CN113667018B - 一种可以进入肿瘤细胞内的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

一种可以进入肿瘤细胞内的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可以进入肿瘤细胞内的BR2‑抗p21Ras单链抗体融合蛋白的序列、表达和纯化的制备方法及用途。本发明通过筛选不同的原核表达载体和菌株的组合，建立了最优的融合蛋白原核重组表达系统，并优化表达条件，使用发酵罐和AKTA层析系统建立了中试级别的表达及纯化工艺。本发明与现有技术相比，提高了融合蛋白的表达量和纯度，为规模化生产奠定了基础，同时该BR2‑抗p21Ras单链抗体融合蛋白能够进入肿瘤细胞内，与p21Ras蛋白结合，从而阻断ras信号通路，达到抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的目的。该BR2‑抗p21Ras单链抗体融合蛋白在制备治疗ras相关肿瘤制剂方面具有广泛的应用前景。

Description

一种可以进入肿瘤细胞内的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白 及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体的涉及一种可以进入肿瘤细胞内的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法。
背景技术
ras基因是一种重要的细胞原癌基因，其命名来自大鼠肉瘤的英文rat asrcoma。ras基因家族包括三个主要成员：H-ras，K-ras及N-ras，其分别定位于第12，11以及1号染色体，编码由188-189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质，三种Ras蛋白的氨基酸序列同源性为85％。
Ras蛋白作为极其重要的信号传导传递蛋白调节细胞的正常分化及增殖。Ras蛋白在合成后，其羧基端必须经过复杂的翻译后修饰，使其准确的定位于细胞膜的内侧面才能发挥其生物学功能。Ras蛋白在细胞外生长信号刺激下与GTP结合成为活性状态的Ras-GTP形式，从而激活Ras蛋白下游众多信号通道，促进细胞分裂，增生和恶性转化。
当ras基因发生突变或过表达时，与GTP结合成为活性状态，导致细胞恶性转化并促进恶性肿瘤细胞的浸润及转移。研究表明，大约30％的人类肿瘤中存在ras基因突变或ras基因的过表达。
利用基因工程技术构建的单链抗体是用柔性寡核苷酸片段连接完整抗体的可变区构建的线性片段，分子量只有完整抗体的1/6，渗透力强，在非靶向组织中滞留时间短、易从体内清除。而且由于没有全抗体的Fc片段，免疫源性低，用于人体几乎不会产生抗鼠抗体反应。这种抗体通过与细胞内特定蛋白的结合使其失活，阻断其与其他蛋白的相互作用，或干扰该蛋白的正常胞内定位，从而阻止其发挥正常生物学功能。
本发明利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从经过Ras蛋白免疫后的Balb/c小鼠脾B淋巴细胞中扩增获得其轻、重链可变区基因片段。通过重叠延伸PCR技术，将柔性寡核苷酸和所述两片段连接，构建出抗p21Ras蛋白的单链抗体基因片段。为了制备可以特异进入肿瘤细胞的抗p21Ras单链抗体，本发明在前期基础上将BR2穿膜肽和抗p21Ras单链抗体基因构建为融合表达基因，并对BR2-抗p21Ras单链抗体融合基因的密码子进行优化，将优化后的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因克隆至pET-32a原核表达载体，再将重组表达载体转入OrigamiB(DE3)大肠杆菌表达菌中，构建出BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白重组表达系统。经过一系列表达及纯化条件的摸索，制备出能够穿透肿瘤细胞膜、抑制肿瘤生长的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白。
发明内容
本发明的目的在于克服上述的不足，提供一种可以进入肿瘤细胞内的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
该BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白是由BR2穿膜肽、重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的融合多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间SEQ ID NO：2中第142-156位氨基酸序列。BR2穿膜肽序列位于SEQ ID NO：2中第1-17位氨基酸序列。
本发明的目的还在于提供了一种BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白重组表达质粒，该重组表达质粒由BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因克隆至原核表达质粒pET-32a的Kpn I和Hind III酶切位点之间而成。所述BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因如SEQ IDNO：1所示。
本发明的目的还在于提供了一种BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的原核表达系统，该原核表达系统由上述重组表达质粒转化到大肠杆菌表达菌OrigamiB(DE3)而成。
本发明的目的还在于提供了一种BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的发酵罐诱导表达条件，可以用于大规模发酵生产表达融合蛋白。
本发明的目的还在于提供了一种BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯化方法，即先超声破碎重组表达菌，离心收集以包涵体形式存在的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，经过包涵体洗涤液洗涤后，使用含8M尿素的变性剂使其变性，利用镍离子亲和层析柱和AKTA系统纯化变性后的包涵体融合蛋白，最后采用尿素梯度透析复性的方法使变性的融合蛋白重新折叠，恢复其生物活性，达到纯化蛋白的目的。
本发明所述BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能广谱拮抗H-Ras、K-Ras、N-Ras三种p21Ras蛋白；该融合蛋白能够穿透高表达神经节苷脂的肿瘤细胞的细胞膜从而进入肿瘤细胞内而无法穿透正常细胞的细胞膜进入正常细胞中，可用于ras基因相关肿瘤的诊断性研究、发病机制研究或治疗性研究。
本发明的上述目的通过如下方案实现：
本发明通过在抗p21Ras单链抗体的N端增加BR2肽序列，使其具有能够特异性穿透肿瘤细胞膜，从而与肿瘤细胞内的p21Ras蛋白结合，阻断ras信号通路的能力。
本发明通过优化了BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因的密码子，改变了原有融合蛋白的DNA序列，使其密码子序列更适合在大肠杆菌中表达，提高了BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白在大肠杆菌中的表达量。
本发明通过实验确定了BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的原核表达质粒和大肠杆菌表达菌株的最佳组合。
本发明通过实验确定了BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳诱导表达条件，并通过AKTA层析系统确定了镍离子亲和层析纯化BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳条件，进一步的提高了蛋白的表达量和蛋白纯度。
本发明所述的一种可以特异性进入肿瘤细胞内的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白的制备方法如下：
1.抗p21Ras单链抗体基因的构建
(1)利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从经过p21Ras蛋白免疫后的Balb/c小鼠脾B淋巴细胞多重扩增获得其轻、重链可变区基因片段。通过重叠延伸PCR，将柔性寡核苷酸链(linker)和所述两片段连接，构建出单链抗体基因片段。
(2)在单链抗体的基因片段两端分别引入不同的酶切位点并与同步双酶切的噬菌粒表达载体pCANTAB-5E连接，获得重组噬菌粒。将鉴定连接正确的重组噬菌粒转化大肠杆菌粒转化大肠杆菌TG1，用辅助噬菌体M13K07进行挽救，通过噬菌体展示技术将目的单链抗体基因片段与表达载体中的gIII基因融合表达并展示在噬菌体尾部表面，获得融合表达的单链抗体，通过间接ELISA实验对融合表达的单链抗体进行检测，筛选出表达抗p21Ras单链抗体的阳性重组噬菌粒。
(3)将筛选获得的阳性重组噬菌粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行可溶性表达，从而获得与E-tag标签融合表达的可溶性的抗p21Ras单链抗体，以该单链抗体为一抗，以E-tag抗体为二抗，采用间接ELISA实验和免疫细胞化学法检测目的单链抗体的特异性及亲和力，证实该单链抗体可特异性识别三种Ras蛋白。
2.BR2-抗Ras单链抗体融合蛋白重组表达载体的构建
由于此前构建的抗p21Ras单链抗体不能直接穿透细胞膜，因此对抗p21Ras单链抗体的DNA序列进行改进，在抗p21Ras单链抗体DNA序列的5’端添加了BR2穿膜肽的DNA序列，让BR2穿膜肽与抗p21Ras单链抗体在原核表达系统中融合表达，使得BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白可以穿透高表达神经节苷脂的肿瘤细胞的细胞膜，结合肿瘤细胞内的p21Ras蛋白，但不进入正常细胞中。同时对BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白DNA序列的密码子进行优化，以提高蛋白在大肠杆菌中的表达量。最后将优化后的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的DNA片段克隆至pET-32a原核表达质粒中，构建出了BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白重组表达质粒。
3.BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的表达及纯化工艺的建立
(1)BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白原核表达系统的构建：将上述BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白重组表达质粒转化到大肠杆菌OrigamiB(DE3)内，通过含氨苄霉素的LB平板筛选出阳性克隆，PCR鉴定确定阳性克隆含有BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因。
(2)BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白原核表达工艺的建立：在1L的三角摇瓶中，通过单因素变量设置诱导时间梯度和诱导方式等方面进行摇瓶表达条件的优化，确定了BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳诱导培养基及最适诱导表达条件。最后利用发酵罐在上述最适培养条件下发酵表达BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，建立BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的表达工艺。
(3)BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白纯化工艺的建立：收集诱导表达后的菌液，离心后超声破碎菌体，离心收集超声破碎后的沉淀包涵体蛋白；包涵体蛋白经过洗涤后，使用含尿素的变性剂使其变性；利用AKTA层析系统通过镍离子亲和层析柱纯化变性后的包涵体蛋白；采用尿素梯度，逐级透析复性使变性的包涵体蛋白重新折叠，恢复其生物学活性。
(4)BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的鉴定：用SDS-PAGE鉴定BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯度，通过分光光度计利用BCA法检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的浓度，并通过WB和ELISA检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的免疫学活性。
本发明所述的一种可以进入肿瘤细胞内的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，其对肿瘤细胞的抑制作用通过如下方法实现：
(1)通过免疫荧光实验检测融合蛋白对高表达神经节苷脂的肿瘤细胞的穿膜能力。
(2)用BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白进行体外抑瘤实验。通过MTT法检测融合蛋白对肿瘤的杀伤作用，细胞划痕实验检测融合蛋白对肿瘤迁移能力的影响，平板克隆检测融合蛋白对肿瘤增殖能力的影响，Transwell检测融合蛋白对肿瘤细胞侵袭能力的影响，TUNEL检测融合蛋白对肿瘤细胞的诱导凋亡作用。
本发明的有益成果：本发明创造性的将前期构建的抗p21Ras单链抗体与BR2穿膜肽融合，通过密码子优化使其能在大肠杆菌表达系统中大量表达，再经过一系列纯化得到了BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，使抗p21Ras单链抗体具备了穿透肿瘤细胞细胞膜的能力，从而使抗p21Ras单链抗体能够与肿瘤细胞内的p21Ras蛋白结合，进而阻断ras信号通路，达到抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡的目的。将BR2-抗p21Ras单链抗体融合基因进行密码子优化并分别克隆到pET-28a、pET-32a、pET-22b三个原核表达质粒中，再将三个重组表达质粒分别都转化到大肠杆菌BL21(DE3)、Origami(DE3)、OrigamiB(DE3)原核表达菌中，构建出9个BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白原核表达系统，并从中筛选出表达量最高的重组表达质粒和表达菌株组合。最后优化摇瓶及发酵罐的发酵条件，通过自诱导培养基在发酵罐中进一步提高了BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的产量，使得最终表达的蛋白产量达到了摇瓶IPTG/LB培养基诱导的12倍。最后利用AKTA系统通过实验摸索并确定了镍离子亲和层析的纯化参数，最终得到了纯度为90％的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白。本发明所确定的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白表达及纯化条件均可以线性放大，可以直接用于BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的工业化生产。BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白通过体外穿膜实验及体外抑制肿瘤细胞实验表明，BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能够特异性穿透高表达神经节苷脂的肿瘤细胞的细胞膜，并在体外可以显著抑制肿瘤细胞的迁移、增殖，并对肿瘤有杀伤及诱导凋亡作用，为今后肿瘤的治疗提供了一种新的靶向药物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过在前期获得的单链抗体基因的5’端添加BR2穿膜肽基因序列，使得抗p21Ras单链抗体能够特异性穿透肿瘤细胞的细胞膜，并能够与肿瘤细胞内的p21Ras蛋白结合，发挥阻断ras信号通路的作用。
(2)本发明通过原核表达系统获得了BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，本发明所制备的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白比现有技术(腺病毒携带抗p21Ras单链抗体基因)更易制备，更易工业化生产。
(3)本发明通过对BR2-抗p21Ras单链抗体融合基因的密码子进行优化，同时通过筛选不同的原核表达质粒和原核表达菌株的组合确定出了最佳的原核表达系统，并通过实验确定了诱导表达的最佳培养基及最适发酵条件，使BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的表达量与现有技术相比提高了45倍。
附图说明
附图1为本发明PCR鉴定重组原核表达菌中BR2-抗p21Ras单链抗体融合基因的电泳图；M:DL2000，泳道1:pET28a-BR2-p21Ras scfv/BL21(DE3)，泳道2:pET28a-BR2-p21Rasscfv/Origami(DE3)，泳道3:pET28a-BR2-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)，泳道4:pET22b-BR2-p21Ras scfv/BL21(DE3)，泳道5:pET22b-BR2-p21Ras scfv/Origami(DE3)，泳道6:pET22b-BR2-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)，泳道7:pET32a-BR2-p21Ras scfv/BL21(DE3)，泳道8:pET32a-BR2-p21Ras scfv/Origami(DE3)，泳道9:pET32a-BR2-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)；
附图2为本发明SDS-PAGE鉴定目的蛋白在不同诱导条件下表达量的电泳图；M:蛋白Marker，泳道1:自诱导条件下pET32a-BR2-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)重组菌中BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的表达量，泳道2:IPTG诱导条件下pET32a-BR2-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)重组菌中BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的表达量；
附图3为本发明通过SDS-PAGE检测纯化后目的蛋白纯度的电泳图；M:蛋白Marker，泳道1:镍离子亲和层析纯化后的包涵体BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白；
附图4为本发明WB检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白与肿瘤细胞中p21Ras蛋白的免疫反应性；M:蛋白Marker，1:人正常支气管上皮细胞BEAS-2B，2:人结肠癌细胞HCT116，3:人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH，4:人脑胶质瘤细胞U251；
附图5为本发明ELISA检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的效价；
附图6为本发明免疫荧光检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的穿膜效果；其中，红色信号为BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，蓝色信号为细胞核；
附图7为本发明MTT实验检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤作用，1：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人结肠癌HCT116细胞的杀伤作用，2：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的杀伤作用，3：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人脑胶质瘤U251细胞的杀伤作用，4：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人正常支气管上皮BEAS-2B细胞的杀伤作用；
附图8为本发明划痕实验检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞迁移能力的影响，1：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人结肠癌HCT116细胞迁移能力的影响，2：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞迁移能力的影响，3：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人脑胶质瘤U251细胞迁移能力的影响；
附图9为本发明克隆形成实验检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞增殖能力的影响，1：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人结肠癌HCT116细胞增殖能力的影响，2：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖能力的影响，3：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人脑胶质瘤U251细胞增殖能力的影响；
附图10为本发明Transwell实验检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞侵袭能力的影响，1：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人结肠癌HCT116细胞侵袭能力的影响，2：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞侵袭能力的影响，3：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对人脑胶质瘤U251细胞侵袭力的影响；
附图11为本发明TUNEL实验检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的结果，1：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的结果，2：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞凋亡的结果，3：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白诱导人脑胶质瘤U251细胞诱导凋亡的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：单链抗体基因片段的制备
1.1p21Ras蛋白免疫Balb/c小鼠：取5只鼠龄在6-8周的Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只注射100μg的本实验室经过原核表达纯化后的p21Ras-K蛋白(p21ras-K蛋白的制备方法参照论文《重组p21ras蛋白的表达、鉴定与纯化及其多克隆抗体的制备》)，初次注射加等量的完全弗氏佐剂，皮下5点注射。两周后进行第二次注射，剂量同第一次，加等量不完全弗氏佐剂，皮下5点注射。两周后进行第三次注射，剂量同第一次，不加佐剂，腹腔注射。两周后进行第四次注射，剂量同第一次，不加佐剂，腹腔注射。3天后取其脾脏，用10ml灭菌的D-Hank’s液冲洗研碎的脾脏。用滴管吸取培养皿内细胞的悬液，移入50ml离心管中，1000g离心10分钟，弃上清，沉淀即为所需要的小鼠脾B淋巴细胞。
1.2小鼠脾B淋巴细胞总RNA的提取和逆转录合成cDNA：将已分离得到的小鼠脾B淋巴细胞，使用传统的Trizol法提取总RNA。提取的具体步骤参照分子克隆指南(第三版)。提取出的RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟。结果显示提取的总RNA的28S、18S、5S亚基大小正确，条带清晰无明显杂带，可用于下游的反转录实验。反转录使用购自Fermentas公司的反转录试剂盒，具体步骤参见说明书操作。
1.3重叠延伸PCR合成单链抗体基因片段：扩增小鼠轻、重链可变区引物和重叠延伸PCR构建单链抗体的Linker引物等均使用购自GE healthcare公司的重组噬菌体抗体系统(Recombinant Phage Antibody System，RPAS)。首先在PCR管内加入下列试剂进行轻链可变区扩增：小鼠脾B淋巴细胞cDNA 4μl；10×PCR Buffer 5μl；dNTP(10mM)5μl；轻链引物混合液1μl；rTaq酶0.5μl；灭菌去离子水34.5μl。另一只PCR管内加入下列试剂进行重链可变区扩增：小鼠脾B淋巴细胞cDNA 4μl；10×PCR Buffer 5μl；dNTP(10mM)5μl；重链引物混合液1μl；rTaq酶0.5μl；灭菌去离子水34.5μl。将上述体系配制好后放入PCR仪经95℃，5分钟；(94℃30秒，55℃45秒，72℃1分钟，30个循环)；72℃10分钟，结束反应。将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟。结果显示扩增的重链可变区大小约为350bp，轻链可变区大小约330bp，与预期一致。
将大小正确的条带进行切胶纯化，胶回收的步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书操作；将纯化后的条带再次取2μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟，确定胶回收后DNA的质量和大致浓度。
用Linker引物连接扩增的轻重链可变区并在连接产物两端引入Sfi I和Not I酶切位点：通过重叠延伸PCR法用Linker混合物将纯化后的相同摩尔量的轻重链可变区片段进行连接，连接产物在RS Primers(酶切位点引物)作用下在重链的5’末端加上Sfi I限制性位点和轻链的3’末端加上Not I酶切位点，可用于后续与有相同酶切位点的表达载体pCANTAB-5E(购自Pharmacia公司)进行连接。具体步骤参照GE healthcare公司的RPAS系统说明书。PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，可见单链抗体条带大小约780bp，与预期一致，条带集中，清晰无杂带。目的条带进行切胶纯化及纯化后的浓度测定。对所构建好的单链抗体命名为抗p21Ras-ScFv。
1.4单链抗体基因片段的克隆：将构建出的单链抗体片段抗p21Ras-ScFv连入pMD-18T载体(购自TAKARA公司)，构建出pMD-ScFv重组质粒。在200μl PCR管中配制如下连接体系：pMD-18T载体1μl；目的片段DNA 0.1pmol-0.3pmol；Solution I补足10μl。金属浴16℃反应4小时。将连接产物加入到100μl DH5α感受态中，冰浴30分钟。42℃热激90秒后立即冰浴90秒。加入900μl LB液体培养基，37℃，80rpm，振荡培养1小时。取200μl培养物涂布于含有X-Gal的LB/Amp平板上37℃倒置培养10小时。
1.5菌液PCR鉴定阳性重组子：挑取LB/Amp平板上的单菌落，溶于50μl的ddH2O中，98℃热裂解10分钟后13000rpm离心1分钟，所得上清即为PCR的模板。在200微升PCR反应管内加入10×PCR Buffer 2.5μl；dNTP Mix(2.5mM each)2μl；M13F(10μM)0.5μl，M13R(10μM)0.5μl；菌液5μl；rTaq酶0.5μl；ddH2O 14μl。设置PCR反应程序为预变性94℃4分钟。(94℃1分钟，57℃1分钟，72℃1分钟，30个循环)，72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，可见在预期的930bp处出现条带，确定为阳性重组克隆。
实施例2：单链抗体库的建立及筛选鉴定
2.1重组噬菌粒的构建
2.1.1重组pMD-ScFv载体及表达载体的双酶切：将经PCR鉴定正确的阳性pMD-ScFv克隆提取质粒，提取步骤按天根质粒小提试剂盒说明书操作。将重组的pMD-ScFv质粒及表达载体质粒pCANTAB-5E(购自Pharmacia公司)分别先进行Sfi I酶切，在200μl PCR反应管内分别加入表达载体质粒/pMD-ScFv载体各30μl；Sfi I酶(10U/μl)4μl；10×Buffer M 5μl，ddH2O 11μl，上述体系配置好后50℃反应4小时。将酶切产物经过胶回收纯化后，在新的200μl PCR反应管中加入纯化产物30μl，Not I酶(10U/μl)2μl，10×Buffer H 5μl，BSA 2μl，Trion X-1002μl，ddH2O 9μl，上述体系配置好后37℃反应4小时。酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，重组的pMD-ScFv质粒双酶切后在780bp处出现目的条带，表达载体质粒双酶切后在3.5kb处出现目的条带。目的条带分别进行切胶纯化，步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书进行。
2.1.2重组表达载体的连接：将经过Sfi I和Not I同步双酶切后的表达载体pCANTAB-5E与ScFv目的片段按摩尔比1:5进行连接，从而构建出含有单链抗体基因的重组表达载体pCANTAB-ScFv。连接总体积为10μl，16℃反应4小时。将连接产物全部加入100μl的TG1感受态中，冰浴30分钟。42℃热激90秒后再冰浴90秒。加入900μl LB液体培养基，37℃，80rpm，振荡培养1小时。取200μl培养物涂布于LB/Amp平板上37℃倒置培养10小时。
2.1.3重组表达载体的鉴定：挑取LB/Amp平板上的单菌落，溶于50μl的ddH2O中，98℃热裂解10分钟后13000rpm离心1分钟，所得上清即为PCR反应的模板。PCR鉴定插入片段使用表达载体pCANTAB-5E的通用引物，S1F:CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC，S6R:GTAAATGAATTTTCTGTATGA-GG。在200微升PCR反应管内加入10×PCR Buffer 2.5μl；dNTPs(2.5mM each)2μl；S1F(10μM)0.5μl，S6R(10μM)0.5μl；菌液5μl；rTaq酶0.5μl；ddH2O 14μl。设置PCR反应程序为预变性94℃4分钟。(94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，30个循环)，72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，可见在预期的950bp处出现条带。将重组表达载体pCANTAB-ScFv进行Sfi I和Not I分步双酶切，在3.5kb和780bp处有酶切条带，则确认为阳性重组克隆。
2.2噬菌体抗体库的富集和筛选
2.2.1噬菌体抗体库的富集：按细菌数量与辅助噬菌体数量1:20的比例加入辅助噬菌体M13K07(购自GE healthcare公司)于鉴定为阳性含有pCANTAB-ScFv的重组子菌液内，放恒温摇床内37℃，150rpm，培养2小时。当看到液体变浑浊时，放入离心机内，室温下1500g离心25分钟，弃上清。用2×YTAK液重悬沉淀，37℃，200rpm，过夜振荡培养。所得的液体即为经过富集后的噬菌体培养液。
2.2.2间接ELISA法筛选单链抗体的特异性：将所得培养液室温下低速离心25分钟，吸取上清，上清内加入1/5体积的10％脱脂奶粉封闭液，室温下放置10分钟。用PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将p21ras-H、N、K蛋白分别稀释至5μg/ml，在每个酶标板孔内加入100μl稀释后蛋白液，4℃冰箱内过夜包被。第二天弃孔内液体，每孔加入0.15M PBS-Tweenz(磷酸盐-吐温)洗涤缓冲液300μl，置振荡摇床上振摇3分钟，弃孔内液体，重复洗涤3次。每孔加入1％BSA-PBS封闭液100μl，置37℃恒温培养箱内孵育1小时，洗板三次。每孔加入100μl适当稀释的融合表达的单链重组噬菌体克隆上清为一抗，置湿盒内37℃恒温孵育1小时后洗板三次，同时设置空白、阴性、阳性对照。每孔加入1:2000稀释的酶标二抗(HRP标记的抗M13g8p蛋白)100μl新鲜配制的TMB(四甲基联苯胺)底物液，避光作用5-10分钟，当阳性对照明显呈蓝色而空白、阴性对照呈无色时即可每孔加入2M H2SO4 50μl终止反应。使用酶标仪读取OD450值，凡待测孔值/阴性对照孔值≥2即为阳性。
2.3单链抗体的可溶性表达及鉴定
2.3.1单链抗体的可溶性表达：将经过ELISA筛选出的含有阳性重组噬菌体的菌液重新扩大培养至OD600≈0.8。将培养好的菌液提取质粒，步骤按QIAGEN质粒小提试剂盒说明书进行。将3μl各个质粒分别转化至100μl BL21(DE3)感受态中。挑取阳性单克隆接于5ml的LB/Amp液体培养基中培养，取前一次的培养菌液按1/100比例加入到1L新的LB/Amp液体培养基中培养至OD600≈0.8。收集培养后的菌体，用灭菌PBS缓冲液重悬菌体，加入100U/μl溶菌酶使溶菌酶终浓度达到1U/μl，室温放置15分钟，4℃，12000rpm，离心30分钟后收集上清。
2.3.2可溶性表达单链抗体的鉴定
2.3.2.1 SDS-PAGE确定单链抗体的相对分子量：在上一步所得的上清中加入一定量的2×SDS上样缓冲液，使蛋白的终浓度为3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加热10分钟，冷却后即可上样进行电泳。电泳完毕，取出分离胶放在盛有去离子水的容器中，加热沸腾后取出。加入快速染色液浸没分离胶即可，在脱色摇床上摇10分钟，当蛋白条带已可见时弃染色液。再次加入约50ml的水，加热沸腾2分钟，停止加热继续在脱色摇床上摇30分钟后观察结果。结果可见在30KDa处出现目的条带，与预期一致。
2.3.2.2免疫细胞化学法检测可溶性表达的单链抗体与肿瘤细胞株的结合特异性及敏感性：采用人肝癌细胞株HepG2，人肝癌细胞株QGY-7703，人胃癌细胞株BGC-853，人胃癌细胞株MKN-28，人结肠直肠癌细胞株HCT116，人卵巢癌细胞株SKOV3，人宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人乳腺癌细胞株MCF-7共10种肿瘤细胞株；将呈对数生长期的10种肿瘤细胞株收集于离心管内，离心弃上清，用生理盐水重悬细胞沉淀，离心弃上清，用95％乙醇重悬细胞沉淀，离心后让细胞沉淀在95％乙醇中固定3小时，小心取出肿瘤细胞沉淀块按常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化及高压抗原修复后，加入制备的可溶性单链抗体作为一抗，抗E-tag抗体作为二抗(购自Abcam公司)，通过SP法检测肿瘤细胞表达p21ras蛋白的情况。结果显示制备的可溶性单链抗体可与上述所有肿瘤细胞株呈不同程度的阳性反应，显示了良好的广泛的抗肿瘤细胞株谱系。
2.4将鉴定结果正确的单链抗体进行测序：将可溶性表达结果正确含有单链抗体基因重组pMD-ScFv载体的菌液送测序公司测序，DNA测序结果表明单链抗体的基因序列排列方式为VH-Linker-VL，与小鼠免疫球蛋白可变区序列数据库Kabat比对后发现序列符合小鼠轻重链可变区基因结构，具体序列见SEQ ID NO：5。
实施例3:BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的制备
3.1 BR2-抗p21Ras单链抗体的重组原核表达质粒的设计及构建
将上一步得到的抗p21Ras单链抗体基因序列的5’端直接添加BR2基因序列(序列见SEQ ID NO：6)，最终得到BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的基因序列，具体序列见SEQID NO：7。将BR2-抗p21Ras单链抗体融合基因序列通过在线网站(http://www.jcat.de/)按照大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化，优化后的序列(具体序列见SEQ ID NO：1)送昆明擎科生物科技有限公司进行化学合成，同时在一条序列的5’端添加Nde I，3’端添加HindIII酶切位点，另一条序列在5’端添加Kpn I，3’端添加Hind III酶切位点，合成两条末端带有不同酶切位点的BR2-抗p21Ras单链抗体融合基因。并将两端含有Nde I和Hind III酶切位点的BR2-抗p21Ras单链抗体融合基因分别克隆至pET-28a(+)和pET-22b原核表达质粒中，将两端含有Kpn I和Hind III酶切位点的BR2-抗p21Ras单链抗体融合基因克隆至pET-32a原核表达质粒中，构建出3种含BR2-抗p21Ras单链抗体融合基因的重组原核表达质粒，此部分由昆明擎科生物科技有限公司完成。重组原核表达质粒构建完成后经测序鉴定正确进行后续实验。
3.2重组原核表达菌的构建
3.2.1 BL21(DE3)重组表达菌的构建
将三种重组质粒分别转化BL21(DE3)感受态，操作步骤同大肠杆菌DH5α转化。分别向完成重组质粒转化的BL21(DE3)重组表达菌中加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm摇床复苏培养60min。吸取200ul的pET-28a(+)重组质粒/BL21(DE3)复苏液均匀涂布到含有50μg/ml卡那抗性的LB固体培养平板上；分别吸取200ul的pET-32a重组质粒/BL21(DE3)和pET-22b重组质粒/BL21(DE3)复苏液分别均匀涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB固体培养平板上。倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养观察菌体生长情况。待有单克隆菌长出时，挑取BL21重组单克隆在LB液体培养基中进行扩增，随后行PCR鉴定阳性克隆。PCR反应体系为：重组菌液5μl，rTaq DNA聚合酶0.25ul，10×PCR buffer 2.5ul，dNTP Mixture2ul，正向引物F1 1ul，反向引物R1 1ul，ddH2O 13.25ul，总体积25ul。反应条件如下：94℃，5min；(94℃，50s；55℃，1min；72℃，45s；共30个循环)；72℃，10min。测序鉴定序列无突变进行后续实验。PCR鉴定结果见说明书附图1。
3.2.2 Origami(DE3)重组表达菌的构建
将三种重组质粒分别转化Origami(DE3)感受态，操作步骤同大肠杆菌DH5α转化。分别向完成重组质粒转化的Origami(DE3)重组表达菌中加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm摇床复苏培养60min。吸取200ul的pET-28a(+)重组质粒/Origami(DE3)复苏液均匀涂布到含有50μg/ml卡那抗性的LB固体培养平板上；分别吸取200ul的pET-32a重组质粒/Origami(DE3)和pET-22b重组质粒/Origami(DE3)复苏液分别均匀涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB固体培养平板上。倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养观察菌体生长情况。待有单克隆菌长出时，挑取Origami(DE3)重组单克隆，进行PCR及测序鉴定，步骤同上。PCR鉴定结果见说明书附图1。
3.2.3 OrigamiB(DE3)重组表达菌的构建
将三种重组质粒分别转化OrigamiB(DE3)感受态，操作步骤同大肠杆菌DH5α转化。分别向完成重组质粒转化的OrigamiB(DE3)重组表达菌中加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm摇床复苏培养60min。吸取200ul的pET-28a(+)重组质粒/OrigamiB(DE3)复苏液均匀涂布到含有50μg/ml卡那抗性的LB固体培养平板上；分别吸取200ul的pET-32a重组质粒/OrigamiB(DE3)和pET-22b重组质粒/OrigamiB(DE3)复苏液分别均匀涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB固体培养平板上。倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养观察菌体生长情况。待有单克隆菌长出时，挑取OrigamiB(DE3)重组单克隆，进行PCR及测序鉴定，步骤同上。PCR鉴定结果见说明书附图1。
3.3 BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的诱导表达
3.3.1摇瓶确定诱导表达BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳组合及条件
3.3.1.1筛选BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳组合
分别将转化成功的重组表达菌，挑取单克隆菌至LB液体培养基中培养。按照1:100的比例，把菌液接种到1L的摇瓶中，37℃，200rpm摇床培养至OD600约0.6左右，加入过滤除菌的诱导剂IPTG至终浓度为0.8mM，在37℃，160rpm的条件下，诱导6h表达目的蛋白，最后SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况。结果表明：BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的表达量在pET-32a/OrigamiB(DE3)的组合中远高于其它组合。因此选择该重组表达菌诱导表达目的蛋白。此外，分别比较了不同菌株可溶性上清和包涵体沉淀中目的蛋白的表达情况，发现无论在哪种组合的表达菌中，BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白大多以包涵体的形式存在，可溶性上清很少，因此后续实验均收集包涵体形式的目的蛋白。
3.3.1.2确定BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白在IPTG/LB培养基中的最适表达条件
挑取pET32a-BR2-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)单克隆菌至LB液体培养基中培养。按照1:100的比例，把菌液接种到1L的摇瓶中，37℃，200rpm摇床培养至OD600约0.6左右，加入过滤除菌的诱导剂IPTG至终浓度为0.8mM，在37℃，160rpm的条件下，设置诱导时间梯度分别为4h、6h、8h、10h、12h、20h，诱导表达目的蛋白。最后SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况。结果显示当诱导时间在6h时目的蛋白条带最宽，表明目的蛋白表达量最高。
3.3.1.3自诱导培养基诱导表达BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白
按照表1配方配制自诱导培养基，按1:100的接种率接种pET32a-BR2-p21Rasscfv/OrigamiB(DE3)重组表达菌。37℃摇床培养，将菌液培养至OD≈0.6左右，然后降温至20℃，200rpm震荡培养20h，用来诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。结果表明摇瓶自诱导表达的重组表达菌的菌体重量达到7.4g/L。与IPTG/LB培养基诱导的最佳条件相比，自诱导培养基诱表达的目的蛋白条带比IPTG/LB培养基诱导的目的蛋白宽很多，自诱导培养基诱导表达的目的蛋白表达量是IPTG/LB培养基的3.5倍左右。自诱导培养基和IPTG/LB培养基诱导表达目的蛋白的对比结果见说明书附图2。
表1自诱导培养基配方
Figure BDA0003210456330000131
3.3.2发酵诱导表达BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白
利用自诱导培养基，确定发酵罐放大诱导表达BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳条件。取pET32a-BR2-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)二级种子液按1:50的比例接种于60L自诱导培养基中，按前期摸索的培养和表达条件发酵。以37℃，200rpm培养8h完成菌体扩增，再以20℃，200rpm的条件下诱导表达18h，通过流加乳糖、蛋白胨和酵母粉进行补料，期间通过流加氢氧化钠和30％的磷酸将pH控制在7.2左右。发酵完成后离心收集菌体，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。结果显示通过发酵诱导表达的重组表达菌菌体的产量可以达到26.464g/L，是摇瓶自诱导表达菌体产量的3倍。表明中试发酵规模诱导条件成功建立，建立了稳定高效的pET32a-BR2-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)重组表达菌的发酵工艺。
3.4 BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯化
3.4.1包涵体蛋白的收集
离心收集的每克菌体中加入10ml洗菌液(20mM Tris-HCl,pH8.0)，4℃重悬洗菌10min后，以12000rpm离心15分钟。弃上清，收集菌体，每g菌体加入30ml超声缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA，5％甘油，0.1mmol/L DTT，0.1mol/L NaCl)重悬，冰上超声破碎，功率60％，超声5s,间隔5s，冰上超声30min。在上述超声裂解物加入纯的TritonX-100至1％(V/V)，以分解细胞膜和溶解膜蛋白。冰上孵育10min，然后12000rpm离心15min，收集的沉淀即为包涵体。包涵体沉淀用每克30ml超声裂解缓冲液重悬12000rpm离心除去TrintonX-100。得到的沉淀为洗涤后的包涵体。沉淀用约2倍体积的20mM，pH＝8，Tris-HCl重悬，12000g离心去上清，以去除EDTA。
3.4.2 BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的亲和层析
每1g包涵体沉淀加入10ml平衡缓冲液(10mM咪唑/1X PBS)悬浮混匀，室温震荡，30min-60min，至包涵体沉淀完全溶解，4℃，12000g，离心20min，弃沉淀，收集上清液。
利用AKTA explorer 100蛋白纯化系统完成BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯化。取Xk30/20层析柱，其内径为2cm，高为30cm。将25ml的Ni Sepharose 6FF/HP层析填料装入柱中。设流速为8ml/min，用3个柱体积的平衡缓冲液平衡镍柱后，将含有包涵体蛋白的平衡缓冲液向镍柱上样，保持压力低于0.4MPa。上样结束后用20倍柱体积的洗涤缓冲液(25mM咪唑/1X PBS)洗涤杂蛋白。当冲洗到流出液OD值小于0.01时，用5倍柱体积的洗脱缓冲液(250mM咪唑/1X PBS)洗脱目的蛋白并收集柱中的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，使用BCA蛋白试剂盒(碧云天，P0012)测定BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的浓度为2.1mg/ml，最终从1L菌液中可纯化到24.3mg的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白。
3.4.3 BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的透析复性
洗脱下来的目的蛋白，需通过尿素梯度复性，去除尿素洗脱物中的尿素，使其正确折叠。透析袋的预处理，根据透析袋说明书把透析袋剪成适当长度，在500ml含有2％NaHCO3和1mmol/L的EDTA(pH＝8)中将透析袋煮沸10min，然后用蒸馏水彻底清洗透析袋。透析复性(蛋白液:透析液＝1:100体积比)，透析顺序从复性液1开始，每次透析6小时，使用磁力搅拌器在4℃下进行透析复性，待透析复性液Ⅳ时透析复性结束，透析复性缓冲液的配方见表2。将蛋白在0.01M PBS缓冲液继续透析6小时，回收蛋白，利用BCA法测定蛋白浓度，具体操作步骤参考说明书，过滤除菌后冻存在-20℃。
表2透析复性液
Figure BDA0003210456330000141
3.4.4 BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的鉴定
3.4.4.1 SDS-PAGE鉴定BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯度
参照BCA蛋白试剂盒(碧云天，P0012)说明书的步骤测定纯化后目的蛋白的浓度。然后根据目的蛋白的浓度，进行SDS-PAGE电泳，鉴定纯化后的目的蛋白的纯度。结果显示经过镍离子亲和层析柱纯化并透析复性后的BR2-抗p21Ras-单链抗体融合蛋白分子量与理论值大小一致，与纯化前相比，重组蛋白经镍柱纯化后杂蛋白条带明显减少，纯度约达90％以上(结果见说明书附图3)。
3.4.4.2 WB检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白与肿瘤细胞中p21Ras蛋白的结合能力
当人正常支气管上皮细胞BEAS-2B、人结肠癌HCT116细胞、人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞和人脑胶质瘤U251细胞在T75细胞培养瓶中生长达80％时，消化后离心，弃上清，加入200ul细胞裂解液冰上裂解细胞30min，离心取上清20ul与5x的上样缓冲液混合，98℃中加热15min。样本制备好后进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后，使用转膜仪将蛋白条带转至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭1h，分别加入TBST稀释的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白100ul(0.5mg/ml,1:800)作为一抗、TBST稀释的抗β-actin抗体100ul(1:2000)，4℃过夜孵育。再分别加入二抗：TBST稀释的带辣根过氧化物酶标记的小鼠抗His-tag抗体100ul(1:4000)、TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体100ul(1:2000)，37℃孵育2h。最后使用DAB显色并观察结果，WB结果显示透析复性后BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能够与上述肿瘤细胞中的p21Ras蛋白结合，但因为正常细胞中几乎不表达p21Ras蛋白，所以在正常细胞系BEAS-2B的总蛋白中没有阳性条带(结果见说明书附图4)。
3.4.4.3 ELISA检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的效价
用pH为9.6的包被液将N-Ras抗原稀释至终浓度为5ug/ml，在96孔板中的每个孔中加入100ul已经稀释过的抗原，在4℃过夜铺板。第二天弃掉孔内缓冲液，使用吸水纸拍干，每孔再次加入300ul的ELISA洗涤液(0.5％吐温/0.1M PBS)洗板三次。96孔板的各孔中加入100ul的1％BSA-PBS封闭液进行封闭，置于37℃恒温培养箱内孵育约1小时。洗板后每孔中加入BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白。按照不同比例稀释(1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200)，37℃恒温培养箱孵育1h。洗涤后加100ul已经按照1:4000比例稀释的抗His标签抗体，之后置于37℃的恒温培养箱孵育1小时。洗板后每孔加入100ul已经按照1:2000比例稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，置于37℃恒温的培养箱内孵育40-60min。各孔加入100ul TMB试剂，将96孔板置于暗处(此步骤需要避光操作)反应15-20分钟，当阳性实验组孔内变为蓝色时，而空白及阴性对照组的孔内无明显的颜色变化时即终止反应。加入50ul的终止液终止显色反应，酶标仪在波长450nm下进行吸光值的检测。
ELISA结果显示0.5mg/ml的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白与N-Ras蛋白的结合效价为1:800，BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白可以与N-Ras抗原发生免疫反应(结果见说明书附图5)。说明经镍柱纯化，透析复性后的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白具有免疫学活性。
实施例4:BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的体外抗肿瘤活性研究
4.1免疫荧光检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞的穿膜能力
制作人结肠癌HCT116细胞、人脑胶质瘤U251细胞、人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞和人正常支气管上皮BEAS-2B细胞的细胞爬片，Triton透化细胞，在爬片上加BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白37℃孵育1小时，后PBS清洗。在爬片上加鼠抗His标签的抗体37℃孵育1小时。清洗后爬片上加罗丹明标记的山羊抗鼠IgG抗体(购自中杉金桥公司)，在37℃的环境下处理40min。清洗后加入DAPI(购自Solarbio公司)对爬片上的细胞核染色，荧光显微镜下观察，可见BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能够进入上述肿瘤细胞内，定位于细胞胞浆，而BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白没有进入正常的BEAS-2B细胞，表明BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白具有特异性穿透肿瘤细胞膜的能力，结果见说明书附图6。
4.2 MTT检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤能力
将人正常支气管上皮BEAS-2B细胞、人结肠癌HCT116细胞、人脑胶质瘤U251细胞、人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞，用含10％胎牛血清的完全培养液制成单细胞悬液，按照每孔细胞数1000-10000接种到96孔板，体积100ul，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中过夜培养。当细胞贴壁长至70％左右时，实验组分别加入终浓度为0uM、1uM、2uM、5uM的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，对照组加入终浓度分别为0uM、1uM、2uM、5uM的BR2蛋白和等体积PBS。连续培养三天，每组细胞每天取3个复孔在每孔中加MTT溶液20μl，37℃继续孵育4h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。室温下15-20min(紫红色溶液)后测量。在酶联免疫监测仪上490nm波长测定各孔光吸收值，记录结果绘制细胞生长曲线。
结果显示：三种肿瘤细胞与BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白共培养24h后，细胞活力较BR2对照组或PBS空白对照组明显降低，加入BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的正常细胞的细胞活力与BR2及PBS对照组基本无差异。同时当药物浓度为2uM时，肿瘤细胞生长抑制明显，与对照组相比由统计学差异。而5uM浓度的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白组虽然比2uM浓度的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白组肿瘤细胞的细胞活力更低，但是无统计学差异，故后续实验BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的终浓度均设置为2uM，结果见说明书附图7。
4.3细胞划痕检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞迁移能力的影响
将人结肠癌HCT116细胞、人脑胶质瘤U251细胞、人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分别按照每孔2ml培养基含有5×105个细胞铺置在6孔板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中过夜培养。24h后当细胞融合率到达100％时，取出细胞在超净工作台中用200ul的枪头垂直划横，并每种细胞分为三个组，实验组中加入终浓度为2uM BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，对照组分别加入终浓度为2uM BR2和等体积PBS。分别在0h、24h、48h显微镜下观察细胞划痕后的愈合情况并拍照。结果显示：与BR2、PBS对照组比较，BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白明显抑制了肿瘤细胞的迁移。说明BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白不仅能穿透肿瘤细胞膜，且能够抑制肿瘤细胞的迁移能力，而单独的BR2没有抑制迁移的作用，结果见说明书附图8。
4.4平板克隆检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞增殖能力的影响
为了检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白是否能抑制ras驱动的肿瘤细胞的增殖，分别将人结肠癌HCT116细胞、人脑胶质瘤U251细胞、人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞按照每孔2ml培养基含100个细胞铺置在6孔板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中过夜培养。当细胞贴壁后，每种细胞分为三个组，实验组中加入终浓度为2uM BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，对照组分别加入终浓度为2uM BR2和等体积PBS。培养2周后培养板中出现肉眼可见的克隆时终止培养，然后弃去6孔板种的培养液，用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)清洗2次，之后加入3ml甲醇固定15min-30min。弃去固定液，加适量姬姆萨工作液染色30min，然后用PBS缓慢洗去染色液，空气干燥。在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。克隆形成率(％)＝(克隆数目/接种细胞数)×100％。
结果显示：在肿瘤细胞中，对照组BR2的克隆形成率少于空白对照组PBS，多于实验组BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的克隆形成率，BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的克隆形成率明显少于PBS空白对照组。说明BR2和BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白均能抑制结肠癌HCT116细胞、神经母细胞瘤SK-N-SH细胞、脑胶质瘤U251细胞克隆形成的能力，但是BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的抑制能力更强，结果见说明书附图9。
4.5 Transwell检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞侵袭能力的影响
将人结肠癌HCT116细胞、人脑胶质瘤U251细胞、人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞以5×104个/孔接种在6孔板中，待细胞贴壁率达到80％时，实验组加入2uM的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，对照组分别加入2uM的BR2及等体积的PBS，继续置于37℃、5％CO2培养箱进行培养。用无血清的培养液将基质胶稀释后加入Transwell侵袭小室上层(60μl/孔)，37℃放置30min待基质胶聚合。取200ul细胞悬液(约1×105个细胞)加入已被基质胶包被的侵袭小室上层，在侵袭小室下层加入500ul含10％FBS的高糖DMEM培养液，将24孔Transwell板置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养24小时后。将侵袭小室从培养板中取出，棉签轻轻擦去微孔膜上层细胞，甲醇固定微孔膜下层细胞15min，姬姆萨染色，甲醇、蒸馏水漂洗，室温晾干后，在倒置显微镜下计数侵袭到多孔滤膜下层的细胞，结果取随机5个视野侵袭细胞数的平均值。
结果显示：在三种肿瘤细胞中，与对照组BR2、空白对照PBS相比，实验组BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的侵袭细胞数明显减少。说明BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白可以抑制人结肠癌HCT116细胞、人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞和人脑胶质瘤U251细胞的侵袭能力，结果见说明书附图10。
4.6 TUNEL检测BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞凋亡的影响
分别将人结肠癌HCT116细胞、人脑胶质瘤U251细胞、人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞按105个细胞/张的数量制作成细胞爬片，分别与终浓度为2uM BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白、BR2蛋白及PBS共培养，然后检测重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡(roche，In situ celldeath detection kit)的情况。TUNEL结果显示，在三种肿瘤细胞中，与对照组BR2、空白对照组PBS相比，BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白组的细胞凋亡率明显增加。表明BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能够促进人结肠癌HCT116细胞、人脑胶质瘤U251细胞、人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的凋亡，结果见说明书附图11。
综上所述，实施例4的结果表明BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对ras驱动的肿瘤细胞有较好的体外抑瘤活性。
序列表
<110>
<120> 一种可以进入肿瘤细胞内的 BR2-抗 p21Ras 单链抗体融合蛋
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtgctggtc tgcagttccc ggttggtcgt ctgctgcgtc gtctgctgcg tatggctcag 60
gttaaactgc aggaatctgg tgaaggtctg gttaaaccgg gtggttctct gaaactgtct 120
tgcgctgctt ctggtttcac cttctctgac tactacatgt actgggttcg tcagaccccg 180
gaaaaacgtc tggaatgggt tgctatcatc tctgacggtg gttcttacac ctactacccg 240
gactctgtta aaggtcgttt caccatctct cgtgacaaca ccaaaaaaaa cctgtacctg 300
cagatgtctt ctctgcgttc tgaagacacc gctatgtact actgcgctcg tgacccgcac 360
tactctggtt cttctcgtct gttcgttaac tggggtcagg gtactaccgt taccgtttct 420
tctggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggtggtg gtggttctga catcgaactg 480
acccagtctc cggcttctct ggctgtttct ctgggtcagc gtgctaccat ctcttaccgt 540
gcttctaaat ctgtttctac ctctggttac tcttacatgc actggaacca gcagaaaccg 600
ggtcagccgc cgcgtctgct gatctacctg gtttctaacc tggaatctgg tgttccggct 660
cgtttctctg gttctggttc tggtactgac ttcaccctga acatccaccc ggttgaagaa 720
gaagacgctg ctacctacta ctgccagcac atccgtgaac tgacccgttc tgaaggtggt 780
ccgtcttggc agatcaaacg t 801
<210> 2
<211> 801
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ile Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys
85 90 95
Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro His Tyr Ser Gly Ser Ser Arg Leu Phe
115 120 125
Val Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr
165 170 175
Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
180 185 190
Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu
225 230 235 240
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg
245 250 255
Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Gln Ile Lys Arg
260 265
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caacgtgaaa aaattattat tcgc 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtaaatgaat tttctgtatg a 21
<210> 5
<211> 750
<212> DNA
<213> Balb/c小鼠(Mus musculus)
<400> 5
atggcccagg tgaagctgca ggagtctggg gaaggcttag tgaagcctgg agggtccctg 60
aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtgact attacatgta ttgggttcgc 120
cagactccgg aaaagaggct ggagtgggtc gcaatcatta gtgatggtgg tagttacacc 180
tactatccag acagtgtgaa ggggcgattc accatctcca gagacaatac caagaaaaac 240
ctgtacctgc aaatgagcag tctgaggtct gaggacacag ccatgtatta ctgtgcaaga 300
gatccccatt actccggtag tagccgcctg tttgttaact ggggccaagg caccacggtc 360
accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggac 420
atcgagctca ctcagtctcc agcttcctta gctgtatctc tggggcagag ggccaccatc 480
tcatacaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tctggctata gttatatgca ctggaaccaa 540
cagaaaccag gacagccacc cagactcctc atctatcttg tatccaacct agaatctggg 600
gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 660
gtggaggagg aggatgctgc aacctattac tgtcagcaca ttagagagct tacacgttcg 720
gaggggggac caagctggca aatcaaacgg 750
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgtgctggtt tacaatttcc tgttggccgc ttgcttcgac ggctcctaag a 51
<210> 7
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgtgctggtt tacaatttcc tgttggccgc ttgcttcgac ggctcctaag aatggcccag 60
gtgaagctgc aggagtctgg ggaaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt attgggttcg ccagactccg 180
gaaaagaggc tggagtgggt cgcaatcatt agtgatggtg gtagttacac ctactatcca 240
gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaata ccaagaaaaa cctgtacctg 300
caaatgagca gtctgaggtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag agatccccat 360
tactccggta gtagccgcct gtttgttaac tggggccaag gcaccacggt caccgtctcc 420
tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catcgagctc 480
actcagtctc cagcttcctt agctgtatct ctggggcaga gggccaccat ctcatacagg 540
gccagcaaaa gtgtcagtac atctggctat agttatatgc actggaacca acagaaacca 600
ggacagccac ccagactcct catctatctt gtatccaacc tagaatctgg ggtccctgcc 660
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcaccctca acatccatcc tgtggaggag 720
gaggatgctg caacctatta ctgtcagcac attagagagc ttacacgttc ggagggggga 780
ccaagctggc aaatcaaacg g 801
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgtgctggtc tgcagttccc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acgtttgatc tgccaagacg 20

Claims (4)

1.一种编码BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的DNA分子或基因，其特征在于：编码BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种原核重组表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述的DNA分子或基因，并将编码BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的基因克隆至原核表达载体pET-32a的KpnI和Hind III限制性内切酶识别位点之间。
3.一种原核重组表达菌株，其特征在于：它由权利要求2所述的原核重组表达载体经过化学转化或电转化至大肠杆菌OrigamiB（DE3）感受态中而成，并能够表达BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白。
4.一种制备BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：a）将权利要求1所述BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因按照大肠杆菌宿主细胞的密码子偏好进行密码子优化后，克隆至原核表达载体pET-32a中，构建重组原核表达载体；b）将步骤a）所述重组原核表达载体转化宿主细胞OrigamiB（DE3）感受态中；c）通过自诱导培养基在发酵罐中诱导重组原核表达菌株表达BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，发酵条件为：取pET32a-BR2-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)二级种子液按1:50的比例接种于60L自诱导培养基中，以37℃、200rpm培养8h完成菌体扩增，再以20℃，pH7.2左右，200rpm的条件下诱导表达18h，期间通过流加乳糖、蛋白胨和酵母粉进行补料；d）离心收集菌体，使用超声缓冲液重悬菌体，冰上超声30min，在超声裂解物加入纯的TritonX-100至终浓度为1％（V/V），冰上孵育10min，然后离心收集包涵体沉淀，并洗涤包涵体去除杂质，最后用平衡缓冲液溶解包涵体沉淀，离心收集上清液；e）利用AKTA层析系统采用镍离子亲和层析从上一步的包涵体溶解上清中分离纯化BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，纯化条件为：用Xk30/20层析柱，其内径为2cm，高为30cm，将25ml的Ni Sepharose 6 FF/HP 层析填料装入柱中，设流速为8ml/min，用3个柱体积的平衡缓冲液平衡镍柱后，将含有包涵体蛋白的平衡缓冲液向镍柱上样，保持压力低于0.4MPa，上样结束后用20倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤杂蛋白，洗涤缓冲液配方为25mM咪唑/1X PBS，当冲洗到流出液OD值小于0.01时，用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白并收集柱中的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，洗脱缓冲液配方为250mM咪唑/1X PBS，并通过梯度透析和复性使融合蛋白恢复免疫学活性。
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