CN114703162B

CN114703162B - 一种具有高转录活性的t7 rna聚合酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN114703162B
Application number: CN202210456084.4A
Authority: CN
Inventors: 朱升龙; 姜旋; 陈永泉; 王振; 叶贤龙; 潘珍珍
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-04-24
Filing date: 2022-04-24
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2042-04-24
Also published as: CN114703162A

Abstract

本发明公开了一种具有高转录活性的T7RNA聚合酶突变体及其应用，属于生物技术领域。本发明对原始T7RNA聚合酶进行改造，构建得到的T7RNA聚合酶突变体相对于野生型T7RNA聚合酶，具有转录效率高、合成产量高、纯度高、特异性强、贮藏稳定性好等优点。适于将T7RNA聚合酶突变体制备成RNA转录试剂盒，用于RNA疫苗和药物、体外转录、基因编辑、病毒RNA探针检测等方面，具有广泛的应用前景。

Description

一种具有高转录活性的T7 RNA聚合酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有高转录活性的T7 RNA聚合酶突变体及其应用，具体涉及一种具有高转录活性的T7RNA聚合酶突变体的制备方法及一种合成siRNA的应用，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，新型冠状病毒在全球大范围内肆虐传播，人们对于病毒遗传信息RNA的研究和mRNA等疫苗的研发需求越来越大，RNA的生理物理和生物化学研究时需要大量特定长度和特定序列的RNA分子作为研究原料，这时需要稳定高效的系统进行体外转录获得RNA，T7体外转录系统提供一个快速的方法用于合成纯净、单链的RNA分子，用T7 RNA聚合酶大规模的合成RNA已经较为广泛的应用于作为生物学活性分子的RNA的研究，T7 RNA聚合酶是一种RNA聚合酶，专门催化5’→3’方向的RNA形成过程。T7 RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的DNA或DNA复制品，在体内T7RNA聚合酶几乎能完整地转录在T7启动子下游的所有DNA序列。针对日趋上涨的需求量，目前市售的T7 RNA聚合酶仍存在生产成本和售价高，稳定性有限，转录活性有待提升等缺点，尚不能完全满足日益增长的研究需要。

T7 RNA聚合酶的另一个重要应用是可体外转录合成用于RNA干涉实验的siRNA。RNA干涉(RNA interference，RNAi)是研究双链RNA对基因表达阻断的作用方法，它将与目的基因对应的双链RNA导入生物体，导致相应mRNA降解。它不是传统的在DNA水平上进行基因敲除，而是通过RNA干涉，在RNA水平上去除目的RNA，因而它是一种有力的研究基因功能的工具，可以快速经济地进行大量基因功能的验证。人工化学合成siRNA的存在价格昂贵，制作周期较长且合成产物不稳定的问题，T7 RNA聚合酶用于制备siRNA则有着操作简单且成本低，合成的siRNA量大等优点，能满足RNA干涉实验的实际需要。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种具有高转录活性的突变体T7 RNA聚合酶，可用于体外RNA的合成，并提供了一种siRNA的合成方法，用于解决现有制备siRNA成本高、步骤繁琐和产量低的技术问题。此外，本发明提供的突变体T7 RNA聚合酶融合了His标签，很大程度上方便后续蛋白纯化步骤，并适用于大规模生产。

本发明提供了一种具有高转录活性的T7 RNA聚合酶变体，所述T7 RNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了编码所述的T7 RNA聚合酶突变体的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了含有所述核苷酸序列的重组质粒。

在一种实施方式中，所述重组质粒以pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体为表达载体。

本发明提供了表达所述的T7 RNA聚合酶变体或含有所述的核苷酸序列的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母为出发菌株。

本发明提供了所述高转录活性的突变体T7 RNA聚合酶的制备，具体步骤如下：

(1)在原始的T7 RNA聚合酶基因序列上进行改造，同时根据原核大肠杆菌进行密码子优化，得到的T7 RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:l所示，并通过NdeI和XhoI酶切位点双酶切连接至大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-30a(+)中；

(2)将带有目的基因片段的质粒，转化到Rosetta(DE3)大肠杆菌菌株中，通过卡那霉素筛选阳性转化子，并于37℃，220rpm条件下扩大培养，直至OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入0.5mM的IPTG，16℃过夜诱导蛋白表达。

本发明提供了一种制备RNA的方法，所述方法是利用所述T7 RNA聚合酶变体以核糖核苷三磷酸为原料、利用编码目标RNA的DNA模板，转录合成目标RNA。

在一种实施方式中，所述方法步骤为：

(1)合成双链DNA模板；

(2)将T7 RNA聚合酶用于RNA体外转录，在35～40℃下反应1～3h；

(3)双核酸酶消化处理和纯化siRNA。

在一种实施方式中，所述目标RNA包括dsRNA、ssRNA、siRNA、miRNA、piRNA、mRNA和shRNA。

本发明提供了含有所述T7 RNA聚合酶变体、或所述核苷酸序列的试剂盒。

在一种实施方式中，所述试剂盒中含有缓冲试剂、核糖核苷三磷酸。

在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有核酸酶抑制蛋白。

本发明提供了所述T7 RNA聚合酶变体在体外转录合成RNA中的应用。

在一种实施方式中，所述RNA包括mRNA、siRNA、gRNA等各类RNA前体。

本发明提供了所述T7 RNA聚合酶变体在制备RNA疫苗和RNA药物中的应用。

本发明提供了所述T7 RNA聚合酶变体在基因编辑、利用RNA探针检测病毒中的应用。

本申请的技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明提供的突变体T7 RNA聚合酶融合了His标签，能容易的与镍柱结合降低了纯化难度，提升产量并增加了纯化的回收效果。

(2)本发明提供的突变体T7 RNA聚合酶选用了pET-30a(+)表达载体，增加了蛋白的可溶性表达，为后续的工业生产提供便利。

(3)本发明提供的突变体T7 RNA聚合酶在体外转录合成siRNA的应用中，相比于野生型，具有转录效率高、合成产量高、纯度高、特异性强、贮藏稳定性好等优点，可以实现准确简便、成本低并且能高效稳定纯化siRNA的目的，在使用RNAi技术的研究中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例2中使用野生型和突变体T7 RNA聚合酶在室温放置不同时间后RNA产量图。

图2为本发明实施例2中使用野生型T7 RNA聚合酶合成siRNA质谱鉴定图。

图3为本发明实施例2中使用突变体T7 RNA聚合酶合成siRNA质谱鉴定图。

图4为本发明实施例3中使用两种T7 RNA聚合酶(野生型和突变体)合成siRNA转染后抑制MyoG基因相对表达量图。

图5为本发明实施例3中使用两种T7 RNA聚合酶(野生型和突变体)合成siRNA转染后抑制细胞成肌分化能力效果对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，需要说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。

实施例中所使用的试剂均为市售。

实施例1

具有高转录活性的T7噬菌体RNA聚合酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)T7 RNA聚合酶变体密码子优化和质粒构建

T7 RNA聚合酶变体氨基酸序列(SEQ ID NO:2)由人工改造后的噬菌体T7的基因组(SEQ ID NO:l，2658bp)编码。改造后的突变体具有较好的热稳定性和极高的转录活性，编码T7 RNA聚合酶变体的密码子优化及全基因合成均在南京金斯瑞公司完成，并且通过NdeI和XhoI酶切位点双酶切连接至大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-30a(+)中，将质粒构建体转化至TOP10大肠杆菌菌株中，用于保存。

(2)T7 RNA聚合酶变体的表达和纯化

原核表达载体质粒被转化到Rosetta(DE3)大肠杆菌菌株中，并在含有卡那霉素(Kan)的LB培养基，220rpm，37℃条件下生长，直至0D₆₀₀达到0.4至0.6后，添加0.5mM的IPTG，在70rpm，16℃条件下过夜12-16h诱导蛋白表达。在4℃，5000rpm条件下离心20min收集菌体沉淀，弃掉培养基再重悬浮于蛋白结合缓冲液(pH值＝8.0，20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑)中。全程低温超声充分裂解菌体沉淀，采用AKTA pure蛋白纯化系统，镍柱来纯化His-标记的T7 RNA聚合酶。先用10倍柱体积的洗涤缓冲液(pH8.0，50mM Tris-HCl，5M NaCl，20mM咪唑)平衡镍柱，后将所有含有目的蛋白的液体通过镍柱填料，接下来用不同浓度梯度的咪唑溶液使T7 RNA聚合酶从柱中洗脱，并根据流出的顺序收集液体。通过SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色鉴定蛋白流出液，选择纯度且浓度高的蛋白进行透析至蛋白保存液，置于-80℃冰箱保存。经过纯化后的蛋白条带单一，无杂蛋白，高效表达，产量高。本发明构建的重组工程菌，具有培养周期短、条件简单、目的蛋白产量高、纯化方便等优点。

实施例2：具有高转录活性的T7 RNA聚合酶突变体在体外转录中应用

一种小干扰siRNA的合成方法，以肌细胞生成素(MyoG)基因的靶序列5’-CCCAGACGAAACCATGCCCAA-3’为例，包括如下步骤：

(1)双链DNA模板的合成

用于合成正义链RNA和反义链RNA的4条DNA模板序列如表1所示，由金唯智公司制备，其中包括T7 RNA聚合酶启动子序列:5′-TAATACGACTCACTATAG-3′(表1中下划线处)，经过退火(95℃处理2min，经45分钟冷却至25℃，然后再25℃保持10分钟)分别得到用于转录出正义链RNA和反义链RNA的DNA模板。

表1

(2)T7 RNA聚合酶用于RNA体外转录

在冰上配置转录反应液，分别添加野生型和突变体T7 RNA聚合酶，充分混匀并短暂离心反应液至管底部，37℃孵育2h，转录反应体系如下：

表2

10×Transcription Buffer：400mM Tris-HCl(pH7.9 at 25℃)，60mM MgCl₂，100mM DTT，100mM NaCl，20mM亚精胺。

反应结束后，用Nanodrop测定转录生成的RNA浓度。并且比较了T7 RNA聚合酶室温下放置72h后的稳定性，分别将T7 RNA酶野生型和T7 RNA酶突变体分别放置0h和72h后，再将其按照表2的反应体系进行转录，转录结束后用Nanodrop测定转录生成的RNA浓度。结果如图1所示，本发明提供的突变体T7 RNA聚合酶的RNA浓度都显著高于野生型酶，在72h之后T7 RNA聚合酶突变体转录得到的RNA的浓度还能保持71.97％，表明本发明提供的突变体T7RNA的在具有高RNA合成产量的同时又有很高的稳定性。

(3)双核酸酶消化处理

全程冰上制备核酸酶消化反应液，然后于37℃孵育1h，用于以除去DNA及冗余片段。反应体系如下：

表3

(4)siRNA纯化

①向上述反应液中加入等体积的水饱和的酸性苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，上下充分倒置混合后，室温10000rpm离心5分钟。

②将上层(水层)移至另一新的离心管中，加入等量的5M的醋酸铵(pH 5.6)和4倍量的99.5％的乙醇。室温静置5分钟后，室温15,000rpm离心10分钟。除去上清液后加入100μl的80％的乙醇，室温15000rpm离心5分钟。

③除去上清液，轻微干燥后加入20-50μl的RNase Free H₂O溶解沉淀，测定上述溶液浓度，并保存于-20℃。

(5)质谱鉴定siRNA产量和纯度

应用Thermo MS系统验证siRNA的纯度，质谱鉴定由苏州金唯智公司完成，进样体积均为20μl。质谱仪以离子源、质量分析器和离子检测器为核心，离子源是使分子在高真空条件下离子化的装置，电离后的分子因接受了过多的能量会碎裂成较小质量的多种碎片离子和中性粒子，进一步被离子检测器测量。结果如图2和图3所示，对比图2和图3结果表明经野生型T7 RNA聚合酶合成的siRNA产量(intensity)要显著低于突变体T7 RNA聚合酶，同时与野生型T7 RNA聚合酶相比，突变体T7 RNA聚合酶合成的siRNA产物单一，没有其他杂片段生成。综上，突变体T7 RNA聚合酶在制备siRNA的应用中，具有转录效率高，合成产量高，纯度高，特异性强等优点。因此，本申请提供的T7 RNA聚合酶可以实现准确简便、成本低并且能高效稳定纯化siRNA的目的，在使用RNAi技术的研究中具有重要的应用价值。

实施例3

基于实施例2所揭示的siRNA合成方法，本实施例进一步对比和验证了所合成高纯度siRNA的实际抑制基因表达效果。

C2C12小鼠成肌细胞购自中国科学院细胞库，转染试剂购自Polyplus公司，胎牛血清FBS，马血清，双抗和DMEM培养基均购自Gibco公司，RNA提取试剂盒RNAisoPlus、反转录试剂盒HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)购自南京诺唯赞有限公司，荧光定量PCR试剂盒/>qPCR SYBR Green Master Mix购自翌圣生物科技(上海)有限公司，引物合成服务由苏州金唯智公司提供。

具体实验步骤如下：

一、细胞转染和分化

培养C2C12细胞并铺板于6孔板中，待细胞融合度到30-40％时即可用于转染，相同浓度两种体外转录合成的siRNA根据转染试剂说明书操作混合配置，将配置好的两种转染混合液分别加入6孔板中，继续于37℃，5％CO₂细胞培养箱内培养，待细胞密度增殖至80％-90％时，更换为含有2％马血清的分化培养液，诱导成肌分化。

二、总RNA提取和逆转录

1、总RNA提取

(1)诱导细胞分化4天后，加1ml PBS洗涤细胞三次，每孔(6孔板)中加入1ml的RNAiso Plus提取总RNA。静置5min后，将液体加入1.5ml无酶EP管中。

(2)加入氯仿，加入量为200μl/1ml RNAiso Plus，震荡混匀后室温静置10min。

(3)12000g 4℃离心15min。离心后可见离心管内溶液分为3层，吸取上层透明水样液体小心加入1.5ml无酶EP管中。

(4)加入500μl的异丙醇，振荡混匀后常温静置10min。

(5)12000g 4℃离心10min，弃上清，管底可见白色沉淀即为RNA。

(6)加入1ml 75％的乙醇(DEPC水配置)，12000g、4℃离心5min。

(7)弃上清，室温静置干燥5min。

(8)依据沉淀量加入30-50μl DEPC水溶解。测浓度后将剩余样品保存至-80℃冰箱中。

2、逆转录反应

准备0.2ml的无酶PCR EP管，置于冰上。在每个EP管中加入4μl 4×g DNA wiperMix，提取好的RNA样品1μg，DEPC补齐至16μl。将上述混合物置于PCR仪器中42℃反应2min，然后每管加入5×Hi Script III q RT Super Mix4μl，混匀后设置反应条件如下：37℃，15min；85℃，5s；4℃，20min。反应结束后将cDNA进行5倍稀释，-20℃储存待测。

三、荧光定量PCR反应

将逆转录反应得到的cDNA进行荧光定量PCR扩增，检测siRNA抑制目的基因表达情况，扩增体系如下：

表4

反应条件：95℃，5min；95℃，5sec；60℃，20sec；72℃，20sec，40cycles，使用Bio-Rad 96孔荧光定量检测仪测定，采用2^-ΔΔCT方法进行相对定量，用β-actin作为内参。

引物序列如下：

MyoG上游引物F：5’-GCAGGCTCAAGAAAGTGAATGA-3’，

MyoG下游引物R：5’-TAGGCGCTCAATGTACTGGAT-3’；

β-actin上游引物F：5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，

β-actin下游引物R：5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’。

统计分析采用GraphPad Prism 8.0软件进行。所有体外实验均重复至少三次以上，数据以均值土标准差(SD)表示，其中P＜0.05被认为具有统计学意义。

结果如图4所示，相比未转染siRNA的对照组，转染野生型T7和突变体T7 RNA聚合酶合成的siRNA均可以降低C2C12细胞中MyoG基因的表达，同时对比两种合成的siRNA效果，突变体T7 RNA聚合酶合成的siRNA抑制目的基因表达的程度要显著强于用野生型T7RNA聚合酶合成的siRNA。MyoG是一种肌肉特异的转录因子，能在组织培养中诱导多种细胞类型的肌生成，其表达对骨骼肌的分化和生长至关重要。由图5所示，显微镜下观察细胞分化形态，C2C12细胞成肌分化时，细胞会相互融合发育成类似肌管的长条状形态，相比野生型T7 RNA聚合酶，由于突变体T7 RNA聚合酶合成的siRNA更显著抑制MyoG基因的相对表达，所以观察到突变体T7-siRNA能更强的抑制成肌分化时的形态变化。

综上，突变体T7 RNA聚合酶合成的siRNA抑制目的基因表达的效果更强。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种具有高转录活性的T7 RNA聚合酶突变体及其应用

<130> BAA220429A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2658

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcatcatc accatcacca ccaccacgga ggtggttcca ataccattaa catcgcgaag 60

aatgacttct ccgacatcga gctcgctgcg attccgttta acactctcgc ggaccactat 120

ggcgagcgct tagcgcgcga gcagttggca cttgagcacg aaagctacga gatgggagaa 180

gctcgttttc gtaagatgtt cgaacgccaa cttaaggccg gtgaggtggc ggacaatgca 240

gcggcgaaac cgttaatcac caccctgctc ccgaaaatga ttgcccgtat taacgattgg 300

ttcgaagaag tcaaagcgaa gagaggtaaa cgtccgactg cgttccagtt cctgcaagaa 360

atcaaaccgg aggctgttgc gtacatcacc attaagacga ccctggcctg tctgaccagc 420

gcggataaca cgacggtgca agcagttgcc tctgcaatcg gccgtgcaat tgaggacgaa 480

gcgcgcttcg gtcgcatccg tgacctggag gcgaagcact ttaaaaagaa cgtggaagaa 540

caactgaaca agcgtgtggg ccatgtctac aaaaaggcgt ttatgcaggt tgtggaggcc 600

gacatgctga gcaaaggttt gctgggcggt gaggcgtgga gcagctggca taaagaagac 660

tcaattcacg tgggtgttcg ctgtattgag atgctgattg aatcgaccgg tatggtgtct 720

ctgcatcgtc aaggtggtag cagcgaaacg atagagctgg cgccggagta cgctgaggcc 780

atcgctaccc gtgccggcgc tttggcgggt attagcccga tgttccaacc gtgtgttgtt 840

ccgcctaaac cgtggaccgg tattacgggt ggtggttact gggcaaatgg ccgtcgtccg 900

ttggccctgg ttcgcaccca tagcaaaaag gctctgatgc gttatgagga cgtttacatg 960

ccggaagtgt acaaagcgat caacatcgcg cagaacaccg cgtggaaaat taacaagaaa 1020

gttctggctg tggccaacgt tatcaccaaa tggaaacact gcccggtgga ggacatcccg 1080

gccatcgagc gcgaagaact gccgatgaaa ccggaagaca tcgatctgac cgcctggaag 1140

cgtgcggctg cggctgtgta tcgtaaggac aaggcgcgta aaagcagacg tattagcctg 1200

gaattcatgt tggagcaggc aaataagttt gccaaccaca aggcgatttg gtttccgtat 1260

aacatggatt ggcgtggtcg tgtctatgcg gtttccatgt tcaatccgca gggcaacgac 1320

atgactaagg gcctgttgac cctggcgaag ggcaaaccga ttggtaaaga gggttattac 1380

tggctgaaaa tccatggagc aaactgcgca ggtgttgaca aggtgccgtt cccggagcgt 1440

attaaattca tcgaggaaaa ccacgagaac attatggcat gtgcaaaatc tccactggag 1500

aacacttggt gggcagagca agactctccg ttttgctttc tggcattctg ctttgaatat 1560

gcgggcgtac agcaccacgg tctgagctac aattgctcct tgccgctggc gtttgatggt 1620

agctgcagcg gaatccagca ctttagcgcc atgttgcgtg atgaagtggg tggccgtgcg 1680

gtgaacttgt tgccaagcga aaccgttcaa gatatctacg gcatcgtagc gaaaaaggtg 1740

aatgaaattc tgcaagccga cgcgattaac ggcaccgata acgaagttgt taccgtcacc 1800

gacgaaaata ccggggaaat ctccgagaag gtaaagctgg gtacgaaggc gttggcgggt 1860

cagtggctgg cgtacggcgt gacccgtagc gtcacaaaac gatccgttat gaccctagcc 1920

tatggctcca aagagttcgg cttccgccaa caggttttgg aggacaccat ccagccggct 1980

atcgatagcg gcaaaggttt gatgttcacc cagccaaatc aggcggcagg ctacatggca 2040

aaactgatct gggaatcggt aagcgtgacg gttgttgctg cggtggaagc aatgaactgg 2100

ctgaagtctg ctgcgaaact gttggctgcg gaagtgaagg acaagaagac tggcgagatt 2160

ctgcgtaagc gctgcgcggt gcattgggtt acaccggatg gcttcccggt ctggcaggag 2220

tacaagaagc cgattcagac ccgcctgaat ctgatgttcc ttggccagtt ccgcctgcaa 2280

ccaacgatta acaccaataa agattcggaa atcgacgcac ataaacaaga aagcggtatt 2340

gcaccgaatt ttgttcacag tcaagatggt agccacctgc ggaaaaccgt ggtttgggca 2400

catgaaaaat atggcatcga gtcgtttgct ctcatccatg atagctttgg taccatcccg 2460

gcggacgcag cgaacctgtt taaagctgtg cgcgaaacca tggttgatac ctatgagtca 2520

tgcgatgtgc tggcggactt ttatgatcag ttcgcggacc agcttcacga atcccagtta 2580

gataagatgc ctgcgctgcc agcaaagggc aacctgaatc ttcgtgatat cctggaatca 2640

gatttcgctt tcgcgtaa 2658

<210> 2

<211> 885

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Ser Asn Thr Ile

1 5 10 15

Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu Ala Ala Ile Pro

20 25 30

Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu Ala Arg Glu Gln

35 40 45

Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu Ala Arg Phe Arg

50 55 60

Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val Ala Asp Asn Ala

65 70 75 80

Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys Met Ile Ala Arg

85 90 95

Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg Gly Lys Arg Pro

100 105 110

Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu Ala Val Ala Tyr

115 120 125

Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser Ala Asp Asn Thr

130 135 140

Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala Ile Glu Asp Glu

145 150 155 160

Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys His Phe Lys Lys

165 170 175

Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His Val Tyr Lys Lys

180 185 190

Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser Lys Gly Leu Leu

195 200 205

Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp Ser Ile His Val

210 215 220

Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr Gly Met Val Ser

225 230 235 240

Leu His Arg Gln Gly Gly Ser Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu

245 250 255

Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser

260 265 270

Pro Met Phe Gln Pro Cys Val Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile

275 280 285

Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val

290 295 300

Arg Thr His Ser Lys Lys Ala Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met

305 310 315 320

Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys

325 330 335

Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys

340 345 350

His Cys Pro Val Glu Asp Ile Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro

355 360 365

Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala

370 375 380

Ala Val Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu

385 390 395 400

Glu Phe Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile

405 410 415

Trp Phe Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser

420 425 430

Met Phe Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu

435 440 445

Ala Lys Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile

450 455 460

His Gly Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg

465 470 475 480

Ile Lys Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys

485 490 495

Ser Pro Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys

500 505 510

Phe Leu Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu

515 520 525

Ser Tyr Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly

530 535 540

Ile Gln His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala

545 550 555 560

Val Asn Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val

565 570 575

Ala Lys Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr

580 585 590

Asp Asn Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser

595 600 605

Glu Lys Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala

610 615 620

Tyr Gly Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala

625 630 635 640

Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr

645 650 655

Ile Gln Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro

660 665 670

Asn Gln Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser

675 680 685

Val Thr Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala

690 695 700

Ala Lys Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile

705 710 715 720

Leu Arg Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro

725 730 735

Val Trp Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met

740 745 750

Phe Leu Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp

755 760 765

Ser Glu Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe

770 775 780

Val His Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala

785 790 795 800

His Glu Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe

805 810 815

Gly Thr Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu

820 825 830

Thr Met Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr

835 840 845

Asp Gln Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro

850 855 860

Ala Leu Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser

865 870 875 880

Asp Phe Ala Phe Ala

885

Claims

1. 一种具有高转录活性的T7 RNA聚合酶变体，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2. 编码权利要求1所述的T7 RNA聚合酶突变体的多核苷酸。

3.含有权利要求2所述的多核苷酸的重组质粒。

4. 表达权利要求1所述的T7 RNA聚合酶变体或含有权利要求2所述的多核苷酸的重组微生物细胞。

5. 一种制备RNA的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的T7 RNA聚合酶变体以核糖核苷三磷酸为原料、利用编码目标RNA的DNA模板，转录合成目标RNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在35~40℃下反应1~3h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述目标RNA包括dsRNA、ssRNA、siRNA、miRNA、piRNA、mRNA和shRNA。

8. 含有权利要求1所述T7 RNA聚合酶变体的试剂盒。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有缓冲试剂、核糖核苷三磷酸。

10. 权利要求1所述T7 RNA聚合酶突变体在体外转录合成RNA中的应用。