CN114277072B - 一种基于kras蛋白的核苷酸交换方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于KRAS蛋白的核苷酸交换方法。本发明中的核苷酸交换方法是在碱性磷酸酶的作用下，严格控制反应时间，按照一定的比例加入GTP类似物，将KRAS蛋白中的核苷酸GDP替换为GTP类似物。最终得到KRAS蛋白与GTP类似物复合物。本发明使用的核苷酸交换方法，可以方便快速的得到交换后的复合物样品。
Description
技术领域
本申请属于蛋白领域，具体地，本申请提供了一种基于KRAS蛋白的核苷酸交换方法。
背景技术
RAS是第一个被发现的人类肿瘤基因(oncogene)。是一种膜结合的信号转导蛋白，能够调控细胞对外界刺激的反应。
KRAS基因的全名叫Kirsten rat sarcoma viral oncogenehomolog，翻成中文是“Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物”。KARS基因编码的蛋白是一种小GTP酶(smallGTPase)，它属于RAS超蛋白家族。
KRAS蛋白质有188个氨基酸，它的分子量是21.6KD。拥有GTPase酶活性的鸟嘌呤核苷结合蛋白。
KRAS基因就像体内的一个“开关”，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用。在细胞内，KRAS蛋白在失活和激活状态之间转变，当KRAS与鸟嘌呤核苷二磷酸(GDP)结合时，它处于失活状态，处于“关”的状态。当它与鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)结合时，它处于激活状态，具有磷酸激酶的活性，代表“开”的状态，可进一步激活下游蛋白，激活下游信号通路。
大部分细胞中的KRAS处于失活状态，当它被激活后，可以激活多条下游信号通路，其中包括MAPK信号通路，PI3K信号通路，和Ral-GEFs信号通路。这些信号通路在促进细胞生存、增殖和细胞因子释放方面具有重要作用。
在研究过程中，提取纯化得到的KRAS蛋白为结合有GDP的处于失活状态的蛋白质。通过体外交换的方法，将结合的GDP变为游离状态，并添加GTP的类似物，可以将KRAS蛋白变为有活性的结合GTP的蛋白。在后续的研究中有广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速高效的核苷酸交换方法，采用原核表达系统，过量表达KRAS蛋白，得到结合有GDP的蛋白后，通过分子筛纯化得到均一性好的蛋白，按照一定的比例加入碱性磷酸酶和GTP类似物后反应。在通过超滤浓缩后，再进行分子筛的纯化，最终得到结合有GTP的KRAS蛋白。通过这种方法交换得到的蛋白，可以通过分子筛的结果判断蛋白的均一性和纯度，反应时间短，可以在一边浓缩的过程中一边缓慢反应，缩短了反应时间，减少了由于反应结束后再准备浓缩过分子筛而造成的蛋白过分酶解，大量损失蛋白，造成整个实验的失败。实验操作方法简单，易于操作。使用此交换方法，可以很好的控制交换的反应时间，获得的交换后的蛋白得率高，我们通过后期的实验验证，使用此方法交换后的蛋白，可以得到高分辨率的蛋白晶体结构。
本发明的实施是这样实现的：原核系统过量表达KRAS蛋白，使用分子筛纯化得到均一性好的蛋白，并置换buffer，以便用于交换。加入碱性磷酸酶和GTP类似物进行室温反应，20min后开始使用超滤方法浓缩，浓缩体积至1ml以内，再次过分子筛纯化，收集交换后的结合GTP的KRAS蛋白。具体的步骤如下：
1、蛋白表达与提取
使用带有N-his tag的KRAS基因的表达菌株进行摇菌，诱导表达后收集菌体。菌体用缓冲液重悬后，高压破碎，高速离心后将上清过Ni柱纯化。
2、Ni柱亲和层析
将高速离心后的蛋白上清液过Ni柱亲和纯化。使用Ni柱重力柱进行纯化，使用洗涤缓冲液进行梯度洗涤杂蛋白。使用洗脱缓冲液进行洗脱KRAS蛋白。SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化效果，将目的蛋白进行后续纯化。
3、分子筛纯化
将洗脱的目的蛋白液使用10KD的超滤管进行浓缩，体积至1ml以内。将浓缩的蛋白液过平衡好的分子筛柱子，进行进一步纯化。过分子筛可以去除少量的杂蛋白，可以判断蛋白质的均一性是否良好，是否可以进行下一步的交换实验，选取均一性好的蛋白进行后续的交换实验。
4、交换实验
将分子筛后的KRAS蛋白进行收集，测定浓度，调整蛋白浓度为1mg/ml，加入10倍摩尔量的GppNHp(GTP(β,γ-NH))，40U碱性磷酸酶，室温孵育20min。将20ml反应样品使用10KD的超滤管浓缩，浓缩过程在4℃进行。整个浓缩过程大约需要30min，体积至1ml以内。
5、第二次分子筛纯化
将浓缩好的样品随即进行分子筛纯化，分子筛柱子提前使用缓冲液平衡好。此次过分子筛的目的一是可以去除游离的GDP、GTP。二是分离反应体系中的碱性磷酸酶。三是可以将反应体系的缓冲液置换为后续用于研究的缓冲体系。四是可以得到均一性好的交换后的蛋白。
将交换后过分子筛的样品浓缩，-80℃冻存。以便于后续研究使用。
具体来说：
一方面，本申请提供了一种基于KRAS蛋白的核苷酸交换方法，其特征在于，使用GTP类似物和碱性磷酸酶将KRAS蛋白有结合GDP的状态转化为结合GTP的状态。
进一步地，所述方法包括蛋白表达和提取、Ni柱亲和层析、第一次分子筛纯化、核苷酸交换、第二次分子筛纯化的步骤。
进一步地，在核苷酸交换中：调整蛋白浓度为1mg/ml，加入10倍摩尔量的GppNHp，40U碱性磷酸酶，室温孵育20min；随后超滤管浓缩。
进一步地，在核苷酸交换中：调整蛋白浓度为1mg/ml，加入10倍摩尔量的GppNHp，40U碱性磷酸酶，室温孵育20min；随后将20ml反应产物使用10KD的超滤管浓缩，浓缩过程在4℃进行，浓缩30min，体积至1ml以内。
进一步地，所述蛋白表达与提取和Ni柱亲和层析为：使用带有N-his tag的KRAS基因的表达菌株进行摇菌，诱导表达后收集菌体；菌体用缓冲液重悬后，高压破碎，高速离心后将上清过Ni柱纯化，使用洗涤缓冲液进行梯度洗涤杂蛋白。使用洗脱缓冲液进行洗脱KRAS蛋白。
进一步地，其中洗涤缓冲液为：洗涤缓冲液1：25mM Tris，0.3M NaCl，20mMImidazole，pH 8.0；洗涤缓冲液2：25mM Tris，0.3M NaCl，40mM Imidazole，pH 8.0；每个梯度洗涤体积约100ml；洗脱缓冲液为25mM Tris，0.3M NaCl，250mM Imidazole，pH 8.0。
进一步地，第一次分子筛的分子筛缓冲液为：25mM Tris-HCl，200mM(NH4)2SO4，0.5mM DTT，pH 7.5；柱为SD 75。
进一步地，第二次分子筛的分子筛缓冲液为：20mM hepes，0.15M NaCl，10mMMgCl2，1mM TCEP，pH 7.5；柱为SD 75。
进一步地，第二次分子筛纯化还包括浓缩步骤。
另一方面，本申请提供了以上述方法获得的结合有GTP的KRAS蛋白。
附图说明
图1为Ni柱亲和纯化结果图，其中：M：蛋白marker；T：全菌液；S：上清液；P：沉淀；FT：flow through；20\40\250：对应不同浓度咪唑洗涤液；
图2为第一次分子筛结果，其中边框为均一性好的目的蛋白；
图3为对应的第一次分子筛结果的SDS-PAGE电泳结果，其中M：蛋白marker；10-20：对应不同的收集管，15-18对应上述边框中的蛋白；
图4为交换反应后的第二次分子筛结果；
图5为对应的交换反应后的第二次分子筛结果的SDS-PAGE电泳结果，其中M：蛋白marker；10-21：对应不同的收集管，14-18为对应的均一性好的目的蛋白。
图6为交换时间为2h(对比实验一)的Ni柱亲和纯化结果图，其中：M：蛋白marker；T：全菌液；S：上清液；P：沉淀；FT：flow through；20\50\250：对应不同浓度咪唑洗涤液。
图7为交换时间为2h(对比实验一)的第一次分子筛结果，其中边框为均一性好的目的蛋白。
图8为交换时间为2h(对比实验一)的对应的第一次分子筛结果的SDS-PAGE电泳结果，其中M：蛋白marker；A9-B9：对应不同的收集管，B12-B10对应上述边框中的蛋白。
图9为交换时间为2h(对比实验一)的交换反应后的第二次分子筛结果。其中边框为均一性好的目的蛋白。
图10为交换时间为2h(对比实验一)的对应的交换反应后的第二次分子筛结果的SDS-PAGE电泳结果，其中M：蛋白marker；A6-B7：对应不同的收集管，A8-A11为对应的均一性好的目的蛋白。
图11为交换反应过夜(对比实验二)的Ni柱亲和纯化结果图，其中：M：蛋白marker；C：未诱导表达的对照菌体；T：全菌液；S：上清液；P：沉淀；FT：flow through；20\35\50\100\300：对应不同浓度咪唑洗涤液；FT2：酶切掉tag后的flow through。
图12为交换反应过夜(对比实验二)的第一次分子筛结果，其中边框为均一性较好的目的蛋白。
图13为交换反应过夜(对比实验二)的对应的第一次分子筛结果的SDS-PAGE电泳结果，其中M：蛋白marker；1-12：对应不同的收集管，6-8对应上述边框中的蛋白。
图14为交换反应过夜(对比实验二)后的第二次分子筛结果。其中边框为均一性较好的目的蛋白。
图15为交换反应过夜(对比实验二)后的第二次分子筛结果的SDS-PAGE电泳结果，其中M：蛋白marker；1-11：对应不同的收集管，4-6为对应的上述边框的蛋白。
具体实施方式
实施例1蛋白表达与提取
使用带有N-6*his-KRAS基因的表达菌株进行摇菌20ml，37℃，220rpm摇菌过夜后，接种与2L LB(含抗生素)中，37℃，220rpm摇菌3h。诱导表达，加入终浓度为0.5mM IPTG，16℃，200rpm继续摇菌20h后收集菌体。菌体用80ml buffer(25mM Tris，0.3M NaCl，pH 8.0)重悬，高压破碎，高速离心后将上清过Ni柱(15000rpm，40min，4℃)。
实施例2Ni柱亲和层析
将高速离心后的蛋白上清液过Ni柱亲和纯化。使用Ni柱重力柱进行纯化，柱体积为5ml，重复过柱3次。使用洗涤缓冲液洗涤液进行梯度洗涤杂蛋白。每个梯度洗涤体积约100ml。使用洗脱缓冲液进行洗脱KRAS蛋白，洗脱体积40ml。
洗涤缓冲液1：25mM Tris，0.3M NaCl，20mM Imidazole，pH 8.0。
洗涤缓冲液2：25mM Tris，0.3M NaCl，40mM Imidazole，pH 8.0。
洗脱缓冲液：25mM Tris，0.3M NaCl，250mM Imidazole，pH 8.0。
实施例3分子筛纯化
将洗脱的目的蛋白液使用10KD的超滤管进行浓缩，体积至1ml以内。将浓缩的蛋白过预先平衡好的分子筛柱子，进行进一步纯化。
分子筛缓冲液：25mM Tris-HCl，200mM(NH4)2SO4，0.5mM DTT，pH 7.5。
Column：SD 75。
实施例4交换实验
将分子筛后的KRAS蛋白进行收集，测定浓度，调整蛋白浓度为1mg/ml，共20ml。加入10倍摩尔量的GppNHp(GTP(β,γ-NH))，40U碱性磷酸酶，室温孵育20min。将20ml反应样品使用10KD的超滤管浓缩，浓缩过程在4℃进行。整个浓缩过程大约需要30min，体积至1ml以内。
实施例5第二次分子筛纯化
将浓缩好的样品随即进行分子筛纯化，分子筛柱子提前使用缓冲液平衡好。缓冲液：20mM hepes，0.15M NaCl，10mM MgCl2，1mM TCEP，pH7.5。Column：SD 75。将交换后过分子筛的样品浓缩，浓度15.5mg/ml，体积0.8ml。-80℃冻存。
对比实验一：交换反应buffer和反应时间摸索，交换反应时间2h：
1、蛋白表达与提取
使用带有N-6*his-KRAS基因的表达菌株进行摇菌表达，收集1L菌体。菌体用80mlbuffer(25mM Tris，0.3M NaCl，pH 8.0)重悬，高压破碎，高速离心后将上清过Ni柱(15000rpm，40min，4℃)。
2、Ni柱亲和层析
将高速离心后的蛋白上清液过Ni柱亲和纯化。使用Ni柱重力柱进行纯化。使用washing buffer洗涤液进行梯度洗涤杂蛋白。使用elution buffer进行洗脱KRAS蛋白，洗脱体积20ml。
washing buffer 1：25mM Tris，0.3M NaCl，20mM Imidazole，pH 8.0。
washing buffer 2：25mM Tris，0.3M NaCl，50mM Imidazole，pH 8.0。
Elution buffer：25mM Tris，0.3M NaCl，250mM Imidazole，pH 8.0。
3、分子筛纯化
将洗脱的目的蛋白液使用10KD的超滤管进行浓缩，体积至1ml以内。将浓缩的蛋白过预先平衡好的分子筛柱子，进行进一步纯化。
分子筛Buffer：25mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 8.0。
Column：SD 75。
4、交换实验
将分子筛后的KRAS单体蛋白进行收集，测定蛋白浓度为3mg/ml，共5ml。加入10倍摩尔量的GppNHp(GTP(β,γ-NH))，30units alkaline phosphatase，室温孵育2h。将反应样品浓缩。
5、第二次分子筛纯化
将浓缩好的样品随即进行分子筛纯化，分子筛柱子提前使用buffer平衡好。Buffer：25mM Tris，0.1M NaCl，pH 8.0。
Column：SD 75
将分子筛后的蛋白单体样品收集，发现使用此方法得到的蛋白得率低，用于后续的蛋白晶体筛选，无法得到蛋白晶体。
对比实验二：交换反应buffer和反应时间摸索，交换反应条件为4℃过夜交换反应：
1、蛋白表达与提取
使用带有N-6*his-KRAS基因的表达菌株进行摇菌表达，收集1L菌体。菌体用80mlbuffer(25mM Tris-HCl,150mM NaCl,5％Glycerol,1mM TCEP，pH 8.0)重悬，高压破碎，高速离心后将上清过Ni柱(15000rpm，40min，4℃)。
2、Ni柱亲和层析及酶切
将高速离心后的蛋白上清液过Ni柱亲和纯化。使用Ni柱重力柱进行纯化。使用washing buffer洗涤液进行梯度洗涤杂蛋白。使用elution buffer进行洗脱KRAS蛋白，洗脱体积20ml。在洗脱蛋白中加入DrICE蛋白酶酶切过夜，以去除his-tag。将酶切液重新过Ni柱，并收集flow through，得到切除tag的目的蛋白。
washing buffer：25mM Tris，0.15M NaCl，20/35/50/100mM Imidazole，pH 8.0。Elution buffer：25mM Tris，0.15M NaCl，300mM Imidazole，pH 8.0。
3、分子筛纯化
将洗脱的目的蛋白液使用10KD的超滤管进行浓缩，体积至1ml以内。将浓缩的蛋白过预先平衡好的分子筛柱子，进行进一步纯化。
分子筛Buffer：32mM Tris-HCl,200mM(NH4)2SO4,0.5mMDTT,0.5mM NaN3,pH＝7.5。Column：SD 75。
4、交换实验
将分子筛后的KRAS单体蛋白进行收集，测定蛋白浓度。加入10倍摩尔量的GppNHp(GTP(β,γ-NH))，2DEA units/mg蛋白的alkaline phosphatase，4℃孵育过夜进行交换反应。将反应样品浓缩。
5、第二次分子筛纯化
将浓缩好的样品随即进行分子筛纯化，分子筛柱子提前使用buffer平衡好。
Buffer：20mM HEPES,150mM NaCl,10mM MgCl2,0.5mM NaN3,pH＝7.5。
Column：SD 75
交换后样品损失太大，只有少量目的蛋白，使用此方法得到的蛋白得率很低，无法用于后续的蛋白晶体筛选实验。
Claims (7)
1.一种基于KRAS蛋白的核苷酸交换方法，其特征在于，使用GTP类似物和碱性磷酸酶将KRAS蛋白从结合GDP的状态转化为结合GTP的状态；
所述方法包括KRAS蛋白表达和提取、Ni柱亲和层析、第一次分子筛纯化、核苷酸交换、第二次分子筛纯化的步骤；
所述核苷酸交换步骤包括：调整KRAS蛋白浓度为1mg/ml，取20mL；加入KRAS蛋白10倍摩尔量的GppNHp，40U碱性磷酸酶，室温孵育20min；随后超滤管浓缩。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在核苷酸交换中：调整KRAS蛋白浓度为1mg/ml，取20mL；加入KRAS蛋白10倍摩尔量的GppNHp，40U碱性磷酸酶，室温孵育20min；随后将20ml反应产物使用10KD的超滤管浓缩，浓缩过程在4℃进行，浓缩30min，体积至1ml以内。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白表达与提取和Ni柱亲和层析为：使用带有N-his tag的KRAS基因的表达菌株进行摇菌，诱导表达后收集菌体；菌体用缓冲液重悬后，高压破碎，高速离心后将上清过Ni柱纯化，使用洗涤缓冲液进行梯度洗涤杂蛋白。使用洗脱缓冲液进行洗脱KRAS蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其中洗涤缓冲液为包括：洗涤缓冲液1：
25mM Tris，0.3M NaCl，20mMImidazole，pH 8.0；洗涤缓冲液2：25mM Tris，0.3M NaCl，40mMImidazole，pH 8.0；洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2洗涤体积均为100ml；洗脱缓冲液为25mM Tris，0.3M NaCl，250mM Imidazole，pH 8.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其中第一次分子筛的分子筛平衡缓冲液为：
25mM Tris-HCl，200mM(NH4)2SO4，0.5mM DTT，pH 7.5；柱为SD 75。
6.根据权利要求1所述的方法，其中第二次分子筛的分子筛平衡缓冲液为：
20mM hepes，0.15M NaCl，10mM MgCl2，1mM TCEP，pH 7.5；柱为SD 75。
7.根据权利要求1所述的方法，其中第二次分子筛纯化还包括浓缩步骤。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102796707A (zh) * | 2012-09-04 | 2012-11-28 | 杨举伦 | 一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-R1及单克隆抗体 |
| CN103880953A (zh) * | 2014-03-03 | 2014-06-25 | 华南农业大学 | 一种猪p21蛋白抗体及其制备方法与应用 |
| CN105467128A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-04-06 | 泰山医学院 | 一种检测小分子G蛋白Ras活性的方法及试剂盒 |
| CN111164427A (zh) * | 2017-07-28 | 2020-05-15 | Cisbio生物试验公司 | 用于测量对g蛋白偶联受体活性的调控的方法 |
| WO2020157441A1 (fr) * | 2019-01-30 | 2020-08-06 | Cisbio Bioassays | Methode pour mesurer la modulation de l'activation d'un recepteur couple a une proteine g avec des analogues du gtp |
| CN111936521A (zh) * | 2017-11-16 | 2020-11-13 | 奥隆制药 | 通过内化到细胞胞浆中抑制细胞中活化的Ras的抗体及其用途 |
| CN112730829A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-04-30 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种快速检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的胶体金试纸条及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113667018B (zh) * | 2021-08-14 | 2023-02-24 | 中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院 | 一种可以进入肿瘤细胞内的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法 |
| CN113603790A (zh) * | 2021-08-14 | 2021-11-05 | 中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院 | 一种可以进入肿瘤细胞内的RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法 |
-
2021
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102796707A (zh) * | 2012-09-04 | 2012-11-28 | 杨举伦 | 一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-R1及单克隆抗体 |
| CN103880953A (zh) * | 2014-03-03 | 2014-06-25 | 华南农业大学 | 一种猪p21蛋白抗体及其制备方法与应用 |
| CN105467128A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-04-06 | 泰山医学院 | 一种检测小分子G蛋白Ras活性的方法及试剂盒 |
| CN111164427A (zh) * | 2017-07-28 | 2020-05-15 | Cisbio生物试验公司 | 用于测量对g蛋白偶联受体活性的调控的方法 |
| CN111936521A (zh) * | 2017-11-16 | 2020-11-13 | 奥隆制药 | 通过内化到细胞胞浆中抑制细胞中活化的Ras的抗体及其用途 |
| WO2020157441A1 (fr) * | 2019-01-30 | 2020-08-06 | Cisbio Bioassays | Methode pour mesurer la modulation de l'activation d'un recepteur couple a une proteine g avec des analogues du gtp |
| CN112730829A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-04-30 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种快速检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的胶体金试纸条及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| K-ras原核表达载体的构建及生物学功能研究;陈思禹等;《生物技术通讯》;第28卷(第3期);第324-327页 * |
| 新型荧光素酶NanoLuc结构研究与改造及SHP2在结肠癌HCT116细胞中的功能研究;陈新;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》(第8期);全文 * |
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