CN1600858A - 一种抑制黑色素的siRNA及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑制黑色素形成的siRNA及其制备方法以及在祛除黑色素方面的应用，内容包括：构建了可以在大肠杆菌中高效表达的与抑制黑色素形成有关的长双链RNA(dsRNA)的表达载体pET－MELIII；转化大肠杆菌在优化条件下大规模发酵生产长双链RNA，每100克菌体(湿重)可生产204毫克dsRNA；均质机均质化破壁抽提RNA，CF－11树脂吸附纯化dsRNA；利用大肠杆菌发酵制备的RNase III对dsRNA进行水解，得到18－25bp的siRNAs；通过脂质体包埋siRNAs；实际使用证明制备的siRNA具有明显祛除黑色素斑的作用。

Description

一种抑制黑色素的siRNA及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种抑制黑色素生物合成的siRNA及其制备方法，以及siRNA在祛除黑色素中的应用。

背景技术

(1)关于黑色素

随着全球工业化的迅猛发展和环境的日益破坏，氟氯化合物剧增和臭氧层遭劫破坏，紫外线辐射增加，对人体造成了三种损伤：皮肤发炎、皮肤老化、色素沉积，其中色素沉积是指皮肤局部或全部的细胞沉积大量黑色素。黑色素发生于黑素细胞中，是一种蛋白质衍生物，呈褐色或黑色，黑素细胞能够活跃合成黑色素生物合成所必需的酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白，它们能使酪氨酸氧化成多巴，井进一步氧化形成黑色素，完成黑素化过程。人体肤色与黑素体的数目、大小、分布及类型有直接的关系。皮肤颜色与黑色素合成的整个系统有密切的关系，在黑素细胞内合成黑色素并形成黑色体，黑素体以单一的颗粒或以复合聚集的形式将黑素颗粒复合体输送到角质细胞，黑色素在角质细胞内的降解或沉积。任何一个环节发生障碍均可导致皮肤颜色变化。

黑色素的生成与酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白的合成及活性、酪氨酸和分子氧的浓度直接有关，其形成的速度和数量还常常受到下列因素的影响：多巴、硫氢基、微量元素、内分泌因素(包括：垂体分泌的垂体激素、肾上腺皮质激素、性激素、神经因素、甲状腺素、氨基酸及维生素)。酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白在黑色素的生物合成及其黑色素化的过程中起着极为重要的作用。通过RNA干扰的实现高效而专一性地干扰酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白基因的表达，从沉默酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白的活性，是抑制黑色素合成、改善皮肤颜色的有效途径。

(2)关于RNA干扰技术

RNA干扰(RNAi)指双链RNA(dsRNA)分子可以特异性地诱发与其同源序列的mRNA分子被降解，导致相应基因表达抑制的现象，是一种特殊的转录后的基因沉默(PTGS)现象。RNAi技术是基于RNAi现象而开发的抑制特定基因表达的分子生物学技术。最早有关RNAi现象的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的共抑制现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNAi现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNAi现象的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片段被证明是RNAi所必需的，称为小分子干扰RNA(siRNA)。果蝇中的研究成果基本阐明了RNAi的机制，当长链的dsRNA进入细胞时，它被一种Dicer核酸水解酶所识别并被剪切成21-25nt的siRNA，双链的siRNA被RNA解链酶解链，以单链的形式与另一核酸水解酶结合形成RNA酶复合体，复合体中的单链RNA象向导一样引导酶复合体识别序列与之互补的mRNA并将其水解，从而特异性地抑制基因的翻译表达。在线虫和植物中，单链的siRNA除了起“向导”作用之外，还可作为聚合反应的引物。在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，单链的siRNA为引物合成互补链，使得单链的mRNA成为双链RNA，新合成的dsRNA则又被核酸酶剪切成siRNA。RdRP的作用使RNAi的信号得到放大，只要极微量的dsRNA就能引起强烈的基因表达抑制。RNAi高效而专一地抑制基因表达的特性首先在线虫功能基因组研究中得到广泛的应用。在哺乳动物细胞中，超过30bp的dsRNA会通过激活PKR系统和RNase L，导致翻译起始的抑制以及非特异的RNA降解，最终导致非特异性的基因表达抑制。这种机制阻碍了RNAi技术在哺乳动物细胞中的应用。Elbashir等人用人工合成的21nt的互补双链siRNA在多种哺乳动物细胞中诱发了RNAi机制，并避开了PKR系统和RNase L，专一性地抑制了目的基因的表达，表明RNAi技术可以成功被应用于哺乳动物。

RNAi技术应用于哺乳动物的关键是制备siRNA。目前siRNA制备有多种方法：化学合成法、细胞内表达法和体外转录长片段dsRNA后用大肠杆菌III型RNase或Dicer水解法等。但以上方法价格昂贵、不易操作和推广困难。基于经济性与实用性，本发明采用更为高效、简便、低成本的方法，利用大肠杆菌发酵大规模制备dsRNA，通过分离纯化和酶切制备siRNAs分子的方法，大量制备抑制黑色素形成的siRNAs。

此发明可以在医药与化妆品领域中得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提出一种能够抑制黑色素形成的小分子干扰RNA(siRNA)及其制备方法，并提出siRNA在祛除黑色素中的应用。

本发明提出的能够抑制黑色素形成的siRNA，从具有SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列经转录获得的dsRNA经酶切获得。

本发明制备上述siRNA的方法包括在大肠杆菌表达能够抑制黑色素合成的双链RNA(dsRNA)以及用酶切得到siRNA 2个步骤：将黑色素生物合成关键酶的相关基因片段TYR、TRP1、TRP2重组后构建到表达有颈环结构双链RNA(dsRNA)的表达载体上，转化大肠杆菌后进行发酵，表达生产dsRNA；离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物，该抽提物用CF-11树脂进行吸附，洗去单链RNA和DNA分子，洗脱收集dsRNA部分，洗脱液通过酒精沉淀回收得到dsRNA(dsRNA的核苷酸序列由SEQ.ID.NO.1所示序列转录获得)；再以RNase III将长链的dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNase III，获得抑制黑色素生物合成的siRNAs。

本发明将上述siRNA用于祛除黑色素的方法如下：用卵磷脂等脂质对上述siRNAs进行脂质体包埋，制备siRNA脂质体用于祛除黑色素和色素斑。

本发明在大肠杆菌中表达抑制黑色素合成的dsRNA，包括构建一种可在大肠杆菌中高效表达dsRNA的表达载体pET-MELIII(见图1、2)，该载体以pET-22b为出发质粒，基本构成元件包括正向序列A片段、反向重复序列B片段和第三片断段C片断，其中A、B片段由酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白三个基因TYR、TRP1、TRP2的片段重组而成。三个片段的基因序列见SEQ.ID.NO1。具体克隆流程见图3所示，其方法是将重组基因片段以相反的方向将5’端连接到间隔序列C片段的两侧，然后克隆到一个带有T7启动子的载体中去。表达载体转化到能表达T7 RNA聚合酶的宿主大肠杆菌后中，重组基因的正反两个方向的DNA片段以及两者之间的C片段被依次转录，成为一条连续的RNA链，生理条件下可以形成互补的长双链RNA。经优化发酵表达，100g湿重的大肠杆菌菌体可得到204mg的dsRNA样品。

本发明中，重组基因的各重组元件分别通过PCR反应从人基因组DNA中获得，以特定限制性核酸内切酶酶切位点克隆为串联重组A片断(1kb)和与A片段互补而排列方向相反的B片段(1kb)。

本发明中，以黑色素生物合成中的三个关键酶基因(TRP1、TRP2、TYR)为靶位，选择合适片段设计PCR引物，通过PCR扩增从人基因组DNA中获得相应的带有特定限制性酶切位点的DNA片段，以特定限制性酶切位点进行分子克隆，获得一个重组基因TYR-TRP1-TRP2，并构建为表达双链RNA的大肠杆菌表达载体pETMELIII。

本发明中，发酵表达生产长双链RNA通过乳糖(6公斤/300升)或异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(ITPG)(1.5克/300升)诱导，以特异提高表达产量。

本发明中，通过脂质体包埋siRNAs的步骤如下：卵磷脂∶胆固醇∶维生素E＝(80-120)∶(8-12)∶1，溶解于氯仿中，梨形圆底烧瓶中35-40℃减压旋转蒸发形成脂膜，以纯氮气除去残留氯仿。35-40℃充氮气条件下，加入5-8mm直径的玻璃珠，以1克脂膜加入25毫升pH7.2的磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温80，10mg维生素C和待包埋的siRNAs)对脂膜进行旋转水化15-20分钟至乳白色。冰水浴条件下对水化液进行超声处理2-3次，每次3-5分钟。SephadexG-100分子筛层析纯化得到脂质体siRNAs。

本发明制备的脂质体siRNAs经涂抹渗透进入皮肤，达到祛除黑色素斑的目的。

本发明的优点：

(1)直接从黑色素生物合成的关键酶--酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白着手，通过分子生物学技术对酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白三个基因片段进行重组，进一步利用小分子RNA干扰的方法特异而高效地沉默酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白基因的表达，以达到抑制黑色素合成的目的。

(2)构建了能在大肠杆菌中高效表达dsRNA的表达载体。利用了一系列的分子生物学技术，设计和克隆表达元件，构建了适于在大肠杆菌中特异表达dsRNA的表达载体。

(3)提供了有效制备siRNA的技术。利用RNase III的酶学特性对经过提取和纯化的dsRNA进行水解，得到可用于小分子RNA干扰的siRNAs。

(4)提供了脂质体包埋siRNAs的技术，提高了siRNAs的稳定性，确保脂质体siRNAs的透皮特性，使产品更为适宜在化妆品中使用。

附图说明

图1为带颈环结构的双链RNA的质粒载体示意图。

图2为pET-MELIII克隆流程图。

图3为长双链RNA经CF-11纯化的琼脂糖凝胶电泳图谱。从左至右为泳道1-7，泳道1、2：吸附前抽提液；泳道3-5：吸附流出液；泳道6、7：纯化的dsRNA。

图4为dsRNA经RNaseIII酶切后的PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图。从左至右为泳道1-5，泳道1：dsRNA，泳道2：分子量标记，分别为21/34/68bp，泳道3：酶切0.5小时，泳道4：酶切1小时，泳道5：酶切3小时。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明。

1.各表达元件的克隆：  根据Genebank公布的人类酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白基因的序列TYR、TRP1、TRP2，分别选择相关片段序列，设计特异引物分别从人基因组DNA中进行PCR扩增获得相应片段序列，PCR扩增时在片段两端分别加入限制性核酸内切酶酶切位点以备克隆需要。TRP1片段5’端和3’端的酶切位点分别是EcoRI和HindIII位点，TRP2片段5’端和3’端的酶切位点分别是HindIII和XbaI/XhoL位点，TYR片段5’端和3’端的酶切位点分别是ClaI/BamHI和EcoRI位点，利用质粒pSK上的多克隆位点，将这些片段分别克隆到pSK载体上，进一步把以上片段串联起来，组成正向的重组基因A片断和反向的重组基因B片断。分别用BamHI/XbaI和ClaI/XhoL双酶切位点将A、B片段克隆到构建的pSK-loops的C片段(360bp)两侧，再通过XbaI和XhoL双酶切位点将A-loop-B片段克隆到pET-22b载体(Novagen公司产品)上，得到重组质粒pET-22b-A-loop-B，即含有颈环结构的重组表达载体pET-MELIII，克隆后的表达质粒以PCR反应和酶切反应鉴定。

2.发酵：将转化了pET-MELIII的大肠杆菌克隆菌rp接种到200mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下在180-220转/分的培养箱中培养过夜，转接到25升的小发酵罐培养8-9小时，再转入300升LB液体培养基(溶积500升)的大发酵罐中，37℃发酵培养3小时后加入6kg乳糖或1.5g IPTG诱导表达dsRNA，继续发酵3小时，发酵液用上海离心机研究所产的GL105型离心机离心收集菌体，冷冻储藏备用。

3.dsRNA提取：取冻藏的大肠杆菌发酵菌体30-50克，充分悬浮于500-600mL的PBS缓冲液中，均质机均质破壁，68-72℃水浴锅加热30分钟，7000rpm低温离心30分钟去除变性的沉淀蛋白质，上清部分补加乙醇至终浓度为20％。

4.dsRNA的纯化：CF-11树脂(每500mL破壁上清用30克树脂)用20％乙醇平衡后，加到破壁上清处理液中搅拌均匀，混合物在冰浴上充分吸附过夜。过夜吸附液通过抽滤除去上清液，并用冰浴预冷的18％酒精溶液抽滤洗涤3-4次，充分洗去DNA和单链RNA。接着用预热至60-70℃的STE缓冲液抽滤洗脱收集双链RNA。收集到的dsRNA抽滤液中加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAc，-20℃沉淀30分钟，10000rpm离心20分钟取沉淀，沉淀用70％的冷乙醇悬浮洗去盐份，离心留取沉淀，沉淀用10mM pH8.0的TE溶解得到纯化的dsRNA，-40℃冰箱保藏。图3为纯化前后的RNA样品的琼脂糖凝胶电泳图谱，从图中可以看出纯化得到的样品为单一的长链dsRNA。CF-11层析柱纯化得到的dsRNA的OD260/OD280＝2.0，表明样品的纯度高。100g大肠杆菌菌体共得到dsRNA样品204 mg。

5.siRNA的获得：经CF-11层析柱纯化得到的dsRNA经定量后，按每微克ds RNA用0.02-0.03微克大肠杆菌来源的RNase III在37℃水解3小时。反应溶液中含1mM DTT，50mMTris-HCl，10mM MnCl₂，50mM NaCl，pH7.5。反应液中加入EDTA终止反应，电泳检测结果显示水解1小时即达到好的水解效果，见图4所示。

6.siRNAs的脂质体包埋，按卵磷脂∶胆固醇∶维生素E＝100∶10∶1配方，分别秤取，溶解于适量氯仿中，梨形圆底烧瓶中35-40℃减压旋转蒸发形成脂膜，以纯氮气循环除去残留溶剂。加入十数粒5-8mm直径的玻璃珠，35-40℃温度并在充氮气条件下，以1克脂膜加入25毫升pH7.2的磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温80，10mg维生素C和待包埋的siRNAs)对脂膜进行旋转水化15-20分钟至乳白色。冰水浴条件下对水化液进行超声处理2-3次，每次3-5分钟。Sephadex G-100分子筛层析纯化得到脂质体siRNAs。

               SEQUENCE LISTING

<110>上海复旦新杨生物科技有限责任公司

     上海复远生物化学研究所有限公司

     复旦大学

<120>一种抑制黑色素msiRNA及其制备方法和应用

<130>11

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1069

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>1

gggatccaac atcttcgatt tgagtgcccc agagaaggac aaattttttg cctacctcac     60

tttagcaaag cataccatca gctcagacta tgtcatcccc atagggacct atggccaaat    120

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cccccgagtc tgcatgacgg tggacagcct agtgaacaag gagtgctgcc cacgcctggg    900

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agccgacaca aggccctgga gtggtcccta catcctacga aaccaggatg accgtgagct   1020

gtggccaaga aaattcttcc accggacctg caagtgcaca gtctagagc               1069

Claims (6)

1.一种抑制黑色素形成的siRNAs，其特征在于从具有SEQ.ID.NO1核苷酸序列转录获得的dsRNA经酶切获得。

2、一种包含权利要求1所述siRNAs的dsRNA，其特征在于具有SEQ.ID.NO1的核苷酸转录序列。

3.一种如权利要求1所述的siRNAs的制备方法，其特征在于将黑色素生物合成酶的相关基因片段TYR、TRP1、TRP2构建到表达有颈环结构双链RNA的表达载体上，转化大肠杆菌后进行发酵，表达生产dsRNA；离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物，该抽提物用CF-11树脂进行吸附，洗去单链RNA和DNA分子，洗脱收集dsRNA部分，洗脱液通过酒精沉淀回收得到dsRNA；再以RNaseIII将长链的dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNaseIII获得抑制黑色素生物合成的siRNAs。

4.一种可在大肠杆菌中高效表达的dsRNA的表达载体，其特征在于该载体为pETMELIII：它以pET-22b为出发质粒，基本构成元件包括正向序列A片段、反向重复序列B片段和第三片断段C片断，其中A、B片段由酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白三个基因TYR、TRP1、TRP2的片段重组而成。

5.一种如权利要求1所述的siRNAs在祛除黑色素中的应用。

6、根据权利要求5所述的siRNAs在祛除黑色素中的应用，其特征在于对siRNAs用卵磷脂脂质体包埋，制备siRNAs脂质体。

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