CN105647995B - 一种提取2′，3′-环形核苷单磷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提取2′,3′‑环形核苷单磷酸的方法，包括如下步骤：(1)提取基因组DNA，PCR扩增，制得基因if3；(2)将基因if3与表达质粒连接，转化后，经发酵培养，制得重组菌发酵液；(3)分离重组菌发酵液中的菌体，破碎细胞，镍柱亲和层析提纯，静置，固液分离，取上清液；(4)将上清液经超滤去除蛋白杂质，经C18反向色谱柱进行高效液相分离，分别制得含四种2′,3′‑环形核苷单磷酸溶液。本发明提供的方法首次实现了从大肠杆菌中同时直接提取四种2′,3′‑环形核苷单磷酸。通过微生物生物发酵，从头合成四种2′,3′‑环形核苷单磷酸，不需要特定的前体物，无化学合成法的污染，简单方便，每升培养液可提取5mg的四种纯品2′,3′‑环形核苷单磷酸。

Description

一种提取2′，3′-环形核苷单磷酸的方法
技术领域
本发明涉及一种提取2',3'-环形核苷单磷酸的方法，特别涉及一种利用重组蛋白从大肠杆菌工程菌中同时提取腺苷-2',3'-环形单磷酸、鸟苷-2',3'-环形单磷酸、胞苷-2',3'-环形单磷酸和尿苷-2',3'-环形单磷酸四种2',3'-环形核苷单磷酸的方法，属于生物技术技术领域。
背景技术
环形核苷酸是细胞内重要的第二信使，参与细胞内多种信号转导途径的调控。第二信使学说是E.W.萨瑟兰1965年提出，他认为人体内各种含氮激素(蛋白质、多肽和氨基酸衍生物)都是通过细胞内的环形腺苷酸(3′,5′-cAMP)而发挥作用的，并把3′,5′-cAMP称为第二信使，这是最早发现的环形核苷酸类第二信使。随后，研究人员在多种生物细胞内发现了环形鸟苷酸(3′,5′-cGMP)，环形胞苷(3′,5′-cCMP)，环形尿苷酸(3′,5′-cUMP)，环形二鸟苷酸(c-di-GMP)，环形二腺苷酸(c-di-AMP)及环形鸟苷腺苷酸(cGAMP)等均可作为第二信使参与胞内信号通路的调控。除了3′,5′-环形核苷单磷酸之外，埃德温(Edwin)等人还首次在人的肾脏细胞中发现了腺苷-2',3'-环形单磷酸(2′,3′-cAMP)，随后人们又在哺乳动物的大脑等组织细胞中发现了腺苷-2',3'-环形单磷酸的存在。科研人员还从植物细胞中检测到腺苷-2',3'-环形单磷酸和鸟苷-2',3'-环形单磷酸(2′,3′-cGMP)，从一株荧光假单胞菌中检测到胞苷-2',3'-环形单磷酸(2′,3′-cCMP)和尿苷-2',3'-环形单磷酸(2′,3′-cUMP)的存在。有关2′,3′-环形核苷单磷酸生理功能的研究较少，现有的研究结果认为，2′,3′-环形核苷单磷酸与组织细胞的损伤有一定的关系，在受损的组织细胞内，2′,3′-环形核苷单磷酸的含量会明显升高；腺苷-2',3'-环形单磷酸具有激活细胞线粒体膜上通透性孔洞的作用，引起细胞凋亡；研究还发现与正常的脑部细胞相比，感染了HIV病毒的脑部细胞内2′,3′-环形核苷单磷酸降解酶的磷酸化水平更高。2',3'-环形核苷单磷酸(2′,3′-cNMPs)与细胞损伤的密切相关性激发了科研人员越来越大的兴趣。
随着2′,3′-环形核苷单磷酸吸引了越来越多的关注，其在科学研究和医学应用上将有更多的需求。目前2′,3′-环形核苷单磷酸的制备均采用化学合成的方法，产量低，价格高，从而极大限制了其开发应用。
发明内容：
本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用重组IF3蛋白与四种2′,3′-环形单磷酸的相互作用快速制备四种2′,3′-环形核苷酸的方法。该方法无需特定的前体物质，利用微生物的生长从头合成四种2′,3′-环形核苷单磷酸，并利用一种重组蛋白快速地将微生物合成的四种2′,3′-环形核苷单磷酸提纯。
本发明技术方案如下：
一种提取2',3'-环形核苷单磷酸的方法，包括如下步骤：
(1)提取大肠埃希氏菌(Escherichia coli)K12菌株的基因组DNA，利用PCR扩增编码IF3蛋白的基因if3，制得基因if3；
所述PCR特异引物序列如下：
F:GGAATTCCATATGATTAAAGGCGGAAAACG，
R:CCGCTCGAGCTGTTTCTTCTTAGG；
(2)将步骤(1)制得的基因if3酶切后与同样经酶切的表达质粒PET-22b连接，然后转化到E.coli BL21(DE3)菌株中，进行发酵培养，制得重组菌发酵液；
(3)分离步骤(2)制得的重组菌发酵液中的菌体，破碎细胞，镍柱亲和层析提纯重组蛋白IF3，然后0℃静置2.5～3.5d，固液分离，取上清液；
(4)将步骤(3)制得的上清液经超滤去除蛋白杂质，滤液经C18反向色谱柱进行高效液相分离，分别制得含四种2',3'-环形核苷单磷酸溶液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的PCR扩增体系(50μL)如下：
PCR反应条件如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃终延伸5min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中酶切采用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切反应体系如下：
反应条件：37℃温浴30min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中连接的反应体系如下：
酶切后的载体pET-22b 1μL
酶切后的基因if3 4μL
Solution I 5μL
反应条件：16℃连接过夜。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，发酵培养步骤如下：
先在35～38℃、150～200rpm条件下扩大培养至菌液在波长为600nm吸光度为0.8；然后在18～22℃、100～140rpm继续培养30min；再加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续诱导培养22～25小时；
所述发酵培养基为淡水LB培养基，组分如下：
10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母粉，pH 8.0，蒸馏水定容至1L。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，破碎细胞步骤如下：
将分离得到的菌体重悬于裂解缓冲液中，在压力为950～1050bar的条件下破碎细胞，12000rpm离心50min，取上清液；
所述的裂解缓冲液组分为：50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH 8.0。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，镍柱亲和层析提纯重组蛋白IF3步骤如下：
将破碎细胞后的上清液上样镍柱，每根镍柱装2mL镍胶，待上清液流过镍胶后，每根镍柱用20mL裂解缓冲液平衡，用20mL冲洗缓冲液冲洗，最后用10mL的洗脱缓冲液洗脱，制得重组蛋白IF3溶液；
所述裂解缓冲液组分为：50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH 8.0；
所述冲洗缓冲液组分为：50mM Tris-HCl、150mM NaCl、20mM咪唑，pH 8.0；
所述洗脱缓冲液组分为：50mM Tris-HCl、150mM NaCl、250mM咪唑，pH 8.0。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，超滤为采用截留分子量为3K的超滤管超滤。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，所述C18反向色谱柱进行高效液相分离的分离程序为：0min，B液0％；2.5min，B液0％；5min，B液30％；10min，B液60％；14min，B液100％；21min，B液100％；22min，B液50％；23min，B液0％；30min，B液0％；流速为10ml/min，检测波长为254nm；
流动相为：A液，10mM醋酸铵溶液，pH 5.0；B液，将A液与甲醇按体积比3:1的比例混合。
有益效果
1、本发明提供的方法首次实现了从大肠杆菌中同时直接提取四种2',3'-环形核苷单磷酸。通过微生物生物发酵，从头合成四种2′,3′-环形核苷单磷酸，不需要特定的前体物，无化学合成法的污染，简单方便，每升培养液可提取5mg的四种纯品2',3'-环形核苷单磷酸；
2、本发明采用大肠杆菌进行生物发酵，由于其遗传背景清楚、生长速度快，有利于进一步采用生物工程方法进行改进，提高产量。
附图说明
图1、镍柱亲和层析纯化的重组蛋白IF3的电泳图。
图中：M、蛋白质分子量标记(marker)；IF3、镍柱亲和层析纯化后的重组IF3蛋白；
图2、提取含4种2′,3′-环形核苷单磷酸溶液的HPLC分析；
图3、纯化得到的2′,3′-cCMP液相色谱和质谱分析；
(a)，液相色谱分析纯化得到的2′,3′-cCMP；
(b)，一级质谱分析纯化得到的2′,3′-cCMP，图谱显示提纯的2′,3′-cCMP的质荷比为306.0491(z＝1),与理论值306.0491完全相符；
(c)，二级质谱分析一级质谱中得到的质荷比为306.0491(z＝1)的离子，片段化方式如(d)所示；
(d)，2′,3′-cCMP结构示意图；
图4、液相色谱，质谱分析纯化得到的2′,3′-cUMP；
(a)，液相色谱分析纯化得到的2′,3′-cUMP；
(b)，一级质谱分析纯化得到的2′,3′-cUMP，图谱显示提纯的2′,3′-cCMP的质荷比为307.0331(z＝1),与理论值307.0331完全相符；
(c)，二级质谱分析一级质谱中得到的质荷比为307.0331(z＝1)的离子，片段化方式如(d)所示；
(d)，2′,3′-cUMP结构示意图；
图5、液相色谱，质谱分析纯化得到的2′,3′-cGMP；
(a)，液相色谱分析纯化得到的2′,3′-cGMP；
(b)，一级质谱分析纯化得到的2′,3′-cGMP，图谱显示提纯的2′,3′-cCMP的质荷比为346.0552(z＝1),与理论值346.0552完全相符；
(c)，二级质谱分析一级质谱中得到的质荷比为346.0552(z＝1)的离子，片段化方式如(d)所示；
(d)，2′,3′-cGMP结构示意图；
图6、液相色谱，质谱分析纯化得到的2′,3′-cAMP；
(a)，液相色谱分析纯化得到的2′,3′-cAMP；
(b)，一级质谱分析纯化得到的2′,3′-cAMP，图谱显示提纯的2′,3′-cCMP的质荷比为330.06(z＝1)，与理论值330.0603极为相符；
(c)，二级质谱分析一级质谱中得到的质荷比为330.06(z＝1)的离子，片段化方式如(d)所示；
(d)，2′,3′-cAMP结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所述大肠杆菌K12菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，菌种保藏号CICC 10424；
大肠杆菌BL21(DE3)感受态购自北京全式金生物技术有限公司，地址：北京市海淀区西小口路66号中关村东升科技园B-3号楼四层。
实施例1
一种重组蛋白表达菌株构建方法，步骤如下：
1.大肠杆菌转录起始因子IF3编码基因的克隆
1.1大肠杆菌K12基因组DNA的提取
参照百泰克公司基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA。
1.2引物设计与合成
根据IF3编码基因序列设计两条引物：
F:GGAATTCCATATGATTAAAGGCGGAAAACG，
R:CCGCTCGAGCTGTTTCTTCTTAGG，
由上海生工生物技术公司合成。
1.3利用PCR进行基因序列扩增及产物回收
(1)以F和R为引物，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃终延伸5min。
PCR扩增体系(50μL)如下：
(2)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果获得一条约500bp的DNA片段。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增出的DNA片段，制得基因if3。
2.表达载体及表达菌株的构建
(i)DNA片段与表达载体酶切
将制得的基因if3和载体pET-22b用NdeI和XhoI双酶切，酶切反应体系如下：
盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上瞬时离心2sec，把样品集中在管底，37℃温浴30min。
(ii)对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收目的DNA片段。
(iii)DNA片段与表达载体连接
连接反应体系如下：
酶切后的载体pET-22b 1μL
酶切后的基因if3 4μL
Solution I 5μL
盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上瞬时离心2sec，把样品集中在管底，16℃连接过夜。
(iv)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET-22b-if3载体转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态。
(v)转化的大肠杆菌BL21(DE3)涂于含100μg/L氨苄青霉素LB培养基，37℃过夜培养。
(vi)转化子送上海生工生物技术有限公司测序验证，获得转入重组pET-22b-if3载体的表达菌株。
实施例2
1.重组菌株的发酵培养
(1)种子的培养
挑取平板上的转入重组pET-22b-if3载体的表达菌株到100mL加入了终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，180rpm过夜培养。
(2)按照1％接种量，将培养好的种子液转接到装液量为1L的摇瓶中。37℃，180rpm培养至菌液在波长为600nm吸光度为0.8时，将培养条件改为20℃，120rpm，继续培养30min后，加入终浓度为0.1mM的IPTG。继续培养24hr。
2.提纯IF3蛋白
(1)提纯蛋白所用的缓冲液为
裂解缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0。
冲洗缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0。
洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0。
(2)10000rpm离心5min收集菌体，按照1L菌液收集的菌体用50mL裂解缓冲液的比例加入裂解缓冲液重悬菌体，压力(1000bar)破碎细胞。
(3)将步骤(2)得到的细胞破碎液，在4℃温度下，12000rpm离心50min去除不可溶沉淀。
(4)将上述离心后的上清液，上样镍柱(每根镍柱装2mL镍胶)。待上清液流过镍胶后，每根镍柱用20mL裂解缓冲液平衡，之后每根镍柱用20mL冲洗缓冲液冲洗。最后每根镍柱用10mL的洗脱缓冲液洗脱蛋白。即得到提纯的目的蛋白IF3。
实施例3
1.2′,3′-环形核苷单磷酸混合物的提取
(1)将洗脱得到的目的蛋白，0℃静置3d，此时蛋白溶液将会出现明显的沉淀。将蛋白溶液12000rpm离心20min，得到上清液。
(2)将步骤(1)中得到的上清液，用截留分子量为3K的超滤管超滤，去除残留的蛋白，超滤膜滤过液即为含有4种2′,3′-环形核苷单磷酸溶液。
2.四种环形核苷酸2′,3′-cAMP，2′,3′-cGMP，2′,3′-cCMP和2′,3′-cUMP纯品的提取
(1)将得到的2′,3′-环形核苷单磷酸溶液，采用C18反向色谱柱进行高效液相色谱分离得到四种2′,3′-环形核苷单磷酸纯品。所用的流动相为：A液，10mM醋酸铵溶液，pH5.0；B液，75％A液加入25％甲醇。
(2)上述步骤中所用的分离程序为：0min，B液0％；2.5min，B液0％；5min，B液30％；10min，B液60％；14min，B液100％；21min，B液100％；22min，B液50％；23min，B液0％；30min，B液0％。流速为10ml/min，检测波长为254nm。
对上述4种2′,3′-环形核苷单磷酸溶液进行HPLC分析，结果如图2所示，对上述4种2′,3′-环形核苷单磷酸溶液进行液相色谱和质谱分析，结果如图3-6所示。

Claims (9)

1.一种提取2', 3'-环形核苷单磷酸的方法，包括如下步骤：
（1）提取大肠埃希氏菌（Escherichia coli）K12菌株的基因组DNA，利用PCR扩增编码IF3蛋白的基因if3，制得基因if3；
所述PCR特异引物序列如下：
F: GGAATTCCATATGATTAAAGGCGGAAAACG，
R: CCGCTCGAGCTGTTTCTTCTTAGG；
（2）将步骤（1）制得的基因if3酶切后与同样经酶切的表达质粒PET-22b连接，然后转化到E.coli BL21（DE3）菌株中，进行发酵培养，制得重组菌发酵液；
（3）分离步骤（2）制得的重组菌发酵液中的菌体，破碎细胞，镍柱亲和层析提纯重组蛋白IF3，然后0℃静置2.5～3.5 d，固液分离，取上清液；
（4）将步骤（3）制得的上清液经超滤去除蛋白杂质，滤液经C18反向色谱柱进行高效液相分离，分别制得含四种2', 3'-环形核苷单磷酸溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的PCR扩增体系如下：
灭菌蒸馏水 32.2 μL
5×TransStart FastPfu 缓冲液 10 μL
dNTP 混合物 5 μL
50 μM引物F 0.4 μL
50 μM引物R 0.4 μL
基因组 DNA 1 μL
TransStart FastPfu DNA 聚合酶 1 μL
PCR反应条件如下：
95℃预变性5 min；95℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，30个循环；72℃终延伸5 min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中酶切采用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切反应体系如下：
缓冲液 2 μL
表达质粒PET-22b或基因if3 8 μL
限制性内切酶NdeI 1 μL
限制性内切酶XhoI 1 μL
灭菌蒸馏水 8 μL
反应条件：37℃温浴30 min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中连接的反应体系如下：
酶切后的载体pET-22b 1 μL
酶切后的基因if3 4 μL
Solution I 5 μL
反应条件：16℃连接过夜。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，发酵培养步骤如下：
先在35～38℃、150～200 rpm条件下扩大培养至菌液在波长为600 nm吸光度为0.8；然后在18～22℃、100～140 rpm继续培养30 min；再加入终浓度为0.1 mM的IPTG，继续诱导培养22～25小时；
所述发酵培养基为淡水LB培养基，组分如下：
10 g NaCl，10 g 蛋白胨，5 g 酵母粉，pH 8.0，蒸馏水定容至1 L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，破碎细胞步骤如下：
将分离得到的菌体重悬于裂解缓冲液中，在压力为950～1050 bar的条件下破碎细胞，12000 rpm离心50 min，取上清液；
所述的裂解缓冲液组分为：50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，镍柱亲和层析提纯重组蛋白IF3步骤如下：
将破碎细胞后的上清液上样镍柱，每根镍柱装2 mL镍胶，待上清液流过镍胶后，每根镍柱用20 mL裂解缓冲液平衡，用20 mL冲洗缓冲液冲洗，最后用10 mL的洗脱缓冲液洗脱，制得重组蛋白IF3溶液；
所述裂解缓冲液组分为：50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0；
所述冲洗缓冲液组分为：50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、20 mM咪唑，pH 8.0；
所述洗脱缓冲液组分为：50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、250 mM咪唑，pH 8.0。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，超滤为采用截留分子量为3K的超滤管超滤。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述C18反向色谱柱进行高效液相分离的分离程序为：0 min，B液0% ；2.5 min，B液0%；5 min，B液30%；10 min，B液60%；14min，B液100%；21 min，B液100%；22 min，B液50%；23min，B液0%；30 min，B液0%；流速为10ml/min，检测波长为254 nm；
流动相为：A液，10 mM醋酸铵溶液，pH 5.0；B液，将A液与甲醇按体积比3:1的比例混合。
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