EP1856254A1 - Methode zur identifizierung von pde11-modulatoren - Google Patents

Methode zur identifizierung von pde11-modulatoren

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Publication number
EP1856254A1
EP1856254A1 EP05749506A EP05749506A EP1856254A1 EP 1856254 A1 EP1856254 A1 EP 1856254A1 EP 05749506 A EP05749506 A EP 05749506A EP 05749506 A EP05749506 A EP 05749506A EP 1856254 A1 EP1856254 A1 EP 1856254A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gaf
domain
amino acid
pde11
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05749506A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Joachim Schultz
Marco Gross-Langenhoff
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda GmbH
Original Assignee
Nycomed GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
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    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide containing the GAF A domain and GAF B domain of a human phosphodiesterase 11 (PDE11) and the catalytic domain of adenylate cyclase and the use of this polypeptide in a method for the identification of PDE11 modulators.
  • PDE11 human phosphodiesterase 11
  • PDEs Phosphodiesterases
  • I 1 Il and III 3 classes of which only class I with its 11 PDE families (called PDE1 to -11) occurs in mammals.
  • GAF domains are ubiquitous in all kingdoms of life and have been described by Aravind and Ponting (Aravind L. and Ponting CP: The GAF domain: an evolutionary link between diverse phototransducing proteins., 1997, TIBS, 22, 458-459) due to protein structure and - defined sequence comparisons.
  • PDE2, PDE5 and PDE6 contain so-called cGMP-binding GAF domains, which play a role in the allosteric activation of PDEs.
  • Adenylate cyclases catalyze the conversion of ATP into cAMP in all areas of life (Cooper DM: Regulation and organization of adenylyl cyclases and cAMP, 2003, Biochem J., 375 (R 3), 517-29, Tang WJ Gilman AG: Construction of a soluble adenylyl cyclase activated by Gs ⁇ and forskolin, 1995, Science, 268, 1769-1772). Due to sequence comparisons and structural considerations, they are subdivided into 5 classes (I to V). Of molecular biological interest are the bacterial class III ACs from cyanobacteria, in particular from Nostoc sp. PCC 7120 which also includes CyaB1.
  • the cyanobacterial ACs CyaB1 and CyaB2 also contain N-terminal GAF domains which are structurally similar to those of PDEs but have cAMP as the activating ligand.
  • the 9 known families of human Class III ACs are all membrane bound and regulated by G proteins (Tang WJ and Gilman AG: Construction of a soluble adenylyl cyclase activated by Gs ⁇ and forskolin, 1995, Science, 268, 1769-1772). , A combination with GAF domains is unknown.
  • a chimer from human PDE11 and bacterial adenylate cyclase is not known.
  • the use of such a chimer in a method for identifying PDE 11 modulators of the prior art is not known.
  • the object underlying the invention is to provide a method for identifying PDE11 modulators.
  • the object is achieved by providing the polypeptide of the invention comprising functionally (a) the GAF A domain and GAF B domain of a human phosphodiesterase 11 (PDE11) or their functionally equivalent variants and (b) the catalytic domain of an adenylate cyclase or its functionally equivalent Variants and their use in a method for identifying PDE11 modulators solved.
  • PDE11 human phosphodiesterase 11
  • a chimeric protein from N-terminal human PDE 11 -GAF domains and C-terminal catalytic center of an adenylate cyclase is useful as effector molecule.
  • the GAF domains are the activation domains that change their conformation upon ligand binding, thereby modulating the catalytic activity of the adenylate cyclase domain, which serves as a read-out.
  • cGMP selectively activates the GAF domain of PDE11 as agonist.
  • the present invention makes it possible to identify PDE11 modulators, ie PDE 11 antagonists or PDE11 agonists, which do not act via the binding and blocking of the catalytic center of PDE11, but by allosteric regulation at the N-terminus of PDE11, ie the GAF Domains, act.
  • PDE11 modulators ie PDE 11 antagonists or PDE11 agonists
  • the invention relates to a polypeptide comprising functionally linked
  • a human phosphodiesterase or PDE is understood to mean an enzyme of human origin which is capable of converting cAMP or cGMP into the corresponding inactive 5'-monophosphates. Due to their structure and properties, the PDEs are classified into different families. Under a human phosphodiesterase 11 or PDE11 is understood in particular an enzyme family of human origin, which is able to convert cGMP into the inactive 5'-monophosphates.
  • GAF A domain and B domain have GAF.
  • the GAF domains of PDE11 are tandemly located in the protein N-terminal.
  • the GAF domain closest to the N-terminus is termed GAFA and the immediately following GAF B.
  • the beginning and end of the GAF domains can be determined by protein sequence comparisons.
  • a SMART sequence comparison (Schultz J., Milpetz F., Bork P. and Pointing CP: SMART a simple modular architecture research tool: 1998, PNAS, 95, 5857-5864) yields, for example, the isoform for GAF A.
  • PDE11A4 L240 to L403 (SEQ ID NO: 6) and GAF B : V425 to K591 (SEQ ID NO: 8).
  • adenylate cyclase an enzyme capable of converting ATP into cAMP. Accordingly, adenylate cyclase activity is understood as meaning the amount of ATP reacted or amount of cAMP formed in a certain time by the polypeptide according to the invention.
  • a catalytic domain of adenylate cyclase is understood as meaning the part of the amino acid sequence of an adenylate cyclase which is necessary for the adenylate cyclase to still have the property of converting ATP into cAMP, ie it is still essentially functional and thus has adenylate cyclase activity.
  • the catalytic domain of adenylate cyclase can be easily determined.
  • the determination of the adenylate cyclase activity can be carried out, for example, by measuring the conversion of radioactive [00- 32 P] -ATP into [ ⁇ - 32 P] -cAMP.
  • the adenylate cyclase activity is easily possible by measuring the resulting cAMP via antibody binding.
  • There are various commercial assay kits such as the cAMP [3 H] or [125 -I] BioTrak® ® cAMP SPA assay from Amersham ® or AlphaScreen ® or ® Lance cAMP assay PerkinElmer ® are all based on the Principle that arises in the AC reaction from ATP unlabeled cAMP.
  • HEFP TM PDE Assay based on IM AP technology, allows the use of a fluorescently labeled substrate instead of radioactivity.
  • the HEFP-PDE assay uses fluorescein-labeled cAMP (FI-cAMP), which is converted by the PDE into fluorescein-labeled 5 1 AMP (Fl-AMP).
  • FI-cAMP fluorescein-labeled cAMP
  • Fl-AMP fluorescein-labeled 5 1 AMP
  • the FI-AMP selectively binds to special beads and this fluoresces strongly.
  • FI-cAMP does not bind to the beads, so that an increase in polarization is proportional to the amount of FI-AMP produced.
  • fluorescently-labeled ATP can be used instead of FI-cAMP and beads that selectively bind to FI-cAMP instead of FI-cAMP (eg, beads loaded with cAMP antibody).
  • polypeptides or domains ie sequence segments of the polypeptides having a particular function
  • polypeptides or domains which differ structurally, as described below, but which still perform the same function: functionally equivalent variants of domains the skilled person easily, as described in more detail below, find by varying and functional testing of the corresponding domains, by sequence comparisons with corresponding domains of other known proteins or by hybridization of the corresponding nucleic acid sequences encoding these domains with suitable sequences from other organisms.
  • a "functional linkage" be threads, preferably understood as covalent compounds of domains which leads to arrangement of the domains is that they can fulfill their function.
  • ß functional binding of the GAFA- domain GAF domain and the catalytic domain of Adenylate cyclase is understood as meaning a compound of these domains which results in an arrangement of the domains such that upon ligand binding, for example, cGMP or PDE11 modulators, the GAF domains change their conformation and thereby modulate the catalytic activity of the adenylate cyclase domain functional binding of the GAF a - GAF domain and the B domain is a binding of these domains understood that a Arrangement of the domains leads to the GAF A domain and the GAF ß domain together as GAF domain in ligand binding, for example by cGMP or PDE11 modulators change their conformation.
  • candidate human phosphodiesterases 11 are selected from the group of isoforms PDE11 A (Accession: NP_058649 / BAB16371), PDE11A1 (Accession: BAB62714 / CAB82573), PDE11A2 ( Accession: BAB16372), PDE11A3 (Accession: BAB62713) and PDE11A4 (Accession: BAB62712) or their respective functionally equivalent variants, particularly preferred is the use according to the invention of the GAF domains of the isoform PDE11A4 or their functionally equivalent variants.
  • the GAF A domain of the polypeptide of the invention has an amino acid sequence containing the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 6 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids having an identity of at least 90%, preferably at least 91%, more preferably at least 92%, more preferably at least 93%, more preferably at least 94%, more preferably at least 95%, more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 6 and has the property of a GAF A domain.
  • SEQ. ID. NO. 6 can be used for the entire description analogous to SEQ. ID. NO. 15 are used.
  • SEQ. ID. NO. Figure 15 is the N-terminus of the GAF A domain around an amino acid (L240) versus SEQ. ID. NO. 6 shortened.
  • substitution refers to the replacement of one or more amino acids by one or more amino acids.
  • conservative exchanges are carried out in which the replaced amino acid has a property similar to that of the original amino acid, for example exchanging GIu with Asp, GIn with Asn, VaI with He, Leu with He, Ser with Thr.
  • Deletion is the replacement of an amino acid by a direct bond.
  • Preferred positions for deletions are the termini of the polypeptide and the links between the individual Protein domains.
  • Insertions are insertions of amino acids into the polypeptide chain, formally replacing a direct bond with one or more amino acids.
  • Identity between two proteins is understood to mean the identity of the amino acids over the entire protein length in each case, in particular the identity which can be determined by comparison with the aid of the laser gene software from DNASTAR. Madison, Wisconsin (USA) using the Clustal method (Higgins DG, Sharp PM., Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, Comput Appl. Biosci 1989 Apr; 5 (2): 151-1) calculated with the following parameters becomes:
  • a protein or a domain which has an identity of at least 90% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 6 is accordingly understood as meaning a protein or a domain which, when comparing its sequence with the sequence SEQ ID NO: 6, in particular according to the above program logarithm with the above parameter set has an identity of at least 90%.
  • GAF A domain The property of a GAF A domain is understood in particular to be its function, in particular to bind together with the GAF B domain cGMP.
  • the GAF A domain of the polypeptide according to the invention has the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 6 on.
  • the GAF B domain of the polypeptide of the invention has an amino acid sequence containing the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 8 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids having an identity of at least 90%, preferably at least 91%, more preferably at least 92%, more preferably at least 93%, more preferably at least 94%, more preferably at least 95%, more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 8 and the property of a GAF B domain aul Anlagen.
  • GAF B domain in particular its function to be responsible for the dimer formation and in particular its property, together with the GAF A domain by binding of cGMP to activate the PDE11 or by binding of PDE11 modulators PDE11 Activity, ie to increase or decrease.
  • the GAF B domain of the polypeptide according to the invention has the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 8 on.
  • the functionally linked GAF A domain and GAF B domain, ie the complete GAF domain, of a human phosphodiesterase 11 (PDE11) or their functionally equivalent variants have an amino acid sequence containing the amino acid sequence SEQ. ID. NO.
  • amino acids having an identity of at least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 93%, more preferably at least 95%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 10 and the regulatory property of the GAF domain of a human phosphodiesterase 11 (PDE11), wherein the amino acid sequences contained the GAF A domain, SEQ. ID. NO. 6 and the GAF B domain, SEQ. ID. NO.
  • the N-terminal residue of the particularly preferred GAF domain SEQ. ID. NO. 10 is from the N-terminus to the GAF A domain SEQ. ID. NO. 6 freely variable and in particular shortened.
  • the N-terminal residue of the most preferred GAF domain is SEQ. ID. NO. 10 by 100 amino acids, more preferably 90 amino acids, more preferably 80 amino acids, more preferably 70 amino acids, more preferably 60 amino acids, more preferably 50 amino acids, more preferably 40 amino acids, more preferably 30 amino acids, more preferably by 20 amino acids, more preferably by 10 amino acids, more preferably by 5 amino acids N-terminal shortened.
  • amino acid partial sequences of the GAF A domain SEQ. ID. NO. 6 and the GAF B domain, SEQ. ID. NO. 8 can be replaced by substitution, insertion or deletion of amino acids by not more than 10%, more preferably not more than 9%, more preferably not more than 8%, more preferably not more than 7%, more preferably not more than 6%, more preferably not more than 5%, more preferably not more than 4%, more preferably not more than 3% , more preferably not more than 2%, more preferably not more than 1, more preferably not more than 0.5%, without the loss of the respective functions described above.
  • the functionally linked GAF A domain and GAF B domain ie the complete GAF domain, of a human phosphodiesterase 11 (PDE11) or its functionally equivalent variants has an amino acid sequence selected from the group
  • adenylate cyclases which have a GAF domain in their natural form.
  • Particularly preferred adenylate cyclases are adenylate cyclases of bacterial origin, in particular of cyanobacteria which have a GAF domain in their natural form or their respective functionally equivalent variants.
  • adenylate cyclases are selected from the group consisting of:
  • Very particularly preferred adenylate cyclases are adenylate cyclases from Anabaena sp. PCC 7120 of the isoform CyaB1 or CyaB2, in particular CyaB1 (Accession: NP_486306, D89623) or their functionally equivalent variant.
  • the catalytic domain of an adenylate cyclase or its functionally equivalent variants has an amino acid sequence containing the amino acid sequence SEQ. ID. NO.
  • amino acids 12 or a sequence derived from this sequence by substitution, insertion or deletion of amino acids having an identity of at least 90%, preferably at least 91%, more preferably at least 92%, more preferably at least 93%, more preferably at least 94%, more preferably at least 95%, more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 12 and has the catalytic property of an adenylate cyclase.
  • a catalytic domain of adenylate cyclase is understood to be the catalytic property of an adenylate cyclase described above, in particular the ability to convert ATP into cAMP.
  • the catalytic domain of an adenylate cyclase or its functionally equivalent variants has an amino acid sequence selected from the group
  • the polypeptide according to the invention comprises the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 1 or SEQ. ID. NO. 4 or one of these sequences derived by substitution, insertion or deletion of amino acids having an identity of at least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 93%, more preferably at least 95%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% at the amino acid level with the sequence SEQ ID NO: 1 or 4 and the regulatory properties of the GAF domain of a human phosphodiesterase 11 (PDE11) and the catalytic properties an adenylate cyclase, wherein the amino acid sequences contained the GAF A domain, SEQ. ID. NO. 6, the GAF B domain, SEQ. ID. NO. 8 and the catalytic domain of adenylate cyclase, SEQ. ID. NO. 12 by substitution,
  • SEQ. ID. NO. 4 can be used for the entire description analogous to SEQ. ID. NO. 13 are used. At SEQ. ID. NO. 13 is missing compared to SEQ. ID. NO. 4 the amino acid A1020.
  • the N-terminal residue of the particularly preferred polypeptides according to the invention SEQ. ID. NO. 1 and SEQ. ID. NO.4 is from the N-terminus to the GAF A domain SEQ. ID. NO. 6 freely variable and in particular shortened.
  • the N-terminal residue of the particularly preferred polypeptides of the invention SEQ. ID. NO. 1 or SEQ. ID. NO.4 is 100 amino acids, more preferably 90 amino acids, more preferably 80 amino acids, more preferably 70 amino acids, more preferably 60 amino acids, more preferably 50 amino acids, more preferably 40 amino acids, more preferably 30 amino acids, more preferably 20 amino acids, even more preferably 10 Amino acids, more preferably by 5 amino acids N-terminal shortened.
  • amino acid partial sequences of the GAF A domain SEQ. ID. NO. 6, the GAF B domain, SEQ. ID. NO. 8 and the catalytic domain of adenylate cyclase, SEQ. ID. NO. 12 can be replaced by substitution, insertion or deletion of amino acids by not more than 10%, more preferably not more than 9%, more preferably not more than 8%, more preferably not more than 7%, more preferably not more than 6%, more preferably not more than 5%, more preferably not more than 4% , more preferably at most 2%, more preferably at most 1, more preferably at most 0.5%, without causing the loss of the respective function described above.
  • the chimeric polypeptide according to the invention contains the N-terminus of the human PDE11A4 N-terminally from M24 to K591 (Accession: BAB62712). This is followed by C-terminal of V386, which mutated from L386 upon insertion of the cloning site, to K859, the C-terminus of CyaB1 (Accession: NP_486306).
  • polypeptide according to the invention comprising the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 1 or SEQ. ID. NO. 4th
  • Very particularly preferred polypeptides according to the invention are polypeptides having the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 1 or SEQ. ID. NO. 4th
  • the invention further relates to polynucleotides, also referred to below as nucleic acids, encoding one of the polypeptides according to the invention described above.
  • All polynucleotides or nucleic acids mentioned in the description can be, for example, an RNA, DNA or cDNA sequence.
  • Particularly preferred polynucleotides according to the invention contain as partial sequences
  • SEQ. ID. NO. Figure 5 represents a particularly preferred partial nucleic acid sequence encoding the most preferred GAF A domain SEQ. ID. NO. 6th
  • SEQ. ID. NO. Figure 7 represents a particularly preferred partial nucleic acid sequence encoding the most preferred GAF B domain SEQ. ID. NO. 8th.
  • SEQ. ID. NO. Figure 11 represents a particularly preferred partial nucleic acid sequence encoding the most preferred catalytic domain of an adenylate cyclase SEQ. ID. NO. 12th
  • nucleic acids or partial nucleic acids encoding the domains described above can furthermore be obtained starting from the partial nucleic acid sequences described above, in particular starting from the sequences SEQ ID NO: 5, 7 or 11 from various organisms whose genomic sequence is unknown, by hybridization techniques easy to find in a conventional manner.
  • Hybridization may be under moderate (low stringency) or preferably under stringent (high stringency) conditions.
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with 2X SSC at 50_C) and those with high stringency (with 0.2X SSC at 50_C, preferably at 65_C) (2OX SSC: 0, 3M sodium citrate, 3M sodium chloride, pH 7.0).
  • the temperature may be raised from moderate conditions at room temperature, 22_C, to stringent conditions at 65_C.
  • Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied at the same time, also one of the two parameters can be kept constant and only the other can be varied.
  • denaturing agents such as formamide or SDS may also be used. In the presence of 50% formamide, hybridization is preferably carried out at 42_C.
  • a particularly preferred polynucleotide according to the invention encoding a polypeptide according to the invention contains the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO.2.
  • a very particularly preferred polynucleotide according to the invention encoding a polypeptide according to the invention has the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 2 on.
  • polypeptides according to the invention can preferably be prepared by transforming a polynucleotide described above, encoding a polypeptide according to the invention into a suitable expression vector, transforming a host cell with this expression vector, expressing this host cell expressing the polypeptide according to the invention and then isolating the protein according to the invention becomes.
  • the invention therefore relates to a method for producing a polypeptide according to the invention by cultivating a recombinant host cell, expression and isolation of the polypeptide according to the invention.
  • the invention further relates to a recombinant plasmid vector, in particular an expression vector, comprising a polynucleotide according to the invention encoding a polypeptide according to the invention.
  • the nature of the expression vector is not critical. Any expression vector capable of expressing the desired polypeptide in a corresponding host cell can be used. Suitable expression systems are known to the person skilled in the art.
  • Preferred expression vectors are PQE30 (Quiagen), pQE60 (Quiagen) pMAL (NEB) pIRES.
  • PIVEX2.4a ROCHE
  • PIVEX2.4b ROCHE
  • PIVEX2.4c ROCHE
  • pUMVCI Aldevron
  • pUMVC2 Aldevron
  • PUMVC3 Aldevron
  • PUMVC4a Aldevron
  • PUMVC4b Aldevron
  • pUMVC7 Aldevron
  • PUMVC ⁇ a Aldevron
  • pSP64T pSP64TS
  • pT7TS pCro7
  • pKJE7 Takara
  • pKM260 pYes260
  • pGEM-T Easy PUMVC ⁇ a (Aldevron)
  • pSP64T pSP64TS
  • pT7TS pCro7
  • pKJE7 Takara
  • pKM260 pYes260
  • pGEM-T Easy Easy.
  • the invention further relates to a recombinant host cell comprising a plasmid vector according to the invention.
  • This transformed host cell is preferably able to express the polypeptide of the invention.
  • the type of host cell is not critical. Both prokaryotic host cells and eukaryotic host cells are suitable. Any host cell capable of expressing the desired polypeptide with a corresponding expression vector can be used. suitable Expression systems from expression vectors and host cells are known in the art.
  • Preferred host cells are, for example, prokaryotic cells such as E. coli, Corynebacteria, yeasts, streptomycetes or eukaryotic cells such as CHO, HEK293 or insect cell lines such as SF9, SF21, Xenopus oocytes.
  • prokaryotic cells such as E. coli, Corynebacteria, yeasts, streptomycetes
  • eukaryotic cells such as CHO, HEK293 or insect cell lines such as SF9, SF21, Xenopus oocytes.
  • the culturing conditions of the transformed host cells such as culture medium composition and fermentation conditions, are known to those skilled in the art and depend on the type of host cell chosen.
  • Isolation and purification of the polypeptide may be by standard methods, for example as described in "The QuiaExpressionist®, Fifth Edition, June2003.
  • transformed host cells expressing the polypeptide of the present invention are also particularly useful for performing methods described below for identifying PDE11 modulators in a cellular assay.
  • it may furthermore be advantageous to immobilize the corresponding host cells on solid supports and / or to carry out a corresponding screening procedure in high-throughput scale (high-throughput screening).
  • nucleic acid sequences can be cut out from known nucleic acid sequences by methods known, for example enzymatic, and reassembled with known nucleic acid sequences and thus produced. Furthermore, all of the abovementioned nucleic acids can be prepared in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide units, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid units of the double helix. The chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, p. 896-897).
  • the invention further relates to a method of identifying a modulator of a human phosphodiesterase 11 (PDE11) comprising the steps
  • step (b) determining if the possible modulator alters the adenylate cyclase activity of the polypeptide of the invention compared to the absence of the possible modulator.
  • step (a) in addition to the possible modulator of a human phosphodiesterase 11 (PDE11), cGMP is contacted with a polypeptide according to the invention.
  • PDE11 human phosphodiesterase 11
  • the potential PDE11 modulator preferably in vitro, is incubated with the preferably purified polypeptide according to the invention and particularly preferably with cGMP, and the change in the adenylate cyclase activity of the polypeptide according to the invention is measured against a test batch without PDE11 modulator.
  • the alteration of adenylate cyclase activity, after addition of the potential PDE11 modulator, can be measured to a pilot preparation containing the polypeptide of the invention and optionally cGMP.
  • the adenylate cyclase activity of the PDE11 / CyaB1 chimera is determined by reaction of a defined amount of ATP in cAMP, as described in more detail below.
  • PDE11 modulator By a modulator of a human phosphodiesterase 11 (PDE11), hereinafter also PDE11 modulator is meant a substance capable of modulating PDE11 activity via binding to the GAF domains of PDE11, i. here, measured by the change in adenylate cyclase activity.
  • a PDE 11 modulator thus acts via the allosteric center of PDE11 and not or not alone via the catalytic center of PDE11.
  • the modulator may be an agonist by increasing the enzymatic activity of PDE11 (PDE11 agonist) or an antagonist by lowering the enzymatic activity of RDE11 (PDE11 antagonist).
  • cGMP is a PDE11 agonist.
  • Preferred PDE11 modulators are furthermore, for example, peptides, peptidomimetics, proteins, in particular antibodies, in particular monoclonal antibodies directed against GAF domains, amino acids, amino acid analogs, nucleotides, nucleotide analogs, polynucleotides, in particular oligonucleotides and particularly preferably so-called "small molecules" or SMOLs
  • Preferred SMOLs are organic or inorganic compounds, including heteroorganic compounds or oranometallic compounds having a molecular weight of less than 1000 g / mol, in particular having a molecular weight of from 200 to 800 g / mol, more preferably having a molecular weight of from 300 to 600 g / mol.
  • a PDE 11 modulator preferably binds to the GAF domains in the polypeptide according to the invention (PDE11 / CyaB1 chimera) and leads either directly to a change in the adenylate cyclase activity of the polypeptide according to the invention (PDE11 / CyaB1-). Chimera) or to alter the adenylate cyclase activity of the PDE11 / CyaB1 chimera by displacing cGMP from the PDE11 / CyaB1 chimera.
  • the dose-response curve according to FIG. 5 results.
  • the PDE 11 A4 / CyaB1 chimera is activated about 4 times by 1 mM cGMP. This corresponds to a% basal value of 400 and shows that cGMP is a PDE11 A4 GAF agonist.
  • cAMP does not activate at 1mM and has a% basal value of about 150, i. it is neither a GAF agonist nor an antagonist.
  • the modulation, ie the change, ie the increase or decrease of the adenylate cyclase activity by the PDE11 modulator in a test batch without cGMP is calculated as% basic value according to the following formula:
  • the% basal value is less than 50 using 100 ⁇ M of the potential PDE11 modulator, this indicates a PDE 11 antagonist binding to the GAF domains in the PDE11 / CyaB1 chimera, while a% basal value greater than 200 suggesting PDE11 agonists.
  • the invention therefore relates to a particularly preferred method according to the invention in which, in the presence of the modulator, a decrease in the adenylate cyclase activity is measured in comparison to the absence of the modulator and the modulator represents a PDE11 antagonist.
  • the invention relates to a particularly preferred method according to the invention after an increase in adenylate cyclase activity is measured in the presence of the modulator compared to the absence of the modulator and the modulator is a PDE11 agonist.
  • the determination of the adenylate cyclase activity is carried out by measuring the conversion of radioactively or fluorescently labeled ATP.
  • the measurement of the adenylate cyclase activity of the polypeptide according to the invention, the PDE11 / CyaB1 chimera, can be carried out by measuring the conversion of radioactive [ ⁇ - 32 P] -ATP into [Ct- 32 P] -CAMP.
  • the adenylate cyclase activity is easily possible by measuring the resulting cAMP via antibody binding.
  • There are various commercial assay kits such as the cAMP [3 H] or [125 -I] BioTrak® ® cAMP SPA assay from Amersham ® or AlphaScreen ® or ® Lance cAMP assay PerkinElmer ® are all based on the Principle that arises in the AC reaction from ATP unlabeled cAMP.
  • HEFP TM PDE assay based on IMAP technology also allows the use of a fluorescently labeled substrate instead of radioactivity.
  • the HEFP-PDE assay uses fluorescein-labeled cAMP (FI-cAMP), which is converted by the PDE into fluorescein-labeled 5 1 AMP (Fl-AMP).
  • FI-cAMP fluorescein-labeled cAMP
  • Fl-AMP fluorescein-labeled 5 1 AMP
  • the FI-AMP selectively binds to special beads and this fluoresces strongly.
  • FI-cAMP does not bind to the beads, so that an increase in polarization is proportional to the amount of FI-AMP produced.
  • fluorescently-labeled ATP can be used instead of FI-cAMP and beads that selectively bind to FI-cAMP instead of FI-cAMP (eg, beads loaded with cAMP antibody).
  • a counterscreen is additionally performed.
  • the invention therefore furthermore relates to a preferred process according to the invention in which, in order to exclude direct modulators of the catalytic domain of adenylate cyclase, a process according to the invention is carried out using a polypeptide which has the catalytic domain of an adenylate cyclase and no functional GAF domain of a human phosphodiesterase 11 (PDE11). having.
  • PDE11 human phosphodiesterase 11
  • the% base value is determined analogously to the method described above, preferably instead of with the PDE11 / CayB1 chimera with a protein which preferably contains only a) the AC catalytic center or b) mutations to amino acids essential for GAF function or c) is truncated N-terminal to the GAF domains.
  • a) is a polypeptide having the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 1, with the proviso that N-terminal A2 to L775 are missing.
  • An example of b) is a polypeptide having the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 1, with the proviso that it contains the mutation D355A.
  • c) is a polypeptide having the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 1, with the proviso that the partial sequence from L240 to K568 is missing.
  • the method is carried out as a cellular assay in the presence of an above-described host cell according to the invention.
  • the resulting cAMP as a measure of the adenylate cyclase activity, can also be determined in cellular assays, as for example in Johnston, P. Cellular assays in HTS, Methods Mol. Biol. 190, 107-16. (2002) and Johnston, P.A. and Johnston, P.A. Cellular platforms for HTS: three case studies.Drag Discov Today. 7, 353-63. (2002).
  • cDNA of the polypeptides of the invention, the PDE11 / CyaB1 chimera, inserted via suitable interfaces in a transfection vector and with the resulting , preferably cDNA of the polypeptides of the invention, the PDE11 / CyaB1 chimera, inserted via suitable interfaces in a transfection vector and with the resulting ,.
  • Vector construct suitable cells such as CHO or HEK293 cells transfected. The cell clones are selected which stably express the polypeptides according to the invention.
  • the intracellular cAMP level of the transfected cell clones is significantly influenced by the adenylate cyclase activity of the polypeptides of the invention.
  • GAF antagonists cause a decrease in adenylate cyclase activity and GAF agonists cause an increase in intracellular cAMP.
  • the amount of cAMP can be measured either after lysis of the cells with the methods described above (BioTrak ®, Alpha Screen ® or HEFP ®), or directly into the cell.
  • a reporter gene is preferably coupled to a CRE (cAMP response element) in the cell line (Johnston, P. Cellular assays in HTS, Methods Mol Biol.
  • cAMP response element binding protein cAMP response element binding protein
  • CRE regulator cAMP response element binding protein
  • ß-galactosidase or luciferase whose expression level can be determined by fluorometric, photometric or luminometric, as in Greer, LF and Szalay, AA Imaging of light emission from the expression of luciferase in living cells and organisms: a review. Luminescence 17, 43-72 (2002) or Hill, S. et al. Reporter gene system for the study of G-protein coupled receptors. Curr. Opin. Pharmacol. 1, 526-532 (2001).
  • the above-described inventive method in particular as a cellular assay in high-throughput scale is applied.
  • the cloning was carried out according to standard methods.
  • the original clone with the human PDE11A4 gene (Genbank Accession No. BAB62712) was provided in a vector.
  • a gene fragment hPDE11A4 1 _ 391 was amplified, which encodes the PDE11 A4 N-terminus with the GAF A domain and N-terminally contains a BglII and C-terminal an XbaI site.
  • the N-terminal SalI site of hPDE11 A4 ⁇ 69 was cloned onto the C-terminal Xhol site of CyaBi 3 ⁇ 6-859 and L386 was mutated from CyaB1 to V. All cloning steps were carried out in E. coli XHblueMRF.
  • the gene for the PDE11-GAF chimera was recloned into the expression vector pQE30 (from Quiagen).
  • the pQE30 vector with the gene for the PDE11 -GAF chimera was retransformed into E. coli BL21 cells.
  • the expression and purification of the protein was analogous to "The QiaExpressionist ® ", Fifth Edition, June 2003.
  • the optimal protein yield under the expression conditions induction with 25 ⁇ M IPTG, 16h incubation at 16 ° C and subsequent French Press treatment of E. coli.
  • the adenylate cyclase activity of the PDE 11 A4 / CyaB1 chimera is measured with and without substance to be investigated.
  • the adenylate cyclase activity by reacting a defined amount of ATP in cAMP and its chromatographic separation via 2 column steps according to Salomon et al. certainly.
  • For the detection of the conversion is used as a radioactive tracer [ ⁇ - 32 P] -ATP and the resulting amount of [ ⁇ - 32 P] -cAMP measured.
  • 3 H-CAMP serves as an internal standard for the recovery rate.
  • the incubation time should be between 1 and 120 min, the incubation temperature between 20 and 45 0 C, the Mg 2+ cofactor concentration between 1 and 20 mM (it can also be appropriate amounts of Mn 2+ used as cofactor) and the ATP concentration between 0.5 ⁇ M and 5 mM.
  • An increase of the substance with respect to the substance without substance indicates a GAF-agonistic effect. If the conversion is inhibited by substance addition, this indicates a GAF-antagonistic effect of the substance.
  • GAF antagonism can also be measured by blocking the activation of the PDE11 A4 / CyaB1 chimera by the native GAF ligand cAMP. For this purpose, the conversion is measured with increasing cAMP concentrations with and without substance. If the sales with substance are below those without substance, this indicates a GAF antagonism of the substance.
  • a reaction mixture contains:
  • the protein samples and the cocktail are mixed in 1.5 ml reaction vessels on ice, the reaction started with ATP and incubated at 37 0 C for 10 min. The reaction is stopped with 150 ⁇ l of AC stop buffer, the reaction vessels are placed on ice and 10 ⁇ l of 20 mM cAMP including 100 Bq [2,8- 3 H] -CAMP and 750 ⁇ l of water are added.
  • each test batch is duplicated.
  • the blank used was a test batch with water instead of enzyme.
  • the enzyme basal activity is determined.
  • each sample is placed on glass columns with 1.2 g of Dowex-50WX4-400 and, after infiltration with 3-4 ml of water. It was then eluted with 5 ml of water on aluminum oxide columns (9 ⁇ 1 cm glass columns with 1.0 g of AL 2 O 3 90 active, neutral) and this with 4 ml of 0.1 M TRIS / HCl, pH 7.5 in scintillation vials eluted with 4 ml of scintillator Ultima XR Gold.
  • the inhibition or activation of the enzyme by the substance is calculated as% basic value according to the following formula:
  • a GAF antagonist is present in a test batch with 100 ⁇ M cGMP when the% base value is less than 90 using 100 ⁇ M of the substance to be investigated.
  • Fig. 1 Amino acid sequence of the PDE11 / CyaB1 chimera
  • Fig. 2 cDNA sequence of the PDE11 / CyaB1 chimera
  • Fig. 4 Schematic representation of the chimeric PDE11 / CYAB1 polypeptide
  • FIG. 5 Activation of the PDE11 / CyaB1 chimera by cyclic nucleotides If the assay with cGMP or cAMP is carried out as substances to be tested, the dose response curve according to FIG. 5 results.
  • the PDE 11A4 / CyaB1 chimera is activated about 4 times by 1 mM cGMP , This corresponds to a% baseline value of 400 and shows that cGMP is a PDE11 A4 GAF agonist.
  • cAMP does not activate at 1mM and has a% basal value of about 150, i. it is neither a GAF agonist nor an antagonist.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid, enthaltend die GAFA-Domäne und GAFB­Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) und die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase sowie die Verwendung dieses Polypeptids in einer Methode zur Identifizierung von PDE11-Modulatoren.

Description

Methode zur Identifizierung von PDE11 -Modulatoren
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid, enthaltend die GAFA-Domäne und GAFB- Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) und die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase sowie die Verwendung dieses Polypeptids in einer Methode zur Identifizierung von PDE11-Modulatoren.
Stand der Technik
Phosphodiesterasen (=PDEs) sind eukaryontische Proteine und als Modulatoren von den cyclischen Nukleotiden cAMP und cGMP bekannt. PDEs werden in 3 Klassen (I1 Il und III) eingeteilt, von denen nur die Klasse I mit ihren 11 PDE-Familien (PDE1 bis-11 genannt) bei Säugetieren vorkommt.
GAF-Domänen sind ubiquitär in allen Reichen des Lebens und wurden von Aravind und Ponting (Aravind L. and Ponting CP: The GAF domain: an evolutionary link between diverse phototransducing proteins. 1997, TIBS, 22, 458-459) aufgrund von Proteinstruktur und - sequenzvergleichen definiert. PDE2, PDE5 und PDE6 enthalten so genannte cGMP-bindende GAF-Domänen, die eine Rolle in der allosterischen Aktivierung der PDEs spielen.
Von humaner PDE11 sind verschiedene Isoformen kloniert und charakterisiert worden (Hetman et al. PNAS 2000, 97, 12891 bis 12895 und Soderling et al., Current Opinion in Cell Biology 2000, 12, 174-179).
Adenylatcyclasen (=ACs) katalysieren in allen Bereichen des Lebens die Umwandlung von ATP in cAMP (Cooper D.M.: Regulation and organization of adenylyl cyclases and cAMP. 2003, Biochem J., 375(R 3),517-29; Tang WJ. and Gilman A.G.: Construction of a soluble adenylyl cyclase activated by Gsα and forskolin. 1995, Science, 268, 1769-1772). Aufgrund von Sequenzvergleichen und strukturellen Überlegungen werden sie in 5 Klassen (I bis V) unterteilt. Von molekularbiologischem Interesse sind die bakteriellen Klasse III ACs aus Cyanobakterien insbesondere aus Nostoc sp. PCC 7120 zu denen auch CyaB1 gehört. Die cyanobakteriellen ACs CyaB1 und CyaB2 enthalten ebenfalls N-terminale GAF-Domänen, die strukturell ähnlich zu denen der PDEs sind, aber cAMP als aktivierenden Liganden haben. Die 9 bekannten Familien der Klasse III ACs des Menschen sind alle Membrangebunden und werden über G-Proteine reguliert (Tang WJ. and Gilman A.G.: Construction of a soluble adenylyl cyclase activated by Gsα and forskolin. 1995, Science, 268, 1769-1772). Eine Kombination mit GAF-Domänen ist nicht bekannt. Die Konstruktion einer Chimäre aus den GAF-Domänen der Ratten-PDE2 und dem katalytischen Zentrum der Adenylatcyclase CyaBi ist bereits beschrieben (Kanacher T., Schultz A., Linder J. U. and Schultz J. E.: A GAF-domain-regulated adenylyl cyclase from Anabaena is a seif activated cAMP switch. 2002, EMBO J., 21, 3672-3680).
Ein Chimer aus humaner PDE11 und bakterieller Adenylatcyclase ist nicht bekannt. Ebenso ist die Verwendung eines solchen Chimers in einer Methode zur Identifizierung von PDE 11 -Modulatoren aus dem Stand der Technik nicht bekannt.
Beschreibung der Erfindung
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Identifizierung von PDE11 -Modulatoren bereitzustellen.
Die Aufgabe wird durch Bereitstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids, umfassend funktionell verknüpft (a) die GAFA-Domäne und GAFB-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) oder deren funktionell äquivalenten Varianten und (b) die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase oder deren funktionell äquivalenten Varianten und dessen Verwendung in einem Verfahren zur Identifizierung von PDE11-Modulatoren gelöst.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass sich ein chimäres Protein aus N-terminalen humanen PDE 11 -GAF-Domänen und C-terminalen katalytischem Zentrum einer Adenylatcyclase als Effektormolekül eignet. Im Chimären Protein sind die GAF-Domänen die Aktivierungsdomänen, die bei Liganden-Bindung ihre Konformation ändern und dadurch die katalytische Aktivität der Adenylatcyclase-Domäne, die als read-out dient, modulieren.
Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, dass cGMP selektiv die GAF-Domäne der PDE11 als Agonist aktiviert.
Diese Ergebnisse waren insbesondere überraschend, da beispielsweise die GAF-Domäne der PDE11A4 nur 26 % Identität zur GAF-Domäne der CyaB1 zeigt und ein funktioneller, aktivierender Ligand der GAF-Domäne der PDE11 A4 bis jetzt unbekannt war (Yuasa K., Kanoh Y., Okumura K., Omori K. Genomic organization of the human Phosphodiesterase PDE11A gene. Evolutionary relatedness with other PDEs containing GAF domains. Eur J Biochem. 2001 , 268, 168-78).
Die vorliegende Erfindung ermöglicht, PDE11 -Modulatoren, d.h. PDE 11 -Antagonisten oder PDE11- Agonisten zu identifizieren, die nicht über die Bindung und Blockierung des katalytischen Zentrums der PDE11 wirken, sondern durch allosterische Regulation am N-Terminus der PDE11, d.h. an den GAF-Domänen, wirken. Wie vorstehend erwähnt, betrifft die Erfindung ein Polypeptid umfassend funktionell verknüpft
(a) die GAFA-Domäne und GAFB-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) oder deren funktionell äquivalenten Varianten und
(b) die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase oder deren funktionell äquivalenten Varianten.
Unter einer humanen Phosphodiesterase oder auch PDE wird ein Enzym humanen Ursprungs verstanden, dass in der Lage ist cAMP oder cGMP in die entsprechenden inaktiven 5'- Monophosphate zu überführen. Augrund ihrer Struktur und Eigenschaften werden die PDEs in verschiedene Familien klassifiziert. Unter einer humanen Phosphodiesterase 11 oder auch PDE11 wird insbesondere eine Enzymfamilie humanen Ursprungs verstanden, die in der Lage ist cGMP in das inaktive 5'-Monophosphate zu überführen.
Erfindungsgemäß als PDE11 kommen sämtliche PDE11 in Frage, die eine GAFA-Domäne und GAFß-Domäne aufweisen. Die GAF-Domänen von PDE11 sind als Tandem N-terminal im Protein lokalisiert. Die GAF-Domäne, die dem N-Terminus am nächsten ist, wird als GAFA bezeichnet und die unmittelbar folgende als GAFB. Anfang und Ende der GAF-Domänen können anhand von Proteinsequenzvergleichen bestimmt werden. Ein SMART-Sequenzvergleich (Schultz J., Milpetz F., Bork P. and Pointing C.P.: SMART a simple modular architecture research tool: identification of signaling domains. 1998, PNAS, 95, 5857-5864) ergibt beispielsweise für GAFA der Isoform PDE11A4: L240 bis L403 (SEQ. ID. NO. 6) und für GAFB: V425 bis K591 (SEQ. ID. NO. 8).
Unter einer Adenylatcyclase wird ein Enzym verstanden, dass in der Lage ist ATP in cAMP zu überführen. Dementsprechend wird unter Adenylatcyclase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das erfindungsgemäße Polypeptid umgesetzte Menge ATP bzw. gebildete Menge cAMP verstanden.
Unter einer katalytischen Domäne einer Adenylatcyclase wird der Teil der Aminosäuresequenz einer Adenylatcyclase verstanden, der nötig ist damit die Adenylatcyclase noch ihre Eigenschaft aufweist, ATP in cAMP zu überführen, also noch im wesentlichen funktionell ist und somit eine Adenylatcyclase-Aktivität aufweist.
Durch iteratives Verkürzen der Aminosäuresequenz und anschließendem Messen der Adenylatcyclase-Aktivität lässt sich die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase einfach bestimmen.
Die Bestimmung der Adenylatcyclase-Aktivität kann beispielsweise durch die Messung des Umsatzes von radioaktivem [00-32P]-ATP in [α-32P]-cAMP erfolgen. Generell ist die Adenylatcyclase-Aktivität leicht über die Messung des entstandenen cAMP über Antikörperbindung möglich. Dafür gibt es verschiedene käufliche Assay-Kits wie die cAMP [3H-] oder [125-l] Biotrak® cAMP SPA-Assays von Amersham® oder den AlphaScreen® bzw. Lance® cAMP Assay von PerkinElmer®: Sie alle basieren auf dem Prinzip, das bei der AC-Reaktion aus ATP unmarkiertes cAMP entsteht. Dieses konkurriert mit exogen zugesetzten 3H-, 1251-, oder Biotin- markierten cAMP um die Bindung an einem cAMP-spezifischen Antikörper. Beim nicht radioaktiven Lance®-Assay ist Alexa®-Flour and den Antikörper gebunden, das mit dem Tracer ein TR-FRET- Signal bei 665 nm erzeugt. Je mehr unmarkiertes cAMP gebunden ist, desto schwächer ist das durch markiertes cAMP ausgelöste Signal. Mit einer Standardkurve können die Signalstärken den entsprechenden cAMP-Konzentrationen zugeordnet werden.
Analog zu dem High-Efficiency Fluorescence Polarization (HEFP™)-PDE-Assay von Molecular Devices, der auf der I M AP-Technologie basiert, kann statt radioaktiv auch fluoreszenz-markiertes Substrat verwendet werden. Beim HEFP-PDE-Assay wird Fluorescein- markiertes cAMP (FI-cAMP) eingesetzt, das von der PDE zu Fluorescein-markierten 51AMP (Fl- AMP) umgesetzt wird. Das FI-AMP bindet selektiv an spezielle Beads und dadurch wird die Fluoreszenz stark polarisiert. FI-cAMP bindet nicht an die Beads, so das eine Zunahme der Polarisation der Menge an entstandenem FI-AMP proportional ist. Für einen entsprechenden AC- Test kann fluoreszenz-markiertes ATP statt FI-cAMP und Beads, die selektiv an FI-cAMP statt an FI-cAMP binden (z. B. Beads die mit cAMP Antikörper beladen sind), verwendet werden.
Unter „funktionell äquivalenten Varianten" von Polypeptiden bzw. Domänen, d.h. Sequenzabschnitten der Polypeptide, mit bestimmter Funktion werden Polypeptide bzw. Domänen verstanden, die sich strukturell unterscheiden, wie nachstehend beschrieben, aber noch die gleiche Funktion erfüllen. Funktionell äquivalente Varianten von Domänen, kann der Fachmann leicht, wie nachstehend näher beschrieben, durch Variation und Funktionstestung der entsprechenden Domänen, durch Sequenzvergleiche mit entsprechenden Domänen anderer bekannter Proteine oder durch Hybridisierung der entsprechenden Nukleinsäuresequenzen kodierend diese Domänen mit geeigneten Sequenzen aus anderen Organismen auffinden.
Unter einer „funktionellen Verknüpfung" werden Verknüpfungen, vorzugsweise kovalente Verbindungen von Domänen verstanden die zu einer Anordnung der Domänen führt, dass sie ihre Funktion erfüllen können. Beispielsweise wird unter einer funktionellen Verknüpfung der GAFA- Domäne, GAFß-Domäne und der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase eine Verbindung dieser Domänen verstanden, die zu einer Anordnung der Domänen führt, so dass die GAF- Domänen bei Liganden-Bindung, beispielsweise von cGMP oder PDE11 -Modulatoren ihre Konformation ändern und dadurch die katalytische Aktivität der Adenylatcyclase-Domäne modulieren. Weiterhin wird beispielsweise unter einer funktionellen Verknüpfung der GAFA- Domäne und der GAFß-Domäne eine Verbindung dieser Domänen verstanden, die zu einer Anordnung der Domänen führt, dass die GAFA-Domäne und die GAFß-Domäne gemeinsam als GAF-Domäne bei Liganden-Bindung, beispielsweise von cGMP oder PDE11 -Modulatoren ihre Konformation ändern.
Vorzugsweise sind die für die GAF Domänen, GAFA und GAFB, in Frage kommenden humanen Phosphodiesterasen 11 (PDE11 ) ausgewählt aus der Gruppe der Isoformen PDE11 A (Accession: NP_058649/ BAB16371), PDE11A1 (Accession: BAB62714/ CAB82573), PDE11A2 (Accession: BAB16372), PDE11A3 (Accession: BAB62713) und PDE11A4 (Accession: BAB62712) oder deren jeweiligen funktionell äquivalenten Varianten, besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Verwendung der GAF-Domänen der Isoform PDE11A4 oder deren funktionell äquivalenten Varianten.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die GAFA-Domäne des erfindungsgemäßen Polypeptids eine Aminosäuresequenz auf, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 6 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 91%, bevorzugter mindestens 92%, bevorzugter mindestens 93%, bevorzugter mindestens 94%, bevorzugter mindestens 95%, bevorzugter mindestens 96%, bevorzugter mindestens 97%, bevorzugter mindestens 98%, bevorzugter mindestens 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 und die Eigenschaft einer GAFA-Domäne aufweist.
Anstelle von SEQ. ID. NO. 6 kann für die ganze Beschreibung analog SEQ. ID. NO. 15 verwendet werden. Bei SEQ. ID. NO. 15 ist der N-Terminus der GAFA-Domäne um eine Aminsäure (L240) gegenüber SEQ. ID. NO. 6 verkürzt.
Dabei kann es sich um eine natürliche funktionell äquivalente Variante der GAFA-Domäne handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen mit anderen Proteinen gefunden werden kann oder um eine künstliche GAFA-Domäne, die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 6 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde.
Unter dem Begriff "Substitution" ist in der Beschreibung der Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von GIu durch Asp, GIn durch Asn, VaI durch He, Leu durch He, Ser durch Thr.
Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.
Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptidkette, wobei formal eine direkte Bindung durch eine oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.
Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene Software der Firma DNASTAR, ine. Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2): 151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Multiple alignment parameter:
Gap penalty 10
Gap length penalty 10
Pairwise alignment parameter:
K-tuple 1
Gap penalty 3
Window 5
Diagonals saved 5
Unter einem Protein oder einer Domäne, die eine Identität von mindestens 90>% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 aufweist, wird dementsprechend ein Protein bzw. eine Domäne verstanden, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO: 6, insbesondere nach obigem Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 90 % aufweist.
Unter der Eigenschaft einer GAFA-Domäne wird insbesondere dessen Funktion verstanden, insbesondere gemeinsam mit der GAFB-Domäne cGMP zu binden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform weist die GAFA-Domäne des erfindungsgemäßen Polypeptids die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 6 auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die GAFB-Domäne des erfindungsgemäßen Polypeptids eine Aminosäuresequenz auf, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 8 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 91%, bevorzugter mindestens 92%, bevorzugter mindestens 93%, bevorzugter mindestens 94%, bevorzugter mindestens 95%, bevorzugter mindestens 96%, bevorzugter mindestens 97%, bevorzugter mindestens 98%, bevorzugter mindestens 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 8 und die Eigenschaft einer GAFB-Domäne aulweist.
Dabei kann es sich um eine natürliche funktionell äquivalente Variante der GAFB-Domäne handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen mit anderen Proteinen gefunden werden kann oder um eine künstliche GAFB-Domäne, die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 6 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren, wie vorstehend beschrieben, abgewandelt wurde.
Unter der Eigenschaft einer GAFB-Domäne wird insbesondere dessen Funktion verstanden für die Dimer-Bildung verantwortlich zu sein und insbesondere dessen Eigenschaft, zusammen mit der GAFA-Domäne durch Bindung von cGMP die PDE11 zu aktivieren oder durch Bindung von PDE11- Modulatoren die PDE11 -Aktivität zu modulieren, d.h. zu erhöhen oder zu erniedrigen.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform weist die GAFB-Domäne des erfindungsgemäßen Polypeptids die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 8 auf.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Polypeptids weisen die funktionell verknüpfte GAFA-Domäne und GAFB-Domäne, d.h. die komplette GAF-Domäne, einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) oder deren funktionell äquivalenten Varianten eine Aminosäuresequenz auf, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 10 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 75%, bevorzugter mindestens 80%, bevorzugter mindestens 85%, bevorzugter mindestens 90%, bevorzugter mindestens 93%, bevorzugter mindestens 95%, bevorzugter mindestens 97%, bevorzugter mindestens 98%, bevorzugter mindestens 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 10 und die regulatorischen Eigenschaft der GAF-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) auf, wobei die enthaltenen Aminosäuresequenzen der GAFA-Domäne, SEQ. ID. NO. 6 und der GAFB- Domäne, SEQ. ID. NO. 8 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren um maximal 10%, bevorzugter maximal 9%, bevorzugter maximal 8%, bevorzugter maximal 7%, bevorzugter maximal 6%, bevorzugter maximal 5%, bevorzugter maximal 4%, bevorzugter maximal 3%, bevorzugter maximal 2%, bevorzugter maximal 1 , bevorzugter maximal 0,5% variieren.
Insbesondere der N-terminale Rest der besonders bevorzugten GAF-Domäne SEQ. ID. NO. 10 ist vom N-Terminus bis zur GAFA-Domäne SEQ. ID. NO. 6 frei variierbar und insbesondere verkürzbar. Vorzugsweise ist der N-terminale Rest der besonders bevorzugten GAF-Domäne SEQ. ID. NO. 10 um 100 Aminosäuren, bevorzugter um 90 Aminosäuren, bevorzugter um 80 Aminosäuren, bevorzugter um 70 Aminosäuren, bevorzugter um 60 Aminosäuren, bevorzugter um 50 Aminosäuren, bevorzugter um 40 Aminosäuren, bevorzugter um 30 Aminosäuren, bevorzugter um 20 Aminosäuren, bevorzugter um 10 Aminosäuren, bevorzugter um 5 Aminosäuren N-terminal verkürzbar.
Die Aminosäureteilsequenzen der GAFA-Domäne SEQ. ID. NO. 6 und der GAFB-Domäne, SEQ. ID. NO. 8 lassen sich durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren um maximal 10%, bevorzugter maximal 9%, bevorzugter maximal 8%, bevorzugter maximal 7%, bevorzugter maximal 6%, bevorzugter maximal 5%, bevorzugter maximal 4%, bevorzugter maximal 3%, bevorzugter maximal 2%, bevorzugter maximal 1 , bevorzugter maximal 0,5% variieren ohne dass es zu einem Verlust der jeweiligen, vorstehend beschriebenen Funktionen kommt.
Vorzugsweise weist die funktionell verknüpfte GAFA-Domäne und GAFB-Domäne, d.h. die komplette GAF-Domäne, einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11 ) oder deren funktionell äquivalenten Varianten eine Aminosäuresequenz auf, ausgewählt aus der Gruppe
(a) N-Terminus von humaner PDE11 A4 von der Aminosäure M24 bis zur Aminosäure K591 oder
(b) SEQ. ID. NO. 10
Für den Teil der katalytischen Domäne einer Adenylatcyclase des erfindungsgemäßen Polypeptides werden bevorzugt Adenylatcyclasen verwendet, die in natürlicher Form eine GAF- Domäne aufweisen. Besonders bevorzugte Adenylatcyclasen sind Adenylatcyclasen bakteriellen Ursprungs, insbesondere aus Cyanobakterien, die in natürlicher Form eine GAF-Domäne aufweisen oder deren jeweiligen funktionell äquivalenten Varianten.
Besonders bevorzugte Adenylatcyclasen sind ausgewählt aus der Gruppe
(a) Adenylatcyclase aus Anabaena sp. PCC 7120 oder deren funktionell äquivalenten Variante,
(b) Adenylatcyclase aus Anabaena variabili ATTC 29413 oder deren funktionell äquivalenten Variante,
(c) Adenylatcyclase aus Nostoc punctiforme PCC 73102 oder deren funktionell äquivalenten Variante,
(d) Adenylatcyclase aus Trichodesmium erythraeum IMS101 oder deren funktionell äquivalenten Variante,
(e) Adenylatcyclase aus Bdellovibrio bacteriovorus HD100 oder deren funktionell äquivalenten Variante,
(f) Adenylatcyclase aus Magnetococcus sp. MC-1 oder deren funktionell äquivalenten Variante,
Ganz besonders bevorzugte Adenylatcyclasen sind Adenylatcyclasen aus Anabaena sp. PCC 7120 der Isoform CyaB1 oder CyaB2, insbesondere CyaB1 (Accession: NP_486306, D89623) oder deren funktionell äquivalente Variante. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase oder deren funktionell äquivalenten Varianten eine Aminosäuresequenz auf, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 12 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 91%, bevorzugter mindestens 92%, bevorzugter mindestens 93%, bevorzugter mindestens 94%, bevorzugter mindestens 95%, bevorzugter mindestens 96%, bevorzugter mindestens 97%, bevorzugter mindestens 98%, bevorzugter mindestens 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 12 und die katalytische Eigenschaft einer Adenylatcyclase aufweist.
Dabei kann es sich um eine natürliche funktionell äquivalente Variante der katalytische Domäne einer Adenylatcyclase handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen mit anderen Adenylatcyclasen gefunden werden kann oder um eine künstliche katalytische Domäne einer Adenylatcyclase, die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 12 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren, wie vorstehend beschrieben, abgewandelt wurde.
Unter der Eigenschaft einer katalytische Domäne einer Adenylatcyclase wird die vorstehend beschriebene katalytische Eigenschaft einer Adenylatcyclase, insbesondere die Fähigkeit, ATP in cAMP zu überführen verstanden.
Vorzugsweise weist die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase oder deren funktionell äquivalenten Varianten eine Aminosäuresequenz auf, ausgewählt aus der Gruppe
(a) C-Terminus von CyaB1 von der Aminosäure L386 bis K859, wobei L386 von CyaB1 durch V386 ersetzt ist oder
(b) SEQ. ID. NO. 12
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder SEQ. ID. NO. 4 oder eine von diesen Sequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 75%, bevorzugter mindestens 80%, bevorzugter mindestens 85%, bevorzugter mindestens 90%, bevorzugter mindestens 93%, bevorzugter mindestens 95%, bevorzugter mindestens 97%, bevorzugter mindestens 98%, bevorzugter mindestens 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder 4 und die regulatorischen Eigenschaften der GAF-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) und die katalytischen Eigenschaften einer Adenylatcyclase aufweist, wobei die enthaltenen Aminosäuresequenzen der GAFA-Domäne, SEQ. ID. NO. 6, der GAFB-Domäne, SEQ. ID. NO. 8 und der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase, SEQ. ID. NO. 12 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren um maximal 10% variieren.
Anstelle von SEQ. ID. NO. 4 kann für die ganze Beschreibung analog SEQ. ID. NO. 13 verwendet werden. Bei SEQ. ID. NO. 13 fehlt gegenüber SEQ. ID. NO. 4 die Aminosäure A1020.
Insbesondere der N-terminale Rest der besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Polypeptide SEQ. ID. NO. 1 und SEQ. ID. NO.4 ist vom N-Terminus bis zur GAFA-Domäne SEQ. ID. NO. 6 frei variierbar und insbesondere verkürzbar. Vorzugsweise ist der N-terminale Rest der besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Polypeptide SEQ. ID. NO. 1 oder SEQ. ID. NO.4 um 100 Aminosäuren, bevorzugter um 90 Aminosäuren, bevorzugter um 80 Aminosäuren, bevorzugter um 70 Aminosäuren, bevorzugter um 60 Aminosäuren, bevorzugter um 50 Aminosäuren, bevorzugter um 40 Aminosäuren, bevorzugter um 30 Aminosäuren, bevorzugter um 20 Aminosäuren, bevorzugter um 10 Aminosäuren, bevorzugter um 5 Aminosäuren N-terminal verkürzbar.
Die Aminosäureteilsequenzen der GAFA-Domäne SEQ. ID. NO. 6, der GAFB-Domäne, SEQ. ID. NO. 8 und der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase, SEQ. ID. NO. 12 lassen sich durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren um maximal 10%, bevorzugter maximal 9%, bevorzugter maximal 8%, bevorzugter maximal 7%, bevorzugter maximal 6%, bevorzugter maximal 5%, bevorzugter maximal 4%, bevorzugter maximal 3%, bevorzugter maximal 2%, bevorzugter maximal 1, bevorzugter maximal 0,5% variieren ohne dass es zu einem Verlust der jeweiligen vorstehend beschriebenen Funktion kommt.
Besonders bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Chimäre Polypeptid N-terminal von M24 bis K591 den N-Terminus der humanen PDE11A4 (Accession: BAB62712). Daran schließt C-terminal von V386, dass aus L386 beim Einfügen der Klonierungsschnittstelle mutiert wurde, bis K859 der C-Terminus von CyaB1 (Accession: NP_486306) an.
Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder SEQ. ID. NO. 4.
Ganz besonders bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide sind Polypeptide mit der Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder SEQ. ID. NO. 4.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ferner Polynukleotide, im folgenden auch Nukleinsäuren genannt, kodierend eines der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Polypeptide. Alle in der Beschreibung erwähnten Polynukleotide oder Nukleinsäuren können beispielsweise eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz sein.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Polynukleotide enthalten als Teilsequenzen
(a) SEQ. ID. NO. 5 oder eine Nukleinsäuresequenz die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 5 unter stringenten Bedingungen hybridisiert und
(b) SEQ. ID. NO. 7 oder eine Nukleinsäuresequenz die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 7 unter stringenten Bedingungen hybridisiert und
(c) SEQ. ID. NO. 11 oder eine Nukleinsäuresequenz die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 11 unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
SEQ. ID. NO. 5 stellt eine besonders bevorzugte Teilnukleinsäuresequenz dar, kodierend die besonders bevorzugte GAFA-Domäne SEQ. ID. NO. 6.
SEQ. ID. NO. 7 stellt eine besonders bevorzugte Teilnukleinsäuresequenz dar, kodierend die besonders bevorzugte GAFB-Domäne SEQ. ID. NO. 8.
SEQ. ID. NO. 11 stellt eine besonders bevorzugte Teilnukleinsäuresequenz dar, kodierend die besonders bevorzugte katalytische Domäne einer Adenylatcyclase SEQ. ID. NO. 12.
Weitere natürliche Beispiele für Nukleinsäuren bzw. Teilnukleinsäuren kodierend die vorstehend beschriebenen Domänen lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Teilnukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO: 5, 7 oder 11 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
Die Hybridisierung kann unter moderaten (geringe Stringenz) oder vorzugsweise unter stringenten (hohe Stringenz) Bedingungen erfolgen.
Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit 2X SSC bei 50_C) und solchen mit hoher Stringenz (mit 0.2X SSC bei 50_C, bevorzugt bei 65_C) (2OX SSC: 0,3 M Natriumeitrat, 3 M Natriumchlorid, pH 7.0). Darüber hinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von moderaten Bedingungen bei Raumtemperatur, 22_C, bis zu stringenten Bedingungen bei 65_C angehoben werden.
Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50 % Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42_C ausgeführt.
Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:
(1) Hybridisierungsbedingungen mit zum Beispiel
(1) 4X SSC bei 65_C, oder (ii) 6X SSC bei 45_C, oder
(iü) 6X SSC bei 68_C, 100 mg/ml denaturierter Fischsperma-DNA, oder (iv) 6X SSC, 0.5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 68_C, oder
(v) 6XSSC, 0.5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50 % Formamid bei 42_C, oder (vi) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42_C, oder
(vii) 50 % (vol/vol) Formamid, 0.1 % Rinderserumalbumin, 0.1 % Ficoll, 0.1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.5, 750 mM NaCI, 75 mM Natriumeitrat bei 42_C, oder
(viii) 2X oder 4X SSC bei 50_C (moderate Bedingungen), oder (ix) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42_ (moderate Bedingungen).
(2) Waschschritte für jeweils 10 Minuten mit zum Beispiel
(i) 0.015 M NaCI/0.0015 M Natriumcitrat/0.1 % SDS bei 50_C, oder (ii) 0.1X SSC bei 65_C, oder (iii) 0.1X SSC, 0.5 % SDS bei 68_C, oder (iv) 0.1X SSC, 0.5 % SDS, 50 % Formamid bei 42_C, oder (v) 0.2X SSC, 0.1 % SDS bei 42_C, oder 2X SSC bei 65_C (moderate Bedingungen).
Ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Polynukleotid kodierend ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.2. Ein ganz besonders bevorzugtes, erfindungsgemäßes Polynukleotid kodierend ein erfindungsgemäßes Polypeptid weist die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 auf.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide lassen sich bevorzugt herstellen, in dem ein vorstehend beschriebenes Polynukleotid, kodierend ein erfindungsgemäßes Polypeptid, in einen geeigneten Expressionsvektor Moniert wird, eine Wirtszelle mit diesem Expressionsvektor transformiert wird, diese Wirtszelle unter Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids exprimiert wird und anschließend das erfindungsgemäße Protein isoliert wird.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids durch Kultivierung einer rekombinanten Wirtszelle, Expression und Isolierung des erfindungsgemäßen Polypeptides.
Die Transformationsmethoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in bei Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 beschrieben.
Die Erfindung betrifft femer einen rekombinanten Plasmidvektor, insbesondere einen Expressionsvektor, umfassend ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kodierend eine erfindungsgemäßes Polypeptid.
Die Art des Expressionsvektors ist nicht kritisch. Es kann jeder Expressionsvektor verwendet werden, der in der Lage ist in einer entsprechenden Wirtszelle das gewünschte Polypeptid zu exprimieren. Geeignete Expressionssysteme sind dem Fachmann bekannt.
Bevorzugte Expressionsvektoren sind PQE30 (Quiagen), pQE60 (Quiagen) pMAL (NEB) pIRES. PIVEX2.4a (ROCHE), PIVEX2.4b (ROCHE), PIVEX2.4c (ROCHE), pUMVCI (Aldevron), pUMVC2 (Aldevron),. PUMVC3 (Aldevron),. PUMVC4a (Aldevron),. PUMVC4b (Aldevron), pUMVC7 (Aldevron),. PUMVCβa (Aldevron),.pSP64T, pSP64TS, pT7TS, pCro7 (Takara), pKJE7 (Takara), pKM260, pYes260, pGEM-T Easy.
Die Erfindung betrifft femer eine rekombinante Wirtszelle umfassend einen erfindungsgemäßen Plasmidvektor. Diese transformierte Wirtszelle ist vorzugsweise in der Lage das erfindungsgemäße Polypeptid zu exprimieren.
Die Art der Wirtszelle ist nicht kritisch. Es eigenen sich sowohl prokaryontische Wirtszellen als auch eukaryontische Wirtszellen. Es kann jede Wirtszelle verwendet werden, die in der Lage ist mit einem entsprechenden Expressionsvektor das gewünschte Polypeptid zu exprimieren. Geeignete Expressionssysteme aus Expressionsvektoren und Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Bevorzugte Wirtszellen sind beispielsweise prokaryontische Zellen, wie E.coli, Corynebacterien, Hefen, Streptomyceten oder eukariotische Zellen wie beispielsweise CHO, HEK293 oder Insektenzelllinien, wie beispielsweise SF9, SF21 , Xenopus Oozyten.
Die Kultivierungsbedingungen der transformierten Wirtszellen, wie beispielsweise Kulturmedium- Zusammensetzung und Fermentationsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und richten sich nach der Art der gewählten Wirtszelle.
Die Isolierung und Reinigung des Polypeptids kann nach Standardmethoden erfolgen, beispielsweise wie in „The QuiaExpressionist®, Fifth Edition, June2003, beschrieben.
Vorstehend beschriebene, transformierte Wirtszellen, die das erfindungsgemäße Polypeptid exprimieren eignen sich auch insbesondere zur Durchführung von nachstehend beschriebenen Verfahren zur Identifizierung von PDE11 -Modulatoren in einem zellulären Assay. Dazu kann es weiterhin vorteilhaft sein, die entsprechenden Wirtszellen auf festen Trägern zu immobilisieren und/oder ein entsprechendes Screening-Verfahren im Hochdurchsatz Maßstab durchzuführen (High-Through-Put-Screening).
Alle vorstehend erwähnten Nukleinsäuresequenzen lassen sich, durch den Fachmann bekannte, beispielsweise enzymatische, Methoden aus bekannten Nukleinsäuresequenzen herausschneiden und mit bekannten Nukleinsäuresequenzen neu zusammensetzen und somit herstellen. Weiterhin sind alle vorstehend erwähnten Nukleinsäuren in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung eines Modulators einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) umfassend die Schritte
(a) Kontaktierung eines möglichen Modulators einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid und
(b) Bestimmung, ob der mögliche Modulator die Adenylatcyclase-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids im Vergleich zur Abwesenheit des möglichen Modulators verändert. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (a) zusätzlich zum möglichen Modulator einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) cGMP mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid kontaktiert.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der mögliche PDE11 -Modulator, vorzugsweise in vitro mit dem vorzugsweise, aufgereinigten erfindungsgemäßen Polypeptid und besonders bevorzugt mit cGMP inkubiert und die Veränderung der Adenylatcyclase-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids gegenüber einem Versuchansatz ohne PDE11-Modulator gemessen.
Alternativ dazu kann die Veränderung der Adenylatcyclase-Aktivität nach Zugabe des möglichen PDE11 -Modulators zu einem Versuchsansatz, der das erfindungsgemäße Polypeptid und gegebenenfalls cGMP enthält, gemessen werden. Die Adenylatcyclase-Aktivität der PDE11/CyaB1- Chimäre wird, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, über Umsetzung einer definierten Menge ATP in cAMP bestimmt.
Unter einem Modulator einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11), im folgenden auch PDE11- Modulator wird eine Substanz verstanden, die in der Lage ist, über Bindung an die GAF-Domänen der PDE11 die PDE11 -Aktivität zu modulieren, d.h. zu verändern, hier gemessen über die Veränderung der Adenylatcyclase-Aktivität. Ein PDE 11 -Modulator wirkt somit über das allosterische Zentrum der PDE11 und nicht oder nicht alleine über das katalytische Zentrum der PDE11. Der Modulator kann ein Agonist sein, indem er die enzymatische Aktivität der PDE11 erhöht (PDE11- Agonist) oder ein Antagonist sein, in dem er die enzymatische Aktivität der RDE11 (PDE11- Antagonist) erniedrigt.
Beispielsweise konnte mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie nachstehend erläutert, überraschenderweise gezeigt werden, dass cGMP einen PDE11-Agonisten darstellt.
Bevorzugte PDE11 -Modulatoren sind weiterhin beispielsweise Peptide, Peptidomimetica, Proteine, insbeondere Antikörper, insbesondere gegen GAF-Domänen gerichtete monoklonale Antikörper, Aminosäuren, Aminosäuren Analoga, Nukleotide, Nukleotid-Analoga, Polynukleotide, insbesondere Oligonucleotide und besonders bevorzugt sogenannte „small molecules" oder SMOLs. Bevorzugte SMOLs sind organische oder anorganische Verbindungen, einschließlich heteroorganische Verbindungen oder oranometallische Verbindungen mit einem Molekulargewicht kleiner 1000 g/mol, insbesondere mit einem Molekulargewicht von 200 bis 800 g/mol, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 300 bis 600 g/mol.
Gemäß vorliegender Erfindung bindet ein PDE 11 -Modulator vorzugsweise an die GAF-Domänen im erfindungsgemäßen Polypeptid (PDE11/CyaB1-Chimär) und führt entweder direkt zu einer Veränderung der Adenylatcyclase-Aktivität des erfϊndungsgemäßen Polypeptids (PDE11/CyaB1- Chimär) oder zu einer Veränderung der Adenylatcyclase-Aktivität des PDE11/CyaB1-Chimär durch die Verdrängung von cGMP vom PDE11/CyaB1 -Chimär.
Wird die erfindungsgemäße Methode nur mit cGMP oder cAMP und ohne PDE11 -Modulator als zu testende Substanzen durchgeführt, so ergibt sich die Dosiswirkungskurve nach Fig. 5. Die PDE 11 A4/CyaB1 -Chimäre wird durch 1 mM cGMP etwa 4 fach aktiviert. Das entspricht einem %- Basalwert von 400 und zeigt das cGMP ein PDE11 A4-GAF-Agonist ist. cAMP aktiviert bei 1 mM nicht und hat einen %-Basalwert von etwa 150, d.h. es ist weder ein GAF-Agonist noch ein Antagonist.
Die Modulation, also die Veränderung, also die Erhöhung oder Erniedrigung der Adenylatcyclase- Aktivität durch den PDE11 -Modulator in einem Versuchsansatz ohne cGMP wird als %-Basalwert nach folgender Formel berechnet:
Umsatz mit Substanz
%-Basalwert = 100 x Umsatz ohne Substanz
Ist der %-Basalwert bei Verwendung von 100 μM des möglichen PDE11 -Modulators kleiner 50, so deutet das auf einen PDE 11 -Antagonisten hin, der an die GAF-Domänen im PDE11/CyaB1- Chimäre bindet, während ein %-Basalwert größer 200 auf PDE11-Agonisten hindeutet.
Die Erfindung betrifft daher ein besonders bevorzugtes, erfindungsgemäßes Verfahren nachdem in Anwesenheit des Modulators eine Erniedrigung der Adenylatcyclase-Aktivität im Vergleich zur Abwesenheit des Modulators gemessen wird und der Modulator einen PDE11 -Antagonisten darstellt.
Ferner betrifft die Erfindung ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren nachdem in Anwesenheit des Modulators eine Erhöhung der Adenylatcyclase-Aktivität im Vergleich zur Abwesenheit des Modulators gemessen wird und der Modulator einen PDE11-Agonisten darstellt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Bestimmung der Adenylatcyclase-Aktivität durch Messung des Umsatzes von radioaktiv- oder fluoreszenz-markiertem ATP.
Die Messung der Adenylatcyclase-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids, dem PDE11/CyaB1-Chimär, kann durch die Messung des Umsatzes von radioaktivem [α-32P]-ATP in [Ct-32P]-CAMP erfolgen. Generell ist die Adenylatcyclase-Aktivität leicht über die Messung des entstandenen cAMP über Antikörperbindung möglich. Dafür gibt es verschiedene käufliche Assay-Kits wie die cAMP [3H-] oder [125-l] Biotrak® cAMP SPA-Assays von Amersham® oder den AlphaScreen® bzw. Lance® cAMP Assay von PerkinElmer®: Sie alle basieren auf dem Prinzip, das bei der AC-Reaktion aus ATP unmarkiertes cAMP entsteht. Dieses konkurriert mit exogen zugesetzten 3H-, 1251-, oder Biotin- markiertem cAMP um die Bindung an einem cAMP-spezifischen Antikörper. Beim nicht radioaktiven Lance®-Assay ist Alexa®-Flour and den Antikörper gebunden, das mit dem Tracer ein TR-FRET- Signal bei 665 nm erzeugt. Je mehr unmarkiertes cAMP gebunden ist, desto schwächer ist das durch markiertes cAMP ausgelöste Signal. Mit einer Standardkurve können die Signalstärken den entsprechenden cAMP-Konzentrationen zugeordnet werden.
Analog zu dem High-Efficiency Fluorescence Polarization (HEFP™)-PDE-Assay von Molecular Devices, der auf der IMAP-Technologie basiert, kann statt radioaktiv auch fluoreszenz-markiertes Substrat verwendet werden. Beim HEFP-PDE-Assay wird Fluorescein- markiertes cAMP (FI-cAMP) eingesetzt, das von der PDE zu Fluorescein-markierten 51AMP (Fl- AMP) umgesetzt wird. Das FI-AMP bindet selektiv an spezielle Beads und dadurch wird die Fluoreszenz stark polarisiert. FI-cAMP bindet nicht an die Beads, so das eine Zunahme der Polarisation der Menge an entstandenem FI-AMP proportional ist. Für einen entsprechenden AC- Test kann fluoreszenz-markiertes ATP statt FI-cAMP und Beads, die selektiv an FI-cAMP statt an FI-cAMP binden (z. B. Beads die mit cAMP Antikörper beladen sind), verwendet werden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erlϊndungsgemäßen Verfahrens wird, um zu differenzieren, ob der veränderte %-Basalwert durch einen GAF-modulatorischen Effekt der Substanz oder durch die direkte Modulation des AC-katalytischen Zentrums bedingt ist, zusätzlich ein Counterscreen durchgeführt.
Die Erfindung betrifft daher weiter ein bevorzugtes eriϊndungsgemäßes Verfahren bei dem man zum Ausschluss von direkten Modulatoren der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase ein erfindungsgemäßes Verfahren durchführt unter Verwendung eines Polypeptids das die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase aufweist und keine funktionelle GAF-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) aufweist.
Vorzugsweise wird dazu der %-Basalwert analog dem vorstehend beschriebenen Verfahren, vorzugsweise statt mit der PDE11/CayB1 -Chimäre mit einem Protein ermittelt, das vorzugsweise nur a) das AC-katalytische Zentrum enthält oder b) Mutationen an für die GAF-Funktion essentiellen Aminosäuren enthält, oder c) N-terminal um die GAF-Domänen verkürzt ist. Ein Beispiel für a) ist ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 , mit der Maßgabe, dass N-terminal A2 bis L775 fehlen.
Ein Beispiel für b) ist ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 , mit der Maßgabe, dass es die Mutation D355A enthält.
Ein Beispiel für c) ist ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 , mit der Maßgabe, dass die Teilsequenz von L240 bis K568 fehlt.
Ergeben 100 μM einer Substanz mit dem nach a, b oder c modifizierten Protein einen %-Basalwert kleiner 50 liegt eine Hemmung des AC-katalytischen Zentrums vor und ein reiner GAF- Antagonismus kann ausgeschlossen werden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erlϊndungsgemäßen Verfahrens wird das Verfahren als zellulärer Assay in Anwesenheit einer vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Wirtszelle durchgeführt.
Dazu kann das entstandenen cAMP, als Maß für die Adenylatcyclase-Aktivität, auch in Zellulären Assays bestimmt werden, wie beispielsweise in Johnston, P. Cellular assays in HTS, Methods Mol Biol. 190, 107-16. (2002) und Johnston, P.A. and Johnston, P.A. Cellular platforms for HTS: three case studies.Drag Discov Today. 7, 353-63. (2002) beschrieben.
Dazu wird vorzugsweise cDNA der erfindungsgemäßen Polypeptide, der PDE11/CyaB1 -Chimäre, über geeignete Schnittstellen in einen Transfektionsvektor eingefügt und mit dem entstandenen ,,. Vektorkonstrukt geeignete Zellen, wie beispielsweise CHO oder HEK293-Zellen transfiziert. Es werden die Zellklone selektiert, die die erfindungsgemäßen Polypeptide stabil exprimieren.
Der intrazelluläre cAMP-Spiegel dertransfizierten Zellklone wird durch die Adenylatcyclase-Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide maßgeblich beeinflusst. GAF-Antagonisten verursachen durch eine Hemmung der Adenylatcyclase-Aktivität ein Absinken und GAF-Agonisten einen Anstieg des Intrazellulären cAMP.
Die cAMP-Menge kann entweder nach Lyse der Zellen mit den oben beschriebenen Methoden (BioTrak®, Alphascreen® oder HEFP®) gemessen werden, oder direkt in der Zelle. Dazu wird in der Zellline vorzugsweise ein Reportergen an ein CRE (cAMP response element) gekoppelt (Johnston, P. Cellular assays in HTS, Methods Mol Biol. 190, 107-16. (2002). Ein erhöhter cAMP-Spiegel führt zu erhöhter Bindung von CREB (cAMP response element binding Protein) an den CRE-Regulator und so zu erhöhter Transkription des Reportergens. Als Reportergen kann z.B. green fluorescent protein, ß-Galactosidase oder Luziferase dienen, deren Expressionslevel flourometrisch, photometrisch oder luminometrisch bestimmt werden kann, wie in Greer, L.F. and Szalay, A.A. Imaging of light emission from the expression of luciferase in living cells and organisms: a review. Luminescence 17, 43-72 (2002) oder Hill, S. et al. Reporter-gene Systems for the study of G-protein coupled receptors. Curr. Opin. Pharmacol. 1, 526-532 (2001) beschrieben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das vorstehend beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere als zellulärer Assay im Hoch-Durchsatz Maßstab angewendet.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung ohne sie auf diese Beispiele zu beschränken:
Beispiel 1
Herstellung der rekombinanten DNA kodierend eine PDE11/CyaB1-Chimäre
Die Klonierung erfolgte nach Standard-Methoden. Der Originalklon mit dem Gen für humane PDE11A4 (Genbank Accession No. BAB62712) wurde in einem Vektor zur Verfügung gestellt. Per PCR wurde analog zu der bei Kanadier et al., EMBO J. 2002, beschriebenen Klonierungen der PDE2-GAF-Chimäre vorgegangen. Mit spezifischen Primern wurde ein Gen-Fragment hPDE11A41_ 391 amplifiziert, das für den PDE11 A4-N-Terminus mit der GAFA-Domäne codiert und N-terminal eine BgIII sowie C-terminal eine Xbal-Schnittstelle enthält. Analog wurde ein Gen-Fragment hPDE11 A4392-569. das für die GAFB-Domäne codiert und N-terminal eine Xbal-Schnittstelle sowie C- terminal eine Sall-Schnittstelle enthält amplifiziert. Die beiden Fragmente wurden über Subklonierungsschritte im Klonierungs-Vektor pBluescriptll SK(-) über die Xbal-Schnittstelle zu hPDE11 A41-569 zusammengefügt. An das Gen-Fragment hPDE11A4M69 wurde über die Sall- Schnittstelle C-terminal ein per PCR generiertes Gen-Fragment CyaB1386-859 mit der katalytische Domäne der Adenylatcyclase CyaB1 (Genbank Accession No. D89623) angehängt. Dabei wurde die N-terminale Sall-Schnittstelle von hPDE11 A4^69 auf die C-terminale Xhol-Schnittstelle von CyaBi3β6-859 kloniert und L386 von CyaB1 zu V mutiert. Alle Klonierungsschritte erfolgten in E. coli XHblueMRF.
Das Gen für die PDE11-GAF-Chimäre wurde in den Expressionsvektor pQE30 (von Quiagen) umkloniert.
Beispiel 2
Expression und Reinigung des Polypeptids
Der pQE30 Vektor mit dem Gen für die PDE11 -GAF-Chimäre wurde in E.coli BL21 Zellen retransformiert. Die Expression und Reinigung des Proteins erfolgte analog zu "The QiaExpressionist®", Fifth Edition, June 2003. Dabei wurde die optimale Proteinausbeute bei den Expressionsbedingungen: Induktion mit 25 μM IPTG, 16h Inkubation bei 16°C und anschließende French Press Behandlung der E. coli, erzielt. Beispiel 3
Durchfuhrung des Assays
Die Adenylatcyclase-Aktivität der PDE 11 A4/CyaB1 -Chimäre wird mit und ohne zu untersuchender Substanz gemessen. Dabei wird die Adenylatcyclase-Aktivität über Umsetzung einer definierten Menge ATP in cAMP und dessen chromatographische Abtrennung über 2 Säulenschritte nach Salomon et al. bestimmt. Zur Detektion des Umsatzes wird als radioaktiver Tracer [α-32P]-ATP eingesetzt und die entstandene Menge [α-32P]-cAMP gemessen. 3H-CAMP dient als interner Standard für die Wiederfindungsrate. Die Inkubationszeit sollte zwischen 1 und 120 min liegen, die Inkubationstemperatur zwischen 20 und 45 0C, die Mg2+-Cofaktorkonzentration zwischen 1 und 20 mM (es können auch entsprechende Mengen Mn2+ als Cofaktor verwendet werden) und die ATP- Konzentration zwischen 0,5 μM und 5 mM. Eine Erhöhung des Umsatzes mit Substanz gegenüber dem ohne Substanz deutet auf einen GAF-agonistischen Effekt hin. Ist der Umsatz durch Substanzzugabe gehemmt, deutet das auf einen GAF-antagonistischen Effekt der Substanz hin. Ein GAF-Antagonismus kann auch über die Blockierung der Aktivierung der PDE11 A4/CyaB1- Chimäre durch den nativen GAF-Liganden cAMP gemessen werden. Dazu wird der Umsatz bei steigenden cAMP-Konzentrationen mit und ohne Substanz gemessen. Liegen die Umsätze mit Substanz unter denen ohne Substanz, deutet das auf einen GAF-Antagonismus der Substanz hin.
Ein Reaktionsansatz enthält:
• 50 μl AC-Test-Cocktail (Glycerin 43,5 % (VA/), 0,1 M Tris/HCI pH 7,5, 20 mM MgCI2)
• 40-x μl Enzym-Verdünnung (enthält je nadfAktivität 0,1-0,3 μg PDE10/CyaB1 -Chimäre in 0,1 % (W/V) wässriger BSA-Lösung)
• x μl Substanz
• 10 μl 750 μM ATP-Start-Lösung inkl. 16-30 kBq [Cc-32P]-ATP.
Die Proteinproben und der Cocktail werden in 1,5 ml Reaktionsgefäßen auf Eis gemischt, die Reaktion mit ATP gestartet und 10 min bei 37 0C inkubiert. Mit 150 μl AC-Stopppuffer wird die Reaktion beendet, die Reaktionsgefäße werden auf Eis gestellt und 10 μl 20 mM cAMP inkl. 100 Bq [2,8-3H]-CAMP und 750 μl Wasser zugegeben.
Jeder Testansatz wird doppelt ausgeführt. Als Blank diente ein Testansatz mit Wasser statt Enzym. Mit einem Testansatz ohne Substanz und cGMP wird die Enzym-Basalaktivität bestimmt. Zur Trennung von ATP und cAMP wird jede Probe auf Glassäulen mit 1 ,2 g Dowex-50WX4-400 gegeben und nach Einsickern mit 3- 4 ml Wasser gewaschen. Anschließend wurde mit 5 ml Wasser auf Aluminiumoxid-Säulen (9 x 1 cm Glassäulen mit 1,0 g AL2O3 90 aktiv, neutral) eluiert und diese mit 4 ml 0,1 M TRIS/HCI, pH 7,5 in Scintillationsgefäße mit 4 ml vorgelegten Scintillator Ultima XR Gold eluiert. Nach gründlichem Mischen wurde im Liquid Scintillation Counter ausgezählt. Die eingesetzten Mengen von radioaktiv markierten cAMP und ATP werden als 3H- und 32P-totals direkt in 5 ml Elutionspuffer und 4 ml Scintillator ausgezählt. Der Umsatz wird als Enzymaktivität nach folgender Formel berechnet: pmo ι.l[cAMP] mg [Protein] x min Zeit [min ] Proteinmenge |jj.g]
Die Hemmung oder Aktivierung des Enzyms durch die Substanz wird als %-Basalwert nach folgender Formel berechnet:
%-Basalwert = 100
Ist %-Basalwert bei 100 μM Substanz kleiner 50 deutet das, wenn eine Hemmung des AC- katalytischen Zentrums ausgeschlossen ist, auf einen GAF-Antagonisten hin, während %-Basalwert größer 200 auf GAF-Agonisten hindeuten.
In einem Versuchansatz mit 100 μM cGMP liegt ein GAF-Antagonist vor wenn der %-Basalwert bei Verwendung von 100 μ M der zu untersuchenden Substanz kleiner 90 ist.
Die Säulen wurden nach der Benutzung wie folgt regeneriert: Dowex-Säulen: 5 ml 2N HCl, 2x 5 ml Wasser
Aluminiumoxid-Säulen: 2x 5 ml 0,1 M TRIS/HCI, pH 7,5
Figurenbeschreibung
Fig. 1: Aminosäuresequenz des PDE11/CyaB1-Chimärs
Fig. 2: cDNA-Sequenz des PDE11/CyaB1-Chimärs
Fig.3: Proteinsequenz der PDE11/CYAB1 -Chimäre nach Aufreinigung, kursiv = Reinigungs-tag aus dem Expressionsvektor (PQE30 von Quiagen); fett = N-Terminus mit PDE-11 GAF-Domänen; fett und unterstrichen= GAFA-Domäne und GAFB-Domäne; V386 wurde zum Einfügen der Klonierungsschnittstelle aus L386 mutiert; unterstrichen = C-terminus von CyaB1 mit katalytischer Domäne.
Fig. 4: Schematische Darstellung des Chimären PDE11/CYAB1-Polypeptids
Fig. 5 Aktivierung der PDE11/CyaB1 -Chimäre durch cyclische Nukleotide Wird der Assay mit cGMP oder cAMP als zu testende Substanzen durchgeführt ergibt sich die Dosiswirkungskurve nach Fig. 5. Die PDE 11A4/CyaB1 -Chimäre wird durch 1 mM cGMP etwa 4 fach aktiviert. Das entspricht einem %-Basaiwert von 400 und zeigt das cGMP ein PDE11 A4-GAF- Agonist ist. cAMP aktiviert bei 1 mM nicht und hat einen %-Basalwert von etwa 150, d.h. es ist weder ein GAF-Agonist noch ein Antagonist.

Claims

Patentansprüche
1. Polypeptid umfassend funktionell verknüpft
(a) die GAFA-Domäne und GAFB-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) oder deren funktionell äquivalenten Varianten und
(b) die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase oder deren funktionell äquivalenten Varianten.
2. Polypeptid nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Phosphodiesterase 11 (PDE11 ) ausgewählt ist aus der Gruppe PDE11 A1 , PDE11 A2, PDE11 A3, PDE11 A4 oder deren jeweiligen funktionell äquivalenten Varianten.
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Phosphodiesterase 11 (PDE11) die Isoform PDE11A4 aufweist.
4. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die GAFA- Domäne eine Aminosäuresequenz aufweist, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 6 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 und die Eigenschaft einer GAFA- Domäne aufweist.
5. Polypeptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die GAFA-Domäne eine Aminosäuresequenz aufweist, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 6.
6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die GAF6- Domäne eine Aminosäuresequenz aufweist, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 8 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 8 und die Eigenschaft einer GAFB- Domäne aufweist.
7. Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die GAFB-Domäne eine Aminosäuresequenz aufweist, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 8.
8. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionell verknüpfte GAFA-Domäne und GAFB-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) oder deren funktionell äquivalenten Varianten eine Aminosäuresequenz aufweist, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 10 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 70 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 10 und die regulatorsichen Eigenschaft der GAF-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) aufweist, wobei die enthaltenen Aminosäuresequenzen der GAFA-Domäne, SEQ. ID. NO. 6 und der GAFB-Domäne, SEQ. ID. NO. 8 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren um maximal 10% variieren.
9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionell verknüpfte GAFA-Domäne und GAFB-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) oder deren funktionell äquivalenten Varianten eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe
(a) N-Terminus von humaner PDE11 A4 von der Aminosäure M24 bis zur Aminosäure K591 oder
(b) SEQ. ID. NO. 10
10. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Adenylatcyclase eine GAF-Domänen enthaltende Adenylatcyclase bakteriellen Ursprungs oder deren jeweiligen funktionell äquivalenten Varianten darstellt.
11. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Adenylatcyclase eine Adenylatcyclase darstellt ausgewählt aus der Gruppe
(a) Adenylatcyclase aus Anabaena sp. PCC 7120 oder deren funktionell äquivalenten Variante,
(b) Adenylatcyclase aus Anabaena variabili ATTC 29413 oder deren funktionell äquivalenten Variante,
(c) Adenylatcyclase aus Nostoc punctiforme PCC 73102 oder deren funktionell äquivalenten Variante,
(d) Adenylatcyclase aus Trichodesmium erythraeum IMS101 oder deren funktionell äquivalenten Variante
(e) Adenylatcyclase aus Bdellovibrio bacteriovorus HD100 oder deren funktionell äquivalenten Variante,
(f) Adenylatcyclase aus Magnetococcus sp. MC-1 oder deren funktionell äquivalenten Variante
12. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Adenylatcyclase eine Adenylatcyclase aus Anabaena sp. PCC 7120 der Isoform CyaB1 oder CyaB2 oder deren funktionell äquivalente Variante darstellt.
13. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase oder deren funktionell äquivalenten Varianten eine Aminosäuresequenz aufweist, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 12 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 12 und die katalytische Eigenschaft einer Adenylatcyclase aufweist.
14. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase oder deren funktionell äquivalenten Varianten eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe
(a) C-Terminus von CyaB1 von der Aminosäure L386 bis K859, wobei L386 von CyaB1 durch V386 ersetzt ist oder (b) SEQ. ID. NO. 12
15. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 14, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder SEQ. ID. NO.4 oder eine von diesen Sequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 70 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder 4 und die regulatorischen Eigenschaften der GAF-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) und die katalytischen Eigenschaften einer Adenylatcyclase aufweist, wobei die enthaltenen Aminosäuresequenzen der GAFA-Domäne, SEQ. ID. NO. 6, der GAFB- Domäne, SEQ. ID. NO. 8 und der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase, SEQ. ID. NO. 12 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren um maximal 10% variieren.
16. Polypeptid nach Anspruch 1 , umfassend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder SEQ. ID. NO. 4.
17. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder SEQ. ID. NO. 4.
18. Polynukleotid kodierend eines der Polypeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17.
19. Polynukleotid nach Anspruch 18, enthaltend als Teilsequenzen
(a) SEQ. ID. NO. 5 oder eine Nukleinsäuresequenz die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 5 unter stringenten Bedingungen hybridisiert und
(b) SEQ. ID. NO. 7 oder eine Nukleinsäuresequenz die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 7 unter stringenten Bedingungen hybridisiert und
(c) SEQ. ID. NO. 11 oder eine Nukleinsäuresequenz die mit der Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 11 unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
20. Polynukleotid enthaltend die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2.
21. Polynukleotid der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2.
22. Rekombinanter Plasmidvektor umfassend ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22.
23. Rekombinante Wirtszelle umfassend einen Plasmidvektor gemäß Anspruch 22.
24. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 durch Kultivierung einer rekombinanten Wirtszelle gemäß Anspruch 23, Expression und Isolierung des Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17.
25. Verfahren zur Identifizierung eines Modulators einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) umfassend die Schritte
(a) Kontaktierung eines möglichen Modulators einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) mit einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 und
(b) Bestimmung, ob der mögliche Modulator die Adenylatcyclase-Aktivität des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 im Vergleich zur Abwesenheit des möglichen Modulators verändert.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei in Schritt (a) zusätzlich zum möglichen Modulator einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) cGMP mit einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 kontaktiert wird.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Adenylatcyclase-Aktivität durch Messung des Umsatzes von radioaktiv- oder fluoreszenzmarkiertem ATP erfolgt.
28. Verfahren nach Anspruch 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass in Anwesenheit des Modulators eine Erniedrigung der Adenylatcyclase-Aktivität im Vergleich zur Abwesenheit des Modulators gemessen wird und der Modulator einen PDE11 -Antagonisten darstellt.
29. Verfahren nach Anspruch 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass in Anwesenheit des Modulators eine Erhöhung der Adenylatcyclase-Aktivität im Vergleich zur Abwesenheit des Modulators gemessen wird und der Modulator einen PDE11-Agonisten darstellt.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass man zum Ausschluss von direkten Modulatoren der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27 durchführt unter Verwendung eines Polypeptids das die katalytische Domäne einer Adenylatcyclase aufweist und keine funktionelle GAF-Domäne einer humanen Phosphodiesterase 11 (PDE11) aufweist.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren als zellulärer Assay in Anwesenheit einer Wirtszelle gemäß Anspruch 23 durchgeführt wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren im Hoch- Durchsatz Maßstab angewendet wird.
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