上，在每个cluster中，通过计算reads间的序列差异，将差异低于阈值的reads进行再次聚类，得到亚聚类(sub-cluster)，默认序列差异阈值为5nt；
对sub-cluster中的reads进行多序列比对。在比对和计算过程中，来源相同的重复reads最终被归并为一条一致性序列，达到纠错和去重的目的；
在PCR或测序过程中，UID序列同样会引入错误，再对相同一致性序列的UID序列进行序列差异计算，将差异低于阈值的UID进行合并，达到纠错UID的目的，默认序列差异阈值为1nt。
参考序列构建：
使用MiXCR(v3.0.3)软件(BolotinDA 2015)，将UID纠错后reads与来自IMGT数据库(Marie-PauleLefranc 2015)的V、D、J基因片段进行比对。MiXCR是目前BCR分析使用率最高的主流软件之一，同时IMGT数据库是免疫组学最权威的数据库。与IMGT数据库中所有V/D/Jgermline序列比对。将下机数据，pairedendreads拼接成一整条contig，merged后的contig即是测到的受体的重组基因序列。通过比对可以获得reads的基因信息、重排方式和CDR3序列。
a)比对：使用SOAP2程序将cleandata与IMGT免疫细胞受体库的V\D\J基因比对，搜索相应的基因片段。重比对：
b)为确保结果的高准确度，在完成初步比对后，将比对序列再次与数据库做重比对，以寻找精确的V\D\J基因片段和序列的位点。
c)去除无效序列：对于未比对、假基因、终止子、无开放阅读框和Primer序列。
d)定位克隆数量最多的BCR重链和轻链匹配对，将该匹配对视为待表达抗体。
构建抗体基因载体-PCR：
在抗体重链两端引入BlpI和NaeI酶切位点，设计引物如下：
在抗体轻链两端引入EcoRI和HindIII酶切位点，设计引物如下：
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，按照说明书用去离子水配置成50uM的浓度。
PCR体系及反应条件如下：
反应条件为:
首次循环前模板预变性94℃,5min；
变性94℃,30sec；
退火55℃,45sec；
延伸72℃,45sec；
反应30个循环,在末次循环后,样品仍需72℃继续延伸10min以补平末端,4℃保存。使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,分别在相应的长度处回收目的片段。
载体连接：
上述PCR反应产物连接至pTT5载体:取7ulPCR反应产物，加入1ulpTT5载体，10×连接缓冲液1ulT4DNA连按酶1ul，16℃连接过夜。连接后的载体命名为：pTT5-anti-Ki67H和pTT5-anti-Ki67L。连接后的载体结构如图8和图9。
制备TG1感受态：
挑取单一TG1菌落于5ml液体LB培养基，37℃振荡培养过夜；
按1：100将过夜菌接种于LB培养基中，37℃振荡培养，OD260值为0.5时停止培养；
菌液加入1.5mlEppendorf管，1000rpm离心1min，弃上清；
加入冰预冷的100mMCaCl2溶液，200ul/管，冰浴30min；
1000rpm离心1min沉淀细菌，弃上清，加入冰预冷的100mMCaCl2溶液，100ul/管；
冰浴1h以上，备用。
转化：
取重组表达质粒pTT5-anti-Ki67H和pTT5-anti-Ki67L质粒30-50ng，感受态细菌100ul，混合冰浴30min；
42℃热休克90sec，冰浴2min；
加液体LB培养基500ul，37℃振荡200r/min培养45min；
低速离心后重悬细菌于100u1，将之涂布于含50ug/mlAmp的LB固体平板；
37℃平放20min，恒温培养箱倒置培养12～14h。
挑取单个菌落于2mLLB液体培养基(含氨苄)中37℃180rpm摇床培养12～14h。
鉴定阳性克隆：
各载体挑取5个单克隆菌落，接种于5ml含50ug/mlAmp的LB液体培养基，37度振荡培养过夜；
10000rpm离心1min收获细菌，提取质粒DNA；
测OD260/OD280决定质粒含量。
取Eppendorf管，依次加入如下成分：
置于37℃，1h；1％琼脂糖凝胶电泳检测。
测序：取50μl酶切鉴定正确的克隆菌液送测序，测序反应由上海桑尼生物工程有限公司完成。
重组质粒的大量提取：
质粒构建成功的菌种接种进200mLLB液体培养基的试管中，37℃恒温180rpm摇床培养12～14h。
用无内毒素质粒大提试剂盒对菌液提取质粒DNA。
重组质粒瞬时转染HEK293E细胞：
采用PEI转染法，将其重组质粒DNA瞬时转染HEK293E细胞：
转染前准备，转染前12h～24h时间内，将HEK293E细胞在含胎牛血清的10％DMEM培养基悬液中进行传代培养，细胞进行的传代密度为4×105mL。
转染前将无血清DMEM培养基，含有目的基因质粒载体和PEI试剂和室温放置备用。
转染时按以下成分制备质粒DNA-PEI混合物：
按照PEI与DNA为3:1的比例将PEI滴加至DNA溶液中立即涡旋混合均匀。
室温下静置孵育15min。
无血清的DMEM培养基去润洗待转染的HEK293E细胞，来去除用于传代的残留的培养基，接着移入无血清培养基，将DNA-PEI混合物滴加至其中。
细胞转染3h后，换用等体积的含有10％胎牛血清的10％DMEM的培养基。
在37℃并且含有5％CO2培养箱中培养细胞36～48h后，将收获的细胞上清液进行分离与纯化。
抗体的分离及纯化：
本文抗体纯化主要是利用proteinA柱进行抗体纯化。具体步骤如下：
样品预处理：将表达抗体的细胞上清用500mL离心管，6000rpm，离心20min，弃沉淀，向上清中加入Na2HPO4.12H2O颗粒，搅拌溶解，调节溶液的pH至8.0～8.5，然后用0.4μm滤膜过滤，去除细胞碎片等杂质；
将AKTA出液口和进液口之间连接，清洗机器，将A、B管插入到0.2mol/LNaOH溶液(gradient：50％B)，流速设置为5～10mL/min，直到pH上升至10.6左右并保持稳定后停止进液。再将A、B管插入NaOH的部分用ddH2O冲洗干净，浸入ddH2O的瓶中(gradient：50％B)。流速仍为5～10mL/min，使pH降低，UV值至稳定状态。
流速调为2mL/min装柱，避免装柱过程中不能产生气泡。
柱平衡：将A管插入0.2mol/LNa2HPO4.12H2O溶液，B管插入0.1mol/L柠檬酸，gradient：100％B(100％柠檬酸)，流速5mL/min，使pH稳定至8.2～8.5，将UV值调零；
上样：将A管插入样品溶液中，gradient：0％B，流速5mL/min；
柱清洗：将A管口用ddH2O冲洗后，插入Na2HPO4.12H2O溶液中，gradient：5％B，流速6mL/min；
柱洗脱：gradient：75％B，流速不变，此时应注意UV峰值变化，如果出现迅速上升的情况，就可以收集样品，并预先在收集管中加入适量的Na2HPO4.12H2O固体颗粒；
再次平衡柱子，gradient：100％B，Flowrate：5mL/min；
纯化完后，将A、B管口用ddH2O冲洗后插入20％乙醇中，gradient：50％B，流速8mL/min。
备选抗体与抗原结合的ELISA验证：
Ki67 2ug/ml包被化学发光抗原板；
将纯化后的抗体用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度，稀释到20pg/ml；
用20％NBS进行抗体浓度梯度稀释，先将各抗体浓度调整到20pg/ml，按3倍比例稀释12个梯度；
取包被好的2ug/ml各种Ki67化学发光抗原板，分别加入不同稀释度的单B细胞测序经噬菌体筛选淘选后的表达的备选抗体，37℃反应1h，PBST洗板5次，加GAH-HRP酶标抗体(1:2000稀释)，37℃反应30min，PBST洗板5次，加入发光液，进行光强检测，分析结果，计算出每个抗体的EC50。结果如图10所示，后续表征方法均使用该数据中每种抗体EC50值最小的克隆型。
等电点分析：
全柱成像实时等电聚焦毛细管电泳:将样品稀释至10mg/mL,并取样品5μL与HRAESlyte3-10(1μL)、SHAES lyte2.5-5(3μL)、0.5％MC(40μL)、等电点标准品(7.03)(0.5μL)、等电点标准品(9.33)(0.5μL)混匀,之后以10000g离心2min,单次进样体积5μL。仪器参数:柱温25℃；阴极电极液:0.1mol/LNaOH；阳极电极液:0.08mol/L H3PO4；检测波长280nm。聚焦程序:1000V,1min；2000V,1min；3000V,4min。温度:25℃,电流<15uA。
离子交换色谱:以去离子水将样品稀释至1mg/mL,高速离心后取10μg进样。A相:10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)；B相:A+0.5mol/L NaCl(pH6.0),检测波长:280nm,流速0.6mL/min。采用SCX色谱柱。
梯度洗脱：
a)0～5.0min,0％B；
b)5.0～43.0min,0～25％B；
c)43.0～43.5min,25％～90％B；
d)43.5～48.5min,90％B；
e)48.5～55min,90％～0％B；
f)55～60min,0％B。
等电点结果如图11，结果表明蛋白在弱碱性的条件下稳定性较好。
糖型分析：
去糖基化步骤：使用PNGaseF将N-糖链从单克隆抗体上裂解下来。此酶可用于从糖蛋白上分离天冬酰胺连接的高甘露糖和复杂的混合型低聚糖，并且保持糖链的完整性。mAb有两个糖基化位点。需根据N-糖基化位点的数量调整PNGaseF的用量。
蛋白的去糖基化过程依据说明书，在37℃下反应3小时。然后停止反应，对样品真空干燥以进行进一步处理。
利用2-AB标记进行荧光检测及样品纯化根据实验步骤使用2-氨基苯酰胺对干燥的糖链样品进行标记，在65℃下反应3小时。标记过程完成后，根据说明书使用HILIC纯化小柱对样品进行纯化。
纯化步骤完成后，对样品进行真空干燥，并采用超纯水:乙腈30:70(v/v)复溶以便分析。扫描结果见图12，结果表明蛋白纯度较好。
实施例3抗人Ki67抗体的应用
免疫染色样本制备：
1、脱蜡至水
①将组织切片置于68℃的烤片机中，烤片时间一个小时。②将拷完切片迅速置入二甲苯中，浸泡10min；取出，置入第二缸二甲苯中，浸泡10min；③从二甲苯中取出切片置入无水乙醇中，浸泡3min；取出，置入第二缸无水乙醇中，浸泡3min；再依次置入90％、80％、70％酒精中梯度水化，各浸泡3min。
2、抗原修复--
①用蒸馏水润洗切片表面的酒精2次，尽量不残留酒精；②将切片置入已经在电饭煲(沸水浴)中预热充分的修复液缓冲液中，持续水浴煮沸20min，再将电饭煲切换至保温档保温10min；③取出修复盒，使其自然冷却至室温。
3、滴加过氧化氢
①用PH 7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3min；②将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上的PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液；
③将切片置于湿盒上，滴加2滴3％H2O2溶液，室温孵育10～15min。
4、滴加一抗
①将切片置于玻片架上，用PH 7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3min；②将切片从玻片架上取出，甩去PBS缓冲液；③将切片置于湿盒上，滴加CK(广谱)一抗，37℃孵育45min
5、滴加二抗
①将切片置于玻片架上，用PH 7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3min；
②将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上的PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液；③将切片置于湿盒上，滴加二抗，室温孵育30min。
6、DAB显色
①将切片置于玻片架上，用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3min；②配制DAB显色液：a液：b液按照比例配制；③将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上的PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液；④将切片置于白纸上，滴加DAB 60ul，室温下镜检显色。
7、苏木素复染
①将切片置于玻片架上，用自来水润洗切片表面的DAB溶液2次；②将切片置入苏木素染色缸中浸泡3min，取出，自来水洗去表面残留的苏木素；③将切片浸入1％盐酸酒精中分化，迅速取出，置入自来水中润洗2次，弃去洗液，自来水流水冲洗组织10min。
8、脱水封片
①将切片置入90％酒精中浸泡5min，取出；置入无水乙醇中，浸泡5min，取出；置入第二缸无水乙醇中，浸泡5min，取出；②用电吹风吹干残留组织表面的酒精，树脂封片。
9、阅片判读
免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异以及阳性率进行进一步划分，具体如下：①样本为低表达；标记为“+”；②样本为中度表达；标记为“++”；③样本为高度表达；标记为“+++”。④样本为阴性，标记为“-”。
染色结果：
将本ki-67和市售ki-67(克隆号sp2)在不同人体肿瘤组织芯片(包括91例肿瘤组织的检测，检测组织涉及食管、胃、结肠、直肠、肝、胰腺、肺、乳腺、肾、前列腺、卵巢、子宫、宫颈的组织芯片进行同步检测并比较检测结果。整个试验过程采取双盲设计，结果显示:本ki-67抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在免疫组化检测中，阳性率与市售抗体相当，但染色强度高于市售抗体，本ki-67抗体抗体染色强度高于市售ki-67(克隆号sp2)的染色强度，说明其敏感度更高，有效避免假阴性结果。
图13-16为食管癌、结肠癌、扁桃体和胎盘的免疫组化染色结果对比图(左为本ki-67染色结果，右为市售ki-67(克隆号sp2))。
正常组织芯片包括33种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。33种正常组织包括大脑、小脑、肾上腺、卵樂、肤腺、甲状旁腺、垂体、舉丸、甲状腺、乳臊、牌脏、扁桃体、胸腺、骨骼、肺、心肌、食道、胃、小肠、结肠、肝、涎腺、肾、前列腺、子宫内膜、宫颈、膀胱、骨骼肌、皮肤、外周神经、间皮、眼、喉。将本ki-67和市售ki-67抗体在正常组织芯片上进行同步检测，阴阳性检测结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种抗人Ki-67抗体，其特征在于，所述抗人Ki-67抗体包含轻链和重链，所述轻链包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述重链包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含编码权利要求1所述的抗人Ki-67抗体的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗人Ki67抗体中轻链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；和/或，编码所述抗人Ki67抗体中重链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
4.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含权利要求2-3任一所述的多核苷酸。
5.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求2-3任一所述的多核苷酸或权利要求4所述的核酸构建体。
6.权利要求1所述的抗人Ki-67抗体在制备Ki-67抗原检测产品中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述Ki-67抗原检测产品为肿瘤检测产品，所述肿瘤为实体瘤。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述实体瘤选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、肛门癌、视网膜母细胞瘤中的一种或多种。
9.一种肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述肿瘤诊断试剂盒包含诊断有效剂量的权利要求1所述的抗人Ki-67抗体或其免疫偶联物。
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