DE60131550T2

DE60131550T2 - Gsk3-polypeptide

Info

Publication number: DE60131550T2
Application number: DE60131550T
Authority: DE
Inventors: Stephen D. Emeryville HARRISON; John A. Emeryville HALL; Maria Emeryville CALDERON-CACIA; Ziyang Emeryville ZHONG; Eric Y. Emeryville FANG; Doris G. Emeryville COIT; Steven H. Emeryville NGUYEN; Angelica Emeryville MEDINA-SELBY
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2001-07-25
Publication date: 2008-10-23
Anticipated expiration: 2021-07-26
Also published as: ATE450604T1; US20030077798A1; US20020082408A1; PT1914305E; JP2004504838A; WO2002010357A3; US20070249004A1; EP1914305A1; DE60131550D1; CN1276974C; EP1319064B1; AU2001280812A1; US7135321B2; WO2002010357A2; ES2295191T3; PT1319064E; US20080182313A1; US20050048511A1; EP1914305B1; US7361484B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung gibt Materialien zur Verwendung in Verfahren an, die sich auf die Identifizierung und Optimierung selektiver Inhibitoren der Glycogensynthasekinase-3 (GSK3) beziehen, und betrifft ferner Verfahren zur Behandlung einer durch GSK3-Aktivität vermittelten Erkrankung. Zu solchen Erkrankungen gehören z. B. die Alzheimer-Krankheit, Diabetes Typ II und Entzündungen.
Beschreibung des einschlägigen Standes der Technik
Glycogensynthasekinase-3 (GSK3) ist eine auf Prolin gerichtete Serin/Threonin-Kinase, die ursprünglich als Aktivität identifiziert wurde, die Glycogensynthase phosphoryliert, wie in Woodgett, Trends Biochem. Sci. 16: 177–181 (1991), beschrieben ist. Die Rolle im Glucosemetabolismus wurde vor kurzem aufgeklärt in Summers et al., J. Biol. Chem. 274: 17934–17940 (1999). GSK3 besteht aus zwei Isoformen, der α- und der β-Form, und ist grundlegend aktiv in ruhenden Zellen und inhibiert die Glycogensynthase durch direkte Phosphorylierung. Nach Insulinaktivierung wird GSK3 inaktiviert, wodurch die Aktivierung der Glycogensynthase ermöglicht wird und möglicherweise andere insulinabhängige Ereignisse stattfinden können. GSK3 wird durch andere Wachstumsfaktoren oder Hormone inaktiviert, die, wie Insulin, durch Rezeptor-Tyrosinkinasen signalgebend wirken. Zu den Beispielen für solche Signalmoleküle gehören IGF-1 und EGF, wie beschrieben ist in Saito et al., Biochem. J. 303: 27–31 (1994), Welsh et al., Biochem. J. 294: 625–629 (1993), und Cross et al., Biochem. J. 303: 21–26 (1994). Es wurde nachgewiesen, dass GSK3 β-Catenin phosphoryliert, wie in Peifer et al., Develop. Biol. 166: 543–56 (1994), beschrieben ist. Zu den weiteren Wirkungen von GSK3 in einem biologischen Kontext gehören die Fähigkeit zur Phosphorylierung des Tau-Proteins in vitro, wie beschrieben ist in Mandelkow und Mandelkow, Trends in Biochem. Sci. 18: 480–83 (1993), Mulot et al., Febs Lett 349: 359–64 (1994), und Lovestone et al., Curr. Biol. 4: 1077–86 (1995), und in Gewebekulturzellen, wie in Latimer et al., Febs Lett 365: 42–6 (1995), beschrieben ist. Die selektive Inhibierung von GSK3 kann zur Behandlung oder Verhinderung von durch GSK3-Aktivität vermittelten Erkrankungen nützlich sein.
Es besteht daher gemäß dem Stand der Technik ein Bedürfnis nach Zusammensetzungen und Molekülen, die GSK3 binden oder mit GSK3 Wechselwirken, wodurch GSK3-Aktivität vermittelt wird. Die Erfindung erfüllt diese Forderung und stellt kristallisierbare GSK3-Polypeptide zur Verfügung, die sich zur Konstruktion und zur Optimierung von GSK3-Inhibitoren eignen.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung gibt GSK3β-Moleküle mit N-terminalen und C-terminalen Trunkierungen an, wobei die Moleküle zur Kristallisation befähigt sind.
Die Erfindung gibt insbesondere eine isolierte Nucleinsäure an, die ein Polynucleotid enthält, das ein aus der Sequenz von SEQ ID NO: 3 bestehendes Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid kristallisiert und mindestens eine biologische Wirksamkeit besitzt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus

(a) Bindung eines GSK3-Inhibitors und
(b) Kinaseaktivität.

Die Erfindung gibt ferner einen Vektor an, der ein Polynucleotid enthält, das ein aus der Sequenz von SEQ ID NO: 3 bestehendes Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid kristallisiert und mindestens eine biologische Wirksamkeit besitzt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus

(a) Bindung eines GSK3-Inhibitors und
(b) Kinaseaktivität.

Die Erfindung gibt ferner ein Polypeptid an, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 besteht.
Bei einigen Ausführungsformen sind die GSK3-Polypeptide der Erfindung befähigt, mit GSK3-Inhibitoren zu Wechselwirken.
Die GSK3-Polypeptide der Erfindung können in einem Verfahren zur Identifizierung eines enzymatisch aktiven GSK3-Polypeptids verwendet werden, das umfasst:

(a) Bereitstellen eines trunkierten GSK3-Polypeptids,
(b) Inkontaktbringen des Polypeptids mit einem Substrat von GSK3 und
(c) Messen der Kinaseaktivität des Polypeptids nach dem Kontakt des Polypeptids mit dem Substrat, wobei das Polypeptid aktiv ist, wenn es mehr als das 0,01-Fache der Aktivität des Volllängenenzyms und vorzugsweise mehr als das 0,1-Fache der Aktivität des Volllängenenzyms zeigt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND DER SEQUENZPROTOKOLLE
Figuren, die sich nicht speziell auf die beanspruchte Erfindung beziehen, dienen lediglich zur Erläuterung.
1 zeigt die Polypeptidsequenz von humaner GSK3β (SEQ ID NO: 1).
2 zeigt die Polypeptidsequenz des trunkierten GSK3β-Polypeptids 557 (SEQ ID NO: 2). Die ersten zehn Aminosäuren stellen ein Glu-Tag dar, dem ein Gly-Linker vor Met in Position 1 folgt.
3 zeigt die Polypeptidsequenz des trunkierten GSK3β-Polypeptids 580 (SEQ ID NO: 3). Die ersten zehn Aminosäuren stellen einen Glu-Tag dar, dem ein Gly-Linker vor Gly in Position 34 folgt.
4 zeigt die Polypeptidsequenz von humaner GSK3α (SEQ ID NO: 4).
5 zeigt die Polypeptidsequenz von humaner GSK3α, die in Position 447 trunkiert ist (SEQ ID NO: 5).
6 zeigt die Polypeptidsequenz von humaner GSK3α, die in Position 97 trunkiert ist (SEQ ID NO: 6).
7 zeigt die Polypeptidsequenz von humaner GSK3α von Position 97 bis Position 447 (SEQ ID NO: 7).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Aspekte der detaillierten Beschreibung, die sich nicht speziell auf die beanspruchte Erfindung beziehen, dienen lediglich der Information.
Die Erfindung gibt Materialien zur Verwendung in Verfahren zur Identifizierung und Optimierung von Inhibitoren von GSK3 an, insbesondere von GSK3β. Die angegebenen Materialien umfassen C-terminal und N-terminal trunkierte GSK3β-Moleküle, die zur Kristallisation befähigt sind und GSK3-Kinaseaktivität beibehalten können, bevorzugt mehr als das 0,01-Fache der Aktivität des Volllängenenzyms und noch bevorzugter mehr als das 0,1-Fache der Aktivität des Volllängenenzyms, was allerdings nicht zwingend ist. Es besteht ein Bedürfnis auf dem vorliegenden Gebiet für solche Inhibitoren im Hinblick auf die Rolle von GSK3 bei einer Vielzahl von Erkrankungen und Krankheitszuständen, wozu die Alzheimer-Krankheit, Diabetes Typ II und Entzündungen gehören. Solche Inhibitoren können identifiziert werden, und identifizierte Inhibitoren können unter Verwendung der kristallisierbaren GSK3-Polypeptide der Erfindung optimiert werden.
In der vorliegenden Beschreibung werden eine Vielzahl GSK3β-Polypeptide offenbart, die sich von dem nativen Polypeptid am C-Terminus und/oder am N-Terminus unterscheiden. Die Aminosäuresequenz von GSK3β ist in 1 dargestellt (SEQ ID NO: 1). Im Offenbarungsumfang eingeschlossen sind beliebige und sämtliche Trunkierungen des GSK3β, bei denen das trunkierte Polypeptid zur Kristallisation befähigt ist und gegebenenfalls, jedoch nicht zwingend, Kinaseaktivität beibehält, wie unter Anwendung der hier beschriebenen Kinase-Assays gemessen wird. Fachleute des vorliegenden Gebiets erkennen, dass die begrenzte Mutation des Proteins oder bestimmte posttranslationelle Modifizierungen ausreichend sein können, um die Kinase zu inaktivieren, die wesentliche dreidimensionale Struktur jedoch aufrechtzuerhalten. Derartige inaktive, jedoch strukturverwandte Moleküle können auch für die Konstruktion und die Optimierung von Inhibitoren von Nutzen sein. Kinase-Assays sind in den Patenten US 6 057 117 und US 6 057 286 offenbart. Die prozentuale Aktivität, die beibehalten wird, ist, falls sie vorliegt, nicht von entscheidender Bedeutung. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität in Gegenwart und in Abwesenheit eines Inhibitors werden hier beschrieben.
In der vorliegenden Beschreibung werden zahlreiche trunkierte GSK3β-Polypeptide offenbart, die diese Kriterien erfüllen. Ein bevorzugtes Polypeptid wird als BV557 bezeichnet, bei dem die C-terminale Aminosäure R³⁸⁴ ist. Dieses Molekül wurde erfolgreich kristallisiert. Zusätzliche aktive Polypeptide umfassen solche mit Trunkierungen bei Aminosäure R³⁴⁴, R³⁵⁴, A³⁷⁴ und I³⁸⁴.
Trunkierte GSK3α-Polypeptide, zu denen ein GSK3α-Polypeptid gehört, das bei S⁹⁷ beginnt und bei S⁴⁴⁷ endet, sind ebenfalls hier offenbart.
Weitere trunkierte GSK3-Polypeptide umfassen Polypeptide, die mit einer N-terminalen Aminosäure beginnen, die sich von der des nativen Proteins dahingehend unterscheidet, dass eine oder mehrere Aminosäuren vom N-Terminus deletiert sind. Bevorzugte N-terminale Trunkierungen umfassen GSK3β-Moleküle, bei denen die Translation des Moleküls bei G³⁴, T³⁹, P⁴⁴, D⁴⁹ oder V⁵⁴ beginnt. Ein Beispiel ist BV580 (Aminosäuren 34 bis 384), das kristallisiert wurde.
Die Offenbarung ist nicht auf diese offenbarten trunkierten Moleküle beschränkt. Unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Assays können Fachleute weitere trunkierte Moleküle konstruieren, wie etwa solche, bei denen 36–76 Aminosäuren vom C-Terminus und/oder 35–54 Aminosäuren vom N-Terminus deletiert sind. Solche Deletionen können individuell auftreten, oder ein Polypeptid kann sowohl eine N-terminale Deletion als auch eine C-terminale Deletion aufweisen. Es ist bevorzugt, jedoch nicht zwingend, wenn die Kinasedomäne relativ intakt bleibt, was sich durch die Erfassung der enzymatischen Aktivität zeigt, beispielsweise durch Anwendung der hier beschriebenen Assays. Es ist ferner auch wünschenswert, aber nicht wesentlich, wenn die enzymatische Aktivität durch einen bekannten GSK3-Inhibitor, wie Lithium, noch inhibiert werden kann. Ein trunkiertes Molekül, das diese Kriterien erfüllt, eignet sich zum Testen von GSK3-Inhibitoren als potentielle therapeutische Mittel sowie zur Optimierung von GSK3-Inhibitoren.
Ein trunkiertes GSK3β-Polypeptid kann aus etwa 250 bis 419 zusammenhängenden Aminosäuren der SEQ ID NO: 1 bestehen, bevorzugt aus etwa 278 bis 419 zusammenhängenden Aminosäuren von SEQ ID NO: 1, noch bevorzugter aus etwa 285 bis 384 zusammenhängenden Aminosäuren von SEQ ID NO: 1 und am meisten bevorzugt aus etwa 351 bis 384 zusammenhängenden Aminosäuren von SEQ ID NO: 1. Zu den bevorzugten trunkierten GSK3β-Polypeptiden gehören die Polypeptide, die beginnen bei Aminosäure 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 oder 62 von SEQ ID NO: 1 und enden an den Aminosäuren 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418 oder 419 von SEQ ID NO: 1. Das Polypeptid kann mit einer beliebigen der aufgelisteten Anfangs-Aminosäuren beginnen und mit einer beliebigen der End-Aminosäuren enden. Exemplarische und nicht einschränkende Beispiele beginnen bei Aminosäure 34, 39, 44 oder 54 und enden bei Aminosäure 420. Weitere, besonders bevorzugte Beispiele beginnen etwa bei Aminosäure 1 und enden bei Aminosäure 340, 344, 354, 374, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419 oder 420.
Ein trunkiertes GSK3α-Polypeptid kann aus etwa 182 bis 482 zusammenhängenden Aminosäuren von SEQ ID NO: 4 bestehen, bevorzugt aus etwa 182 bis 386 zusammenhängenden Aminosäuren von SEQ ID NO: 4, noch bevorzugter aus etwa 182 bis 351 zusammenhängenden Aminosäuren von SEQ ID NO: 4 und am meisten bevorzugt aus den Aminosäuren von etwa S⁹⁷ bis S⁴⁴⁷ von SEQ ID NO: 4.
Die trunkierten GSK3-Polypeptide können nach einem beliebigen im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Ein Verfahren umfasst die Expression eines geeignet hergestellten Polynucleotids, das ein Polypeptid mit der angestrebten Trunkierung codiert. So wurde zum Beispiel ein hier offenbartes Polypeptid, das Polypeptid BV557, hergestellt durch Erzeugung eines Konstrukts, das GSK3β codiert, das bei M¹ beginnt und bei I³⁸⁴ endet, wie in den Beispielen beschrieben ist. Kurz zusammengefasst wurden Insektenzellen einer Transfektion mit Baculovirus-Vektor (als pBlueBac4,5.Glu.GSK3B.DC.I384 # 28 bezeichnet), der BU557 codiert, unterzogen, und das Protein wurde aus den lysierten Zellen extrahiert. Das Protein wurde durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Glu-Tag-Antikörpers, der auf einer Sepharosesäule immobilisiert war, gereinigt. Die Aktivität des gereinigten Proteins wurde unter Verwendung des in dem Patent US 6 057 286 beschriebenen Kinase-Assays in vitro bestimmt.
Die hier vorliegenden Beispiele beschreiben die Herstellung von BV557, BV580 und anderen trunkierten GSK3-Polypeptiden durch Expression von Vektoren, welche die Polypeptide codieren, und die anschließende Isolierung und Reinigung der Polypeptide. Die Polypeptide können auch durch enzymatische Spaltung eines nativen GSK3-Proteins nach auf diesem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Weitere geeignete Verfahren umfassen die Expression eines Polynucleotids, das ein trunkiertes Polypeptid codiert, in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Säugerzellen, Bakterienzellen oder Hefezellen. Die bevorzugte Zelle zur Expression des Polypeptids ist allerdings eine Insektenzelle, bevorzugt eine mit einem Baculovirus infizierbare Insektenzelle, wie etwa eine Sf-9-Zelle.
Die Erfindung kann ferner zur Herstellung nichtphosphorylierter Formen von GSK3 angewandt werden, bei denen die ATP-Bindungsstelle mit der des Wildtypproteins identisch ist. Zu solchen Formen gehören nichtphosphoryliertes GSK3β Y216 und nichtphophoryliertes GSK3α Y279. Andere Formen umfassen Konstrukte mit mindestens einer geänderten Aminosäure, welche die Phosphorylierung verhindert, wie zum Beispiel GSK3β, bei der Y216 in F216 geändert ist, und GSK3α, bei der Y279 in F279 geändert ist. Diese Formen eignen sich für Inhibitor-Bindungsassays zur Identifizierung von Inhibitoren für GSK3. Die Erfindung kann zur Herstellung eines GSK3β-Moleküls angewandt werden, bei dem Position 216 nicht phosphoryliert ist. Es wurde von uns nachgewiesen, dass ein GSK3β-Peptid mit einer Mutation von Y216 zu F216 kristallisiert und eine Struktur zeigt, bei der sich die ATP-Bindungsstelle von der eines nichtmutierten Peptids nicht wesentlich unterscheidet.
Weitere nur einmal vorkommende sowie mehrfache Aminosäureänderungen umfassen S⁹ zu A⁹ in GSK3β und S²¹ zu A²¹ in GSK3α.
Diese Änderungen in der Phosphorylierung oder der Fähigkeit zur Phosphorylierung werden wahlweise in die hier offenbarten trunkierten Formen von GSK3α und GSK3β eingeführt.
Die Erfindung gibt entsprechend GSK3-Moleküle an, die sich zur Konstruktion und zur Optimierung von Inhibitoren von GSK3 als pharmazeutische Mittel eignen.
Die GSK3-Konstrukte der Erfindung sind zur Kristallisation befähigt. In gereinigter Form binden die Konstrukte in einer Weise an Inhibitoren, die mit der Inhibitorbindung am nativen GSK3- Polypeptid vergleichbar ist, da eine Retention der korrekten Faltungskonformation an der Inhibitor-Bindungsstelle vorliegt. Das Potential zur Kristallisation wird durch Anwendung einer Vielzahl von Assays gemessen, zu denen die spezifische Aktivität, die Aggregation und die Mikroheterogenität gehören (siehe zum Beispiel Tabelle 1). Diese Parameter sind Hinweise auf die Reinheit der Präparation und die Löslichkeit des Konstrukts. Die spezifische Aktivität ist ebenfalls bevorzugt für ein Assay zur Erfassung der Bindung eines Inhibitors an der korrekten Bindungsstelle des GSK3-Konstrukts geeignet. Ein weiteres geeignetes Verfahren beruht auf der Fluoreszenzpolarisation. Kurz zusammengefasst bewegt sich ein mutmaßlicher Inhibitor mit einem daran angebrachten Fluorophor frei in Lösung. Wenn der Fluorophor durch polarisiertes Licht angeregt wird, besitzt somit das emittierte Licht, das nach einer begrenzten Verzögerung erzeugt wird, nunmehr eine zufällige Polarisation, und das emittierte Licht ist nicht mehr polarisiert. In Gegenwart eines GSK3-Konstrukts mit einer intakten Inhibitor-Bindungsstelle wird die Rate der freien Bewegung ausreichend verlangsamt, um sicherzustellen, dass, obwohl die Lichtemission in Bezug auf die Anregung verzögert ist, der Fluorophor sich lediglich geringfügig bewegt hat. Somit behält das angeregte Licht die Polarisation bei. Eine Messung der Fluoreszenzpolarisation zeigt daher, ob sich das GSK3-Konstrukt zur Identifizierung und Optimierung eines Inhibitors eignet oder nicht. Der Fluorophor kann an einer Verbindung wie etwa Staurosporin (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA) angebracht werden. Auch wenn GSK3-Konstrukte keine Kinaseaktivität beibehalten, kann ihre Inhibitor-Bindung unter Anwendung von Fluoreszenzpolarisations-Assays noch bestimmt werden.
Der Ausdruck "trunkierte Glycogensynthasekinase-3" oder "trunkierte GSK3", wie er hier verwendet ist, bezieht sich auf GSK3α oder GSK3β. GSK3 ist ein Protein, das ursprünglich aufgrund seiner Phosphorylierung von Glycogensynthase identifiziert wurde, wie in Woodgett et al., Trends Biochem Sci. 16: 177–181 (1991), beschrieben ist. Synonyme für GSK3 sind Tau-Protein-Kinase-I (TPK I), FA-Kinase und Kinase FA. Formen von GSK3 von Säugern wurden kloniert, wie in Woodgett, EMBO J. 9(8): 2431–2439 (1990), beschrieben ist. Inhibitoren von trunkierten GSK3-Polypeptiden können Inhibitoren von beliebigen der bekannten Formen von GSK3 sein, einschließlich GSK3α und/oder GSK3β. Die hier offenbarten trunkierten Polypeptide besitzen eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten des GSK3-Proteins, zu denen zum Beispiel Kinaseaktivitäten wie etwa die Polymerisation des Tau-Proteins oder die Phosphorylierung der Glycogensynthase gehören. Daher können trunkierte GSK3-Polypeptide, die sich zum Design und zur Optimierung von Inhibitoren von GSK3 eignen, eine Sequenzidentität von mindestens 40%, bevorzugt von 50%, vorzugsweise von 60%, bevorzugt von 70% und noch bevorzugter von 80% und am meisten bevorzugt von 90% mit der Aminosäuresequenz des nativen Proteins aufweisen, unabhängig davon, ob es von einer humanen oder einer nichthumanen Quelle stammt. Die Polynucleotide, die ein GSK3-Polypeptid codieren, können eine Sequenzidentität von 60%, bevorzugt von 70%, noch bevorzugter von 80%, noch bevorzugter von 90% und am meisten bevorzugt von 95% mit der nativen Polynucleotidsequenz von GSK3 aufweisen. Daher eignen sich auch derartige Allele und Varianten der nativen Polynucleotidsequenz, bei denen das Polynucleotid eine Aminosäuresequenz mit Substitutionen, Deletionen oder Insertionen im Vergleich mit der nativen Sequenz codiert.
Der Ausdruck "Peptidsubstrat" bezieht sich auf ein Peptid oder ein Polypeptid oder ein synthetisches Peptidderivat, das durch die GSK3-Aktivität in Gegenwart einer geeigneten Menge an ATP oder eines Phosphat-Donors phosphoryliert werden kann. Die Erfassung des phosphorylierten Substrats geschieht allgemein durch Zugabe eines markierten Phosphats, das durch auf dem Gebiet der Markierung bekannte Mittel erfasst werden kann, wie etwa ein radioaktiv markiertes Phosphat. Das Peptidsubstrat kann ein Peptid sein, das als Teil eines längeren Polypeptids in einem Molekül verbleibt, oder kann ein isoliertes Peptid sein, das zur Phosphorylierung durch GSK3 ausgelegt ist.
Wie in den Patenten US 6 057 117 und 6 057 286 offenbart ist, umfassen die Verfahren zur Bestimmung der GSK3-Aktivität in vitro die Konstruktion von Peptidsubstraten. Das Peptidsubstrat kann ein beliebiges, durch GSK3 phosphorylierbares Peptidsubstrat sein; dabei kann es sich um ein Peptidsubstrat mit der Formel Ankerligand-(X)nSXXXS(X)m (SEQ ID NO: 8) (worin X eine beliebige Aminosäure, n eine beliebige ganze Zahl und m eine beliebige ganze Zahl bedeuten und vorzugsweise n + m + 5 < 20, d. h., n + m < 15 ist) handeln, das am C-terminalen Serin vorphosphoryliert ist. Das Assay wird durchgeführt durch Inkontaktbringen des vorphosphorylierten Substrats mit dem trunkierten GSK3-Polypeptid in Gegenwart von radioaktiv markiertem γ-Phosphat-ATP, eines Substratankers und wahlweise eines Inhibitorkandidaten. Das in vitro durchgeführte Verfahren zur Identifizierung eines Inhibitors der GSK3-Kinaseaktivität umfasst das Inkontaktbringen eines Peptidsubstrats, das an einen Ankerliganden gekoppelt ist, mit dem trunkierten GSK3-Polypeptid in Gegenwart eines radioaktiv markierten γ-Phosphat-ATP, eines Substratankers und eines Inhibitorkandidaten, Messen eines Einbaus der radioaktiven Markierung in das Peptidsubstrat und anschließend, in einem separaten Testgefäß, Inkontaktbringen eines an einen Ankerliganden gekoppelten Peptidsubstrats mit der trunkierten GSK3 in Gegenwart eines radioaktiv markierten γ-Phosphat-ATP und eines Substratankers und Messen des Einbaus der radioaktiven Markierung in das Peptidsubstrat; schließlich wird ein Inhibitor der Kinaseaktivität des trunkierten GSK3 durch eine Verringerung des Einbaus der Markierung im Assay mit dem Inhibitorkandidaten im Vergleich zum Assay ohne den Inhibitorkandidaten identifiziert.
Zur Durchführung des hier offenbarten Kinase-Assays unter Anwendung von Mikrovertiefungen in vitro kann ein Szintillationsmittel durch Vorbeschichtung der Vertiefungen mit einem Szintillationsmaterial oder durch spätere Zugabe anschließend an einen Waschschritt vorliegen, wie in Beispiel 4 beschrieben ist. Das Szintillationsmittel kann von Packard, Meridian, Conn., bezogen werden. Die mit dem Szintillationsmittel beschichteten Vertiefungen werden dann zusätzlich mit Streptavidin als Substratanker beschichtet, wobei Biotin der Ankerligand am Peptid ist. Alternativ kann das Streptavidin auf Agarosekügelchen vorliegen, die das Szintillationsmittel enthalten, oder es kann auf einer ansonsten unbehandelten Platte durch Beschichtung aufgebracht werden, zu der dann anschließend das Szintillationsmittel zugegeben wird. In jedem Fall bindet das Streptavidin in den Vertiefungen das Biotin, das damit in Kontakt kommt. Nach einem Assay unter Verwendung von radioaktiv markiertem ATP verursacht die in das phosphorylierte Substrat, das mit dem Biotin konjugiert wurde, eingebrachte radioaktive Markierung eine Lichtemission des Szintillationsmittels. Wenn das Streptavidin an Agarosekügelchen gebunden wird, die das Szintillationsmittel enthalten, verursacht die Bindung eines mit Biotin konjugierten radioaktiv markierten Peptidsubstrats die Szintillation der Kügelchen. In beiden Fällen, bei mit Szintillationsmittel ausgekleideten Vertiefungen wie auch bei das Szintillationsmittel enthaltenden Agarosekügelchen, zeigt eine Verringerung der Szintillation im Vergleich mit einer Kontrollmenge an Szintillationsmittel, die unter nicht-inhibierenden Bedingungen gemessen wurde, das Vorliegen eines funktionellen Inhibitors der GSK3-Aktivität an. Wenn das Peptid durch GSK3 mit ³²P-markiertem oder ³³P-markiertem Phosphat phosphoryliert wurde, führt der radioaktive Zerfall dazu, dass das in einer Mikrovertiefung vorliegende Szintillationsmittel oder in Agarosekügelchen eingemischte Szintillationsmittel, die im Reaktionsgemisch vorliegen, Licht emittiert, wobei die Messung der Menge des emittierten Lichts ein Maß für die Aktivität des GSK3 im Assay ist. Eine in Gegenwart eines Inhibitorkandidaten beobachtete niedrige Aktivität des GSK3 im Vergleich mit der Aktivität von GSK3 bei Abwesenheit des Inhibitors kann anzeigen, dass der Inhibitor funktionell ist und die GSK3-Kinaseaktivität zu inhibieren vermag. In jedem Fall sollte ein Überschuss an Streptavidin gegenüber dem Peptid in jede Vertiefung eingebracht werden oder an den Agarosekügelchen gebunden werden.
Die GSK3-Inhibitoraktivität kann unter Anwendung eines zellfreien Assays gemessen werden, wie es in der Veröffentlichung WO 99/65897 offenbart und im vorliegenden Beispiel 4 beschrieben ist. Die Aktivität kann auch unter Verwendung eines zellenbasierten Assays gemessen werden. Kurz zusammengefasst wird eine Zelllinie, wie zum Beispiel eine COS-Zelllinie, mit Tau und mit einem GSK3-Polypeptid transfektiert. Die Phosphorylierung von Tau an einer bestimmten Stelle wird unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers überwacht, da die Phosphorylierung an dieser Stelle von der GSK3-Aktivität abhängig ist.
Zu den Beispielen für hier offenbarte Polypeptide gehören die nachstehenden trunkierten Polypeptide unter Bezugnahme auf SEQ ID NO: 1:
GSK3β trunkiert bei R³⁴⁴
GSK3β trunkiert bei R³⁵⁴
GSK3β trunkiert bei T³⁶⁴
GSK3β trunkiert bei A³⁷⁴
GSK3β trunkiert bei I³⁸⁴
GSK3β beginnend bei G³⁴
GSK3β beginnend bei T³⁹
GSK3β beginnend bei P⁴⁴
GSK3β beginnend bei D⁴⁹
GSK3β beginnend bei V⁵⁴
Die obigen Trunkierungen können kombiniert werden und ergeben ein GSK3βP-Polypeptid, das bei einer der Positionen G³⁴, T³⁹, P⁴⁴, D⁴⁹ oder V⁵⁴ beginnt und bei einer der Positionen R³⁴⁴, R³⁵⁴, T³⁶⁴, A³⁷⁴ oder I³⁸⁴ endet.
Zu weiteren Beispielen für hier offenbarte Polypeptide gehören die nachstehenden trunkierten Polypeptide unter Bezug auf SEQ ID NO: 4:
GSK3α trunkiert bei S⁴⁴⁷
GSK3α beginnend bei S⁹⁷
GSK3α beginnend bei S⁹⁷ und trunkiert bei S⁴⁴⁷.
Ein trunkiertes GSK3-Polypeptid, wie es hier offenbart ist, kann auf der Basis eines oder mehrerer Parameter ausgewählt werden. Ein Polypeptid kristallisiert vorzugsweise in einer Form, die der des nativen GSK3 ähnlich ist, bei korrekter Faltung und um die Inhibitorbindungsstelle herum. Die Kristallisation kann unter Verwendung eines Crystal Screen Kits (Hampton Research, Laguna Niguel, CA) oder unter Anwendung von Verfahren vorgenommen werden, die von Jancarik, J., et al. in J. Appl. Cryst. 24: 409–411, 1991, beschrieben wurden. Das Potential eines Polypeptids zur Bildung von Kristallen kann auf der Basis der spezifischen Aktivität, der Reinheit, der Homogenität, durch Massenspektrometrie, Aggregation und dynamische Lichtstreuung ermittelt werden. Ein bevorzugtes trunkiertes Polypeptid entspricht folgenden Parametern: Reinheit von mindestens 90%; weniger als 100% Aggregation bei 4°C nach zwei Wochen, sowie weniger als 50% Heterogenität (50% oder mehr an der angestrebten Form). Ein am meisten bevorzugtes trunkiertes Polypeptid besitzt eine Reinheit von mindestens 98%, weist keine Aggregation bei 4°C nach zwei Wochen auf und besitzt eine Heterogenität von weniger als 5% (unphosphorylierte Form). Solche Parameter zeigen an, dass die Polypeptid-Präparation kristallisationsfähig ist, was sie zur Auffindung und Optimierung und GSK3-Inhibitoren geeignet macht.
Eine Voraussetzung für die Kristallisation besteht darin, eine ausreichend konzentrierte Lösung des Proteins zu erzielen. Nicht alle GSK3-Konstrukte bleiben bei der erforderlichen Konzentration löslich. Eine bevorzugte Konzentration beträgt > 1 mg/ml, noch bevorzugter > 5 mg/ml und am meisten bevorzugt > 10 mg/ml.
Die hier als 557 (SEQ ID NO: 2), 580 (SEQ ID NO: 3), 458 und 524 offenbarten Polypeptide erfüllen die oben beschriebenen Kriterien (siehe Beispiel 3). Das Polypeptid 458 besteht aus den Aminosäuren 1–420 von SEQ ID NO: 1 plus dem folgenden Anhang am N-Terminus: EFMPTEAMAAPKRVI (SEQ ID NO: 8). Das Polypeptid 524 besteht aus den Aminosäuren 1–420 von SEQ ID NO: 1 plus der folgenden Anfügung am N-Terminus: EYMPMEGGG (SEQ ID NO: 9). Weitere modifizierte oder trunkierte GSK3-Polypeptide können nach der hier vorliegenden Beschreibung hergestellt und getestet werden.
BEISPIELE
Die nachfolgenden Beispiele sind lediglich beispielhaft und sollen die Erfindung nicht einschränken.
BEISPIEL 1
HERSTELLUNG UND REINIGUNG DES GSK3β-KONSTRUKTS 557
Beispiele, die sich nicht auf die beanspruchte Erfindung beziehen, dienen lediglich der Information.
Lyse und Extraktion. Ein Insektenzellen-Aufschlämmung aus Sf-9-Zellen (etwa 10 g) aus einer Kultur in einer 1-l-Kulturflasche wurde mit 30 ml Lysatpuffer zusammengebracht: 20 mM Tris, pH 8,0/80 mM NaCl/1 mM MgCl₂/1 mM Arsenat/1 mM Wolframat/1 mM PMSF/0,5 mg Leupeptin/0,2 mg Aprotinin. Die Zellen wurden mit einem Dounce-Homogenisator lysiert. Eine verbesserte Extraktion des Proteins wurde durch Zusatz von 5% Glycerin und 0,2% Octylglucosid erzielt. Das Gemisch wurde 30 Minuten auf Eis gerührt. Das gesamte Lysat wurde 25 Minuten bei 4°C und 39000 x g zentrifugiert. Der resultierende Überstand enthielt das extrahierte GSK3-β Nr. 557.
Ionenaustauschchromatographie. Es wurden folgende Materialien und Bedingungen angewandt: Das Harz war Fractogel EMD SO₃ ^– (M); der Säulendurchmesser betrug 1,6 cm, das Säulenvolumen war 10 ml. Die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 90 cm/h unter Verwendung eines Äquilibrierungspuffers von 20 mM Na-Phosphat/5% Glycerin, pH 7,5, betrieben Die Chromatographie wurde bei 4°C durchgeführt.
Der Lysat-Überstand wurde mit S-Fractogel-Äquilibrierungspuffer 1:1 verdünnt und auf die äquilibrierte Säule geladen. Die Säule wurde mit einer Gesamtmenge von 14 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen. Das GSK3-β wurde mit einem linearen Salzgradienten, über 20 Säulenvolumina, gegen Äquilibrierungspuffer plus 1 M NaCl eluiert. Während der Gradienten-Elution wurden 3 ml/Fraktion gesammelt. Der Pool wurde auf der Basis von SDS-PAGE- und Western-Blot-Ergebnissen für die gesammelten Fraktionen hergestellt. Die Fraktionen 13–24 wurden gepoolt.
Die Affinitätschromatographie wurde unter Verwendung folgender Materialien und Anwendung folgender Prozeduren durchgeführt: Das Harz bestand aus Protein-G-Sepharose, auf der monoklonaler Anti-Glu-Tag-Antikörper immobilisiert war; der Äquilibrierungspuffer war PBS/0,3 M NaCl/0,2% Octylglucosid/10% Glycerin. Der Säulendurchmesser betrug 1,6 cm, das Säulenvolumen war 13 ml. Die Fließgeschwindigkeit betrug 30 cm/h während der Beladung und während des Waschens und 15 cm/h während der Elution.
Der S-Fractogel-Pool wurde bei einer Fließgeschwindigkeit 30 cm/h auf die äquilibrierte Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit etwa 6 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer bis zur Absorptionsgrundlinie heruntergewaschen, und GSK3β wurde mit 50 ml Äquilibrierungspuffer, der 2 mg Elutionspeptid (EYMPTD) enthielt, eluiert. Die Fließgeschwindigkeit während der Elution wurde auf 15 cm/h verringert. Während der Elution wurden 2 ml-Fraktionen gesammelt. Auf der Grundlage der SDS-PAGE-Ergebnisse wurden die Elutionsfraktionen 6–17 mit einem Gesamtvolumen von 24 ml gepoolt.
Endausbeute. Der Pool der Affinitätssäule enthielt bei einer Konzentration von 0,17 mg/ml eine Menge von 4,1 mg GSK3β Nr. 557. Dies entspricht einer Endausbeute von 4,1 mg gereinigtem Produkt 557/l Wachstumsmedium. Die Reinheit nach den 2 Säulen-Reinigungen wurde durch visuelle Inaugenscheinnahme der SDS-PAGE-Ergebnisse zu > 95% geschätzt.
BEISPIEL 2
HERSTELLUNG UND REINIGUNG DES GSK3B-KONSTRUKTS 580
Extraktion. Eine Paste von Sf-9-Zellen von einer 10-l-Fermentation wurde mit 100 ml PBS (10 mM NaPi, pH 7,5, 150 mM NaCl) gewaschen und dann mit 300 ml Puffer H resuspendiert (20 mM Tris, pH 7,5, 1 mM Wolframat, 1 mM Arsenat, 5 mM DTT, 10 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin A, 10% Glycerin, 0,35% Octylglucosid, 1 mM Mg2⁺). Die Zellen wurden in einem 100-ml-Dounce-Homogenisator homogenisiert (20 Stöße Pistill B). Die vereinigten Homogenisate wurden in einem Ti45-Rotor bei 40.000 U/min 35 min zentrifugiert, um die Zelltrümmer und die Zellkerne abzutrennen. Der Überstand von der Zentrifugierung wurde sorgfältig abdekantiert und durch ein Filter von 0,45 μm filtriert.
S-Fractogel. 100 ml S-Fractogel (EM Science, Katalog-Nr. 18882) wurde in eine Säule von 3,2 cm × 12,5 cm gepackt und mit > 1 l Puffer A (20 mM Tris, pH 7,5, 10% Glycerin) äquilibriert. Das Filtrat vom vorhergehenden Schritt wurde bei einem Durchsatz von 15 ml/min auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 1 l Puffer A gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in Puffer A über 20 Säulenvolumina eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 20 ml fraktioniert. Fraktionen, die GSK3 enthielten, wurden durch Western-Blot unter Verwendung eines Anti-GSK-Antikörpers (Santa Cruz Biotech, Katalog-Nr. SC-7291) erfasst. Die im Western-Blot positiven Fraktionen wurden gepoolt und mit dem gleichen Volumen Puffer M (20 mM Tris, pH 7,5, 10% Glycerin, 3,1 M NaCl) gemischt und durch ein Filter von 0,45 μm filtriert. Das Filtrat wurde für die Chromatographie mit Phenyl-650 M aufgehoben.
Phenyl-650 M. 37,5 ml Phenyl-650 M (Tosohass, Katalog Nr. 014943) wurden in eine Säule von 2,2 cm × 10 cm gepackt und mit 500 ml Puffer C äquilibriert (20 mM Tris, pH 7,5, 10% Glycerin, 1,6 M NaCl). Das Filtrat vom S-Fractogel-Schritt wurde mit 7,5 ml/min auf die Säule aufgegeben. Nach Vervollständigung der Beladung wurde die Säule mit 6,5 Säulenvolumina Puffer C gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100% Puffer D (20 mM Tris, pH 7,5, 10% Glycerin) über 20 Säulenvolumina eluiert. Die Fraktionen wurden zu jeweils 15 ml gesammelt, und die GSK enthaltenden Fraktionen wurden durch Western Blot unter Verwendung eines Anti-GSK-Antikörpers ermittelt. Die Western-Blot-positiven Fraktionen wurden gepoolt und auf eine Affinitätssäule mit Glu-Tag-Antikörper aufgegeben.
Affinitätschromatographie mit Glu-Tag-Antikörper. Die Verwendung eines Glu-Tags ist in Rubinfeld et al., Cell 65: 1033–1042, 1991, beschrieben, und ein Hybridom, das den Anti-Glu-Tag-Antikörper exprimiert ist, in Grussenmyer et al., PNAS 82: 7952–7954 (1985), beschrieben. 50 mg des Glu-Tag-Antikörpers wurden auf 25 ml Affi-Gel 10 (BioRAD, Katalog Nr. 153-6046) immobilisiert und in eine Säule von 2,2 cm × 6,5 cm gepackt. Die Säule wurde mit 200 ml Puffer E (20 mM Tris, pH 7,5, 10% Glycerin, 0,3 M NaCl, 0,2% Octylglucosid) äquilibriert, und der Fraktionenpool aus dem Phenyl-650 M-Schritt wurde mit 1,0 ml/min aufgebracht. Nach Vervollständigung der Beladung wurde die Säule mit 100 ml Puffer E gewaschen und dann mit 60 ml Glu-Tag-Peptid (100 μg/ml) in Puffer E eluiert und in Fraktionen von jeweils 5 ml fraktioniert. Die GSK enthaltenden Fraktionen wurden mit SDS-PAGE und durch Färbung mit Coomassie-Blau ermittelt. Diese Fraktionen wurden gepoolt und in einem Amicon-Konzentrator mit einer Membran 10 k MWCO YM10 auf etwa 6 mg/ml aufkonzentriert. Das konzentrierte Material war dann für die Kristallisation bereit.
BEISPIEL 3
AKTIVITÄT VON TRUNKIERTEN GSK3β-POLYPEPTIDEN
Es wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt, das 5,9 μM vorphosphoryliertes SGSG-verknüpftes CREB-Peptid (Wang et al., Anal. Biochem. 220: 397–402 (1994)) in Reaktionspuffer (5 mM Tris, pH 7,5, 5 mM DTT; 1 mM MgCl₂, 0,01% BSA) enthielt, in dem die gewünschte Menge an trunkiertem GSK3-Polypeptid enthalten war. ATP (spezifische Aktivität 5,3 Ci/mmol) wurde bis zu einer Endkonzentration von 25 μM zugegeben, und das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Übertragung von 30 μl auf eine P81-Filterscheibe (Whatman) gestoppt. Die Scheibe wurde viermal in 150 ml 75 mM H₃PO₄ jeweils 5 Minuten gewaschen. Das Filter wurde an Luft getrocknet; die Zählung wurde unter 5 ml Szintillationsflüssigkeit vorgenommen. Die Zählung der spezifischen Aktivität erfolgte durch Ermittlung der Zählrate (in cpm) bezogen auf die Masse an GSK3 in der Reaktion (in μg).

Die spezifische Aktivität für das Konstrukt 557 betrug 4,3·10⁷ cpm/μg, für das Konstrukt 458 2,8·10⁷ cpm/μg und für das Konstrukt 524 2,2 × 10⁷ cpm/μg. Tabelle 1

Konstrukt	Reinheit	mittlere spezifische Aktivität	N	Konzentration	Aggregation bei 4°C	Aggregation bei Raumtemperatur	Heterogenität
		cpm/μg		mg/ml			%
458	> 98%	2,8·10⁷	35	11,5	11% bei > 2 Wochen	über Nacht	10–20% unphosphoryliert
557	> 98%	4,3·10⁷	7	12,7	keine bei > 2 Wochen	über Nacht	5% unphosporyliert
524	> 98%	2,2·10⁷	24	10	nicht bestimmt		< 5% unphosphoryliert

N = Anzahl der zur Ermittlung der "mittleren spezifischen Aktivität" verwendeten Tests.

BEISPIEL 4
SCREENING AUF GSK3-INHIBITIONSAKTIVITÄT UNTER VERWENDUNG EINES ZELLFREIEN ASSAYS
Die als GSK3-Inhibitoren zu testenden Verbindungen werden in DMSO gelöst und dann auf ihre Inhibition von humanem GSK3β getestet. Die Expression von GSK3β ist zum Beispiel in Hughes et al., Eur. J. Biochem., 203: 305–11 (1992), beschrieben; diese Druckschrift wird hier in Bezug genommen. Ein Aliquot von 300 ml Substratpuffer (30 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 3 μg/ml GSK3β) und 0,5 mM biotinyliertem vorphosphoryliertem SGSG-verknüpftem CREB-Peptid (Chiron Technologies PTY Ltd., Clayton, Australien) wird in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Polypropylen mit 96 Vertiefungen verteilt. Dann wird DMSO in einer Menge von 3,5 μl/Vertiefung, das variierende Konzentrationen von jeder zu testenden Verbindung oder von Staurosporin enthält (ein bekannter Kinase-Inhibitor, der als positive Kontrolle oder als negative Kontrolle benützt wird) (d. h., DMSO allein), zugegeben, worauf gründlich gemischt wird. Die Reaktionen werden dann durch Zugabe von 1 μM nicht-markiertem ATP und 1–2·10⁷ cmp γ³³P-markiertem ATP in einer Menge von 50 μl/Vertiefung initiiert, und die Reaktion wird etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen gelassen.
Während die Reaktion fortschreitet, werden mit Streptavidin beschichtete Labsystems "Combiplate 8"-Capture-Platten (Labsystems, Helsinki, Finnland) durch Inkubieren mit PBS mit einem Gehalt von 1% Rinderserumalbumin in einer Menge von 300 ml/Vertiefung während mindestens einer Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Die Blocklösung wird dann durch Absaugen entfernt, und die Capture-Platten werden mit Stoppreagens (50 μM ATP/20 mM EDTA) in einer Menge von 100 μl/Vertiefung gefüllt.
Nach Beendigung der dreistündigen Enzymreaktion werden dreifache 100 μl-Aliquote von jedem Reaktionsgemisch in drei Vertiefungen übertragen, die Stopplösung enthalten, eine Vertiefung auf jeder der drei Capture-Platten, und die Inhalte der Vertiefungen werden gut gemischt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur werden die Vertiefungen der Capture-Platten durch Absaugen geleert, wonach fünfmal mit PBS und mit einem 12-kanaligen Corning 430474-ELISA-Plattenwaschgerät gewaschen wird. Abschließend werden 200 μl Microscint-20-Szintillationsflüssigkeit in jede Vertiefung der Platte gegeben. Die Platten werden mit Plattenabdichtern bedeckt und dann 30 Minuten auf einem Schüttler belassen. Jede Capture-Platte wird in einem Packard TopCount-Szintillationszähler (Meridian, Connecticut) gezählt, und die Ergebnisse werden als Funktion der Konzentration der Verbindungen aufgetragen.
Die nach diesem Verfahren identifizierten Verbindungen können dadurch weiter optimiert werden, dass ihre Fähigkeit getestet wird, sich an die trunkierten GSK3-Polypeptide der Erfindung zu binden, wobei das Fluoreszenzpolarisations-Assay beispielsweise für trunkierte Polypeptide verwendet wird, die keine GSK3-Kinaseaktivität zeigen. Alternativ kann ein trunkiertes GSK3-Polypeptid der Erfindung anstelle des nativen GSK3-Proteins verwendet werden.
BEISPIEL 5
SCREENING AUF INHIBIERUNG DER TAU-PROTEIN-PHOSPHORYLIERUNG
A. Transiente Transfektion von COS-Zellen mit einem Expressionsplasmid, das trunkierte GSK3 exprimiert, und Konstruktion eines Plasmids mit Tau-Expression
COS-Zellen werden in T25-Gewebekulturflaschen in einem MEM-Medium mit hohen Glucosegehalt/5% Rinderfötalserum gehalten. Zellen von einer konfluenten T25-Kulturflasche werden geerntet, und 80.000 Zellen/Vertiefung werden in Corning-Gewebekulturplatten mit 6 Vertiefungen zu einem Endvolumen an Medium von 2 ml/Vertiefung eingesät. Die Zellen werden 48 Stunden bei 37°C wachsen gelassen. Die Zellen werden dann zweimal in Opti-MEM-Medium, das kein Rinderfötalserum enthält, gewaschen und schließlich in 1 ml Opti-MEM-Medium belassen.
Ein Polynucleotid, das Tau-Protein codiert, wird unter einem frühen SV40-Promotor in ein Plasmid pSG5 subkloniert, um ein Tau-exprimierendes Plasmid zu erzeugen. Die Klonierung von cDNA, die Tau-Protein codiert, ist allgemein in Goedert et al., EMBO Journal 8(2): 393–399 (1989), beschrieben, wobei diese Druckschrift hier in Bezug genommen wird. Ein GSK3-Expressionsplasmid wird durch Subklonieren des trunkierte GSK3 codierenden Polynucleotids in pCG hergestellt, das ein ApEVRF-Derivat ist, das beschrieben ist in Giese et al., Genes & Development, 9: 995–1008 (1995) und in Matthias et al., Nucleic Acid Research, 17: 6418 (1989), wobei diese beiden Druckschriften hier in Bezug genommen werden. Das Polynucleotid kann eines der trunkierten GSK3-Polypeptide der Erfindung codieren.
Es wurden folgende Lösungen in Eppendorf-Röhrchen von 1,5 ml hergestellt:
Lösung A: für jede Transfektion werden 2 μg DNA (Tau-Expressions-Plasmid) und 0,7 μg DNA (GSK3-Expressionsplasmid) in 100 μl Opti-MEM-Medium (Gibco BRL) verdünnt; Lösung B: für jede Transfektion werden 8 μl Lipofectamin-Reagens in 100 μl Opti-MEM-Medium verdünnt. Die beiden Lösungen werden vereinigt, vorsichtig gemischt und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, damit sich die DNA-Lipsom-Komplexe bilden können. Für jede Transfektion wird 0,8 ml Opti-MEM-Medium zu dem Röhrchen zugegeben, das die Komplexe enthält. Die verdünnte Lösung wird vorsichtig gemischt und auf die gespülten Zellen überschichtet. Die Zellen werden mit der komplexierten DNA/Lipofectamin 6 Stunden bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wird 1 ml Wachstumsmedium (MEM-Medium mit hohem Glucosegehalt) mit 20% Rinderfötalserum (FBS) in jede Vertiefung gegeben, worauf über Nacht bei 37°C inkubiert wird. 18 Stunden nach dem Beginn der Transfektion wird das Medium durch frisches, vollständiges Medium ersetzt, und die Zellen werden weitere 48 Stunden bei 37°C wachsen gelassen.
B. Assay zur Inhibierung der Tau-Phosphorylierung
Zwei Stunden vor dem Ernten werden 2 μl GSK3-Inhibitor, der in DMSO gelöst ist, in jede Vertiefung gegeben, wonach bei 37°C inkubiert wird. Nach 2 Stunden wird das Medium entfernt, und die Zellen werden auf Trockeneis rasch auf den Platten eingefroren und bei –70°C gelagert. Die Zellen werden dann auf Eis in Gegenwart von 200 μl Lysepuffer aufgetaut (1% Triton^® X-100, 20 mM Tris pH 7,5, 137 mM NaCl, 15% Glycerin, 25 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin-A, 1 μM PMSF, 21 μg/ml Aprotinin, 50 mM NaF, 50 mM β-Glycerophosphat, 15 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat). Die Inhalte aller Vertiefungen werden 5 min bei 4°C und 14.000 g zentrifugiert, und die Überstände werden in saubere Röhrchen übertragen. An diesem Punkt können die Lysate bei –20°C gelagert werden.
C. ELISA zur Erfassung von phosphoryliertem Tau-Protein in Zelllysaten
Streifen aus Immulon 4 (Dynatech) werden mit monoklonalem Antikörper gegen phosphoryliertes Tau-Protein (AT8, Polymedco, Inc.) in einer Menge von 5 μg/ml in PBS mit Gehalt an Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ in einer Menge von 100 μl/Vertiefung beschichtet. Nach Inkubation bei 4°C über Nacht werden die Streifen zweimal mit Waschpuffer (PBS mit einem Gehalt von 0,05% Tween^® 20) gewaschen und mit PBS, die 1% BSA, 5% normales Mausserum und 0,05% Tween^® 20 enthält, bei Raumtemperatur 1 Stunde geblockt. Die Streifen werden 5 Mal mit Waschpuffer gewaschen. Lysat (100 μl), das 1:10 in PBS verdünnt ist, die 1% BSA, 0,1% NaN₃ enthält, wird in jede Vertiefung gegeben, wonach 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wird. Nach dem Waschen werden 100 μl biotinylierter monoklonaler Antikörper gegen nichtphosphoryliertes Tau-Protein (HT7, Polymedco, Inc.) in PBS-BSA einer Konzentration von 0,5 μg/ml in jede Vertiefung gegeben. Die Streifen werden 5 Mal gewaschen, wonach HRP-konjugiertes Streptavidin zugegeben, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann ausgiebig mit Waschpuffer gewaschen wird. Zur Farbentwicklung wird TMB-Substrat (Pierce) verwendet, und die Reaktion wird durch Zusatz eines gleichen Volumens 0,8 M Schwefelsäure gestoppt. Die Streifen werden mit einem ELISA-Plattenauswertegerät unter Verwendung eines 450 nm-Filters ausgewertet. Die Konzentration der Verbindung, welche die Tau-Phosphorylierung zu 50% des Maximalniveaus inhibiert (d. h., der Wert IC₅₀), wird durch Anpassung einer sigmoiden Kurve an die aufgetragenen Daten ermittelt.
Fachleute erkennen zahlreiche Äquivalente der speziellen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung oder sind dazu in der Lage, ohne mehr als Routineversuche durchführen zu müssen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nucleinsäure, die ein Polynucleotid enthält, das ein aus der Sequenz von SEQ ID NO: 3 bestehendes Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid kristallisiert und mindestens eine biologische Wirksamkeit besitzt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus (a) Bindung eines GSK3-Inhibitors und (b) Kinaseaktivität.
Vektor, der das Polynucleotid von Anspruch 1 enthält.
Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 besteht.