DE19914644A1

DE19914644A1 - Deoxynukleosidkinase aus Insektenzellen zur Nukleosidmonophosphatsynthese

Info

Publication number: DE19914644A1
Application number: DE1999114644
Authority: DE
Inventors: Birgitte Munch-Petersen; Jure Piskur; Leif Sondergaard; Hans-Georg Ihlenfeldt; Christian Klein; Ursula Hagedorn
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2000-10-05

Abstract

Rekombinante Kinase, die während der Nukleosidmonophosphatsynthese ohne den Zusatz von stabilisierenden SH-Reagentien und ohne stabilisierende Proteine stabil ist und die alle vier natürlichen Deoxynukleotide akzeptiert, und aus Insektenzellen wie z. B. Drosophila Melanogaster erhältlich ist. Darüber hinaus betrifft die Erfindung entsprechende DNA-Sequenzen, Vektoren, transformierte Zellen, ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Kinase sowie die Verwendung zur Herstellung von Nukleodismonophosphaten.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante Kinase aus Insektenzellen wie bei spielsweise Drosophila Melanogaster, die während der Nukleosidmonophosphatsynthese ohne den Zusatz von stabilisierenden SH-Reagentien, ohne stabilisierende Proteine und ohne Deter gentien stabil bleibt und die alle vier natürlichen Deoxynukleoside akzeptiert. Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine DNA Sequenz, welche die erfindungsgemäße Ki nase codiert, sowie ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kinase und deren Ver wendung während der Nukleosidmonophosphatsynthese.

(Deoxy)-Nukleosidkinasen katalysieren die Phosphorylierung von Nukleosiden bzw. Deoxynu kleosiden zu den entsprechenden Nukleotidmonophosphaten und tragen damit wesentlich zum "Salvage pathway" des Nukleotidstoffwechsel bei.

Die katalysierte Reaktion ist:

Die Deoxy-Nukleosidmonophosphate sind wiederum Ausgangsprodukte der Deoxy-Nukleo sidtriphosphate, welche in sehr stark steigenden Maße als Reagentien für die PCR-Reaktion ver wendet werden.

Die Deoxy-Nukleosid-Monophosphate sind zur Zeit auf drei Wegen zugänglich:

1. aus der Hydrolyse von Fischsperma
2. durch chemische Synthese aus den Deoxy-Nukleosiden
3. durch enzymatische Synthese aus den Deoxy-Nukleosiden.

Die bisher bekannten Verfahren weisen eine Reihe von Nachteilen auf. So entstehen bei der Hy drolyse von Fischsperma alle 4 Monophosphate in etwa in gleichen Verhältnissen, eine Tatsache, die am Bedarf des Marktes vorbeigeht (z. B. wird d-UTP, daß teilweise statt d-TTP verwendet wird, aus d-CTP hergestellt). Außerdem ist das bei der Hydrolyse entstehende d-TTP mit ca. 2% d-UTP verunreinigt, und läßt sich praktisch nicht abtrennen.

Weiterhin ist die tierische Herkunft der Edukte unter regulatorischen Gesichtspunkten (GMP) als kritisch zu bewerten. Und nicht zuletzt ist der Markt der Monophosphate aus Fischsperma sehr begrenzt.

Bei der chemischen Synthese entstehen eine ganze Reihe von Nebenprodukten, die bei einer chromatographischen Aufreinigung schwer abzutrennen sind. Außerdem müssen einige Basen (z. B. Guanosin) vor der Phosphorylierung mit Schutzgruppen versehen werden, wodurch der Syntheseaufwand deutlich steigt.

Die Nachteile des Standes der Technik wurden überwunden durch die Bereitstellung einer re kombinanten multifunktionalen Deoxynukleosidkinase aus Insektenzellen wie insbesondere Drosophila Melanogaster (Dm-dNK), die während der Nukleosidmonophosphatsynthese ohne den Zusatz von stabilisierenden SH-Reagentien, ohne stabilisierende Proteine und Detergentien stabil bleibt und die alle vier natürlichen Deoxynukleoside akzeptiert: Thymidin (dThd), Deoxy cytidin (dCyd), Deoxyadenosin (dAdo) und Deoxyguanosin (dGuo). Stabil im Sinne der vorlie genden Erfindung bedeutet, daß die Umsatzrate für die katalysierte Reaktion innerhalb von 5 Stunden, bevorzugt innerhalb von 10 Stunden, besonders bevorzugt innerhalb von 12 Stunden bei 37°C praktisch nicht abnimmt. Es ist überraschend, daß das Enzym ohne den Zusatz von thiolhaltigen Stabilisatoren so lange stabil bleibt. Diese Stabilität konnte bei anderen Kinasen bislang nicht beobachtet werden (1-9) Durch das Weglassen dieser Stabilisatoren bei der Ver wendung der erfindungsgemäßen Kinase bei der Synthese läßt sich die Synthese billiger ge stalten und vor allem die Aufreinigung der Produkte stark vereinfachen.

Des weiteren haben bisher bekannte Kinasen eine wesentlich höhere Substratspezifität. Dies führt dazu, daß man für die Synthese der einzelnen Nukleoside nicht mehr jeweils eine spezifi sche Kinase braucht. Besonders vorteilhaft ist die geringe Spezifität für die Synthese von modifi zierten Nukleosidanaloga, wie von dideoxy-Nukleosiden, bzw. basen- oder zucker-modifizierten Nukleosiden. Basenmodifizierte Nukleoside sind z. B. 7-deaza-Nukleoside, C-Nucleoside und an der Base mit Reportergruppen (Farbstoffen, Digoxigenin, Biotin) markierte Nucleotide. Zucker modifizierte Nukleoside sind z. B. Azathymidin, Arabinosyl-Thymidin. Die kinetischen Konstan ten der Drosophila-Kinase im Vergleich mit bekannten analogen Enzymen sind in Tabelle 1 zu sammengestellt. Die spezifische Aktivität kc der erfindungsgemäßen Kinase ist um ein mehr faches höher als die der vorbekannten Kinasen. Die Aktivität des Enzyms wurde gemessen wie in der Referenz: Munch-Peterson et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 9032-9038, beschrieben. Da durch wird wesentlich weniger Enzym benötigt, um dNMPs zu synthetisieren. (Faktor 3,5- 14.000, Vergleiche Kc-Werte in Tabelle 1). Die Spezifitätskonstante (k_c/K_M) der erfindungsge mäßen Kinase ist um mehrere Potenzen höher als die der vorbekannten Kinasen, sie liegt in der Größenordnung der Diffusionskonstante. Dies führt zu einem vollständigen Umsatz bei Einsatz der Kinase zur d-NMP-Synthese. Sie liegen um den Faktor 2-6500 höher als bisher bekannte Kinasen, siehe Abb. 1.

Überaschenderweise ist das erfindungsgemäße Enzym auch bei 60°C noch stabil, was ebenfalls für die Reaktionsführung von Vorteil ist. Das erfindungsgemäße Enzym hat bevorzugterweise bei T = 37°C eine Halbwertszeit von t_½ ≧ 50 h in Tris Puffer mit 5 mM MgCl₂ und t_½ ≧ 25 h in Wasser und akzeptiert alle natürlichen Deoxynukleoside (Beispiel 6).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Kinasen aus anderen nonvertebraten Organismen, insbesondere aus anderen Tierarten aus der Klasse der Hexapoda, die vergleichbare Eigenschaften mit denen der Kinase aus Drosophila aufweisen. Insbesondere solche Kinasen, die im wesentlichen die oben beschriebene Stabilität sowie im wesentlichen die oben beschriebene Substratspezifität aufweisen. Bevorzugt sind Kinasen isoliert aus der Unterklasse der Pterygota, besonders bevorzugt aus der Ordnung der Diptera, besonders bevorzugt aus der Familie der Dro sophilidae.

Gegenstand der Erfindung ist des weiteren eine DNA-Sequenz sowie funktionelle Fragmente da von, die die erfindungsgemäße Kinase codiert. Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz ist dadurch gekennzeichnet, daß die im folgenden aufgeführten Primer an die DNA-Sequenz der er findungsgemäßen Kinase hybridisieren:

SEQ ID No.: 2

SEQ ID No.: 3

SEQ ID No.: 4

SEQ ID No.: 5

SEQ ID No.: 6

SEQ ID No.: 7

SEQ ID No.: 8

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch solche Kinasen und DNA-Sequenzen, an deren DNA-Sequenz Oligonukleotide mit der SEQ ID No.: 2, 3, 5, 7 und 8 oder mit der SEQ ID No.: 2, 4, 5, 7 und 8 oder mit der SEQ ID No.: 2, 5, 6, 7 und 8 hybridisieren.

Vorteilhaft sind dabei die folgenden Hybridisierungsbedingungen:

- Hybridisierung: 0,75 M NaCl, 0,15 Tris, 10 mM EDTA, 0,1% Natriumpyrophosphat, 0,1% SLS, 0,03% BSA, 0.03% Ficoll 400, 0,03% PVP und 100 µg/ml boiled calf thymus DNA bei 50°C für ca. 12 Stunden
- Waschen: 3 × 30 Minuten mit 0,1X SET, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat und 0,1 M Phosphatpuffer bei 45°C

Die erfindungsgemäße Sequenz der Kinase ist dargestellt in Abb. 5, SEQ ID No.: 1.

Die erfindungsgemäße DNA Sequenz ist erhältlich aus Drosophila melanogaster durch das im folgenden beschriebene Verfahren:

Ein pBluescript SK +/- Phagmid, das ein 1.1 kbp cDNA-Insert unter anderem enthaltend das mut maßliche Gen, das für die Deoxynukleosidkinase kodiert, wurde von dem Berkeley Drosophila Genom- Sequenzierungsprojekt bezogen (Klon LD15983). Die ersten 600 Basenpaare vom 5'- Ende der 1.1 kbp cDNA, die über EcoRI und XhoI in die multiple cloning site (MCS) des Phag mids kloniert wurde, waren von Harvey et al. von der Universität Kalifornien, Berkley bereits se quenziert. Basierend auf diesen Sequenzinformationen wurden neue Primer entworfen (DM-TK1 und DM-TK2/ SEQ ID NO. 9: 5'-TCCCAATCTCACGTGCAGATC-3' und. SEQ ID NO 10: 5'-TTCATCGAAGAGTCCATTCAC-3', die eine vollständige Sequenzierung des Inserts er möglichten. DM-TK1 ist ein 21 bp sense primer, der stromaufwärts des vermuteten Translations startregion bindet. DM-TK2 wurde als 21 bp sense Primer nach dem 3'-Bereichs des bereits se quenzierten Teils der cDNA entworfen.

Anhand dieser Sequenz konnte ein offener Leserahmen identifiziert werden, der 750 bp umfasst und für ein Protein mit 250 Aminosäuren codiert. Die DNA-Sequenz SEQ ID NO. 1 ist in Abb. 5 dargestellt. Das rechnerische Molekulargewicht dieses Proteins wurde mit 29 kDa er mittelt und stimmt somit mit den Angaben von Munch-Peterson et al. 1998, die die Größe der nativen DM-dNK mit annähernd 30 kDa beschrieben hat, überein.

Ausgehend von den Sequenzinformationen konnte das Strukturgen, das für die DM-dNK codiert, mittels "polymerase chain reaction" (PCR)-Technik (Mullis, K. B. und Faloona, F. A., Methods in Enzymol. 155 (1987) 335-350) aus dem 1.1 kbp cDNA-Insert des pBluescript SK +/- Phagmids isoliert werden. Dazu wurde ein spezifisches Primerpaar (siehe SEQ ID NO.11: 5'- GCGCGAATTCATGGCGGAGGCAGCATCCTGTGC-3' und SEQ ID NO.12: 5'- GCGCAAGCTTATTATCTGGCGACCCTCTGGC-3') mit entsprechenden Restriktionsendo nukleaseschnittstellen für die spätere Insertion in geeignete Expressionsplasmide synthetisiert. So besitzt die 5'-Primer (DM-dNK3) eine EcoRI-Restriktionsendonukleaseschnittstelle stromaufwärts der codierenden Sequenz, während die 3'-Primer (DM-dNK4) eine HindIII-Restriktionsendonukle aseschnittstelle stromabwärts der codierenden Sequenz beinhaltet. Desweiteren sind im 3'-Primer stromabwärts der codierenden Sequenz zwei Stopcodons zur gesicherten Termination der Transla tion integriert.

Klonierung des Strukturgens für die DM-dNK in pUC18

Der PCR-Ansatz wurden auf ein Agarosegel aufgetragen und das ca. 750 Bp große Strukturgen wurde aus dem Agarosegel isoliert. Das PCR-Fragment wurde mit den EcoRI- und HindIII-Restrik tionsendonukleasen 1 Stunde bei 37°C geschnitten. Gleichzeitig wurde das pUC18-Plasmid mit den EcoRI- und HindIII-Restriktionsendonukleasen 1 Stunde bei 37°C geschnitten, der Ansatz mit tels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das 2635 Bp große Vektorfragment isoliert. An schließend wurden das PCR-Fragment und das Vektorfragment mittels T4-DNA-Ligase miteinan der ligiert. Dazu wurden 1 µl (20 ng) Vektorfragment und 3 µl (100 ng) PCR-Fragment, 1 µl 10x Li gase-Puffer (Maniatis et al., 1989 Molecular cloning, a laboratory manual, Sambrok, Fritsch, Maniatis, Buch 3, Abschnitt B27; Munch-Peterson (1991) J. Biol. Chem. 266, 9032), 1 µl T4-DNA- Ligase, 4 µl steriles H₂O bidestilliert, pipettiert, vorsichtig gemischt und über Nacht bei 16°C inku biert.

Das klonierte Gen wurde mittels Restriktionsanalyse und durch Sequenzierung überprüft.

Klonierung des Strukturgens für die DM-dNK in geeignete Expressionsvektoren

Zur Expression der DM-dNK wurde das Strukturgen in geeignete Expressionsvektoren so kloniert, daß das Strukturgen in der richtigen Orientierung unter Kontrolle eines geeigneten Promotors, be vorzugt einem induzierbaren Promotor, besonders bevorzugt dem lac-, lacUV5-, tac- oder T5-Pro motor insertiert ist. Bevorzugte Expressionvektoren sind pUC-Plasmide mit lac- oder lacUV5-Pro motor oder pKK-Plasmide.

Dafür wurde das Strukturgen für die DM-dNK mittels EcoRI und HindIII aus dem Plasmid pUC18 ausgeschnitten, der Restriktionsansatz durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das ca. 750 Bp große Fragment aus dem Agarosegel isoliert. Gleichzeitig wurden die Expressionsvektoren mit EcoRI und HindIII geschnitten, der Restriktionsansatz durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das resultierende Vektorfragment aus dem Agarosegel isoliert. Die so gewonnenen Fragmente wurden wie beschreiben miteinander ligiert. Die ordnungsgemäße Insertion des Gens wurde mittels Restriktionsanalyse und Sequenzierung nachgeprüft.

Transformation der Expressionsvektoren in verschiedene E-coli Expressionsstämme

Kompetente Zellen verschiedener E.coli-Stämme wurden entsprechend der Methode nach Hana han (J. Mol. Biol. 166 (1983) pp. 557) hergestellt. 200 µl derart hergestellter Zellen wurden mit 20 ng isolierten Plasmid-DNA (Expressionsvektoren) versetzt. Nach 30 min. Inkubation auf Eis erfolgte ein Hitzeschock (90 sec bei 42°C). Anschließend wurden die Zellen in 1 ml LB-Medium überführt und zur phänotypischen Expression 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Aliquote dieses Trans formationsansatzes wurden auf LB-Platten mit Ampicillin als Selektionsmarker ausplattiert und 15 Stunden bei 37°C inkubiert.

Geeignete Wirtszellen sind E.coli K12 JM83, JM101, JM105, NM522, UT5600, TG1, RR1ΔM15, E.coli HB101, E.coli B.

Expression der DM-dNK in E.coli

Zur Expression der DM-dNK wurden plasmidhaltige Klone in 3 ml Lb_amp-Medium angeimpft und bei 37°C im Schüttler inkubiert. Bei einer optischen Dichte von 0,5 bei 550 nm wurden die Zellen mit 1 mM IPTG induziert und 4 h bei 37°C im Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die optische Dichte der einzelnen Expressionsklone bestimmt, ein Aliquot, das einer OD₅₅₀ von 3/ml entspricht, entnommen und die Zellen abzentrifugiert (10 min 6000 rpm, 4°C). Die Zellen wurden in 400 µL TE-puffer (50 mM TRIS/50 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, durch Ultraschall aufgeschlossen und durch Zentrifugation die lösliche Proteinfraktion von der unlöslichen Proteinfraktion getrennt (10 min, 14000 rpm, 4°C). Alle Fraktionen wurden mit SDS- und β-Mercaptoethanol haltigen Auf tragspuffer versetzt und die Proteine durch Kochen (5 min 100°C) denaturiert. Anschließend wurde je 10 µl mittels eines 15% analytisches SDS-Gel analysiert (Laemmli U. K. (1970) Nature 227: pp. 555-557).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Nukleo sidmonophosphate, durch die nachfolgend beschriebenen Schritte näher gekennzeichnet:

- Synthese der Nukleosidmonophosphate ausgehend von Nukleosiden durch enzymatische Phosphorylierung mit einer erfindungsgemäßen Kinase als Enzym
- Verwendung eines Nukleotidtriphosphats als Phosphatgruppendonor in katalytischen Mengen
- In.situ Regeneration des Phosphatgruppendonors über ein regenerierendes System (CK/CP; PK/PEP; Acetylphosphat/Acylkinase, Pyrophosphat/Pyrophosphorylase

Als Nukleosidmonophosphat im Sinne der Erfindung gelten die eigentlichen Nucleosidmono phosphate, Deoxynucleosidmonophosphate, Dideoxynucleosidmonophosphate, sowie andere zucker- und basenmodifizierte Nucleosidmonophosphate.

Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der erfindungsgemä ßen Kinase bei der Nukleosidmonophosphatsynthese.

Kurze Beschreibung der Abbildungen Abb. 1

In Abb. 1 sind die kinetischen Konstanten von verschiedenen Nukleosidkinasen aufgeführt (hTK1/2 humane Thymidinkinasae 1/2; hdCK = humane deoxy-Cytidinkinase; hdGK = humane deoxy-Gunaosinkinse; HSV = Herpes Simplex Virus). Die Daten stammen aus

a) Munch Petersen et al. J. Biol. Chem. 266, 9032 (1991); J. Biol. Chem. 268, 15621 (1993),
b) Biochem. Biophys. Acta 1250, 158 (1995),
c) Bohmann und Eriksson Biochemistry, 27 4258 (1988),
d) Wang et al. J. Biol. Chemistry 268, 22847 (1993),
e) Iwatsuki et al. J. Mol. Biol. 29, 155 (1967),
f) Black et al. J. Gen. Virology 77, 1521 (1996),
g) Ma et al. P.N.A.S. 93, 14385 (1996).

Abb. 2

In Abb. 2 ist die Bildung von d-CMP aus Cytidin unter den im Beispiel 2 genannten Bedingun gen gezeigt.

Abb. 3

In Abb. 3 ist die Bildung von d-AMP aus Adenosin und d-GMP aus Guanosin unter den in Beispiel 4 genannten Bedingungen gezeigt.

Abb. 4

In Abb. 4 ist die Bildung von d-CMP aus Cytidin unter den in Beispiel 3 genannten Bedingungen gezeigt.

Abb. 5

Die Abb. 5 zeigt die DNA-Sequenz des Clones.

Abb. 6

Die Abbildung zeigt das Temperaturoptimum der Nucleosidkinase aus D. melanogaster.

Abb. 7

Die Abbildung zeigt die Stabilität von rekombinanter im Vergleich zu isolierter Dm-Nucleosid kinase. Abb. 7A ist ohne Zusatz von BSA bestimmt worden, Abb. 7B mit Zusatz von BSA.

Referenzenliste

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2. Cheng, Y.-C. and M. Ostrander (1976) Deoxythymidine kinase induced in HeLa TK cells by herpes simplex virus type I and type II. II. Purification and characterization, J. Biol. Chem., 251, 2605-2610.
3. Ellims, P. H., T. E. Gan and L. Cosgrove (1982) Human thymidine kinase: Purification and some properties of the TK1 isoenzyme from placenta, Mol. Cell. Biochem., 45, 113-116.
4. Gan, T. E., J. L. Brumley and M. B. Van Der Weyden (1983) Human thymidine kinase. Puri fication and properties of the cytosolic enzyme of placenta, J. Biol. Chem., 258, 7000-7004.
5. Sherley, J. L. and T. J. Kelly (1988) Human cytosolic thymidine kinase. Purification and physical characterization of the enzyme from HeLa cells, J. Biol. Chem., 263, 375-382.
6. Munch-Petersen, B., L. Cloos, G. Tyrsted and S. Eriksson (1991) Diverging substrate speci ficity of pure human thymidine kinases 1 and 2 against antiviral dideoxynucleosides, J. Biol. Chem., 266, 9032-9038.
7. Bohman, C. and S. Eriksson (1988) Deoxycytidine kinase from human leukemic spleen: Preparation and characterization of the homogenous enzyme, Biochemistry, 27, 4258-40265.
8. Kierdaszuk, B. and S. Eriksson (1990) Selective inactivation of the deoxyadenosine phos phorylating activity of pure human deoxycytidine kinase: Stabilization of different forms of the enzyme by substrates and biological detergents, Biochemistry, 29, 4109-4144.
9. Kristensen, T. Quantification of thymidine kinase (TK1) mRNA in normal and leukemic cells and investigation of structure-function relationship of recombinant TK1 enzyme. 1996. Department of Life Sciences and Chemistry, Roskilde University, Denmark. Ref Type: Thesis/Dissertation. Available at Roskilde University Library.
10. Hanahan D., (1983) J. Mol. Biol. 166: 557
11. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual second Edition, B.27 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (USA)
12. Mullis, K. B. und Faloona, F. A., (1987) Methods in Enzymol 155: 335-350
13. Munch-Peterson B., Piskur J. und Sondergaard L. (1998) J. Biol. Chem. 273, 3926-3931
14. Laemmli U. K. (1970) Nature 227: pp. 555-557

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher:

Beispiel 1 Produktion und Isolierung der rekombinanten DM-Kinase

Ein E. Coli-Stamm BL21 wurde mit einem pGEX-2T Vektor (Amersham Pharmacia Biotec) in den das Strukturgen der DM-Kinase cloniert wurde mittels CaCl₂-Methode (Sambrook, Molecu lar cloning, 2^nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory press) transformiert. Eine transformierte Kolonie wurde in 100 ml LB-Medium (10 mg Tryptone, 5 mg Hefeextrakt, 8 mg NaCl pro L), das 50 µg/ml Ampicillin enthält über Nacht bei 37°C angezogen. Die Kultur wurde am nächsten Tag auf eine OD von 0,6 in einem Liter LB-Medium eingestellt und die Expression mittels 100 µl IPTG induziert. Die Kultur wurde über Nacht bei 25°C gehalten und die Zellen durch Zentri fugation geerntet. Die Zellen wurden in 100 ml Puffer A (20 mM Kaliumphoshat (pH 7,5), 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 10% Glycerin, 1% Triton X100 und 0,1 mM Phenylsulfonylfluoride) re suspendiert. Der Aufschluß erfolgte mittels French-Press. Das Homogenisat wurde zentrifugiert (20000 U/min 15 min) und über einen 1 µm Whatman Glas-Mikrofilter sowie einen 0,45 µm Celluloseacetat-Filter filtriert.

Das Homogenat wurde auf eine GSH-Säule (15 × 45 mm) aufgezogen, die mit 10 Säulenvo lumina Puffer B (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 1 mM DTT, 10% Glycerol, 1% Triton X100, 0,1 mM Phenylsulfonylfluorid, 5 mM Benzamidine, 50 mM Aminocapronsäure) äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 50 Bettvolumina Puffer B und 10 Volumina Puffer C (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH₂PO₄, 1,8 mM KH₂PO₄) gewa schen und anschließend wurde das Fusionsprotein durch 2stündiges Rezirkulieren von 1 Säulen volumen Puffer C mit 400 U Thrombin gespalten. Die DM-Nucleosidkinase wurde dann mit 3 Säulenvolumina Puffer C eluiert.

Beispiel 2 Vergleich Synthese von d-CMP mit und ohne Thiolzugabe

d-Cyt	22 mg
Tris-Puffer pH 8,0	2 ml
MgAc	10 mg
ATP	66 mg
d-NK	0,132 U
CK	100 U
DTT	7 mg/0 mg

Die Umsatzrate wird über die Integration der Peakflächen in der HPLC bestimmt Die Umsetzung verläuft im Ansatz ohne DTT nur unwesentlich langsamer, vor allem aber sie bricht auch nach 45 Stunden nicht ab (siehe Abb. 2).

Beispiel 3 Synthese von d-GMP und d-AMP

d-Ado bzw. d-Guo	28 mg
Wasser	2 ml
MgAc	32 mg
ATP	3 mg
CK	100 U
d-NK	0,396 U

Der Umsatz läuft über 32 Stunden ohne Einbruch, die Umsatzrate liegt über 80%, es müssen keine Thiole zugegeben werden. Es kann auf den Tris-Puffer verzichtet werden (siehe Abb. 3).

Beispiel 4 Synthese von d-CMP

d-Cyt	22 mg
Tris-Puffer pH 8,0	2 ml
MgAc	32 mg
ATP	3 mg
CK	100 U
d-NK	0,132 U

Auch nach 66 h ist das Enzym trotz fehlender Thiol-Stabilisatoren noch aktiv. Die Umsatzrate liegt bei 80% trotz der Anwendung von nur katalytischen ATP Mengen (siehe Abb. 4).

Beispiel 5 Synthese von NMPs dd-NMPs und basenmodifizierten d-NTPs Substratlösung

CP	250 mg
ATP	7 mg
Mg-Acetat	160 mg
AL=L<in 25 ml 50 mM Tris pH 8,0

Je 0,5 ml der Lösung wird zu ca. 2,5 mg des entsprechenden Nucleosids gegeben. Dazu werden je 50 U Creatinkinase und 0,32 U d-NK gegeben

Beispiel 6 Aktivität der Kinase aus D. melanogaster bei verschiedenen Temperaturen

Die Aktivität der Dm-Nukleosidkinase wurde bei verschiedenen Temperaturen bestimmt. Sie zeigt ein breites Optimum mit einem Maximum bei 60°C (siehe Abb. 6)
Der Aktivitätstest ist in Literatur 14 beschrieben.

Beispiel 7 Aktivität von rekombinanter Dm-Kinase im Vergleich mit nativer Dm-Kinsae

Die Aktivität von rekombinanter Dm-Kinase im Vergleich mit nativer, isolierter Dm-Kinase wurde bestimmt. Nach verschieden langen Inkubationen in 50 mM Tris pH 7,5 + 2,5 mM MgCl₂ bei 37°C wurde die Restaktivität bestimmt.

Während die rekombinante Dm-Kinase auch ohne Zusatz von BSA stabil bleibt, sinkt die Akti vität der nativen innerhalb von 50 min auf < 20% ab. Durch Zusatz von 2,5 mg/ml BSA bleibt die native Kinase ebenfalls stabil (Abb. 7A + 7B).

Die Halbwertszeit beträgt in Tris-Puffer in Anwesenheit von MgCl₂ 50 h, ohne MgCl₂ 31 h und in reinem Wasser 28 h. Die native Dm-Kinase hat unter gleichen Bedingungen eine Halbwerts zeit von < 12 min.

Claims

1. Rekombinante Kinase, die während der Nukleosidmonophosphatsynthese ohne den Zusatz von stabilisierenden SH-Reagentien und ohne stabilisierende Proteine stabil ist und die alle vier natürlichen Deoxynukleoside akzeptiert, erhältlich aus Zellen von nonvertebraten Organismen.

2. Rekombinante Kinase gemäß Anspruch 1, die aus Insektenzellen erhältlich ist.

3. Rekombinante Kinase gemäß Anspruch 1 oder 2, die in aufgereinigter Form eine spezifische Aktivität von mindestens 20 U/mg (1U = 1 µmol/min) für alle 4 natürlichen Deoxynukleo side aufweist.

4. Rekombinante Kinase gemäß einem der Ansprüche 1-3, die eine Spezifitätskonstante k_c/K_m von < 10000 M^-1s^-1 für alle natürlichen Deoxynucleoside aufweist.

5. Rekombinante Kinase gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei die Kinase bei 37°C eine Halbwertszeit t_½ ≧ 50 H in Tris Puffer mit 5 mM MgCl₂ und t_½ ≧ 25 h in Wasser aufweist.

6. Rekombinante Kinase gemäß einem der Ansprüche 1-5, die ein breites Temperaturoptimum zwischen 40 und 60°C aufweist.

7. Rekombinante Kinase gemäß einem der Ansprüche 1-6 erhältlich aus Drosphila Melano gaster.

8. DNA Sequenz codierend eine Kinase aus Drosophila Melanogaster gemäß einem der An sprüche 1-7.

9. DNA Sequenz gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Primer mit den Sequenzen SEQ ID No. 2-8 an diese DNA Sequenz hybridisieren.

10. Vektor enthaltend die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 8 oder 9 und einen Promotor.

11. Wirt der mit einem Vektor gemäß Anspruch 10 transformiert wurde.

12. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Kinase gemäß einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Schritte durchgeführt werden:

1. Isolierung der codierenden Sequenz der DM-dNK,
2. Klonierung des Strukturgens in bevorzugte Expressionsvektoren für E.coli mit induzierbaren Promotoren,
3. Transformation der Expressionsvektoren in bevorzugte E.coli-Wirtsstämme und
4. Expression des DM-dNK-Gens in E.coli durch entsprechende Induktion.

13. Verwendung einer rekombinanten Kinase erhältlich aus Drosophila Melanogaster gemäß einem der Ansprüche 1-7 zur Nukleosidmonophosphatsynthese.

14. Verfahren zur Herstellung eines Nukleosidmonophosphates, dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante Kinase gemäß Ansprüchen 1-7 zur Phosphorylierung eines Nukleosides verwendet wird.