DE69923274T2

DE69923274T2 - Deoxynukleotidtriphosphatkinase aus Insektenzellen zur Synthese von Nukleosidmonophosphaten

Info

Publication number: DE69923274T2
Application number: DE69923274T
Authority: DE
Inventors: Dr. Hans-Georg Ihlenfeldt; Dr. Brigitte Munch-Petersen; Dr. Jure Piskur; Dr. Leif Sondergaard
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-10-12
Filing date: 1999-10-06
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2019-10-07
Also published as: EP0999275A3; DK0999275T3; US7625735B2; DE69923274D1; CA2284101A1; JP2000139481A; CA2284101C; EP0999275A2; US20020192788A1; US20060252131A1; JP4350235B2; ATE287452T1; EP0999275B1

Description

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante Kinase aus Insektenzellen, wie etwa z.B. Drosophila Melanogaster, die während der Synthese von Nukleosidmonophosphaten ohne Zugabe von stabilisierenden SH-Reagenzien, ohne stabilisierende Proteine und Detergenzien stabil bleibt und alle vier natürlichen Desoxynukleoside akzeptiert. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA-Sequenz, die eine erfindungsgemäße Kinase codiert, wie auch ein Verfahren zur Herstellung der Kinase gemäß der Erfindung und ihre Verwendung während der Synthese von Nukleosidmonophosphaten.
(Desoxy)-nukleosidkinasen katalysieren die Phosphorylierung von Nukleosiden bzw. Desoxynukleosiden zu den entsprechenden Nukleotidmonophosphaten und haben daher eine wichtige Rolle im "Salvage-Pfad" des Nukleotidmetabolismus.
Die katalysierte Reaktion ist:
Die Desoxynukleosidmonophosphate sind Ausgangsprodukte für die Desoxynukleosidtriphosphate, die in einem wachsenden Ausmaß als Reagenzien für die PCR-Reaktion verwendet werden.
Die Desoxynukleosidmonophosphate sind derzeit auf drei Arten erhältlich:

1. aus der Hydrolyse von Fischsperma
2. durch chemische Synthese aus Desoxynukleosiden
3. durch enzymatische Synthese aus Desoxynukleosiden.

Die bislang bekannten Verfahren haben eine Anzahl von Nachteilen. So werden während der Hydrolyse von Fischsperma alle vier Monophosphate in etwa denselben Mengen hergestellt; dies ist eine Tatsache, welche die Marktanforderungen verfehlt (z.B. wird d-UMP, das partiell anstelle von d-TMP verwendet wird, aus d-CMP hergestellt). Weiterhin ist aus der Hydrolyse resultierendes d-TMP mit ungefähr 2% d-UMP kontaminiert und kann nicht praktisch isoliert werden.
Weiterhin wird der tierische Ursprung der Edukte als von einem regulatorischen Standpunkt (GMP) aus kritisch angesehen. Darüber hinaus ist der Markt von Monophosphaten aus Fischsperma sehr limitiert.
Während der chemischen Synthese werden eine Anzahl von Nebenprodukten gebildet, die schwierig durch chromatographische Reinigung zu trennen sind. Zusätzlich müssen verschiedene Basen (z.B. Guanosin) vor der Phosphorylierung mit Schutzgruppen versehen werden, was die Synthesezeit beachtlich verlängert.
Die Nachteile des Standes der Technik wurden durch die Bereitstellung einer rekombinanten multifunktionellen Desoxynukleosidkinase aus Insektenzellen wie etwa insbesondere Drosophila melanogaster (Dm-dNK) gelöst, die während der Synthese von Nukleosidmonophosphaten ohne Zugabe von stabilisierenden SH-Reagenzien, ohne stabilisierende Proteine und Detergenzien stabil bleibt und die alle vier natürlichen Desoxynukleoside akzeptiert: Thymidin (dThd), Desoxycytidin (dCyd), Desoxyadenosin (dAdo) und Desoxyguanosin (dGuo). In der vorliegenden Erfindung bedeutet stabil, das die Ausbeutenrate für die katalysierte Reaktion innerhalb von 5 Stunden, vorzugsweise 10 Stunden, insbesondere bevorzugterweise innerhalb von 12 Stunden bei 37°C praktisch nicht sinkt. Es ist überraschend, dass das Enzym für eine so lange Zeit ohne Zugabe von Thiol enthaltenden Stabilisatoren stabil bleibt. diese Stabilität ist bei anderen Kinasen bislang nicht beobachtet worden (1–9). Durch Weglassen dieser Stabilisatoren bei Verwendung der Kinasen gemäß der Erfindung bei der Synthese wird die Synthese billiger und vor allem kann die Produktreinigung in weitem Ausmaß vereinfacht werden.
Darüber hinaus weisen bislang bekannte Kinasen eine beachtlich höhere Substratspezifität auf; als Folge ist es für die Synthese individueller Nukleoside nicht mehr notwendig, die entsprechende spezifische Kinase zu haben. Besonders vorteilhaft ist die niedrige Spezifität für die Synthese von modifizierten Nukleosidanalogen, wie etwa Didesoxynukleosiden oder Basen- oder Zucker-modifizierten Nukleosiden. Basen-modifizierte Nukleoside sind beispielsweise 7-Deazanukleoside, C-Nukleoside und Nukleotide, die mit Reportergruppen (Farbstoff, Digoxigenin, Biotin) an der Base markiert sind. Zucker-modifizierte Nukleoside sind beispielsweise Azathymidin, Arabinosylthymidin. Die kinetischen Konstanten der Drosophila-Kinase im Vergleich zu bekannten analogen Enzymen sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die spezifische Aktivität kc der Kinase gemäß der Erfindung ist mehrfach höher als die von zuvor bekannten Kinasen. Die Aktivität des Enzyms wurde wie in der Referenz beschrieben gemessen: Munch-Peterson et al. (1991), J. Biol. Chem. 266, 9032–9038. Dadurch ist eine beachtlich niedrigere Menge an Enzym zur Synthese von dNMPs notwendig (Faktor 3,5–14.000, vgl. Kc-Werte in Tabelle 1). Die Spezifitätskonstante (k_c/K_M) der erfindungsgemäßen Kinase übersteigt die der bislang bekannten Kinasen um mehrere Potenzen und liegt im Bereich der Diffusionskonstante. Dies führt zu einer kompletten Ausbeute, wenn die Kinase zur d-NMP-Synthese zugegeben wird. Sie sind um den Faktor 2 bis 6.500 höher als vorbekannte Kinasen, siehe 1.
Überraschenderweise ist das Enzym der vorliegenden Erfindung bei 60°C noch stabil, was für das Reaktionsprozedere vorteilhaft ist. Vorzugsweise weist das Enzym gemäß der Erfindung bei T = 37°C eine Halbwertszeit von t_1/2 ≥ 50 h in Trispuffer mit 5 mM MgCl₂ und t_1/2 ≥ 25 h in Wasser auf und akzeptiert alle natürlichen Desoxynukleoside (Beispiel 6).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Kinasen aus anderen Nicht-Vertebratenorganismen, insbesondere aus anderen Tierspezies der Hexapoden-Klasse, die vergleichbare Eigenschaften mit denen der Drosophila-Kinase zeigen. Insbesondere weisen solche Kinasen im wesentlichen die oben beschriebene Stabilität und die oben beschriebene Substratspezifizät auf. Bevorzugte Kinasen sind solche, die aus der Subklasse der Pterygota gewonnen werden, und insbesondere werden solche bevorzugt aus der Diptera-Klasse, insbesondere bevorzugt aus der Drosophilidae-Familie.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA-Sequenz wie auch funktionelle Fragmente derselben, welche für die Kinase gemäß der Erfindung codieren. Die DNA-Sequenz gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die im folgenden ausgelisteten Primer mit der DNA-Sequenz der Kinase gemäß der Erfindung hybridisieren:
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind auch solche Kinasen und DNA-Sequenzen, an deren DNA-Sequenz Oligonukleotide mit den SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7 und 8 oder mit den SEQ-ID NO: 2, 4, 5, 7 und 8 oder mit den SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7 und 8 hybridisieren.
Die folgenden Hybridisierungsbedingungen sind vorteilhaft:

– Hybridisierung: 0,75 M NaCl, 0,15 Tris, 10 mM EDTA, 0,1 Natriumpyrophosphat, 0,1% SLS, 0,03% BSA, 0,03% Ficoll 400, 0,03 PVP und 100 μd/ml gekochte Kalbsthymus-DNA bei 50°C für ungefähr 12 Stunden.
– Waschen: 3 × 30 min mit 0,1 X SET, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat und 0,1 M Phosphatpuffer bei 45°C.

Die Kinasesequenz gemäß der Erfindung ist in 5, SEQ ID NO: 1 angegeben.
Die DNA-Sequenz gemäß der Erfindung ist aus Drosophila Melangogaster durch das nachfolgend beschriebene Verfahren erhältlich:
Ein ein 1,1 kbp cDNA-Insert enthaltender pBluescript SK +/– Phagmid, der neben anderen das vermutlich für die Desoxynukleosidkinase codierende Gen enthält, wurde vom Berkeley Drosophila-Genomsequenzierungsprojekt erhalten (Klon LD15983). Die ersten 600 Basenpaare des 5'-Endes der 1,1 kbp cDNA, die über EcoRI und XhoI in die Mehrfachklonierungsstelle (MCS) des Phagmids geklont wurden, waren bereits durch Harvey et al., University of California, Berkeley sequenziert worden. Basierend auf diesen Sequenzinformationen wurden neue Primer entwickelt (Dm-TK1 und Dm-TK2/SEQ ID NO: 9: 5'-TCCCAATCTCACGTGCAGATC-3' und SEQ ID NO: 10: 5'-TTCATCGAAGAGTCCATTCAC-3', was eine vollständige Sequenzierung des Inserts ermöglichte. Dm-TK1 ist ein 21 bp Sense-Primer, der stromauf des angenommenen Translationsstartbereichs bindet. Dm-TK2 wurde als 21 bp Sense-Primer anhand des 3'-Bereich des bereits sequenzierten cDNA-Teils entworfen.
Mit dieser Sequenz konnte ein offener Leserahmen, der 750 bp enthält und für ein Protein mit 250 Aminosäuren codiert, identifiziert werden. Die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 ist in 5 dargestellt. Das berechnete Molekulargewicht dieses Proteins betrug 29 kDa und entspricht daher mit dem von Munch-Peterson et al. 1998 angegebenen Daten, die ein Gewicht von knapp 30 kDa für native Dm-dNK anzeigen.
Ausgehend von der Sequenzinformation konnte das für die Dm-dNK codierende Strukturgen aus dem 1,1 kbp cDNA-Insert des pBluescript SK +/– Phagmiden durch die "Polymerasekettenreaktions"-Technik (PCR (K. B. Mullis und F. A. Faloona, Methods in Enzymol. 155 (1987) 335–350) isoliert werden. Dafür wurde ein spezifisches Primerpaar (siehe SEQ ID NO: 11: 5'-GCGCGAATTCATGGCGGAGGCAGCATCCTGTGC-3' und SEQ ID NO: 12: 5'-GCGCAAGCTTATTATCTGGCGACCCTCTGGC-3') mit dem entsprechenden Endonukleaserestriktionsort der späteren Insertion in geeignete Expressionsplasmide synthetisiert. So hat der 5'-Primer (Dm-dNK3) eine EcoRI-Endonukleaserestriktionsstelle stromaufwärts von der codierenden Sequenz, während der 3'-Primer (Dm-dNK4) eine HindIII-Endonukleaserestriktionsstelle stromabwärts der codierenden Sequenz enthält. Weiterhin enthält der 3'-Primer stromab von der codierenden Sequenz zwei Stopcodons für die sichere Beendigung der Translation. Weiterhin waren geeignete Primer, die für die Translationsinitiierung in E. coli optimiert waren, die folgenden:
Klonierung des Strukturgens für die Dm-dNK in pUC18
Die PCR-Präparation wurde auf ein Agarosegel gegeben und das 750 Bp-Strukturgen wurde aus dem Agarosegel isoliert. Das PCR-Fragment wurde mit EcoRI und HindIII-Restriktionsendonukleasen für 1 Stunde bei 37°C geschnitten. Gleichzeitig wurde das pUC18-Plasmid mit EcoRI und HindIII-Restriktionsendonukleasen für 1 Stunde bei 37°C geschnitten, die Präparation wurde dann durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das 2635 Bp-Vektorfragment isoliert. Nachfolgend wurden das PCR-Fragment und das Vektorfragment durch T4-DNA-Ligase ligiert. Dann wurden 1 μl (20 ng) Vektorfraktion und 3 μl (100 ng) PCR-Fragment 1 μl 10 × Ligasepuffer (Maniatis et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual, Sambrok, Fritsch, Maniatis, Buch 3, Abschnitt B27; Munch-Peterson (1991) J. Biol. Chem. 266, 9032), 1 μl T4-DNA-Ligase, 4 μl sterile H₂O bidist. pipettiert, sorgfältig gemischt und über Nacht bei 16°C inkubiert.
Das geklonte Gen wurde mittels Restriktionsanalyse und durch Sequenzierung überprüft.
Klonierung des Strukturgens für die Dm-dNK in geeigneten Expressionsvektoren
Zur Expression der Dm-dNK wurde das Strukturgen in geeignete Expressionsvektoren in einer solchen Weise kloniert, dass das Strukturgen in der richtigen Orientierung unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, vorzugsweise einem induzierbaren Promotor, insbesondere bevorzugterweise dem lac-, lacUV5-, tac- oder T5-Promotor inseriert wurde. Bevorzugte Expressionsvektoren waren pUC-Plasmide mit lac- oder lacUV5-Promotoren oder pKK-Plasmide.
Dafür wurde das Strukturgen aus dem Plasmid pUC18 für die Dm-dNK mittels EcoRI und HindIII ausgeschnitten, der Restriktionsverdau wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das ungefähr 750 Bp-Fragment wurde aus dem Agarosegel isoliert. Gleichzeitig wurden die Expressionsvektoren mit EcoRI und HindIII geschnitten, der Restriktionsverdau wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das sich ergebende Vektorfragment wurde aus dem Agarosegel isoliert. Die sich ergebenden Fragmente wurden wie beschrieben ligiert. Die richtige Insertion des Gens wurde durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung verifiziert.
Bevorzugte Expressionsektoren sind auch pUC18, pKK177-3, pKKT5. Insbesondere bevorzugt ist pKKT5. Der Expressionsvektor pKKT5 wird aus pKK177-3 erhalten (Kopetzki et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 216: 149–155), indem die tac-Promotoren durch T5-Promotoren ersetzt wurden, die aus dem Plasmid pDS (Bujard et al. 1987, Methods Enzymol. 155: 416–433) abgeleitet waren. Die EcoRI-Endonukleaserestriktionsstelle wurde aus der Sequenz des T5-Promotors durch Punktmutation entfernt.
Transformation der Expressionsvektoren in verschiedenen E. coli-Expressionsstämmen
Kompetente Zellen verschiedener E. coli-Stämme wurden gemäß dem Hanahan-Verfahren (J. Mol Biol. 166 (1983) S. 557) hergestellt. 200 μl der sich ergebenden Zellen wurden mit 20 ng isolierter Plasmid-DNA (Expressionsvektoren) gemischt. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde ein thermischer Schock (90 s bei 42°C) ausgeführt. Nachfolgend wurden die Zellen in 1 ml LB-Medium transferiert und für die phänotypische Expression für 1 h bei 37°C inkubiert. Aliquots dieser Transformationspräparationen wurden auf LB-Platten mit Ampicillin als Selektionsmarker plattiert und dann für 15 h bei 37°C inkubiert.
Geeignete Wirtszellen sind E. coli K12 JM83, JM101, JM105, NM522, UT5600, TG1, RR1ΔM15, E. coli HB101, E. coli B.
Expression von Dm-dNK in E. coli
Für die Expression von Dm-dNK-Klonen wurden Plasmid-enthaltende Klone in 3 ml Lb_amp-Medium inokuliert und im Schüttler bei 37°C inkubiert. Bei einer optischen Dichte von 0,5 bei 550 nm wurden die Zellen mit 1 mM IPTG induziert und im Schüttler für 4 h bei 37°C inkubiert. Nachfolgend wurde die optische Dichte der individuellen Expressionsklone determiniert, ein Aliquot mit einer OD₅₅₀ von 3/ml wurde entnommen und die Zellen wurden zentrifugiert (10 min bei 6.000 U/min, 4°C). Die Zellen wurden in 400 μl TE-Puffer resuspendiert (50 mM TRIS/50 mM EDTA, pH 8,0) durch Ultraschall freigesetzt und dann wurde die lösliche Proteinfraktion von der unlöslichen Proteinfraktion durch Zentrifugation abgetrennt (10 min, 14.000 U/min, 4°C). Ein SDS und β-Mercaptoethanol enthaltender Puffer wurde allen Fraktionen zugegeben und die Proteine wurden durch Kochen (5 min bei 100°C) denaturiert. Nachfolgend wurden jede Menge von 10 μl mittels 15% analytischen SDS-Gel (Laemmli U. K. (1970) Nature 227: S. 555–557) analysiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren für die Herstellung von Nukleosidmonophosphaten, das detaillierter durch die folgenden Schritte charakterisiert ist:

– Synthese von Nukleosidmonophosphaten, ausgehend von Nukleosiden durch enzymatische Phosphorylierung mit einer Kinase gemäß der Erfindung als Enzym
– Verwendung eines Nukleotidtriphosphats als ein Phosphatgruppendonor in katalytischen Mengen
– in situ-Regeneration des Phosphatgruppendonors über ein Regenerationssystem (CK/CP; PK/PEP; Acetylphosphat/Acylkinase, Pyrophosphat/Pyrophosphorylase)

Als Nukleosidmonophosphat gemäß der Erfindung sind die ursprünglichen Nukleosidmonophosphate, Desoxynukleosidmonophosphate, Didesoxynukleosidmonophosphate wie auch andere Zucker- und Basen-modifizierten Nukleosidmonophosphate anwendbar.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Kinase gemäß der Erfindung bei der Synthese von Nukleosidmonophosphat.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1:
Die kinetischen Konstanten der verschiedenen Nukleosidkinasen sind in 1 aufgelistet (hTK1/2 = humane Thymidinkinase 1/2; hdCK = humane Desoxycytidinkinase;
hdGK = humane Desoxyguanosinkinase; HSV = Herpes Simplex-Virus). Die Daten sind entnommen:

a) Munch Petersen et al., J. Biol. Chem. 266, 9032 (1991); J. Biol. Chem. 268, 15621 (1993),
b) Biochem. Biophys. Acta 1250, 158 (1995),
c) Bohmann and Eriksson Biochemistry, 27, 4258 (1988),
d) Wang et al., J. Biol. Chemistry 268, 22847 (1993),
e) Iwatsuki et al., J. Mol. Biol. 29, 155 (1967),
f) Black et al., J. Gen. Virology 77, 1521 (1996),
g) Ma et al., P.N.A.S. 93, 14385 (1996)

2:
2 zeigt die Bildung von d-CMP aus Cytidin unter den in Beispiel 2 erwähnten Bedingungen.
3:
3 zeigt die Bildung von d-AmP aus Adenosin und d-GMP aus Guanosin unter den in Beispiel 4 erwähnten Bedingungen.
4:
4 zeigt die Bildung von d-CMP aus Cytidin unter den in Beispiel 3 erwähnten Bedingungen.
5:
5 zeigt die DNA-Sequenz des Klons.
6:
6 zeigt das Temperaturoptimum der Nukleosidkinase aus D. Melanogaster.
7:
7 zeigt die Stabilität der rekombinanten Dm-Nukleosidkinase im Vergleich zu isolierter Dm-Nukleosidkinase. Die 7a wurde ohne Zugabe von BSA bestimmt, 7B unter Zugabe von BSA.
Referenzen

1. Lee, L.–S. und Y.–C. Cheng (1976) Human deoxythymidine kinase. I. Purification and general properties of the cytoplasmic and mitocondrial isozymes derived from blast cells of acute myelocytic leukemia, J. Biol. Chem., 251, 2600–2604.
2. Cheng, Y.–C. und M. Ostrander (1976) Deoxythymidine kinase induced in HeLa TK cells by herpes simplex virus type I and type II. II. Purification and characterization, 1. Biol. Chem., 251, 2605–2610.
3. Ellims, P. H., T. E. Gan und L. Cosgrove (1982) Human thymidine kinase: Purification and some properties of the TKI 'isoenzyme from placenta, Mol. Cell. Biochem., 45, 113–116.
4. Gan, T. E., J. L. Brumley und M. B. Van Der Weyden (1983) Human thymidine kinase. Purification and properties of the cytosolic enzyme of placenta, J. Biol. Chem., 258, 7000–7004.
5. Sherley, J. L. und T. J. Kelly (1988) Human cytosolic thymidine kinase. Purification and physical characterization of the enzyme from HeLa cells, J. Biol. Chem., 263, 375–382.
6. Munch-Petersen, B. L. Cloos. G. Tyrsted und S. Eriksson (1991) Diverging substrate specificity of pure human thymidine kinases 1 and 2 against antiviral dideoxynucleosides, J. Biol. Chem., 266, 9032–9038.
7. Bohman, C. und S. Eriksson (1988) Deoxycytidine kinase from human leukemic spleen: Preparation and characterization of the homogenous enzyme. Biochemistry, 27, 4258–40265.
8. Kierdaszuk, B. und S. Eriksson (1990) Selective inactivation of the deoxyadenosine phosphorylating activity of pure human deoxycytidine kinase: Stabilization of different forms of the enzyme by substrates and biological detergents, Biochemistry, 29, 4109–4144.
9. Kristensen, T. Quantification of thymidine kinase (TK1) mRNA in normal and leukemic cells and investigation of structure-function relationship of recombinant TK1 enzyme. 1996. Department of Life Sciences and Chemistry, Roskilde University, Denmark. Ref Type: Thesis/Dissertation. Available at Roskilde University Library.
10. Hanahan D., (1983) J. Mol. Biol. 166: 557
11. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausgabe, B. 27 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (USA)
12. Mullis, K. B. und Faloona, F. A., (1987) Methods in Enzymol. 155: 335–350
13. Munch-Peterson B., Piskur J. und Sondergaard L. (1998) J. Biol. Chem. 273, 3926–3931
14. Laemmli U. K. (1970) Nature 227: S. 555–557

Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1:
Herstellung und Isolation von rekombinanter Dm-Kinase
Ein E. coli-Stamm BL21 wurde mit pGEX-2T-Vektor (Amersham Pharmacia Biotec) transformiert, in welchen das Strukturgen der Dm-Kinase, mittels des CaCl₂-Verfahrens (Sambrook, Molecular cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press) kloniert wurde. Eine transformierte Kolonie wurde in 100 ml LB-Medium (10 mg Trypton, 5 mg Hefeextrakt, 8 mg NaCl pro l), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, über Nacht bei 37°C aufgenommen. Am nächsten Tag wurde die Kultur auf eine OD von 0,6 in 1 l LB-Medium eingestellt und die Expression wurde durch 100 μl IPTG induziert. Die Kulturtemperatur von 25°C wurde über Nacht aufrecht erhalten und die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden in 100 ml Puffer A (20 mM Kaliumphosphat (pH 7,5), 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 10% Glycerin, 1 Triton X100 und 0,1 mM Phenylsulfonylfluoriden) aufgenommen. Die Mischung wurde durch eine French-Presse aufgebrochen. Das homogenisierte Substrat wurde zentrifugiert (20.000 U/min/15 min) und mit einem 1 μm Whatman-Glasmikrofilter und ein 0,45 μm Celluloseacetatfilter gefiltert.
Die homogenisierte Substanz wurde auf eine GSH-Säule (15 × 45 mm), die mit 10 Säulenvolumina Puffer B (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 1 mM DTT, 10% Glycerin, 1% Triton X100, 0,1 mM Phenylsulfonylfluorid, 5 mM Benzamidin, 50 mM Aminocapronsäure) äquilibriert war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 50 Bettvolumen Puffer B und 10 Volumen Puffer C (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH₂PO₄, 1,8 mM KH₂PO₄) gewaschen und danach wurde das Fusionsprotein durch Rezirkulation von einem Säulenvolumen Puffer C mit 400 Einheiten Thrombin für 2 Stunden aufgesplittet. Die Dm-Nukleosidkinase wurde dann mit 3 Säulenvolumina Puffer C eluiert. Beispiel 2 Vergleich der Synthese von d-CMP mit und ohne Thiolzugabe

d-Cyt 22 mg

Trispuffer, pH 8,0 2 ml

MgAc 10 mg

ATP 66 mg

d-NK 0,132 Einheiten

DTT 7 mg/0 mg
Die Ausbeute wird durch die Integration der Spitzenflächen unter Verwendung von HPLC bestimmt. Die Reaktion ist nicht merklich langsamer in der Präparation ohne DTT und ist vor allem nach 45 Stunden nicht beendet (siehe 2) Beispiel 3 Synthese von d-GMP und d-AMP

d-Ado oder d-Guo 28 mg

Wasser 2 ml

MgAc 32 mg

ATP 3 mg

CK 100 Einheiten

d-NK 0,396 Einheiten

KP (Kreatinphosphat) 20 mg
Die Reaktion schreitet ohne Verlangsamung für 32 Stunden fort, die Ausbeuterate ist über 80% und es muss kein Thiol zugegeben werden. Die Zugabe von Tris-Puffer ist nicht absolut notwendig (siehe 3). Beispiel 4 Synthese von d-CMP

d-Cyt 22 mg

Trispuffer, pH 8,0 2 ml

MgAc 32 mg

ATP 3 mg

CK 100 Einheiten

d-NK 0,132 Einheiten

CP 20 mg
Selbst nach 66 Stunden ist trotz des Fehlens von Thiostabilisatoren das Enzym immer noch aktiv. Die Ausbeuterate ist 80%, trotz der Verwendung von nur katalytischen ATP-Mengen (siehe 4). Beispiel 5 Synthese von NMPs, dd-NMPs und Basen-modifizierten d-NTPs Substratlösung

Cp 250 mg

ATP 7 mg

Mg-Acetat 160 mg

in 25 ml 50 mM Tris, pH 8,0
eine Menge von jeweils 0,5 ml der Lösung wird zu ungefähr 2,5 mg des entsprechenden Nukleosids zugegeben. Dann werden 50 Einheiten Kreatinkinase und 0,32 Einheiten d-NK zugegeben.
Beispiel 6
Aktivität der Kinase aus D. Melanogaster bei verschiedenen Temperaturen
Die Aktivität der Dm-Nukleosidkinase wurde bei verschiedenen Temperaturen bestimmt. Sie zeigt ein breites Optimum mit einem Maximum bei 60°C (siehe 6).
Der Aktivitätstest ist in Referenz Nr. 14 beschrieben.
Beispiel 7
Aktivität der rekombinanten Dm-Kinase im Vergleich zu nativer Dm-Kinase
Die Aktivität der rekombinanten Dm-Kinase im Vergleich zu nativer, isolierter Dm-Kinase wurde bestimmt. Nach verschiedenen Inkubationszeiträumen in 50 mM Tris, pH 7,5 + 2,5 mM MgCl₂ bei 37°C wurde die verbleibende Aktivität bestimmt.
Während die rekombinante Dm-Kinase ohne Zugabe von BSA stabil bleibt, sinkt die Aktivität der nativen Kinase innerhalb von 50 min auf < 20%. Durch Zugabe von 2,5 mg/ml BSA bleibt auch die native Kinase stabil (7A + 7B).
Die Halbwertzeit in Tris-Puffer in Anwesenheit von MgCl₂ beträgt 50 h, ohne MgCl₂ 31 h und in reinem Wasser 28 h. Die native Dm-Kinase hat eine Halbwertzeit von < 12 min unter denselben Bedingungen.
SEQUENZLISTE

Claims

Rekombinante Kinase, die sich von nicht Vertebratenorganismen ableitet, wobei die Kinase während der Synthese des Nukleosidmonophosphats ohne die Zugabe von stabilisierenden SH-Reagenzien, ohne stabilisierende Proteine stabil bleibt und alle vier natürlichen Desoxynukleoside akzeptiert, die aus E. coli nach einem Verfahren erhältlich ist, welches die folgenden Schritte umfasst: 1) Isolierung der kodierenden Sequenz von Drosophila melanogaster Desoxynukleosidkinase (Dm-dNK), 2) Klonierung des Strukturgens in bevorzugte Expressionsvektoren für E. coli mit induzierbaren Promotoren, 3) Transformation der Expressionsvektoren in bevorzugten E. coli Wirtsstämmen und 4) Expression des Dm-dNK-Gens in E. coli durch geeignete Induktion.
Rekombinante Kinase nach Anspruch 1, die – in aufgereinigter Form – eine spezifische Aktivität von mindestens 20 U/mg (1 U = 1 μMol/Min) für alle vier natürlichen Desoxynukleoside zeigt.
Rekombinante Kinase nach einem der Ansprüche 1 bis 2, die eine Spezifizitätskonstante k_c/K_m > 10000 M^–1 s^–1 für alle natürlichen Desoxynukleoside zeigt.
Rekombinante Kinase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Kinase eine Halbwertzeit von t_1/2 > 50 h in Tris (tris(hydrooxymethyl)-aminomethan)-Puffer mit 5 mMol MgCl₂ und t_1/2 > 25 h in Wasser bei 37°C aufweist.
Rekombinante Kinase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die ein breites Temperaturoptimum zwischen 40 und 60°C zeigt.
Rekombinante Kinase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die von Drosophila melanogaster abgeleitet ist.
Verwendung einer rekombinanten Kinase, erhältlich von Drosophila melanogaster nach einem der Ansprüche 1 bis 6, für die Synthese von Nukleosidmonophosphaten.
Verfahren zur Herstellung eines Nukleosidmonophosphats, worin eine rekombinante Kinase nach den Ansprüchen 1 bis 6 für die Phosphorylierung eines Nukleosids verwendet wird.