DE602004013160T2

DE602004013160T2 - Verfahren zur anwendung eines an lkb1/strad/mo25-komplexes

Info

Publication number: DE602004013160T2
Application number: DE602004013160T
Authority: DE
Inventors: David Grahame Newport on Tay HARDIE; Dario Alessi; Jerome Boudeau
Original assignee: University of Dundee
Current assignee: University of Dundee
Priority date: 2003-07-17
Filing date: 2004-07-16
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2024-07-17
Also published as: EP1651673A2; ES2308198T3; US20070036793A1; WO2005010174A2; DK1651673T3; EP1651673B1; DE602004013160D1; WO2005010174A3; ATE392433T1; JP2007530000A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Protein-Kinasen und ihre Regulierung.
LKB1 ist eine Ser/Thr-Protein-Kinase, die mit anderen Protein-Kinasen nicht eng verwandt ist (Übersicht in Yoo et al., 2002). Mutationen von LKB1 sind mit dem Peutz Jeghers Cancer Syndrom (PJS) in Verbindung gebracht worden, einer autosomalen, dominanten, vererbten Erkrankung (Hemminki et al., 1998; Jenne et al., 1998), die bei den Betroffenen durch die Entwicklung von vielfachen gastro-intestinalen hamartomatösen Polypen sowie einem weiten Spektrum von gutartigen und bösartigen Tumoren charakterisiert ist (Hemminki, 1999), sowie mit einem um das 15-fache erhöhten Risiko in vielen Geweben malignen Krebs zu entwickeln [20, 21]. Bis heute wurden bei PJS-Patienten nahezu 100 verschiedene Mutationen des LKB1-Gens identifiziert, wobei von den meisten von ihnen angenommen werden kann, dass sie die Aktivität von LKB1 beeinträchtigen [22]. Die Beseitigung beider Allele des LKB1-Gens bei Mäusen führt zu einer embryonalen Sterblichkeit in der Mitte der Trächtigkeit, die sich aus vielfachen Defekten ergibt (Ylikorkala et al., 2001), was darauf hinweist, dass LKB1 eine wichtige Rolle bei der Entwicklung spielt. Es ist wichtig, dass heterozygote Mäuse lebensfähig sind, aber PJS-artige Erkrankung entwickeln, die durch gastro-intestinale Hamartome charakterisiert ist, obwohl es umstritten ist, ob diese durch eine Haploinsuffizienz oder den Verlust der Mischerbigkeit verursacht sind (Übersicht in [22]). Später in ihrem Leben (beispielsweise mit einem Alter von mehr als 50 Wochen) entwickeln diese Tiere auch maligne Tumoren, wie z. B. ein hepatozelluläres Karzinom, von dem gezeigt wurde, dass es mit einem Verlust der LKB1-Expression einhergeht (Bardeesy et al., 2002; Jishage et al., 2002; Miyoshi et al., 2002; Nakau et al., 2002; Rossi et al., 2002). Eine Überexpression von LKB1 in manchen Krebszellen führt zu einer Wachstumsunterdrückung aufgrund eines Anhaltens des G1-Zell-Zyklus in Abhängigkeit von der katalytischen Aktivität von LKB1 (Tiainen et al., 1999), und es wurde vorgeschlagen, dass dies durch die Aktivierung von p21^WAF1/CIP1 durch einen von p53 abhängigen Mechanismus vermittelt wird (Tiainen et al., 2002). Zusammen genommen deuten diese Erkenntnisse stark darauf hin, dass die Wahrscheinlichkeit besteht, dass LKB1 als Tumor-Suppressor wirkt. Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass die von C. elegans (Watts et al., 2000), Drosophila (Martin and St. Johnston 2003) und Xenopus (Ossipova et al., 2003) stammenden Homologe von LKB1 die Zellpolarität regulieren und dass dann, wenn diese Funktion beim Menschen konserviert ist, der Verlust der Zellpolarität bei PJS-Patienten für die Entwicklung von Hamartomen verantwortlich sein könnte. Obwohl sich LKB1 im Wesentlichen im Kern befindet, wenn es in Zellen überexprimiert wird, wird auch häufig ein niedriger Pegel von cytosolischer Lokalisation beobachtet (Karuman et al., 2001; Smith et al., 1999; Tiainen et al., 1999). Kennzeichnender Weise behalten Mutanten von LKB1, die aus dem Zellkern ausgeschlossen werden, ihre volle wachstumsunterdrückende Aktivität bei, was darauf hinweist, dass die Lokalisierung dieses Enzyms im Zytoplasma für seine Tumor-Unterdrückungsfunktion wichtig ist (Tiainen et al., 2002). Einige mutante Formen von LKB1, die bei PJS-Patienten gefunden wurden, sind nur im Nukleus lokalisiert und können im Zytoplasma nicht nach gewiesen werden (Boudeau et al., 2003b; Tiainen et al., 2002), was weiterhin darauf hinweist, dass eine zytoplasmische Lokalisierung von LKB1 wichtig ist.
Es ist wenig darüber bekannt, wie LKB1 reguliert wird und wie es funktioniert. LKB1 wird in vivo an mehreren Residuen phosphoryliert und eine Mutation gewisser Phosphorylierungsstellen behindert die Fähigkeit von LKB1, das Zellenwachstum zu unterdrücken, doch wurden die Mechanismen, durch welche diese Phosphorylierungsereignisse die Funktion von LKB1 regulieren, noch nicht genau beschrieben (Collins et al., 2000; Sapkota et al., 2002a; Sapkota et al, 2002b; Sapkota et al, 2001). Es bestand auch ein beträchtliches Interesse daran, mit LKB1 wechselwirkende Proteine zu identifizieren, die eventuell seine Funktion regulieren können. Bis jetzt wurde von einer Reihe von Proteinen gezeigt, dass sie sich an LKB1 binden, nämlich das Tumor-Unterdrückungsprotein p54 (Karuman et al., 2001), das mit Brahms verwandte Gen-1-Protein (Brg1), bei dem es sich um einen Bestandteil des Chromatin-Remodellierungs-Komplexes handelt (Marignani et al., 2001), ein Protein, das als mit LKB1 wechselwirkendes Protein 1 (LIP1) (Smith et al., 2001) bezeichnet wurde, und der kinase-spezifische Chaperon-Komplex, der aus Cdc37 und Hsp90 besteht (Boudeau et al., 2003a). Es wurde vorgeschlagen, dass die Bindung von LKB1 an p53 entscheidend für die Vermittlung des von p53 abhängenden Zelltodes ist (Karuman et al., 2001), während vorgeschlagen wurde, dass die Bindung von LKB1 an Brg1 für das von Brg1 abhängige Anhalten des Zellwachstums erforderlich ist (Marignani et al., 2001). Die Wechselwirkung von LKB1 mit LIP1 verankerte LKB1 im Zytoplasma (Smith et al., 2001), während die Bindung von LKB1 an Cdc37 und Hsp90 das LKB1-Protein in Zellen stabilisierte (Boudeau et al., 2003a).
Kürzlich haben wir gezeigt, dass LKB1 mit einer mit STE20 verwandten Pseudokinase in Verbindung steht, die als STRADα (STe20-Related ADaptor Protein-α) in Verbindung steht, das keine katalytische Aktivität besitzt, weil Schlüsselresiduen fehlen, die für die Funktion von nahezu allen Protein-Kinasen erforderlich sind (Bass et al., 2003). Darüber hinaus bindet LKB1 STRADα durch seine katalytische Domäne, und diese Wechselwirkung erhöht in vivo die Aktivität von LKB1 und fördert auch die Lokalisation von LKB1 im Zytoplasma (Bass et al., 2003). LKB1 ist nicht länger in der Lage, das Zellwachstum in Zellen zu unterdrücken, in denen STRADα unter Verwendung einer siRNA-Verfahrensweise verarmt worden ist, was darauf hinweist, dass die Bindung von LKB1 an STRADα eine wesentliche Rolle bei der Vermittlung seiner Tumor-Unterdrückungsfunktion spielt. STRADα wird auch in vitro und in vivo durch LKB1 phosphoryliert, was dazu führt, dass STRADα das erste physiologische Substrat für LKB1 ist, das bisher identifiziert wurde (Bass et al., 2003).
Durch AMP aktivierte Protein-Kinase-Kinase (AMPKK) und durch AMP aktivierte Protein-Kinase (AMPK) sind die vor- und nachgeschalteten Komponenten einer Protein-Kinase-Kaskade, die als Sensor für die zelluläre Energieaufladung wirkt [1,2]. AMPK wird durch eine Erhöhung von zellulärem 5'-AMP aktiviert, die immer einen Abfall im Verhältnis von ATP zu ADP aufgrund der Reaktion begleitet, die durch Adenylat-Kinase katalysiert wird (2ADP ↔ ATP + ADP). Dies tritt während metabolischen Stressbelastungen wie z. B. Sauerstoffmangel, Ischämie, Glukose-Mangel und, in Skelett- und Herzmuskeln während der Kontraktion oder bei körperlicher Belastung auf [1–3]. Dies trifft für die beiden katalyti schen Untereinheits-Isoformen von AMPK (AMPKα1 und AMPKα2) zu. Sobald es durch Stress aktiviert worden ist, schaltet AMPK die Aufnahme von Glukose und Fettsäure und den oxidativen Metabolismus dieser Brennstoffe ein, um ATP zu erzeugen, während biosynthetische Pfade abgeschaltet werden, die ATP verbrauchen. Es erreicht diesen metabolischen Schaltvorgang sowohl durch direkte Phosphorylierung von metabolischen Enzymen als auch durch Langzeiteffekte bezüglich der Gen-Expression [1, 2]. AMPK wird durch auch durch Metformin, eines der am meisten verwendeten Diabetes-Medikamente, durch einen unbekannten Mechanismus aktiviert (obwohl bei Erwachsenen hierfür hohe Dosen von mehr als 2 g pro Tag erforderlich sind), bei dem keine Absenkung von zellulären ATP-Pegeln auftritt. Die Aktivierung von AMPK sowohl durch eine ATP-Verringerung als auch durch Phenformin erfordert eine Phosphorylierung der katalytischen AMPK-(α)-Untereinheit an ihrem T-Schleifen-Residuum (Thr172 in AMPKα1) durch eine vorgeschaltete Kinase. Zwar sind am bestem die Wirkungen von AMPK auf den Metabolismus bekannt, doch deuten jüngste Arbeiten darauf hin, dass es auch das Zellwachstum und die Zellausbreitung reguliert. Erstens hemmt eine Aktivierung der Kinase die Proteinsynthese dadurch, dass eine Phosphorylierung des Elongations-Faktors-2 bewirkt wird [4], sowie durch eine Hemmung der Phosphorylierung von p70S6K durch mTOR-Pfad [5, 6]. Zweitens hat es in verschiedenen Zellen einerseits die Apoptose fördernde Effekte [7–9] als andererseits auch Anti-Apoptose-Effekte [10, 11]. Drittens vermindert es den Pegel des RNA-Bindeproteins HuR im Zytoplasma, wodurch die Stabilität von mRNAs kodierenden, proliferativen Genen vermindert wird, wie z. B. von Cyclinen A und B1 [12]. Viertens hemmt es die Proliferation von HepG2-Zellen durch die Stabilisierung von p53 [13].
In der Druckschrift WO 02/06520 wird die spezifische Hemmung des Signalübertragungs-Pfades Ras/MEK/ERK durch LKB1 beschrieben.
Ein Verfahren zur Untersuchung der LKB1-Aktivität wird in WO 2004/113562 beschrieben.
Die Regulierung von LKB1 und seine bekannten Aktivitäten sind übersichtsmäßig bei Boudeau et al. (FEBS Letters 546: 159–165) zusammengefasst.
Wir haben vor kurzem aus Rattenleber eine vorgeschaltete Kinase teilweise gereinigt, nämlich AMPKK, die AMPK durch Phosphorylierung bei Thr172 in der Aktivierungsschleife der Kinase-Domäne aktiviert [14] Hawley et al. (J. Biol. Chem. (1996), 271: 27879–87)]. Wir waren jedoch nicht in der Lage, genügend Material zu reinigen, um eine Aminosäure-Sequenz zu erhalten und die Aktivität als definiertes Gen-Produkt zu identifizieren. Wir haben dadurch nach Kinasen stromaufwärts des Saccharomyces cerevisiae Homologs von AMPK (dem SNF1-Komplex) gesucht, dass wir die Fähigkeit einer Sammlung von 119 Hefe-Proteinkinase-Glutathion-S-Transferase-Fusionen (GST) untersucht haben, Säugetier- und Hefe-Kinasen zu aktivieren. Diese Vorgehensweise identifizierte die Elm1-Protein-Kinase als mögliche vorgeschaltete Kinase [15]. Durch das Analysieren von Protein-Kinasen, die mit Snf1 Wechselwirken, durch eine Zwei-Hybrid-Analyse identifizierten Schmidt und Kollegen Pak1 als weitere potentielle vorgeschaltete Kinase in Hefe [16]. Weder die elm1Δ- noch die pak1Δ-Stämme, bei denen die einzelnen Kinase-Gene getilgt waren, hatten den gleichen Phänotyp wie ein snf1Δ-Stamm. Elm1 und Pak1 bilden jedoch eine kleine Unterfamilie mit der Tos3-Protein-Kinase und ein mutanter Dreifach-elm1Δ pak1Δ tos3Δ-Stamm hatte einen zu snf1Δ ähnlichen Phänotyp, der durch Expression irgendeiner der drei Kinasen in den Wildtyp-Zustand zurückversetzt wurde [15]. Dies bewies, dass die drei Protein-Kinasen in teilweise redundanter Weise als vorgeschaltete Kinasen für den SNF1-Komplex wirken.
Die nächsten Verwandten von Elm1, Pak1 und Tos3, die durch das menschliche Genom kodiert werden, sind die β-Isoform von von Calmodulin abhängiger Protein-Kinase-Kinase (CaMKKβ). Wir haben früher gezeigt, dass eine CaMKK, die aus Schweinegehirn gereinigt worden war, in zellfreien Untersuchungen AMPK aktivieren konnte, allerdings schlecht im Vergleich mit der Aktivierung von von Calmodulin abhängiger Protein-Kinase I (CAMKI). Die zuvor aus Rattenleber gereinigte AMPKK war jedoch nicht von Calmodulin abhängig [17]. Zu anderen, weniger engen Verwandten der Elm1/Pak1/Tos3-Familie beim Menschen gehört LKB1 (siehe die Ausrichtung in 1), eine Serin/Threonin-Kinase mit 50 kDa, die, wie oben erläutert, ursprünglich als das bei dem vererbten Peutz-Jeghers-Syndrom (PJS) mutierte Gen entdeckt wurde [18, 19]. Einige menschliche Tumor-Zelllinien, die HeLa- und G361-Zellen (Melanomzellen) umfassen, zeigen keine Expression von LKB1-mRNA und -Protein, und eine Expression von Wildtyp-LKB1 in diesen Zellen verursachte einen Wachstumsstopp in der G1-Phase, während eine Expression von katalytisch inaktiver LKB1 oder mehrerer LKB1-Mutationen, die aus PJS-Mutationen isoliert wurden, das Zellwachstum nicht anhalten konnten [23]. Es wurde auch berichtet, dass der durch die Expression von LKB1 in G361-Zellen induzierte Wachstumsstopp durch eine Ko-Expression von Cyclin-D1 oder E umgekehrt wurde und mit der transkriptionalen Induktion des von Cyclin abhängigen Kinase-Inhibitors p21^WAF1/CIP1 in Verbindung stand; auch wurde gezeigt, dass dies von p53 abhängig ist [24]. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass LKB1 als Tumor-Suppressor wirkt und dass die katalytische Aktivität von LKB1 für diese Funktion wesentlich ist. Das oder die nachgeschalteten Substrate, die LKB1 phosphoryliert, um die Unterdrückung des Zellwachstums zu vermitteln, blieben unbekannt.
Wir identifizieren MO25α (Mouse-Protein 25-α) als neue Komponente des LKB1-STRADα-Komplexes und stellen fest, dass MO25α eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung dieses Komplexes im Zell-Zytoplasma spielt und auch die katalytische Aktivität von LKB1 erhöht. Sowohl zu STRADα als auch zu MO25α gibt eine eng verwandte Isoform (STRADβ und MO25β), die im menschlichen Genom kodiert wird und die ebenfalls mit LKB1 zusammenwirken kann. Wir zeigen, dass MO25 als Gerüstkomponente des LKB1-STRAD-Komplexes wirken kann. Obwohl STRADα [30] und STRADβ mit den Ste20-Protein-Kinasen verwandt sind, werden einige der Residuen, die in einer aktiven Protein-Kinase erwartet werden, nicht konserviert, und sie werden daher als „Pseudokinasen" klassifiziert. Z. B. bindet MO25α an den C-Terminus beispielsweise von STRADα und stabilisiert die Assoziation zwischen STRADα und LKB1. Die Assoziation von LKB1 mit STRAD und MO25 erhöht die Kinase-Aktivität bezüglich eines künstlichen Substrats (Myelin-Basisprotein) und erhöht auch seine Lokalisierung im Zytoplasma, die zuvor mit der Tumor-Unterdrückungsfunktion von LKB1 in Verbindung gebracht wurde, da Mutanten, denen ein Kern-Lokalisierungs-Signal fehlte, dennoch in der Lage waren, das Zellwachstum zu unterdrücken [24].
Weiterhin beschreiben wir das Herauslösen von zwei vorgeschalteten Kinasen (AMPKK1 und AMPKK2) aus Rattenleber. Wir zeigen, dass sowohl AMPKK1 als auch AMPKK2 LKB1 im Komplex mit STRADα und MO25α enthalten, und dass beide Aktivitäten mit Anti-LKB1-Antiköpern zu einer Immuno-Präzipitation führen. Darüber hinaus aktivieren sowohl endogene als auch rekombinante LKB1/STRAD/MO25-Komplexe, die aus HEK-293T-Zellen isoliert wurden, AMPK über eine Phosphorylierung von Thr172 an der α-Untereinheit. Wir zeigen, dass die Fähigkeit von LKB1 zur Phosphorylierung und Aktivierung von AMPK durch die Anwesenheit von STRAD- und MO25-Untereinheiten drastisch erhöht wird, was darauf hinweist, dass beide Untereinheiten für eine maximale Aktivität wesentlich sind. Weiterhin aktivierten Medikamente, die AMPK in anderen Zellarten aktivieren (AICA-Riboside und Phenformin) das AMPK in HeLa-Zellen nicht, die kein LKB1 exprimieren. Die stabile Expression von Wildtyp-LKB1, aber nicht eines katalytisch inaktiven Mutanten stellt die Aktivierung von AMPK durch diese Medikamente wieder her. Somit zeigen wir, dass LKB1 im Komplex mit STRAD und MO25 der physiologische Aktivator von AMPK ist. Es ist jetzt möglich, Untersuchungen zur Identifizierung von Verbindungen durchzuführen, welche die physiologische Aktivierung von AMPK verändern.
Ein erster Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung zur Verwendung bei der Veränderung (Modulation), beispielsweise zum Fördern der Aktivierung oder Phosphorylierung von AMPK (durch AMP aktivierte Protein-Kinase) oder eines Mitgliedes der AMPK-Unterfamilie in einer Zelle, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst: (1) Ermitteln, ob eine Testverbindung die Protein-Kinasen-Aktivität von LKB1 verändert, beispielsweise fördert, und (2) Auswählen einer Verbindung, die die Protein-Kinasen-Aktivität von LKB1 verändert, beispielsweise fördert, wobei sich das LKB1 in einer Zubereitung mit STRAD und MO25 befindet, wobei das MO25 rekombinant ist und von einer rekombinanten Nukleinsäure exprimiert wird.
Die Protein-Kinasen-Aktivität von LKB1, die bei dem Durchmusterungsverfahren (screening) verändert bzw. festgestellt wird, kann die Phosphorylierung eines nicht physiologischen Substrates wie z. B. des Myelin-Basisproteins sein (wie dies beispielsweise in den BEISPIELEN erläutert wird).
Alternativ kann die Protein-Kinasen-Aktivität von LKB1, die bei den Durchmusterungsverfahren verändert bzw. festgestellt wird, die Phosphorylierung eines Mitglieds der AMPK- oder AMPK-Unterfamilie oder eines Fragmentes jeweils hiervon sein, wie dies noch weiter erläutert wird. Die Phosphorylierung von AMPK oder eines Mitgliedes der AMPK-Unterfamilie kann dadurch abgeschätzt werden, dass die Aktivierung oder Phosphorylierung von AMPK oder des Mitglieds der AMPK-Unterfamilie gemessen wird, wie dies weiter unten in den Beispielen erläutert wird. Beispielsweise werden in den Beispielen 3 und 4 geeignete Peptid-Substrate für LKB1 erläutert, zu denen das NUAK2-T-Loop-Peptid gehört (das als LKBtid bezeichnet wird). Die Aktivierung von AMPK (beispielsweise) kann unter Verwendung eines Reporter-Gens abgeschätzt werden, dessen Expression durch AMPK moduliert wird. Andere Verfahren und Reagenzien, die bei der Messung der Protein-Kinase-Aktivität von LKB und/oder der Phosphorylierung oder Aktivierung von AMPK oder eines Mitglieds der AMPK-Unterfamilie nützlich sein können (oder eines Fragmentes hiervon) sind in den Beispielen, z. B. in Beispiel 4 beschrieben.
Die Protein-Kinase-Aktivität kann durch eine Veränderung des V_max oder des K_m (oder beider) des LKB1 (oder, gegebenenfalls von AMKP oder eines Unterfamilien-Mitglieds) für ein spezielles Substrat erhöht oder vermindert werden. Beispielsweise kann die Aktivität durch ein erhöhtes V_max oder ein vermindertes K_m erhöht werden. Es sei darauf hingewiesen, dass es nicht erforderlich sein muss, den Wert entweder von V_max oder K_m zu ermitteln, um zu bestimmen, ob das LKB1 (oder AMKP oder das Unterfamilien-Mitglied) aktiviert oder deaktiviert worden ist. Es sei darauf hingewiesen, dass die dephosphorylierte (deaktivierte) AMPK oder eine entsprechendes Unterfamilien-Mitglied eine gewisse enzymatische Aktivität beibehalten kann.
Die Aktivität kann als die Menge eines Substrats gemessen werden, die in einem gegebenen Zeitraum phosphoryliert wird; eine Änderung der Aktivität kann daher als Änderung der Menge des Substrates (beispielsweise bei einer einzigen Konzentration) erfasst werden, die in einem gegebenen Zeitraum phosphoryliert wird. Es ist bevorzugt, dass die Aktivität je nach dem um einen Faktor von wenigstens 2, vorzugsweise 5, 10, 15, 20, 25, 30 oder 50 erhöht oder vermindert wird.
Es sei darauf hingewiesen, dass es erforderlich sein kann, den Einfluss der Verbindung auf die Aktivität des Substrates (beispielsweise AMPK) zu ermitteln, beispielsweise dadurch, dass die Aktivität des Substrates gemessen wird, wenn es der Verbindung ausgesetzt wird (1) nach einer LKB1-Exposition des Substrates, (2) vor einer LKB1-Exposition des Substrates und/oder (3) ohne eine LKB1-Exposition.
Es kann die Expression eines Proteins gemessen werden, das durch eine von einem Promotor transkribierte RNA kodiert wird, der (direkt oder indirekt) durch ein Substrat von LKB1 reguliert wird (oder die Produktion der RNA selbst). Das Protein kann ein Protein sein, das physiologisch durch ein Substrat von LKB1, beispielsweise durch AMPK oder ein Unterfamilien-Mitglied reguliert wird, oder es kann sich um ein „Reporter"-Protein handeln, wie dies dem Fachmann bekannt ist (d. h. es kann ein rekombinantes Konstrukt verwendet werden). Ein Reporter-Protein kann ein Protein sein, dessen Aktivität leicht untersucht werden kann, beispielsweise β-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyl-Transferase oder Luciferase (siehe z. B. Tan et al (1996).
Die AMPK-Aktivierung beispielsweise in der Leber verringert die Expression von Enzymen der Gluconeogenese (Phosphophenolpyruvat-carboxylase und Glukose-6-phosphatase); siehe Lochhead et al „5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside mimics the effects of insulin an the expression of the 2 key gluconeogenic genes." PEPCK und Glucose-6-phosphatase; Diabetes, 2000, Jun: 4986): 896–903; Yamauchi et al „Adiponectin stimulates glucose utilization and fatty-acid Oxidation by activating AMP-activated Protein kinase." Nat. Med. 2002 Nov; 8 (11): 1288–95. Eine weitere Klasse von Genen, die durch AMPK beispielsweise in der Leber abgeschaltet werden, sind diejenigen, welche die Enzyme der Fettsäure-Biosynthese kodieren (Fettsäure-Synthase und AcetylCoacarboxylase); siehe Woods et al "Characterization of the role of AMP-activated Protein kinase in the regulation of glucose-activated gene expression using constitutively active and dominant negative forms of the kinase". Mol. Cell. Biol. 2000 Sep; 20 (18): 6704–11. Die Aktivierung von AMPK vermindert auch den Pegel von vier Transkriptions-Faktoren: von dem das Sterol-Reaktionselement bindenden Protein 1C (Zhou et al „Role of AMP-activated Protein kinase in mechanism of metformin action." J. Clin. Invest. 2001 Oct; 108 (8): 1167–74), des Hepatocyt-nuklear-Faktor-4alpha (Leclerc et al "Hepatocyte nuclear factor-4alpha involved in type 1 maturity-onset diabetes of the young is a novel target of AMP-activated Protein kinase". Diabetes. 2001 Jul; 50 (7): 1515–21); sowie von C/EBPalpha und PPAR-gamma (Habinowski et al "The effects of AICAR an adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells." Biochem Biophys Res Commun. 2001 Sep 7; 286 (5): 852–6). Somit können solche Gene (oder rekombinante Gene, die regulatorische Sequenzen aus diesen Genen umfassen) als Reporter-Gene verwendet werden.
Unter dem Ausdruck „Modulation oder Veränderung der Protein-Kinasen-Aktivität" wird sowohl eine Hemmung als auch eine Erhöhung der Protein-Kinasen-Aktivität verstanden.
Es sei darauf hingewiesen, dass bei den Verfahren gemäß der Erfindung, bei denen eine Phosphorylierung eines Polypeptids auftreten kann, die Anwesenheit eines geeigneten Phosphat-Spenders erforderlich sein kann, wie dies für den obigen Gesichtspunkt der Erfindung beschrieben wird. Geeignete Phosphat-Spender sind dem Fachmann bekannt und umfassen ATP, beispielsweise als das entsprechende Magnesiumsalz (MgATP), wie in den Beispielen beschrieben.
Das LKB1 befindet sich in einer Zubereitung zusammen mit STRAD und MO25. Wie oben erwähnt, wird angenommen, dass LKB1 in einem Komplex mit diesen Polypeptiden in Zellen vorhanden ist, und dass die Anwesenheit dieser Polypeptide die Aktivität von LKB1 erhöht. Das LKB1 (und vorzugsweise auch das STRAD) kann beispielsweise aus Zellen gereinigt werden, in denen das LKB1 (und vorzugsweise auch das STRAD) natürlicherweise exprimiert wird, doch kann es bequemer sein, wenn das LKB1 und/oder das STRAD rekombinant sind. Das MO25 ist rekombinant und wird von einer rekombinanten Nukleinsäure exprimiert.
Der Ausdruck AMPK ist dem Fachmann bekannt, wie oben angegeben. Das AMPK (oder ein anderes Substrat, beispielsweise das Myelin-Basisprotein), das in der Untersuchung verwendet wird, kann rekombinant oder nicht rekombinant sein. Das AMPK kann eine durch Bakterien exprimierte, katalytische AMPKα1-Domäne sein (beispielsweise wie in [44] beschrieben); oder ein heterotrimerer Komplex wie z. B. diejenigen, die in [45] und Beispiel 2 beschrieben sind. Die AMPK kann die Aminosäuresequenz einer natürlicherweise auftretenden AMPK besitzen oder sie kann ein Fusionspolypeptid umfassen (beispielsweise wie in [45] oder in Beispiel 2 beschrieben) oder sie kann ein Fragment oder eine Variante einer natürlicherweise auftretenden AMPK sein, das bzw. die die Fähigkeit beibehält, durch LKB1 phosphoryliert oder aktiviert zu werden, beispielsweise wie in Beispiel 2 beschrieben. Somit ist es bevorzugt, dass die AMPK eine AMPK ist, welche ein Threonin-(oder Serin-)Residuum an der Position beibehält, die zum Threonin 172 der die volle Länge besitzenden, menschlichen, α1-katalytischen Domäne vom Wildtyp äquivalent ist. Es ist bevorzugt, dass die AMPK kein Mutant ist, bei dem Thr172 durch ein anderes Residuum als Serin ersetzt ist, beispielsweise durch Alanin. Ein Fragment, das von AMPK abgeleitet werden kann (oder von einem AMPK- Unterfamilien-Mitglied) und das Thr172-Residuum umfasst und zumindest einen Teil der T-Schleifen-Sequenz, die dieses Residuum umschließt, beispielsweise zumindest 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Residuen C-terminal und N-terminal von diesem Residuum, ist ein geeignetes Substrat für eine Verwendung in der Durchmusterungs-Untersuchung. Ein Beispiel für ein solches Peptid-Substrat ist im Beispiel 3 beschrieben.
Beispiele von Zugangs-GI-Nummern für katalytische Domänen der menschlichen AMPK-alpha1-Untereinheit umfassen:

> gi|5453964|ref|NP_006242.1| LocusLink info Protein kinase, AMP-activated, alpha 1 catalytic subunit; AMPK alpha 1; Protein kinase, AMP-activated, catalytic, alpha-1 [Homo sapiens]
sgi|20178277|sp|Q13131|AAK1_HUMAN 5'-AMP-activated Protein kinase, catalytic alpha-1 chain (AMPK alpha-1 chain)
gi|4115829|dbj|BAA36547.1| LocusLink info AMP-activated Protein kinase alpha-1 [Homo sapiens]

Beispiele für Zugangs-GI-Nummern für katalytische Domänen der menschlichen AMPKalpha2-Untereinheit umfassen:

> gi|11493357|emb|CAC17574.1| dJ758N20.1 (Protein kinase, AMP-activated, alpha 2 catalytic subunit) [Homo sapiens]
> gi|5453966|ref|NP_006243.1| LocusLink info Protein kinase, AMP-activated, alpha 2 catalytic subunit; Protein kinase, AMP-activated [Homo sapiens]

Der Ausdruck LKB1 ist dem Fachmann ebenfalls bekannt. Das in der Untersuchung verwendete LKB1 kann rekombinant oder nicht rekombinant sein. Das LKB1 kann bakteriell exprimiert sein, doch ist es bevorzugt, dass es in einem Säugetier-System exprimiert wird und/oder dass es zusammen mit STRAD und/oder MO25, vorzugsweise zusammen mit beiden exprimiert wird, wie dies z. B. in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wird. Das LKB1 kann die Aminosäuresequenz von natürlicherweise auftretendem LKB1 besitzen, oder es kann ein Fusionspolypeptid sein (beispielsweise wie in den Beispielen beschrieben) oder es kann ein Fragment oder eine Variante von natürlicherweise auftretendem LKB1 sein, das bzw. die die Fähigkeit beibehalten hat, AMPK, beispielsweise an Thr172 von AMPK zu phosphorylieren oder zu aktivieren, wie dies beispielsweise im Beispiel 2 beschrieben ist. Somit ist das LKB1 ein LKB1, welches die aktive Kinase-Domäne beibehält. Ein Fragment von LKB1, das die intakte Kinase-Domäne aber keine anderen Bereiche von LKB1 enthält, kann nützlich sein. Dieser Bereich von LKB1 ist ausreichend, um die Protein-Kinasen-Aktivität beizubehalten und mit STRAD in Wechselwirkung zu treten. Das in der Untersuchung verwendete LKB1 ist kein kinase-dead Mutant, wie in den Beispielen beschrieben. Es ist bevorzugt, dass LKB1 die Fähigkeit beibehält, mit STRAD und/oder MO25 in Wechselwirkung zu treten, wie weiter unten erläutert.
Zugangsnummern für LKB1 umfassen die folgenden:

AAC15742 Peutz-Jeghers syndrome Protein [Homo sapiens] gi|3063585|gb|AAC15742.1| [3063585]
Q15831 Serine/threonine Protein kinase II (Serine/threonine-Protein kinase LKB1) gi|3024670|sp|Q15831|STKB_Human[3024670]
NP_000446 serine/threonine Protein kinase II [Homo sapiens] gi|4507271|ref|NP_000446.1 [4507271]

Es ist besonders bevorzugt, wenn auch nicht wesentlich, dass das LKB1-Polypeptid hinsichtlich der Phosphorylierung der die volle Länge besitzenden, menschlichen AMPKα1 am Residuum Thr172 (vorzugsweise in Anwesenheit von STRAD und MO25) oder eines Peptidsubstrats, das diesen Bereich umschließt, oder bezüglich der Phosphorylierung von Myelin-Basisprotein zumindest 30% der Enzym-Aktivität des die volle Länge besitzenden menschlichen LKB1 aufweist. Es ist mehr bevorzugt, dass das LKB1-Polypeptid wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 70% und noch stärker bevorzugt wenigstens 90% der Enzymaktivität des die volle Länge besitzenden menschlichen LKB1 hinsichtlich der Phosphorylierung der die volle Länge besitzenden, menschlichen AMPKα1 am Residuum Thr172 (vorzugsweise in der Anwesenheit von STRAD und MO25) oder eines Peptidsubstrats besitzt, das diesen Bereich umschließt.
In ähnlicher Weise sind die Ausdrücke STRAD und MO25 dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird ein STRAD-Polypeptid (STRADα) von Baas et al (2003) in EMBO J 22(12), 3062–3072 und in EMBL/GenBank Zugangsnummer AF308302 beschrieben. Menschliches STRADα- und STRADβ-Sequenzen (NCBI-Zugangsnummer AAM19143) sind in 10 dargestellt. MO25-Polypeptide werden in Miyamoto et al (1993); Karos & Fisher (1999) und Nozaki et al (1996) und, beispielsweise in der Zugangsnummer NP_057373 (menschliches MO25α) und Q9H9S4 (menschliches MO25β) beschrieben. Weitere Beispiele von MO25-Polypeptiden sind in 2 dargestellt und weitere Zugangsnummern sind in der Figurenbeschreibung wiedergegeben. MO25 zeigt keine Sequenz-Homologie zu anderen Proteinen in der Datenbank, doch zeigen jüngere Studien, dass es strukturell mit der Armadillo-Repeat-Domäne verwandt ist (Milburn et al, 2003). Das STRAD, das in der Untersuchung verwendet wird, kann rekombinant oder nicht rekombinant sein, doch ist das in der Untersuchung verwendete MO25 rekombinant. STRAD oder MO25 kann bakteriell exprimiert sein, doch ist es bevorzugt, dass sie in einem Säugetier-System und/oder zusammen mit LKB1 exprimiert werden, wie beispielsweise in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. STRAD oder MO25 kann die Aminosäure-Sequenz von natürlicherweise auftretendem STRAD oder MO25 besitzen, oder kann ein Fusionspolypeptid sein (beispielsweise wie in den Beispielen beschrieben) oder es kann ein Fragment oder eine Variante von natürlicherweise auftretendem STRAD oder MO25 sein, das bzw. die die Fähigkeit von STRAD beibehält, sich an MO25 und an LKB1 zu binden, und die Fähigkeit von MO25, sich an STRAD oder einem Komplex aus LKB1 und STRAD zu binden. Zumindest der C-terminale Bereich von MO25 kann erforderlich sein.
Hinsichtlich der Sequenz-Beibehaltung über die gesamte Länge von MO25 wird angenommen, dass es wünschenswert sein kann, ein MO25 mit voller Länge zu verwenden. Es ist bevorzugt, dass das STRAD-Polypeptid die C-terminale Sequenz Trp-Asp/Glu-Phe besitzt (von der angenommen wird, dass sie von MO25 erkannt wird), doch wird dies nicht als wesentlich betrachtet, da MO25 sich auch an STRAD binden kann, dem diese Residuen fehlen, wenn STRAD an LKB1 gebunden ist (siehe Beispiel 1). Es ist auch bevorzugt, dass die Pseudokinasen-Domäne von STRAD vorhanden ist, da diese für eine Bindung von MO25 erforderlich sein kann. Beispielsweise ist bevorzugt, dass STRAD kein Fragment ist, dem die Residuen fehlen, die den 88 C-terminalen Aminosäuren des die volle Länge besitzenden STRADα entsprechen (das eine abgeschnittene Pseudokinasen-Domäne besitzt und nicht mit menschlichen LKB1 oder MO25α in Wechselwirkung tritt). Es kann wünschenswert sein, STRAD mit voller Länge zu verwenden.
Beispielsweise kann die Leistungsfähigkeit des besagten Polypeptids hinsichtlich der Wechselwirkung beispielsweise mit dem STRAD-Polypeptid oder seiner Bindung an dieses durch irgendein Verfahren zum Erkennen bzw. Messen einer Protein/Protein-Wechselwirkung gemessen werden, wie dies weiter unten erläutert wird. Geeignete Verfahren umfassen Hefe-zwei-Hybrid-Wechselwirkungen, Co-Purifikation, ELISA, Co-Immuno-Präzipitation, Vernetzungsstudien, strukturelle Studien, Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragungs-Verfahren (FRET) und Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Verfahren. Somit kann man annehmen, dass besagtes MO25 (beispielsweise menschliches MO25α) in der Lage ist, sich an ein STRAD-Polypeptid zu binden oder mit diesem in Wechselwirkung zu treten (beispielsweise mit menschlichem STRADα), wenn eine Wechselwirkung zwischen dem besagten MO25-Polypeptid und dem besagten STRAD-Polypeptid durch ELISA, Co-Immuno-Präzipitation oder Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Verfahren oder durch eine Hefe-zwei-Hybrid-Wechselwirkung oder ein Co-Purifikations-Verfahren erkannt werden kann, wie dies beispielsweise in Beispiel 1 oder Beispiel 2 beschrieben ist.
Es ist bevorzugt, dass die Wechselwirkung unter Verwendung eines Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Verfahrens erkannt werden kann, wie es beispielsweise in WO 00/56864 beschrieben ist. Ein Polypeptid kann auf der Testoberfläche immobilisiert werden, beispielsweise kann es durch Aminogruppen an einen SensorChip CM5^TM gemäß den Anweisungen des Herstellers gekoppelt werden, oder ein biotinyliertes Polypeptid kann an einen mit Avidin beschichteten SensorChip SA gebunden werden. Dann wird das andere Polypeptid (mit Konzentrationen beispielsweise zwischen 0 und zwischen 10 μM und 1,0 μM, beispielsweise 2 μM) über die Oberfläche injiziert und es wird in jedem Fall die Bindung im eingeschwungenen Zustand ermittelt. Aus diesen Messungen kann ein K_d bestimmt werden. Es ist bevorzugt, dass die Wechselwirkung ein K_d von weniger als 8 μM aufweist, stärker bevorzugt von weniger als 5 μM, 2 μM, 1 μM, 500 nM, 300 nM, 200 nM oder 150 nM, beispielsweise von ungefähr 150 nM. Alternativ kann ein K_d für ein Polypeptid in Konkurrenz mit dem immobilisierten Polypeptid ermittelt werden. Ein Polypeptid (beispielsweise mit einer Konzentration von 0,5 μM) wird mit freiem Polypeptid (beispielsweise bei Konzentrationen zwischen 0 und 3 μM) gemischt und die Mischung wird über die immobilisierten Polypeptide injiziert. In jedem Fall wird die Bindung im Dauerzustand ermittelt, woraus das K_d der Wechselwirkung unter Verwendung des Cheng-Prescott-Verhältnisses ermittelt werden kann. Alternativ kann die Wechselwirkung in Ausdrü cken einer beobachteten Reaktion oder entsprechender beobachteter Reaktionen ausgedrückt werden, gemessen in Ausdrücken der an die Oberfläche gebundenen Proteinmasse.
Unter „Varianten" eines Polypeptides verstehen wir Einfügungen, Ausschneidungen und Substitutionen entweder konservativ oder nicht konservativ. Insbesondere umfassen wir mit diesem Ausdruck Varianten des Polypeptids, bei denen derartige Änderungen die Protein-Kinasen-Aktivität oder die Fähigkeit nicht wesentlich verändern, sich an spezielle Bindungspartner in geeigneter Weise zu binden.
Unter „konservativen Substitutionen" werden Kombinationen wie z. B. Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr verstanden.
Es wird hier der drei Buchstaben oder einen Buchstaben umfassende Aminosäuren-Code der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission mit Ausnahme des oben definierten Symbols Zaa verwendet. Insbesondere stellt Xaa irgendeine Aminosäure dar. Es ist bevorzugt, dass wenigstens die Aminosäuren, die den hier definierten Konsensus-Sequenzen entsprechen, L-Aminosäuren sind.
Es ist besonders bevorzugt, wenn die Polypeptid-Variante eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die zumindest 65% Identität mit der Aminosäure-Sequenz des entsprechenden menschlichen Polypeptids aufweist, mehr bevorzugt wenigstens 70%, 71%, 72%, 73% oder 74%, noch mehr bevorzugt wenigstens 75%, noch mehr bevorzugt wenigstens 80%, noch stärker bevorzugt wenigstens 85%, noch mehr bevorzugt wenigstens 90% und in am meisten bevorzugter Weise 95% oder 97% Identität mit der Aminosäure-Sequenz des betreffenden menschlichen Polypeptids.
Es ist weiter bevorzugt, wenn eine Protein-Kinasen-Variante eine Aminosäuren-Sequenz aufweist, die zumindest 65% Identität mit der Aminosäuren-Sequenz der katalytischen Domäne des menschlichen Polypeptids aufweist, mehr bevorzugt wenigstens 70%, 71%, 72%, 73% oder 74%, noch mehr bevorzugt wenigstens 75%, noch stärker bevorzugt wenigstens 80%, noch mehr bevorzugt wenigstens 83% oder 85%, in stärker bevorzugter Weise wenigstens 90% und besonders bevorzugt wenigstens 95% oder 97% Identität mit der entsprechenden menschlichen Aminosäure-Sequenz.
Es sei darauf hingewiesen, dass die katalytische Domäne eines mit einer Protein-Kinase in Beziehung stehenden Polypeptids durch einen Fachmann ohne weiteres beispielsweise unter Verwendung des unten beschriebenen Sequenz-Vergleiches identifiziert werden kann. Protein-Kinasen zeigen einen konservierten katalytischen Kern, wie übersichtsmäßig bei Johnson et al (1996) Cell, 85, 149–158 und Taylor & Radzio-Andzelm (1994) Structure 2, 345–355 dargestellt. Dieser Kern faltet sich in eine kleine N-terminale Keule, die in starkem Maße eine antiparallele β-Lage umfasst, und eine große C-terminale Keule, bei der es sich hauptsächlich um eine α-Helix handelt.
Die prozentuale Sequenz-Identität zwischen zwei Polypeptiden kann unter Verwendung geeigneter Computerprogramme ermittelt werden, beispielsweise des GAP-Programms der University of Wisconsin Genetic Computing Group, und es sei darauf hingewiesen, dass die prozentuale Identität in Relation zu Polypeptiden berechnet wird, deren Sequenzen optimal ausgerichtet worden sind.
Die Ausrichtung kann alternativ unter Verwendung des Clustal W-Programms (Thompson et al, 1994) durchgeführt werden. Die verwendeten Parameter können die folgenden sein:
Fast pairwise alignment parameters: K-tuple (word) size; 1, window size; 5, gap penalty; 3, number of top diagonals; 5. Scoring method: x percent.
Multiple alignment parameters: gap open penalty; 10, gap extension penalty; 0,05. Scoring matrix: BLOSUM
Es sei darauf hingewiesen, dass die MO25-Sequenzen, die in 2 dargestellt sind, Beispiele von MO25-Varianten sind, wie oben definiert.
Das Residuen-Äquivalent für beispielsweise Thr172 der die volle Länge besitzenden menschlichen AMPKα1 kann durch Ausrichtung der Sequenz des Polypeptids mit den die volle Länge besitzenden menschlichen AMPKα1 in solcher Weise identifiziert werden, dass die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen maximiert wird. Die Ausrichtung kann durch optische Inspektion und/oder durch die Verwendung geeigneter Computer-Programme durchgeführt werden, beispielsweise des GAP-Programms der University of Wisconsin Genetic Computing Group, das auch die Berechnung der prozentualen Identität der Polypeptide ermöglicht. Das Align Program (Pearson (1994) in: Methods in Molecular Biology, Computer Analysis of Sequence Data, Part II (Griffin, AM und Griffin, HG, Herausgeber) S. 365–389, Humana Press, Clifton). Somit sind auf diese Weise die identifizierten Residuen ebenfalls "äquivalente Residuen".
Es sei darauf hingewiesen, dass es leicht ist im Fall der abgeschnittenen (truncated) Formen von AMPKα1 oder bei Formen, bei denen einfache Ersetzungen von Aminosäuren stattgefunden haben, das „äquivalente Residuum" zu identifizieren.
Es ist bevorzugt, dass die Polypeptide, die der Reihen-Durchmusterung verwendet werden, von Säugetieren, bevorzugt von Menschen (oder von einer Art, die beim Ackerbau oder als domestiziertes Haustier zum Einsatz kommt, beispielsweise von einem Hund, einer Katze, einem Pferd oder Rind) stammen, einschließlich natürlicherweise auftretender allelischer Varianten (einschließlich Splice-Varianten). Die bei der Reihendurchmusterung verwendeten Polypeptide können einen GST-Teil umfassen oder können biotinyliert oder auf andere Weise markiert sein, beispielsweise mit einer 6His-, HA-, myc- oder Epitop-Markierung, wie dies dem Fachmann bekannt ist, oder in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wird. Dies kann bei der Reinigung und/oder Erkennung des oder der Polypeptide nützlich sein.
Der Einfluss der Verbindung kann dadurch ermittelt werden, dass die Rate oder das Ausmaß der Phosphorylierung des Substrat-Polypeptids durch das LKB1 in der Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der Verbindung, beispielsweise mit Konzentratio nen von ungefähr 100 μM, 30 μM, 10 μM, 3 μM, 1 μM, 0,1 μM, 0,01 μM und/oder 0,001 μM mit der Rate oder dem Ausmaß der Phosphorylierung in Abwesenheit der Verbindung verglichen wird.
Die Verbindung kann den Effekt der Wechselwirkung von STRAD und/oder MO25 mit LKB1 nachahmen. Eine Verbindung, welche den Effekt von STRAD und/oder MO25 bei LKB1 nachahmt, kann die Rate oder das Ausmaß der Phosphorylierung des Substrats-Polypeptids erhöhen (beispielsweise von AMPK oder eines Subfamilien-Mitglieds oder eines Fragments von irgendeinem hiervon).
Unter „Nachahmen des Effekts der Wechselwirkung von STRAD und/oder MO25 mit LKB1" wird verstanden, dass die Verbindung einen quantitativen oder qualitativen Einfluss auf das LKB1, beispielsweise auf seine Protein-Kinasen-Aktivität oder Stabilität besitzt, welche der gleiche ist, wie ein Einfluss des STRAD oder MO25 auf die Protein-Kinase, beispielsweise ihre Protein-Kinasen-Aktivität oder Stabilität, wie in den Beispielen 1 und 2 erläutert. Beispielsweise wird angenommen, dass STRAD und MO25 die Rate erhöhen, mit der LKB1 beispielsweise AMPK oder Myelin-Basisprotein phosphoryliert; eine die Wirkung von STRAD oder MO25 nachahmende Verbindung kann die Rate erhöhen, mit welcher LKB1 (in Abwesenheit von STRAD und/oder MO25) ein Substrat-Polypeptid, beispielsweise AMPK phosphoryliert.
Die AMPK-Unterfamilie wird im Beispiel 2 erläutert (siehe auch [41]) und umfasst die folgenden Polypeptide:
MELK (Heyer et al., 1999 "Expression of Melk, a new Protein kinase, during early mouse development." Dev Dyn, 215, 344–351; Heyer et al., 1997 "New member of the Snf1/AMPK kinase family, Melk, is expressed in the mouse egg and preimplantation embryo." Mol Reprod Dev, 47, 148–156).
QIK (Xia et al., 200 "The new serine-threonine kinase, Qik, is a target of the Quin oncogene." Biochem Biophys ResCommun, 276, 564–570).
SIK (Coyle et al., 2003 "Sam68 enhances the cytoplasmic utilization of intron-containing RNA and is functionally regulated by the nuclear kinase Sik/BRK." Mol Cell Biol, 23, 92–103; Derry et al., 2003 "Altered localization and activity of the intracellular tyrosine kinase BRK/Sik in prostate tumor cells." Oncogene, 22, 4212–4220; Derry et al., 2000 "Sik (BRK) phosphorylates Sam68 in the nucleus and negatively regulates its RNA binding ability." Mol Cell Biol, 20, 6114–6126; Feldman et al., 2000 "The salt-inducible kinase, SIK, is induced by depolarization in brain." J Neurochem, 74, 2227–2238; Horike et al., 2002 "Roles of several domains identified in the primary structure of salt-inducible kinase (SIK)." Endocr Res, 28, 291–294.; Lin et al., 2000 "SIK (Salt-inducible kinase): regulation of ACTH-mediated steroidogenic gene expression andnuclear/cytosol redistribution." Endocr Res, 26, 995–1002.; Llor et al., 1999 "BRK/Sik expression in the gastrointestinal tract and in colon tumors." Clin Cancer Res, 5, 1767–1777.; Vasioukhin and Tyner, 1997 "A role for the epithelial cell-specific tyrosine kinase Sik during keratinocyte differentiation." Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 14477–14482.; Wang et al., 1999 "Cloning of a novel kinase (SIK) of the SNF1/AMPK family from high salt diet-treated rat adrenal." FEBS Lett, 453, 135–139)
Andere Familien-Mitglieder umfassen NuaK1, NuaK2, BrsK1, BrsK2 und QSK, über die wenig bekannt ist. Wir nehmen an, dass LKB1 diese anderen Protein-Kinasen in der AMPK-Unterfamilie phosphorylieren und aktivieren kann. Andere Familien-Mitglieder (die auf einem Zweig des Kinase-Baums liegen, der den oben angegebenen Familien-Mitgliedern unmittelbar benachbart ist) umfassen MARK1, MARK2, MARK3 und MARK4. Siehe beispielsweise Manning et al (2002). "The Protein kinase complement of the human genome" Science 298, 1912–1934. MARK3 ist auch als PARIA oder C-TAK1 bekannt (Peng et al (1998) Cell Growth Differ 9, 197–208; Spicer et al (2003) Oncogene 22, 4752–4756).
Metformin oder seine Analogen können durch die Aktivierung sowohl einer dieser Kinasen als auch von AMPK wirken. Solche Unterfamilien-Mitglieder oder Fragmente hiervon oder Fusionsprodukte eines solchen Fragments (beispielsweise ein T-Schleifen-Peptid, wie oben und im Beispiel 3 erläutert) können ein geeignetes Substrat für eine Verwendung in dem Durchmusterungs-Verfahren gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung sein.
Eine gemäß einem Verfahren der Erfindung identifizierte Verbindung kann in unterschiedlichem Ausmaß die Fähigkeit der Protein-Kinase verändern, unterschiedliche Substrate zu phosphorylieren, beispielsweise verschiedene natürlicherweise auftretende Mitglieder der AMPK-Unterfamilie. Somit ist es bevorzugt, wenn auch nicht entscheidend, dass dann, wenn eine Reihen-Durchmusterung für eine Verbindung zur Verwendung bei der Veränderung der AMPK-Aktivität durchgeführt wird, AMPK oder ein Fragment hiervon als Substrat verwendet wird. In ähnlicher Weise ist es bevorzugt, aber nicht entscheidend, dass dann, wenn eine Reihen-Durchmusterung für eine Verbindung zur Verwendung bei der Veränderung der Aktivität eines speziellen Mitglieds der AMPK-Unterfamilie durchgeführt wird, dieses Unterfamilien-Mitglied oder ein Fragment hiervon als Substrat verwendet wird.
Das Verfahren ist nützlich bei der Identifizierung von Verbindungen, die z. B. die Aktivierung von AMPK oder eines Unterfamilien-Mitglieds fördern. Eine Verbindung, welche die Aktivierung von AMPK oder eines AMPK-Unterfamilien-Mitgliedes von auslöst, kann bei der Behandlung von Diabetes und Fettleibigkeit nützlich sein. Eine solche Verbindung kann die Aktivität von Metformin oder seiner Analogen nachahmen oder eine höhere Wirksamkeit besitzen.
LKB1 ist auch eine Tumor-Unterdrückungs-Protein-Kinase, welche das Zellwachstum und die Zellausbreitung hemmt. Die hier dargestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Tumor-Unterdrückungsfunktionen von LKB1 dadurch vermittelt werden können, dass LKB1 AMPK und/oder eines oder mehrere der oben angegebenen Unterfamilien-Mitglieder phosphoryliert und deren Aktivierung auslöst. Somit können diese Polypeptide neue Tumor-Unterdrückungs-Protein-Kinasen sein, und eine Verbindung, die eine oder mehrere dieser Protein-Kinasen aktiviert, kann bei Behandlung von Krebs nützlich sein.
Eine Verbindung, welche die Phosphorylierung oder Aktivierung von AMPK oder eines AMPK-Familien-Mitgliedes fördert, kann dadurch wirken, dass sie den LKB1-STRAD-MO25-Komplex stabilisiert. Es kann nützlich sein, eine Reihen-Durchmusterung hinsichtlich eines solchen Stabilisierungseffektes durchzuführen (entweder vor oder nach oder anstelle einer Auswahl auf der Basis einer Protein-Kinase-Aktivitäts-Untersuchung wie oben beschrieben). Beispielsweise könnte eine solche Reihen-Durchmusterung die Auswertung bzw. Abschätzung der Wirkungen einer Verbindung auf die Komplex-Bildung oder Stabilität umfassen, beispielsweise unter Verwendung der Verfahren zur Erfassung oder Einschätzung der molekularen Wechselwirkungen, wie oben erläutert. Beispielsweise können Co-Immuno-Präzipitations- oder Co-Reinigungs-Verfahren verwendet werden, oder es kann ein Reporter-Gen/Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet werden. Ein Komplex kann auch unter Verwendung von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragungs-Verfahren (FRET) erkannt werden (beispielsweise unter Verwendung von Fusions-Proteinen, die fluoreszierende Proteine umfassen, beispielsweise grün, blau oder gelb fluoreszierende Proteine (GFPs, BFPs, YFPs, wie sie dem Fachmann bekannt sind)), beispielsweise im Material von Zellen, in denen das LKB1 und das STRAD und/oder MO25 gemeinsam exprimiert werden, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
Die Verbindung kann eine Verbindung sein, die sich an einen Berührungsbereich zwischen zwei oder mehr der Teilnehmer LKB1, STRAD und MO25 oder in dessen Nähe bindet, oder es kann eine Verbindung sein, die sich an einen anderen Bereich bindet, die beispielsweise eine konformationale oder allosterische Veränderung induziert, die den Komplex stabilisiert (oder destabilisiert), oder seine Ausbildung fördert (oder hemmt). Die Verbindung kann sich an LKB1 oder STRAD oder MO25 (oder an den Komplex als Ganzes) binden, um auf diese Weise die LKB1-Protein-Kinase-Aktivität durch einen allosterischen Effekt zu erhöhen. Dieser allosterische Effekt kann ein allosterischer Effekt sein, der bei der natürlichen Regelung der Aktivität von LKB1 eine Rolle spielt.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, die LKB1, STRAD und rekombinantes MO25 umfasst, das von einer rekombinanten Nukleinsäure exprimiert wird. Die Zubereitung kann rekombinante LKB1 und/oder rekombinantes STRAD umfassen. Die Zubereitung kann bei einer Untersuchung gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung nützlich sein.
Unter „gereinigt" wird verstanden, dass die Zubereitung zumindest teilweise von anderen Komponenten getrennt worden ist, in deren Anwesenheit sie ausgebildet wurde, beispielsweise von anderen Bestandteilen einer rekombinanten Zelle. Beispiele von Reinigungsverfahren, die verwendet werden können, sind in den Beispielen beschrieben.
Die Zubereitung kann im Wesentlichen rein sein. Unter „im Wesentlichen rein" wird verstanden, dass das oder die besagten Polypeptide im Wesentlichen frei von anderen Proteinen sind. Somit wird hier jede Zusammensetzung miterfasst, die zumindest 30% des Protein-Gehaltes gewichtsmäßig als die besagten Polypeptide umfasst, vorzugsweise wenigstens 50%, mehr bevorzugt wenigstens 70%, noch mehr bevorzugt wenigstens 90% und besonders bevorzugt wenigstens 95% des Protein-Gehaltes.
Somit umfasst die Erfindung auch Zusammensetzungen, welche die besagten Polypeptide und eine Verunreinigung enthalten, wobei die Verunreinigung weniger als 70% der Zusammensetzung bezüglich des Gewichts, vorzugsweise weniger als 50% der Zusammensetzung, stärker bevorzugt weniger als 30% der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt weniger als 10% der Zusammensetzung und besonders bevorzugt weniger als 5% der Zusammensetzung hinsichtlich des Gewichts beträgt.
Die Erfindung umfasst auch die besagten, im Wesentlichen reinen Polypeptide, wenn sie mit anderen Komponenten ex vivo kombiniert sind, wobei diese anderen Komponenten nicht alle die Komponenten sind, welche in der Zelle gefunden werden, in welchen diese Polypeptide gefunden werden.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft eine Zelle, die in der Lage ist, LKB1, STRAD und überexprimiertes oder rekombinantes MO25 zu exprimieren. Die Zelle kann eine rekombinante Nukleinsäure umfassen, die MO25 kodiert, und/oder eine rekombinante Nukleinsäure, die LKB1 kodiert, und/oder eine rekombinante Nukleinsäure, die STRAD kodiert. Die Zelle kann in der Lage sein, MO25 aus der endogenen Sequenz, die MO25 kodiert, zu überexprimieren, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren des sequenzspezifischen Zielens von Transkriptions-Aktivatoren. Die Zelle kann eine prokaryotische oder eine eukaryotische Zelle sein. Beispielsweise kann es sich um eine eukaryotische Zelle handeln, beispielsweise eine Insekten-, Hefe- oder Säugetier-Zelle, beispielsweise um eine menschliche Zelle. Beispiele von geeigneten Zellen werden in den Beispielen beschrieben.
Die rekombinante Nukleinsäure ist vorzugsweise für die Expression des kodierten Polypeptids geeignet. Die rekombinante Nukleinsäure kann die Form eines Expressionsvektors besitzen. Rekombinante Polynukleotide, die für die Expression eines gegebenen Polypeptids geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt und Beispiele hiervon werden in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft eine Zelle, die LKB1, STRAD und überexprimiertes oder rekombinantes MO25 enthält. Die Zelle kann rekombinantes LKB1 und/oder rekombinantes STRAD umfassen. Die Zelle kann eine Zelle gemäß dem vorausgehenden Gesichtspunkt der Erfindung sein. Die Zelle kann wenigstens 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5, 10 oder 20 mal mehr MO25 (oder LKB1 oder STRAD, je nachdem) umfassen, als eine äquivalente Zelle, die nicht modifiziert wurde, um MO25 zu überexprimieren oder rekombinantes MO25 zu exprimieren.
Unter „geeignet für eine Expression" wird verstanden, dass es sich bei dem Polynukleotid um ein Polynukleotid handelt, das translatiert werden kann, um das Polypeptid, beispielsweise RNA zu bilden, oder dass das Polynukleotid (bei dem es sich vorzugsweise um DNA handelt), welches das Polypeptid gemäß der Erfindung kodiert, in geeigneter Ausrichtung und in einem für eine Expression korrekten Leserahmen in einen Expressionsvektor, wie z. B. ein Plasmid eingefügt wird. Das Polynukleotid kann mit den geeigneten transkriptionalen und translationalen, regulatorischen Steuernukleotid-Sequenzen verbunden sein, die von irgendeinem gewünschten Wirt erkannt werden; solche Steuerungen können in den Expressionsvektor mit aufgenommen sein.
Merkmale von Vektoren, die für eine Replikation in Säugetierzellen bzw. eukaryotischen Zellen geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt, und Beispiele hierfür werden unten angegeben. Es sei darauf hingewiesen, dass ein Vektor für eine Replikation sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen geeignet sein kann.
Es wurde eine Vielzahl von Verfahren entwickelt, um arbeitsmäßig Polynukleotide, insbesondere DNA mit Vektoren zu verknüpfen, beispielsweise über komplementäre kohäsive Termini. Geeignete Verfahren werden in Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY beschrieben.
Ein wünschenswerter Weg zur Modifikation der DNA, die ein Polypeptid gemäß der Erfindung kodiert, besteht darin, die Polymerase-Kettenreaktion zu verwenden, wie sie von Saiki et al (1988) Science 239, 487–491 beschrieben wird. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die DNA in einen geeigneten Vektor einzuführen, beispielsweise dadurch, dass auf geeignete Restriktionsstellen eingewirkt wird, oder es kann verwendet werden, um die DNA auf andere nützliche Weisen zu modifizieren, wie dies aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Bei diesem Verfahren wird die DNA, die enzymatisch amplifiziert werden soll, von zwei speziellen Primern flankiert, die selbst in die amplifizierte DNA aufgenommen werden. Diese spezifischen Primer können Erkennungsstellen für Restriktions-Endonuklease enthalten, die verwendet werden kann, um eine Klonierung in Expressionsvektoren unter Verwendung von Verfahren durchzuführen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren die RNA) wird dann in einem geeigneten Wirt exprimiert, um ein Polypeptid zu erzeugen, welches die Verbindung gemäß der Erfindung bildet. Somit kann die DNA, die das Polypeptid kodiert, welches die Verbindung gemäß der Erfindung bildet, in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren in geeigneter Weise modifiziert werden, wobei die hier gegebenen Anweisungen zu berücksichtigen sind, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle für die Expression und Produktion des Polypeptids gemäß der Erfindung zu transformieren. Diese Verfahren umfassen solche, wie sie in den US-Patenten 4,440,859 vom 3. April 1984 für Rutter et al., 4,530,901 vom 23. Juli 1985 für Weissman, 4,582,800 vom 15. April 1986 für Crowl, 4,677,063 vom 30. Juni 1987 für Mark et al, 4,678,751 vom 7. Juli 1987 für Goeddel, 4,704,362 vom 3. November 1987 für Itakura et al, 4,710,463 vom 1. Dezember 1987 für Murray, 4,757,006 vom 12. Juli 1988 für Toole, Jr. et al, 4,766,075 vom 23. August 1988 für Goeddel et al und 4,810,648 vom 7. März 1989 für Stalker beschrieben sind, deren Inhalt hier durch Bezugnahme mit aufgenommen wird.
Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren die RNA), welche das Polypeptid kodiert, kann mit einer Vielzahl von anderen DNA-Sequenzen für eine Einführung in einen geeigneten Wirt verbunden werden. Die Begleit-DNA hängt von der Art des Wirtes, der Art der Einführung der DNA in den Wirt und davon ab, ob eine episomale Aufrechterhaltung oder Integration gewünscht wird.
Allgemein wird die DNA in einen Expressionsvektor wie z. B. ein Plasmid in der richtigen Ausrichtung und mit dem richtigen Leserahmen für die Expression eingefügt. Erforderlichenfalls kann die DNA mit den geeigneten transkriptionalen und translationalen regulatorischen Steuer-Nukleotid-Sequenzen verknüpft sein, die von dem gewünschten Wirt erkannt werden, obwohl solche Steuer-Nukleotid-Sequenzen im Allgemeinen im Expressionsvektor verfügbar sind. Der Vektor wird dann mit Hilfe von Standardverfahren in den Wirt eingeführt. Im Allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert. Daher ist es erforderlich, transformierte Wirtszellen zu selektieren. Ein Selektionsverfahren umfasst, dass in den Expressionsvektor eine DNA-Sequenz mit irgendwelchen erforderlichen Steuerelementen aufgenommen wird, die in den transformierten Zellen ein für eine Auswahl geeignetes Merkmal kodiert, wie z. B. Widerstandsfähigkeit gegen Antibiotika. Alternativ kann das Gen für ein solches Selektionsmerkmal sich auf einem anderen Vektor befinden, der verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle zu co-transformieren.
Wirtszellen, welche durch die rekombinante DNA gemäß der Erfindung transformiert worden sind, werden dann für einen ausreichenden Zeitraum und unter geeigneten Bedingungen in Kultur angesetzt, wie dies dem Fachmann bekannt ist, und unter Berücksichtigung der hier gegebenen Anweisungen, um eine Expression des Polypeptids zu ermöglichen, das dann gesammelt werden kann.
Es sind viele Expressions-Systeme bekannt, einschließlich Bakterien (beispielsweise E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (beispielsweise Saccharomyces cerevisiae), Fadenpilze (beispielsweise Aspergillus), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen.
Die Vektoren umfassen ein prokaryotisches Replikon, wie z. B. ColE1 ori, für die Ausbreitung in einem Prokaryoten, selbst wenn der Vektor für die Expression in anderen, nicht prokaryotischen Zelltypen verwendet werden soll. Die Vektoren können auch einen geeigneten Promoter, wie z. B. einen prokaryotischen Promoter umfassen, der in der Lage ist, die Expression (Transkription und Translation) von Genen in einer bakteriellen Wirtszelle, wie z. B. E. coli zu steuern, die hiermit transformiert worden ist.
Ein Promotor ist ein Expressions-Steuerelement, das von einer DNA-Sequenz gebildet wird, welche es ermöglicht, dass eine Bindung der RNA-Polymerase und eine Transkription auftreten. Promotor-Sequenzen, die mit exemplarischen bakteriellen Wirtszellen kompatibel sind, werden typischerweise in Plasmid-Vektoren vorgesehen, welche geeignete Restriktionsstellen für das Einfügen einer DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung besitzen.
Typische prokaryotische Vektorplasmide sind pUC18, pUC19, pBR322 und pBR329, die von Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA) bezogen werden können, sowie pTrc99A und pKK223-3, die von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA geliefert werden.
Ein typisches Säugetier-Zellen-Vektorplasmid ist pSVL, das von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA geliefert wird. Dieser Vektor verwendet den SV40-Late-Promotor, um die Expression von geklonten Genen anzutreiben, wobei der höchste Pegel der Expression in T-Antigen erzeugenden Zellen wie z. B. COS-1-Zellen gefunden wird.
Ein Beispiel eines einführbaren Säugetier-Expressions-Vektors ist pMSG, der ebenfalls von Pharmacia geliefert wird. Dieser Vektor verwendet den durch Glukocorticoid induzierbaren Promotor des langen Terminal-Repeats von Mäuse-Gesäuge-Tumor-Viren, um die Expression des geklonten Gens anzutreiben.
Geeignete Hefe-Plasmid-Vektoren sind pRS403-406 und pRS413-416, die allgemein von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA geliefert werden. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und PRS406 sind Yeast Integrating plasmids (Ylps) und umfassen die selektierbaren Hefemarker HIS3, TRP1, LEU2 und URA3. Die Plasmide pRS413-416 sind Yeast Centromere plasmids (YCps).
Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotische sein. Bakterielle Zellen sind bevorzugte prokaryotische Wirtszellen und sind typischerweise ein Stamm von E. coli wie z. B. die E. coli-Stämme DH5, die von Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA geliefert werden, und RR1, die von der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, MD, USA (Nr. ATCC 31343) zur Verfügung gestellt werden. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Hefezellen, Insektenzellen und Säugetierzellen, vorzugsweise Wirbeltierzellen, wie beispielsweise von einer Maus, einer Ratte, einem Affen, oder menschliche Fibroplast-Zelllinien. Hefe-Wirtszellen umfassen YPH499, YPH500 und YPH501, die im Allgemeinen von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA geliefert werden. Bevorzugte Wirtszellen umfassen menschliche embryonale Nieren-293-Zellen (siehe Beispiel 1), China-Hamster-Eierstock-Zellen (CHO), die von ATCC unter der Bezeichnung CCL61 lieferbar sind, NIH-Schweizer-Maus-Embryonal-Zellen NIH/3T3, die von ATCC unter der Bezeichnung CRL 1658 geliefert werden, und von Affen-Nieren abgeleitete COS-1-Zellen, die von ATCC unter der Bezeichnung CRL 1650 geliefert werden. Bevorzugte Insektenzellen sind Sf9-Zellen, die mit Baculovirus-Expressions-Vektoren transfiziert werden können.
Die Transformation von geeigneten Zell-Wirten mit einem DNA-Konstrukt wird mit Hilfe von bekannten Verfahren durchgeführt, die typischerweise von der Art des verwendeten Vektors abhängen. Bezüglich der Transformation von prokaryotischen Wirtszellen siehe beispielsweise Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 69, 2110 und Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Die Transformation von Hefe-Zellen beschreiben Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Das Verfahren von Beggs (1978) Nature 275, 104–109 ist ebenfalls nützlich. Für die Transfektion von Wirbeltier-Zellen geeignete Reagenzien, beispielsweise Calciumphosphat und DEAE-Dextran oder Liposom-Zubereitungen werden von Stratagene Cloning Systems, oder Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA geliefert.
Es kann auch Elektroporation eingesetzt werden, um Zellen zu transformieren und/oder zu transfizieren, wie dies für die Transformation von Hefezellen, bakteriellen Zellen, Insektenzellen und Wirbeltierzellen aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Beispielsweise können viele bakterielle Arten durch Verfahren transformiert werden, wie sie in Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637–646 beschrieben werden, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme mit aufgenommen wird. Die größte Anzahl von Transformanten wird ständig nach einer Elektroporation der DNA-Zell-Mischung gewonnen, die in 2,5 × PEB suspendiert ist, wobei 6250V pro cm bei 25:FD verwendet werden.
Verfahren zur Transformation von Hefe durch Elektroporation sind in Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182 beschrieben.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein DNA-Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Beispielsweise ist es möglich, Zellen, die sich aus der Einführung eines Expressions-Konstruktes gemäß der vorliegenden Erfindung ergeben, wachsen zu lassen, um das Polypeptid gemäß der Erfindung zu erzeugen. Die Zellen können gesammelt und lysiert werden und ihr DNA-Gehalt kann unter Verwendung eines Verfahrens auf das Vorhandensein von DNA untersucht werden, wie es von Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 oder Bereut et al (1985) Biotech. 3, 208 beschrieben wird.
Zusätzlich zur direkten Untersuchung des Vorhandenseins von rekombinanter DNA kann eine erfolgreiche Transformation durch bekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rekombinante DNA in der Lage ist, die Expression des Proteins zu steuern. Beispielsweise erzeugen Zellen, die erfolgreich mit einem Expressions-Vektor transformiert worden sind, Proteine, welche die entsprechende Antigenizität zeigen. Proben von Zellen, von denen man vermutet, dass sie transformiert worden sind, werden gesammelt und hinsichtlich des Proteins unter Verwendung geeigneter Antikörper untersucht.
Somit betrifft zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen selbst die vorliegende Erfindung auch eine Kultur solcher Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur oder eine Kultur, die von einer monoklonalen Kultur in einem Nährmedium abgeleitet worden ist.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung zur Herstellung einer Zubereitung gemäß der Erfindung umfasst den Schritt, die Zubereitung aus einer Zelle gemäß der Erfindung zu reinigen. Verfahren zum Kultivieren von Wirtszellen und zum Isolieren von rekombinanten Proteinen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Beispiele geeigneter Reinigungs-Verfahren sind in den Beispielen beschrieben. Beispielsweise können eine oder mehrere Komponenten der Zubereitung markiert werden, um die Reinigung unter Verwendung von Affinitäts-Reagenzien zu unterstützen, wie dies dem Fachmann bekannt ist und in den Beispielen beschrieben wird. Chromatographische Verfahren können ebenfalls verwendet werden, wie sie beispielsweise in den Beispielen beschrieben sind.
Die Zubereitung gemäß dem vorausgehenden Aspekt der Erfindung kann beispielsweise markierte LKB1, STRAD und MO25 umfassen. Die Verhältnisse von LKB1:STRAD:MO25 können 1:1:1 sein, beispielsweise wie dies durch in den Beispielen beschriebene Verfahren gemessen wird. Es sei darauf hingewiesen, dass das ermittelte Verhältnis in Abhängigkeit von den Details des zur Herstellung der Zubereitung verwendeten Verfahrens variieren kann. Die Zubereitung kann einen Komplex umfassen, der LKB1, STRAD und MO25 umfasst, wie dies in den Beispielen beschrieben ist.
Das Verfahren gemäß dem ersten Gesichtspunktes der Erfindung kann mit LKB1 in der Form einer Zubereitung durchgeführt werden, die gemäß dem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung hergestellt worden ist, oder in Form einer Zubereitung oder eines Komplex, die bzw. der durch das oben angegebene Verfahren oder in einer Zelle gemäß der Erfindung erhalten wurde oder erhalten werden kann.
Die oben genannten Polypeptide können durch Verfahren hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind und unten in den Beispielen 1 oder 2 beschrieben werden, beispielsweise unter Verwendung von molekularbiologischen Verfahren oder automatisierten chemischen Peptid-Synthese-Verfahren.
Es sei darauf hingewiesen, dass peptidähnliche Verbindungen ebenfalls nützlich sein können. So werden unter den Ausdrücken „Polypeptid" oder „Peptid" nicht nur Moleküle verstanden, bei denen Aminosäure-Residuen durch Peptid-(CO-NH-)-Verknüpfungen verbunden sind, sondern auch Moleküle, bei denen die Peptid-Bindung umgedreht ist. Solche retro-inversen Peptidomimetiks können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, beispielsweise wie sie von Mézière et al (1977) in J. Immunol. 159, 3230–3237 beschrieben werden, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme mit aufgenommen wird. Diese Vorgehensweise umfasst die Herstellung von Pseudo-Peptiden, die Änderungen enthalten, welche die Hauptstruktur (backbone) betreffen, aber nicht die Orientierung der Seitenketten. Mézière et al (1997) zeigen, dass diese Pseudo-Peptide zumindest für Reaktionen von MHC-Klasse-II- und T-Helfer-Zellen-Antworten nützlich sind. Retro-inverse Peptide, welche NH-CO-Verbindungen statt CO-NH-Peptid-Verbindungen enthalten, sind widerstandsfähiger gegen Proteolyse.
In ähnlicher Weise kann die Peptid-Bindung weggelassen werden, wenn gewährleistet ist, dass ein geeigneter Verbindungsbestandteil vorhanden ist, der die Abstände zwischen den Cα-Atomen der Aminosäure-Residuen aufrecht erhält; es ist besonders bevorzugt, wenn der Verbindungsbestandteil im Wesentlichen die gleiche Ladungsverteilung und im Wesentlichen die gleiche Planarität wie die Peptid-Bindung besitzt.
Es sei darauf hingewiesen, dass das Peptid bequem an seinem N- oder C-Terminus blockiert sein kann, um dabei zu helfen, die Empfindlichkeit gegen exoproteolytischen Abbau zu vermindern.
Somit sieht man, dass die STRAD- oder MO25-Polypeptide eine peptidomimetische, d. h. eine ein Peptid nachahmende Verbindung sein können.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung zur Veränderung der zellulären LKB1-Aktivität, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (1) Ermitteln, ob eine Testverbindung die LKB1-Protein-Kinase-Aktivität einer Zubereitung oder eines Komplexes oder einer Zelle gemäß der Definition in irgendeinem der vorhergehenden Gesichtspunkte der Erfindung verändert (beispielsweise erhöht), und (2) Auswählen einer Verbindung, welche die Protein-Kinase-Aktivität von LKB1 verändert. Die LKB1-Protein-Kinase-Aktivität kann gemessen werden, indem man beispielsweise ein Myelin-Basisprotein als Substrat verwendet, oder indem man AMPK oder ein Mitglied der AMPK-Unterfamilie oder ein Fragment hiervon (wie oben und im Beispiel 3 erläutert) als Substrat verwendet. Eine Verbindung, welche die LKB1-Protein-Kinase-Aktivität verändert, beispielsweise erhöht, kann in der Medizin beispielsweise zur Behandlung von Krebs nützlich sein.
Die in den Verfahren identifizierten Verbindungen können selbst als medikamentöse Wirkstoffe nützlich sein, oder sie können Leitverbindungen für die Konstruktion und Synthese von wirksameren Verbindungen darstellen.
Die Verbindung kann eine medikamenten-artige Verbindung oder eine Leitverbindung bzw. Ausgangsverbindung für die Entwicklung einer medikamenten-artigen Verbindung für jedes der obigen Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung sein. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Verfahren als Reihen-Untersuchungen bei der Entwicklung von pharmazeutischen Verbindungen oder Medikamenten nützlich sein können, wie sie dem Fachmann bekannt sind.
Der Ausdruck „medikamenten-artige Verbindung" ist dem Fachmann bekannt und kann eine Verbindung bezeichnen, die Merkmale besitzt, die sie für eine Verwendung in der Medizin geeignet machen können, beispielsweise als aktiver Bestandteil in einem Medikament. So kann beispielsweise eine medikamenten-artige Verbindung ein Molekül sein, das durch die Verfahren der organischen Chemie, weniger bevorzugt durch Verfahren der Molekularbiologie oder Biochemie synthetisiert werden kann, und ist vorzugsweise ein kleines Molekül, das weniger als 5000 Dalton aufweist. Eine medikamenten-artige Verbindung kann zusätzlich Merkmale einer selektiven Wechselwirkung mit einem speziellen Protein oder speziellen Proteinen aufweisen und bioverfügbar und/oder in der Lage sein, Zellmembranen zu durchdringen, doch sei darauf hingewiesen, dass diese Merkmale nicht entscheidend sind.
Der Ausdruck „Leitverbindung" ist dem Fachmann ebenfalls bekannt und kann bedeuten, dass die Verbindung zwar nicht selbst für eine Verwendung als Medikament geeignet ist (beispielsweise weil sie bezüglich des beabsichtigten Ziels nur eine geringe Wirksamkeit besitzt oder in ihrer Wirkung nicht selektiv oder instabil oder schwierig zu synthetisieren ist oder eine schlechte Bioverfügbarkeit aufweist), die aber einen Ausgangspunkt für die Konstruktion von anderen Verbindungen bilden kann, die wünschenswertere Eigenschaften besitzen.
Man sieht, dass es wünschenswert ist, Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität der Protein-Kinase in vivo verändern können. Somit sieht man, dass die bei dem Verfahren verwendeten Reagenzien und Bedingungen so gewählt werden können, dass die Wechselwirkungen zwischen beispielsweise besagter LKB1 und beispielsweise den STRAD- oder MO25-Polypeptiden im Wesentlichen die gleichen sind wie zwischen dem menschlichen LKB1 und menschlichem STRAD und/oder MO25. Es sei darauf hingewiesen, dass sich die Verbindung an das LKB1 oder an STRAD oder MO25 binden kann.
Die Verbindungen, die in den Durchmusterungs-Verfahren der Untersuchung oder in anderen Untersuchungen getestet werden, in denen die Fähigkeit einer Verbindung gemessen werden kann, die Protein-Kinasen-Aktivität einer Protein-Kinase, beispielsweise von LKB1 zu messen, können Verbindungen sein, die unter Verwendung von Molekular-Modellierverfahren ausgewählt und/oder konstruiert (oder auch modifiziert) worden sind, beispielsweise unter Verwendung von Computer-Verfahren. Die ausgewählte oder konstruierte Verbindung kann synthetisiert werden (wenn sie nicht bereits synthetisiert ist) und hinsichtlich ihrer Wirkung auf LKLB1, beispielsweise bezüglich ihrer Wirkung auf die Protein-Kinasen-Aktivität getestet werden. Die Verbindung kann in einem Reihen-Durchmusterungs-Verfahren gemäß der Erfindung getestet werden.
Es sei darauf hingewiesen, dass Durchmusterungs-Untersuchungen, die in der Lage sind, mit einem hohen Durchsatz zu arbeiten, besonders bevorzugt sind. Beispiele können die beschriebenen, auf Zellen basierenden Untersuchungen und Protein-Protein-Bindungs-Untersuchungen umfassen. Ein weiteres Beispiel ist ein auf SPA basierendes System (Scintillation Proximity Assay; Amersham International), das dem Fachmann bekannt ist. Andere Verfahren zur Erkennung von Polypeptid-Polypeptid-Wechselwirkungen umfassen Ultrafiltration mit Ionensprüh-Massenspektroskopie sowie HPLC- oder andere physikalische und analytische Verfahren. Fluoreszenz-Energie-Resonanz-Transfer-Verfahren (FRET), die dem Fachmann bekannt sind, können beispielsweise verwendet werden, bei denen die Bindung von zwei für einen durch Fluoreszenz markierten Bestandteilen dadurch gemessen werden kann, dass die Wechselwirkung der fluoreszierenden Markierungen gemessen wird, wenn sie sich nahe beieinander befinden.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist eine Verbindung, die durch ein Durchmusterungs-Verfahren gemäß der Erfindung identifiziert wird oder identifizierbar ist.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist eine Verbindung gemäß der Erfindung zur Verwendung in der Medizin.
Die Verbindung kann auf irgendeine geeignete Weise verabreicht werden, üblicherweise parenteral, beispielsweise intravenös, intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär oder intravesikal, in sterilen, nicht pyrogenen Standard-Zubereitungen mit Verdünnern und Trägern. Die Verbindung kann auch topisch verabreicht werden. Die Verbindung kann auch in einer lokalisierten Weise, beispielsweise durch Injektion verabreicht werden. Die Behandlung kann aus einer einzelnen Dosis oder aus der Verabreichung einer Vielzahl von Dosen über einen gewissen Zeitraum hinweg bestehen. Die Verbindung kann als Antikrebs-Wirkstoff oder für die Behandlung beispielsweise von Diabetes oder Fettleibigkeit nützlich sein.
Zwar ist es möglich, eine Verbindung gemäß der Erfindung für sich alleine zu verabreichen, doch ist sie vorzugsweise in einer pharmazeutischen Zubereitung zusammen mit einem oder mehreren akzeptablen Trägern vorhanden. Der oder die Träger müssen in dem Sinn „akzeptabel" sein, das sie mit der Verbindung gemäß der Erfindung kompatibel und für ihren Empfänger nicht schädlich sind. Typischerweise sind die Träger Wasser oder Salzlösung, das bzw. die steril und frei von Pyrogen sind.
Somit schafft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die durch die Durchmusterungs-Verfahren gemäß der Erfindung identifizierte oder identifizierbare Zusammensetzung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft einen Teilesatz, der LKB1 oder ein LKB1 kodierendes, rekombinantes Polynukleotid, STRAD oder ein STRAD kodierendes, rekombinantes Polynukleotid oder ein MO25 kodierendes rekombinantes Polynukleotid umfasst. Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft einen Teilesatz, der folgendes umfasst: (1) AMPK oder ein Mitglied der AMPK-Unterfamilie oder ein rekombinantes Polynukleotid, das AMPK oder ein Mitglied der AMPK-Unterfamilie kodiert (einschließlich einem Fragment hiervon, wie oben oder im Beispiel 3 erläutert) und (2) einen Teilesatz, wie er in Bezug auf den vorausgehenden Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, oder Zellen gemäß der Erfindung. Solche Teilesätze können bei der Herstellung einer Zubereitung oder eines Komplexes nützlich sein, die bzw. der beispielsweise bei einem Durchmusterungs-Verfahren gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung nützlich sein kann. Das oder die rekombinanten Polynukleotide können sich in einem Expressions-Vektor befinden (beispielsweise wie oben erläutert), oder (in weniger bevorzugter Weise) für eine in vitro erfolgende Expression geeignet sein.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein Verfahren zur Zubereitung eines LKB1/STRAD/MO25-Komplexes, das folgende Schritte umfasst: (1) Auswählen eines Zelltyps, in dem LKB1 überexprimiert werden soll, einschließlich des Schritts der Ermittlung, ob der Zelltyp STRAD und MO25 exprimiert und (2) Zubereiten eines LKB1/STRAD/MO25-Komplexes, der LKB1 in den ausgewählten Zelltyp überexprimiert. Verfahren zur Ermittlung, ob die Zellart STRAD und MO25 exprimiert, sind dem Fachmann bekannt und Beispiele für solche Verfahren sind in den Beispielen beschrieben. Alternativ kann es sich bei dem Zelltyp um eine Art handeln, von der bereits bekannt ist, dass sie STRAD und MO25 exprimiert. Beispiele solcher Zellen umfassen 293-, HeLa-, G361- und Rat2-Zellen. STRADα und MO25α werden in den meisten analysierten Zellen mit hohem Niveau exprimiert.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein Verfahren zur Zubereitung eines LKB1/STRAD/MO25-Komplexes, das die folgende Schritte umfasst: (1) Überexprimieren von LKB1 in einer Zelle unter Verwendung eines Verfahrens gemäß dem vorausgehenden Gesichtspunkt der Erfindung und (2) Zubereiten dieses Komplexes aus der Zelle. Geeignete Verfahren zum Zubereiten des LKB1/STRAD/MO25-Komplexes sind in den Beispielen beschrieben.
Die Überexpression von LKB1 kann beispielsweise in eukaryotischen Zellen zu einem Wachstumsstopp führen. Es kann daher erforderlich sein, LKB1 unter Verwendung eines tansienten Expressions-Systems zu exprimieren, wie dies beispielsweise in den Beispielen beschrieben ist oder unter Verwendung eines regulierten (induzierbaren) Expressions-Systems, wie dies dem Fachmann bekannt ist.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein Verfahren zum Identifizieren eines genetischen Unterschiedes im Zusammenhang mit PJS (Peutz-Jeghers-Syndrom), das folgende Schritte umfasst: (1) Ermitteln der Sequenz eines Gens, das eine STRAD- oder MO25-Isoform kodiert in wenigstens einem Patienten, der unter PJS leidet, (2) Identifizieren irgendeines Unterschiedes zwischen der Sequenz des betreffenden Patienten und einer äquivalenten Sequenz von einer Person ohne JPS. Die Zuordnung von LKB1-Substrat und MO25 und die Zuordnung eines LKB1-Mangels zu PJS deuten darauf hin, dass bei PJS auch Defekte in Bezug auf MO25 oder STRAD eine Rolle spielen könnten. Verfahren zur Identifizierung von Mutationen in Kandidaten-Genen und zur Ermittlung, ob eine Mutation mit der Erkrankung verknüpft oder nicht verknüpft ist, sind dem Fachmann bekannt.
Somit schafft die Erfindung STRAD oder MO25 oder ein rekombinantes Polynukleotid, das sie kodiert, für eine Verwendung in der Medizin. Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung sieht die Verwendung von STRAD oder MO25 oder eines diese Substanzen kodierenden Polynukleotides bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs, PJS, Diabetes oder Fettleibigkeit vor. Das rekombinante Polynukleotid kann die Form eines Gen-Therapie-Vektors, beispielsweise eines viralen Gen-Therapie-Vektors besitzen, wie dies den Fachleuten bekannt ist.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die AMPK oder ein Mitglied der AMPK-Unterfamilie durch einen ähnlichen Mechanismus wie Metformin oder Phenformin oder AICA-Riboside aktiviert, wobei die Wirkung einer Testverbindung auf die Aktivierung von AMPK oder eines Mitglieds der AMPK-Unterfamilie durch eine Zubereitung oder einen Komplex oder eine Zelle gemäß der Erfindung mit der Wirkung von Metformin oder Phenformin oder AICA-Riboside auf die Aktivierung von AMPK oder eines Mitglied der AMPK-Unterfamilie verglichen und eine Verbindung mit einem ähnlichem Effekt ausgewählt wird. Ein solches Verfahren kann bei der Bestimmung nützlich sein, ob eine Verbindung potenter ist als Metformin oder Phenformin oder AICA-Riboside.
Unter dem Ausdruck „Antikörper" werden auch synthetische Antikörper und Fragmente und Varianten von ganzen Antikörpern (beispielsweise wie oben erläutert) verstanden, welche die Antigen-Bindestelle beibehalten. Der Antikörper kann eine monoklonaler Antikörper sein, doch kann es sich auch um eine polyklonale Antikörper-Zubereitung, einen Teil oder Teile hiervon (beispielsweise ein F_ab-Fragment oder F(ab')₂) oder einen synthetischen Antikörper oder einen Teil hiervon handeln. Fab-, Fv-, ScFv- und dAb-Antikörper-Fragmente können alle in einer Form exprimiert werden, die von E. coli ausgeschieden wird, wodurch die leichte Herstellung von großen Mengen dieser Fragmente ermöglicht wird. Unter dem Ausdruck „ScFv-Moleküle" werden Moleküle verstanden, bei denen die V_H- und V_L-Partnerdomänen über ein flexibles Oligopeptid miteinander verknüpft sind. Antikörper der Klasse IgG sind bevorzugt.
Geeignete monoklonale Antikörper für ausgewählte Antigene können durch bekannte Verfahren zubereitet werden, beispielsweise durch Verfahren wie sie in „Monoclonal Antibodies: A manual of techniques" H. Zola (CRC Press, 1988) und in „Monoclonal Hybridoma Antibodies: techniques and Applications", JGR Hurrell (CRC Press, 1982) beschrieben und in der oben definierten Weise modifiziert sind. Bispezifische Antikörper können durch Zellfusion, durch Reassoziation von monovalenten Fragmenten oder durch chemische Vernetzung von ganzen Antikörpern hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern sind beschrieben bei Corvalen et al. (1987) Cancer Immunol. Immunother. 24, 127–132 und 133–137 und 138–143.
Eine allgemeine Übersicht über die Verfahren, die bei der Synthese von Antikörper-Fragmenten, die ihre spezielle Bindungsstellen beibehalten, eine Rolle spielen, findet sich bei Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293–299.
Die Erfindung wird nun weiter unter Bezugnahme auf die folgenden, nicht einschränkend zu verstehenden Figuren und Beispiele erläutert.
Figuren-Beschreibungstexte
1. Assoziation von MO25α mit LKB1. (A) Zell-Lysate, die von parenteralen Vergleichs-HeLa-Zellen oder von HeLa-Zellen abgeleitet worden waren, die in stabiler Weise N-terminal mit Flag-Epitope markierte Wildtyp-LKB1 (WT) oder kinase-dead LKB1 (KD) exprimieren, wurden durch eine Anti-Flag-M2-Affinitäts-Agarose-Säule geschickt, das LKB1 mit dem Flag-Peptid ausgespült und die Proben in der Weise konzentriert, wie dies bei „Materialien und Methoden" beschrieben ist. Die Proben wurden auf einem Polyacrylamid-Gel elektrophoresziert und die Protein-Bänder wurden nach einer kolloidalen Blaufärbung optisch inspiziert. Die Protein-Bänder, die nur für die WT- und KD-LKB1-Zubereitungen einzigartig sind, sind gekennzeichnet. (B) Die gemäß (A) gekennzeichneten, kolloidal blau gefärbten Bänder wurden aus dem Gel ausgeschnitten, die Proteine im Gel mit Trypsin abgebaut, und ihre Identitäten wurden durch das tryptische Peptid-Massenspektral-Fingerprintverfahren ermittelt. Die Identität von STRADα und MO25α wurde durch eine LC-MS/MS-Sequenz-Analyse auf einem Q-TOF2-Massenspektrometer bestätigt. Die Anzahl von tryptischen Peptiden, der Prozentsatz der Sequenzübereinstimmung und die NCBI-gi-Nummern für jedes identifizierte Protein sind angegeben. (C) Die in (A) gereinigten Proben wurden mit den angegebenen Antikörpern immuno-geblottet. Identische Ergebnisse wurden nach zwei unabhängigen Reinigungen von LKB1 aus HeLa-Zellen erhalten.
2. Aminosäure-Sequenz und Gewebeverteilungs-Muster von MO25α- und MO25β-Isoformen. (A) Aminosäuren-Sequenz-Ausrichtung der humanen MO25α-(NCBI-Zugangsnummer NP_057373) und MO25β-(NCBI-Zugangsnummer NP Q9H9S4)-Isoformen sowie der von C. elegans stammenden MO25α-(NCBI-Zugangs nummer CAB16486) und MO25β-Isoformen (NCBI-Zugangsnummer NP_508691) und der von Drosophila stammenden, vermutlichen MO25-Homologe (NCBI-Zugangsnummer P91891). Konservierte Residuen sind schwarz eingerahmt und die homologen Residuen sind grau schattiert. Die Sequenz-Ausrichtungen wurden unter Verwendung der CLUSTALW- und BOXSHADE-Programme unter Verwendung von Standardparametern durchgeführt, die unter http://www.ch.embnet.org/ zugänglich sind. (B) Ein mit ³²P-markiertes Fragment der MO25α-cDNA wurde als Probe für einen Northern-Blot verwendet, der polyadenylierte RNA enthielt, die von den angegebenen menschlichen Geweben isoliert worden war. Die Membran wurde autoradiographiert und es wurde beobachtet, dass die MO25α-Probe zu einer 4,2-kb Message hybridisierte, was mit der Größe identisch ist, die für die MO25α-Message aus einer Datenbank-Analyse vorhergesagt worden war. Zur Beladungs-Überprüfung wurde der Northern-Blot mit einer β-Actin-Probe hybridisiert. (C & D) Die angegebenen Extrakte von Mäusegewebe (C) oder Zellen (D), die 20 μg Gesamt-Zell-Protein enthielten, wurden mit den Anti-MO25α- und Anti-MO25β-Antikörpern immuno-geblottet.
3. Endogenes LKB1 steht in Verbindung MO25α. (A) LKB1 wurde aus 2 mg der angegebenen Lysate unter Verwendung von 10 μg von anti-LKB1-Antikörper kovalent gekoppelt an Protein-G-Sepharose immuno-präzipitiert, und die Immuno-Präzipitate wurden mit den angegebenen Antikörpern immuno-geblottet. Als Kontrolle wurden die Immuno-Präzipitate auch in parallelen Experimenten mit Preimmune-IgG-Antikörpern durchgeführt, die kovalent an Protein-G-Sepharose gekoppelt waren. In jedem Gel wurden 20 μg des gesamten Zell-Lysats ebenfalls parallel immuno-geblottet. (B) MO25α wurde so wie oben immuno-ausgefällt mit der Ausnahme, dass 15 μg des MO25α-Antikörpers verwendet wurden. Die gezeigten Ergebnisse stammen von einem einzigen Experiment, das dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt wurde.
4. MO25α steht über STRAD mit LKB1 in Verbindung. (A) 293-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, welche für die Expression des angegebenen GST-Fusions-Proteins zusammen mit Myc-MO25α kodieren. 35 Stunden nach der Transfektion wurden die mit GST gekennzeichneten Proteine aus den Zell-Lysaten unter Verwendung von Glutathion-Sepharose affinititäts-gereinigt, wie in „Materialien und Verfahren" beschrieben. Ähnliche Mengen des gereinigten GST-Fusions-Proteins wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen und mit Anti-Myc-Antikörper immuno-geblottet, um ko-gereinigte Myc-MO25α zu erkennen, oder mit einem Anti-GST-Antikörper um sicherzustellen, dass vergleichbare Mengen der mit GST gekennzeichneten Proteine in jeder Spur vorhanden waren (oberer und mittlerer Kasten). 5 μg der gesamten Zell-Lysate wurden vor der Affinitäts-Reinigung auch einem Immuno-Blotting mit Anti-Myc-Antikörper unterzogen, um sicherzustellen, dass Myc-MO25α in jeder Ko-Transfektion in ähnlichem Ausmaß exprimiert war (unterer Kasten). (B) N-terminal mit GST markiertes LKB1 wurde in 293-Zellen in Anwesenheit und in Abwesenheit von Flag-STRADα exprimiert und so wie beschrieben gereinigt. Die gereinigten Proteine wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen und durch kolloidale Blaufärbung sichtbar gemacht (oberer Kasten). Das angezeigte, schwache Protein-Band, das einem endogenen Protein von 40-kDa entspricht (mit * markiert) wurde durch einen tryptischen Peptid-Massen-Spektral-Fingerabdruck als endogen exprimiertes MO25α (mit 38% Sequenzübereinstimmung) identifiziert. Die gereinigten Proteine wurden ebenfalls mit den angegebenen Antikörpern immuno-geblottet (unterer Kasten). (C) Wie oben, mit der Ausnahme, dass das GST-LKB1 in 293-Zellen zusammen mit den angegebenen Isoformen von Flag-STRAD und Myc-MO25 exprimiert wurde, und die durch kolloidale Blaufärbung sichtbar gemachten Proteine wurden ebenfalls mit den angegebenen Antikörpern immuno-geblottet. Für alle Kästen wurden ähnliche Ergebnisse in wenigstens drei voneinander getrennten Experimenten erhalten.
5. MO25α und STRADα verankern LKB1 im Zytoplasma. HeLa-Zellen wurden mit den angegebenen Konstrukten transfiziert, welche für die Expression von Myc-MO25α, Flag-STRADα und GFP-LKB1 kodieren. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in 4 Vol.-% Paraformaldehyd fixiert und mit Anti-MO25α-Antikörper immuno-gefärbt, um MO25α zu erkennen (TR-Anti-Schaf-Sekundär-Antikörper, roter Kanal) sowie mit Anti-Flag, um STRADα zu erkennen (CY5-Anti-Maus-Sekundär-Antikörper, blauer Kanal). Die Lokalisierung von GFP-LKB1 wurde direkt durch die GFP-Fluoreszenz sichtbar gemacht (grüner Kanal). Die Zellen wurden unter Verwendung eines konfokalen Zeiss-Mikroskops LSM 510 META abgebildet. Die dargestellten Zellen sind repräsentative Bilder, die in drei getrennten Experimenten erhalten wurden. Die Maßstabs-Balken entsprechen 10 μm.
6. MO25α erkennt die C-terminalen drei Residuen von STRADα. (A) Wildtyp-STRADα, das N-terminal mit GST markiert war, oder die angegebenen Mutanten von STRADα wurden in 293-Zellen zusammen mit Myc-MO25α exprimiert und 36 Stunden nach der Transfektion wurden die STRADα-Proteine aus den Zell-Lysaten unter Verwendung von Glutathion-Sepharose affinitäts-gereinigt. Ähnliche Mengen des gereinigten Proteins wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und einem Immuno-Blotting mit Anti-Myc-Antikörper unterzogen, um co-gereinigte Myc-MO25α zu erkennen, oder mit einem Anti-GST-Antikörper, um sicherzustellen, dass vergleichbare Mengen des mit GST markierten Proteins in jeder Spur vorhanden waren (obere und mittlere Blöcke). 5 μg des Gesamtzell-Lysates wurden vor der Affinitäts-Reinigung ebenfalls einem Immuno-Blotting mit Anti-Myc-Antikörper unterzogen, um sicherzustellen, dass Myc-MO25α in jedem Zustand in ähnlichen Mengen exprimiert war (unterer Block). (B) 0,5 mg des angegebenen Zell-Lysats wurden mit 0,5 μg eines N-terminal biotinylierten Peptids inkubiert, das entweder die 12 C-terminalen Residuen von STRADα enthielt, konjugiert zu Streptavidin-Sepharose (NLEELEVDDWEF, als STRADα-C12 bezeichnet) oder Mutanten dieses Peptids, bei denen die angegebenen Residuen einzeln zu Ala mutiert waren. Nach dem Isolieren und Waschen der Kügelchen wurden die Proben einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen und mit einem Anti-MO25α-Antikörper immuno-geblottet. (C) Die Bindung von bakteriell exprimiertem MO25α an die angegebenen Peptide wurde durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz-BiaCore-Analyse analysiert, wie in „Materialen und Methoden" beschrieben. Die Bindung wurde über einen Bereich von MO25α-Konzentrationen (6,25–3200 nM) analysiert und der Antwortpegel bei der Dauerzustands-Bindung wurde gegen den log der MO25α-Konzentration aufgetragen. Das geschätzte K_d für das STRADα-C12-Peptid wurde durch Anwendung der Formel [ml × m0/(m0 + m2)] auf die Daten unter Verwendung einer Kaleidagraph-Software erhalten, und das K_d wurde auf 850 nM berechnet. WEF-C12 entspricht NLEELEVDDWEF, WEA- C12 entspricht NLEELEVDDWEA, AEF-C12 entspricht NLEELEVDDAEF, WAF-C12 entspricht NLEELEVDDWAF und WEF-C6 entspricht VDDWEF.
7. Bindung von LKB1 an STRADα erzeugt eine oder mehrere neue Bindungsstellen für MO25α. Die angegebenen Formen von GST-STRADα wurden in 293-Zellen zusammen mit Myc-MO25α und/oder Flag-LKB1 vom Wildtyp oder der isolierten, katalytischen Domäne von LKB1 ko-exprimiert [44–343]. 36 Stunden nach der Transfektion wurden die GST-STRADα-Proteine affinitäts-gereinigt, der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen und mit einem Anti-Myc-Antikörper immuno-geblottet, um Myc-MO25α zu erkennen, sowie mit einem Anti-Flag-Antikörper um mitgereinigte Flag-LKB1 und Flag-LKB1 [44–343] zu erkennen, oder mit einem Anti-GST-Antikörper, um STRADα-Formen zu erkennen (obere Kästen). 5 μg des gesamten Zell-Lysats wurden ebenfalls vor der Affinitäts-Reinigung einem Immuno-Blotting mit Anti-Myc- und Anti-Flag-Antikörpern unterzogen, um sicherzustellen, dass MO25α und LKB1 in jeder Transfektion in ähnlichen Mengen erzeugt worden waren (untere Kästen). Ähnliche Ergebnisse wurden in drei getrennten Experimenten erhalten.
8. MO25-Isoformen stabilisieren den LKB10Stradα-Komplex. (A) 293-Zellen wurden mit 3 μg des DNA-Konstrukts transfiziert, das für die Expression von GST-LKB1 kodiert, in Anwesenheit oder in Abwesenheit von 3 μg des Flag-STRADα-Konstrukts und in Abwesenheit oder in Anwesenheit von identischen Mengen des Myc-MO25α-Konstrukts. 36 Stunden nach der Transfektion wurde GST-LKB1 aus den Zell-Lysaten affinitäts-gereinigt und mit geeigneten Epitop-Antikörpern immuno-geblottet, um LKB1, STRADα und MO25α zu detektieren. 5 μg des gesamten Zell-Lysats wurden vor der Affinitäts-Reinigung auch mit den angegebenen Antikörpern immuno-geblottet (untere Kästen). (B) Es wurden die gleichen Vorgänge wie oben mit der Ausnahme durchgeführt, dass das MO25β-Konstrukt statt des MO25α-Konstruktes verwendet wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei getrennten Experimenten erhalten.
9. Aktivierung von LKB1 durch Verknüpfung mit STRAD- und MO25-Isoformen. 293-Zellen wurden mit Konstrukten transfiziert, die GST-LKB1 kodieren, in Anwesenheit oder Abwesenheit von Konstrukten, welche die identischen Isoformen von STRAD und MO25 kodieren. 36 Stunden nach der Transfektion wurde GST-LKB1 affinitäts-gereinigt und hinsichtlich Autophosphorylierung und Transphosphorylierung von MBP untersucht, wie in „Materialien und Methoden" beschrieben. Die Reaktionsprodukte wurden elektrophoresziert und das Gel autoradiographiert (obere Kasten). Die Phosphorylierung von MBP durch LKB1 bei Thr65 wurde ebenfalls durch Immuno-Blotting mit einem für Phosphor spezifischen Antikörper (T65-P), der durch LKB1 an diesem Residuum phosphoryliertes MBP erkennt. Jede Reaktion wurde ebenfalls mit den geeigneten Epitop-Markierungs-Antikörpern immuno-geblottet, um die Pegel von LKB1 und STRAD- und MO25-Isoformen zu überwachen. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei getrennten Experimenten erhalten.
10. Ausrichtung der Aminosäure-Sequenz von STRAD-Isoformen mit den engsten STE-20-Kinase-Verwandten. (A) Aminosäuren-Sequenz-Ausrichtung von humanem STRADα (NCBI-Zugangsnummer AAG48269) und STRADβ (NCBI-Zugangs nummer AAM19143) mit humaner SPAK (NCBI-Zugangsnummer AAC72238) und humanem OSR1 (NCBI-Zugangsnummer NP_005100). Konservierte Residuen sind schwarz eingerahmt und homologe Residuen sind grau schattiert. Das katalytische Asp (Subdomäne VI) und Asp-Phe-Gly (Subdomäne VII), die in den aktiven SPAK- und OSR1-Protein-Kinasen vorhanden sind, aber in den STRADα- und STRADβ-Pseudo-Kinasen fehlen, sind eingerahmt und mit einem Stern gekennzeichnet. Das C-terminale Trp-Glu-Phe-Motiv, das bei STRADα und STRADβ entsprechend einer Phe-Glu-Phe-Sequenz in SPAK und OSR1 vorhanden ist, ist eingerahmt und mit Dreiecken gekennzeichnet, und die Stellen von LKB1-Phosphorylierung in STRADα (Thr329 und Thr419) (Bass et al., 2003) sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die Sequenz-Ausrichtungen wurden unter Verwendung CLUSTALW- und BOXSHADE-Programmen unter Verwendung von Standard-Parametern durchgeführt, die unter der Adresse http://www.ch.embnet.org/ zugänglich sind.
11. MO25-Isoformen erhöhen die Expression von STRADβ und die Ausbildung des LKB1-STRADβ-Komplexes. (A) 293-Zellen wurden mit 3 mg des DNA-Konstruktes transfiziert, das für die Expression von GST-LKB1 kodiert, in Anwesenheit oder Abwesenheit von 3 μg Flag-STRADβ-Konstrukt und in Abwesenheit oder Anwesenheit von angegebenen Mengen des Myc-MO25α-Konstruktes. 36 Stunden nach der Transfektion wurde GST-LKB1 aus den Zell-Lysaten affinitäts-gereinigt und mit geeigneten Epitop-Antikörpern immuno-geblottet, um LKB1, STRADβ und MO25α zu detektieren. 5 μg des gesamten Zell-Lysats wurden vor der Affinitäts-Reinigung ebenfalls mit den angegebenen Antikörpern immuno-geblottet (untere Kästen). (B) Die obigen Vorgänge wurden mit der Ausnahme durchgeführt, dass das MO25β-Konstrukt anstelle des MO25α-Konstrukts verwendet wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei getrennten Experimenten erhalten und zwar auch dann, wenn STRADß als GST-Fusionsprotein im pEBG-2T-Vektor statt dem pCMV5-Vektor exprimiert wurde (Daten nicht dargestellt).
12. Ausrichtung der Aminosäure-Sequenzen von Tos3, Pak1 und Elm1 von Hefe und LKB1 und CaMKKβ (β3-Variante) von Menschen. Die Ausrichtung wurde unter Verwendung von PILEUP von GCH-Suite [49] erzeugt und die Konsensus-Sequenz wurde ermittelt und eine Färbung unter Verwendung von BOXSHADE v3.2.1 [50] hinzugefügt. Residuen, die zumindest in der Hälfte der Sequenzen identisch sind, sind grau gefärbt, wobei konservative Änderungen ebenfalls in grau gekennzeichnet sind. Die Konsensus-Sequenz ist durch Großbuchstaben dargestellt, wenn das Residuum an einer speziellen Position in allen Sequenzen identisch ist, und durch Kleinbuchstaben, wenn zumindest die Hälfte konserviert ist. Nur die konservierten zentralen Bereiche, welche die Kinase-Domänen enthalten (Residuen 50–310 von LKB1, ungefähr) sind dargestellt.
13. Zwei AMPKKs können aus einem Rattenleber-Extrakt herausgelöst werden, doch sind beides Komplexe zwischen LKB1, STRADα und MO25α. (A) Trennung von zwei Aktivitäten, welche die katalytische GST-AMPKα1-Domäne aktivieren, durch Q-Sepharose-Chromatographie. Die Darstellung zeigt die AMPKK-Aktivität in Fraktionen (offene Kreise), Absorbanz bei 280 nm (durchgezogene Linie) und die Leitfähigkeit in dem Eluat (gestrichelte Linie). Die X-Achse gibt die Fraktions-Nummer wieder (4,5 ml Fraktionen). B, C, D: Untersuchung von Blots von Säulenfraktionen nach SDS-PAGE (1 μl pro Spur) unter Verwendung von Anti-LKB1 (B), Anti-STRADα (C) und Anti-MO25α (D). E, F, G: Fraktionen 26–30 wurden unter Verwendung von Ultra-4 30.000 MWCO Zentrifugal-Konzentratoren von Amicon von 4,5 ml auf 250 μl konzentriert und 2 μl wurden pro Spur aufgebracht. Nach dem SDS-PAGE wurden die Gele auf Nitrocellulose übertragen und die Membranen mit Anti-LKB1 (E), Anti-STRADα (F) und Anti-MO25α (G) untersucht.
14. AMPK-Aktivität, und die LKB1-, STRADα- und MO25α-Polypeptide können aus Rattenleber-AMPKK1 und -AMPKK2 unter Verwendung von Anti-LKB1-Antikörpern immuno-präzipitiert werden. (A) Verringerung der AMPKK-Aktivität aus dem Überstand. Von Schafen stammendes Anti-Human-LKB1 oder Preimmune-Kontroll-Immunoglobulin (IgG) wurde an Protein-G-Sepharose-Kügelchen vorgebunden und mit DMP vernetzt, wie zuvor beschrieben [51], mit der Ausnahme, dass eine abschließende Waschung der Kügelchen mit 100 mM Glycin bei einem pH-Wert von 2,5 durchgeführt wurde. An die Kügelchen gebundene Antikörper (40 μl) wurden mit der Peak-Fraktion von AMPKK1 (0,04 Einheiten), AMPKK2 (0,03 Einheiten) oder einem rekombinanten GST-LKB1:STRADα:MO25α-Komplex (0,06 Einheiten) 20 Minuten lang inkubiert, und die Kügelchen wurden in einer Mikrozentrifuge (14.000 × g, 2 Minuten) entfernt. Die AMPKK-Aktivität wurde in den Überständen ermittelt und ist als Prozentsatz des Wertes ausgedrückt, der unter Verwendung der Kontroll-IgG erhalten wurde. (B) Die Pellets aus dem Experiment in (A) wurden im Originalvolumen resuspendiert und es wurden Proben der Überstände und der Pellets durch Western-Blotting mit Anti-LKB1-Antikörper analysiert. Die rekombinante LKB1 wandert wegen der GST-Markierung zu einer höheren Molekularmasse. (C) Gleicher Vorgang wie bei A mit der Ausnahme, dass die Menge von AMPKK1, AMPKK2 und des rekombinanten GST-LKB1-STRADα-MO25α-Komplexes auf 0,44, 0,70 bzw. 1,4 Einheiten erhöht wurde, und dass die Aktivitäten in den resuspendierten Pellets ermittelt wurden. Bei diesem Experiment war die Menge des Antikörpers limitierend, so dass nur ein Teil der Aktivität ausgefällt wurde. (D) Die Pellets aus dem Experiment (C) wurden resuspendiert und Proben wurden durch Western-Blotting mit Anti-LKB1-, Anti-STRADα- und Anti-MO25α-Antikörper analysiert.
15. Rekombinante LKB1-STRAD-MO25-Komplexe können in wirksamer Weise AMPK über eine Phosphorylierung bei Thr172 aktivieren. (1): Die angegebenen Kombinationen von mit GST markierten Wildtyp-LKB1 (WT, Spuren 1–9) oder kinasedead LKB1-Mutanten (D194A, KD, Spuren 10–13) oder nur GST (Spur 14) mit Flag-markierter STRADα oder STRADβ und myc-markiertem MO25α oder MO25β wurden in HEK-293T-Zellen ko-exprimiert, auf Glutathion-Sepharose gereinigt und hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, die katalytische Domäne von GST-AMKα1 zu aktivieren (oberer Kasten). Proben einer jeden Inkubation wurden auch durch Western-Blotting analysiert und unter Verwendung der angegebenen Antikörper untersucht (von oben nach unten): Anti-pT172, Anti-AMPKα1 katalytische Domäne (GST-α1), Anti-GST, um GST-LKB1 zu erkennen, Anti-FLAG, um STRADα und STRADβ und Anti-Myc, um MO25α und MO25β zu erkennen. Alle Proteine wanderten mit der erwarteten Beweglichkeit, wenn man die Epitop-Markierungen berücksichtigt. Die drei unteren Blots wurden an blanken Reaktionen durchgeführt, bei denen keine katalytische Domäne von GST-AMPKα1 vorhanden war, da es den Anschein hat, als ob diese die Detektion in gewisser Weise stören würde. (B) Rekombinanter GST-LKB1:STRADα:MO25α-Komplex wurde verwendet, um die katalytische Domäne von Wildtyp-GST-α1 (GST-α1-WT) oder von einem T172A-Mutanten (GST-α1T172A) unter Verwendung von [γ-³²]ATP zu phosphorylieren, wie dies unter „Verfahren" beschrieben ist. Das Reaktionsprodukt wurde durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Pfeile zeigen die Wanderung von GST-LKB1 (das autophosphoryliert) und der katalytischen Domäne von GST-α1.
16. Aktivierung und Phosphorylierung von heterotrimeren AMPK-Komplexen durch AMPKK1, AMPKK2 und rekombinante GST-LKB1:STRADα:MO25α-Komplexe. Kombinante α1β1γ1- oder α2β1γ1-Komplexe wurden 10 Minuten lang mit MgATP und AMPKK1 (2,8 oder 1,4 Einheiten/ml), AMPKK2 (10,3 oder 5,15 Einheiten/ml) oder GST-LKB1:STRADα:MO25α (14,3 oder 7,2 Einheiten/ml) inkubiert und die AMPK-Aktivität wurde ermittelt. Es wurde doppelt so viel vorgeschaltete Kinase zugegeben, wenn der α1β1γ1-Komplex das Substrat war, da Pilot-Experimente zeigten, dass er weniger leicht aktiviert werden konnte. Die Bilder stammen von Western-Blots, die mit phosphor-spezifischem Anti-pT172-Antikörper (oberer Kasten) und mit einer Mischung von Anti-α1- und -α2-Antikörpern untersucht wurden, um eine gleichförmige Beladung der α1β1γ1- oder α2β1γ1-Komplexe zu zeigen (es sei darauf hingewiesen, dass der Anti-α2-Antikröper selbst bei gleichen Protein-Beladungen immer ein stärkeres Signal gibt als Anti-α1).
17. Endogene AMPKK-Aktivität kann aus 293-Zellen unter Verwendung von Anti-LKB1 immuno-ausgefällt werden, doch kann Aktivität nur dann aus HeLa-Zellen immuno-ausgefällt werden, wenn sie in stabiler Weise LKB1 (aber nicht einen katalytisch inaktiven Mutanten) von einem induzierbaren Promotor exprimeren. LKB1 wurde aus 5 mg Zellextrakt immuno-ausgefällt, der aus nicht transfizierten HEK-293T-Zellen (Spuren 1, 2) nicht transfizierten HeLa-Zellen (Spuren 3, 4) oder HeLa-Zellen extrahiert worden waren, die von einem induzierbaren Promotor in stabiler Weise Wildtyp-LKB1 (WT) (Spuren 5, 6) oder einen kinase-dead (KD) Mutanten von LKB1 (D194A)-(Spuren 7, 8) exprimieren. Die Immuno-Ausfällung erfolgte mit Anti-LKB1 (Spuren 1, 3, 5, 7) oder einem Pre-immune-Kontroll-Immunoglobulin (IgG, Spuren 2, 4, 6, 8). Proben eines jeden Immuno-Präzipitats wurden verwendet, um die Aktivierung der katalytischen Domäne von GST-AMPKα1 zu untersuchen, um die Phosphorylierung der katalytischen Domäne von GST-AMPKα1 an Thr172 zu untersuchen (mittlerer Kasten), und um die Rückgewinnung von LKB1 zu ermitteln (unterer Kasten). Proben eines jeden Immuno-Präzipitats wurden auch bezüglich des Vorhandenseins von endogenem STRADα und MO25α mit geeigneten Antikörpern immuno-geblottet. Wie in dem oberen Kasten dargestellt, erhält man die Basisaktivität, wenn die katalytische Domäne von GST-AMPKα1 mit MgATP für sich allein (keine Zusätze) inkubiert wird.
18. Wiederherstellung der Fähigkeit von AMPK, durch AICA-Riboside und Phenformin in HeLa-Zellen durch die Expression von LKB1 aktiviert zu werden. Kontroll-HeLa-Zellen (Spuren 1, 2, 3), HeLa-Zellen, die Wildtyp-LKB1 exprimieren (WT) (Spuren 4, 5, 6) und kinase-dead (D194A, KD) mutante LKB1 (Spuren 7, 8, 9) wurden entweder unstimuliert gelassen oder mit 2 mM AICA-Riboside oder 10 mM Phenformin 60 Minuten lang behandelt und lysiert. (A) Endogene AMPK wurde aus den Zellextrakten immuno-ausgefällt und untersucht. (B) Die Zell-Lysate wurden mit Antikörpern immuno-geblottet, die AMPKα1 erkennen, das an Thr172 phosphoryliert ist, oder ganze AMPKα1; die Ergebnisse wurden unter Verwendung des LI-COR IR-Odyssesy^TM-Abbildungsgerätes analysiert wie unter „Materialien und Verfahren" beschrieben, und sind als Verhältnis der beiden Signale ausgedrückt. (C) Die Zell-Lysate wurden durch Western-Blotting analysiert und die Membranen mit Antikörpern untersucht, die ACC erkennen, das bei Ser-79 phosphoryliert ist, oder Streptavidin, um das gesamte AMPKα1 zu ermitteln. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung des LI-COR IR-Bildgerätes analysiert, wie in (B).
19. Sequenz-Ausrichtung der Aktivierungsschleifen-Sequenzen von Kinasen der AGC-Unterfamilie (PKAα und PKCα, von denen nicht angenommen wird, dass sie durch LKB1 aktiviert werden) mit den T-Schleifen-Residuen der AMPK/SNF1-Unterfamilie von Protein-Kinasen. Das Verfahren und die Darstellung sind so, wie in 1 beschrieben. Die Threonin-Residuen, die Thr172 von AMPK entsprechen („P") und andere Residuen, die im Text erwähnt sind, sind mit nach unten gerichteten Pfeilen angegeben. Alle Sequenzen stammen vom Menschen mit Ausnahme von AtSnRK1-α1, AtSnRK1-α2 und ScSnf1, bei denen es sich um die Homologe von AMPK von Arabidopsis thaliana (AtSnRK1, auf SNF1-bezogene Kinase-1) und Saccharomyces cerevisiae (ScSnf1) handelt. Obwohl von den vom Menschen und den von Arabidopsis und S. cerevisiae stammenden Homologen ebenso wie von den PKAα- und PKCα-Kinasen bekannt ist, dass sie durch die Phosphorylierung des Threonin-Residuen-Äquivalents an Thr172 aktiviert werden, muss doch gezeigt werden, ob die anderen Mitglieder der AMPK-Unterfamilie (NuaK1, NuaK2, BrsK1, BrsK2, SIK, QIK, QSK, MELK) durch Phosphorylierung dieses Residuums aktiviert werden und ob LKB1-STRAD-MO25-Komplexe diese Phosphorylierung vermitteln können.
20. K_m und V_max für ein Peptidsubstrat (als AMPKtide bezeichnet). Die Untersuchungsbedingungen sind in Beispiel 3 beschrieben.
21. Aktivierung von mit AMPK verwandten Kinasen durch LKB1. (A) Dendrogram und T-Schleifen-Sequenzen der AMPK-Unterfamilie von Protein-Kinasen (Manning et al, 2002). Die identischen Residuen sind schwarz schraffiert und die konservierten Residuen sind grau. Die T-Schleifen-Thr- und -Ser-Residuen sind mit einem Stern gekennzeichnet. (B) Die angegebenen mit AMPK verwandten Kinasen wurden mit Wildtyp-LKB1:STRAD:MO25-Komplexen (leere Quadrate) oder mit katalytisch inaktiven LKB1[D194A]:STRAD:MO25-Komplexen (nicht ausgefüllte Kreise) in Anwesenheit von Mg²⁺ und ATP inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten wurde die Aktivität von mit AMPK verwandten Kinasen mit dem AMARA-Peptid untersucht und die Ergebnisse sind als spezifische Aktivität ausgedrückt. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte ± SA (Standardabweichung) der dreifach ausgeführten Untersuchungen und sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Die Fehlerbalken sind nur dann dargestellt, wenn sie größer sind als die Größe der nicht ausgefüllten Quadrate.
22. Wirksame Aktivierung von mit AMPK verwandten Kinasen durch LKB1 erfordert STRAD- und MO25-Untereinheiten. Die angegebenen Kombinationen von mit GST markierten Wildtyp-LKB1 (WT, Spuren 1–9) oder katalytisch inaktivem LKB1 (D194A, Spuren 10–13) oder nur GST (Spur 14) mit FLAG-markierter STRADα oder STRADβ, und mit myc-markiertem MO25α oder MO25β wurden in HEK-293T-Zellen ko-exprimiert und auf Glutathion-Sepharose gereinigt. Die Komplexe wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, die katalytische Domäne von AMPKα1 oder den angegebenen, mit AMPK verwandten Kinasen zu aktivieren. Die Ergebnisse sind als spezifische Aktivität ausgedrückt, wobei das AMARA-Peptid als Substrat verwendet wurde. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SA von Untersuchungen dargestellt, die dreifach ausgeführt wurden und für zwei unabhängige Experimente repräsentativ sind. Proben von jeder Inkubation wurden auch durch Western-Blotting analysiert und unter Verwendung der angegebenen Antikörper (von oben nach unten) untersucht. Anti-GST um LKB1 zu erkennen, Anti-FLAG um STRADα und STRADβ zu erkennen, und Anti-Myc um MO25α und MO25β zu erkennen. Alle Proteine wanderten mit der erwarteten Beweglichkeit, wenn man die Epitop-Markierungen berücksichtigt.
23. Das T-Schleifen-Thr ist die Hauptstelle der LKB1-Phosphorylierung an den mit AMPK verwandten Kinasen. Wildtyp-Formen (WT) und Mutanten von T-Schleifen-Thr zu Ala (Thr → Ala) der angegebenen mit GST-AMPK verwandten Kinasen wurden mit dem LKB1:STRAD:MO25-Komplex in Anwesenheit von Mg²⁺ und [γ ³²P] ATP inkubiert. Die Phosphorylierung der Protein-Substrate wurde durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-Gel und nachfolgende Autoradiographie der mit Coomassie Blue gefärbten Bänder entsprechend einem jeden Substrat ermittelt. Eine gleiche Menge einer jeden Inkubation wurde auch durch Western-Blotting mit einem Anti-HA-Antikörper analysiert, um eine gleiche Beladung von mit AMPK verwandten Kinasen vom Wildtyp und ihrer Mutanten, sicherzustellen (von denen alle eine HA-Epitop-Markierung besitzen). Alle Proteine wanderten mit der erwarteten Beweglichkeit, wenn die man die Epitop-Markierungen berücksichtigt. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei getrennten Experimenten erzielt.
24. Einfluss der Mutation des Thr in der T-Schleife auf die Aktivierung von mit AMPK verwandten Kinasen durch LKB1. Die angegebenen mit AMPK verwandten Kinasen vom Wildtyp oder die Mutanten dieser Enzyme, bei denen das Thr der T-Schleife entweder in Ala (T/A) oder Glu (T/E) verändert war, wurden in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) von Wildtyp-LKB1:STRAD:MO25 in Anwesenheit von Mg²⁺ und ATP inkubiert. Nach 30 Minuten wurden die mit AMPK verwandten Kinasen mit dem AMARA-Peptid untersucht, und die Ergebnisse sind als spezifische Aktivität ausgedrückt. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte ± SA der dreifach ausgeführten Untersuchungen und sind für zwei unabhängige Experimente repräsentativ. Gleiche Mengen einer jeden Inkubation wurden auch durch Western-Blotting mit einem Anti-HA-Antikörper analysiert, um eine gleiche Beladung der mit AMPK verwandten Kinasen vom Wildtyp und der entsprechenden Mutanten sicherzustellen (die alle eine HA-Markierung tragen).
25. Analyse der Phosphorylierung und Aktivierung von MARK-Kinasen. (A) Katalytisch inaktive MARK3 [D196A] (KI), die nicht autophosphorylieren kann, und die angegebenen Mutanten wurden mit dem LKB1-Komplex 30 Minuten lang mit Mg²⁺-[γ ³²P]ATP inkubiert und durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-Gel getrennt, das dann autoradiographiert wurde. Die mit ³²P markierten MARK3-Proteine wurden mit Trypsin aufgeschlossen und die sich ergebenden mit ³²P markierten Peptide wurden auf einer C₁₈-Säule chromatographiert. Fraktionen, welche das mit ³²P markierte, tryptische T-Schleifen-Peptid enthalten (Peptide P_A und P_B) sind dargestellt. (B) Die Peptide P_A und P_B wurden einer Festphasen-Sequenzierung unterzogen und die ³²P-Radioaktivität wurde nach jedem Zyklus einer Edman-Degradation gemessen. In Kombination mit MALDI TOF-TOF-Massenspektrometrie ermöglichte dies die Identifizierung der in jedem Peptid phosphorylierten Stellen. Die Peptide P_A umfassen das MARK3-T-Schleifen-Peptid phosphoryliert bei Thr211 und Ser215, und die Peptide P_B das MARK3-T-Schleifen-Peptid phosphoryliert bei Thr211. (C-F) Die angegebenen Wildtyp-Formen (WT) oder Mutanten von MARK-Kinasen, bei denen das T-Schleifen-Thr oder das Ser entweder zu Ala (T/A, S/A) oder Glu (T/E, S/E) mutiert war, wurden in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) vom Wildtyp-LKB1:STRAD:MO25 in Anwesenheit von Mg²⁺ und ATP inkubiert. Nach 30 Minuten wurden die MARK-Kinasen unter Verwendung des AMARA-Peptids untersucht, und die Ergebnisse sind als spezifische Aktivität dargestellt. Gleiche Mengen einer jeden Inkubation wurden ebenfalls durch Western-Blotting mit einem Anti-HA-Antikörper analysiert, um eine gleichförmige Beladung der MARK-Kinasen vom Wildtyp und ihrer Mutanten sicherzustellen (von denen alle eine HA-Epitop-Markierung tragen). Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte ± SA einer Dreifach-Untersuchung und die Ergebnisse sind repräsentativ für wenigstens zwei unabhängige Experimente (G) MARK4 wurde mit dem LKB1-Komplex so wie in (A) phosphoryliert und das mit ³²P-markierte Hauptpeptid wurde durch Festphasen-Edman-Sequenzierung wie in (B) analysiert. In Kombination mit einer MAIDI TOF-TOF-Massenspektrometrie (30C) wurde gezeigt, dass dieses Peptid die T-Schleife von MARK4 umfasst, die nur am Thr-Residuum phosphoryliert ist.
26. Identifizierung von Peptid-Substraten für LKB1. (A) Eine kinetische Analyse der Phosphorylierung der angegebenen T-Schleife durch den LKB1:STRAD:MO25-Komplex wurde durchgeführt. Das T-Schleifen-Thr-Residuum in jedem Peptid ist unterstrichen und fett gedruckt und 3 Arg-Residuen wurden dem C-Terminus eines jeden T-Schleifen-Peptids hinzugefügt, um ihre Erfassung auf Fotozellulose-p81-Papier zu ermöglichen. Die K_m- und V_max-Werte wurden aus der nichtlinearen Regression ermittelt. (B) Gleiche Mengen eines jeden durch den LKB1-Komplex phosphorylierten Peptids wurden einer Festphasen-Edman-Sequenzierung unterzogen, und die ³²P-Radioaktivität wurde nach jedem Zyklus der Edman-Degradation gemessen. Ein kleiner Anteil eines jeden Peptids kann an die Sequelon-Arylamin-Membran durch saure interne Asp und Glu-Residuen statt durch ihre C-terminalen Carboxyl-Gruppen gekoppelt werden. Dies trägt zu der offensichtlich geringen Freisetzung von ³²P-Radioaktivität bei, die bei manchen Asp- und Glu-Residuen beobachtet wird. (C) Die gleichen Kombinationen von mit GST markierten Wildtyp-LKB1 (WT, Spuren 1–9) oder katalytisch inaktiver LKB1 (D194A, Spuren 10–13) oder nur GST (Spur 14), mit FLAG markiertem STRADα oder STRADβ und mit Myc markiertem MO25α oder MO25β, wie in 22 verwendet, wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, die angegebenen Peptide zu phosphorylieren (Peptid-Konzentration 200 μM). Die Ergebnisse sind als Dipeptid-Kinasen-Aktivität ausgedrückt, die pro mg von LKB1:STRAD:MO25 erzeugt wurde, das den Versuchen zugegeben wurde. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte ± SA von drei Untersuchungen und sind repräsentativ für wenigstens zwei unabhängige Experimente.
27. Aktivität von mit AMPK verwandten Kinasen in LKB1^+/+ und LKB1^–/–-MEFs. LKB1^+/+ oder LKB1^–/– wurden entweder unbehandelt gelassen (schwarze Balken) oder mit 10 mM Phenformin (Phen, weiße Balken) eine Stunde lang stimuliert. AMPKα1 und mit AMPK verwandte Kinasen wurden aus den Zell-Lysaten immuno-ausgefällt und in vitro wurde die Kinasen-Aktivität bezüglich des AMARA-Peptids gemessen, wie in „Materialien und Methoden" beschrieben (Beispiel 4). Um eine gleiche Expression der Kinase in jeder Probe zu bestätigen, wurden Zell-Lysate (AMPKα1, NUAK2, MARK2/3 und MARK4) oder immuno-ausgefällte Proteine (QIK, QSK, SIK und MARK1) einer SDS-PAGE- und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Alle mit AMPK verwandten Kinasen wanderten mit der erwarteten molekularen Masse. Im Fall von AMPKα1 wurden die Zell-Lysate mit einem Phosphor-Thr172-Antikörper (P-AMPK) immuno-geblottet, der die phosphorylierte C-Schleife erkennt. Ein Kontroll-Immuno-Blot von LKB1-Pegeln in Zell-Lysaten ist im Block B ebenfalls dargestellt. Die gezeigten Ergebnisse sind Mittelwerte +SA von 2 bis 4 Untersuchungen und sind repräsentativ für wenigstens zwei unabhängige Experimente.
28. AICA-Riboside aktiviert mit AMPK verwandte Kinasen nicht. (A) LKB1^+/+-MEFs wurden entweder unbehandelt gelassen oder mit den angegebenen Konzentrationen von Phenformin (Phen) eine Stunde lang stimuliert. AMPKα1/α2 und LKB1 wurden aus den Zell-Lysaten immuno-ausgefällt und die in vitro auftretende Kinase-Aktivität bezüglich des AMARA- bzw. LKBtide-Peptids wurden gemessen, wie in „Materialien und Methoden" beschrieben (Beispiel 4). (B) Um eine gleiche Expression der Kinase in jeder Probe zu bestätigen, wurden Zell-Lysate einer SOS-PAGE- und Western-Blot-Analyse mit den angegebenen Antikörpern unterzogen. Der Phosphor-pT172-Antikörper (P-AMPK) erkennt die phosphorylierte T-Schleife von AMPKα1. Die Ergebnisse sind als die Mittelwerte ± SA für eine Dreifach-Untersuchung dargestellt und sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. (C) LKB1^+/+-MEFs wurden entweder unbehandelt gelassen (schwarze Balken) oder mit 2 mM AICA-Riboside (AICAR, weiße Balken) eine Stunde lang stimuliert. AMPKα1 und die angegebenen mit AMPK verwandten Kinasen wurden aus den Zell-Lysaten immuno-ausgefällt und es wurde die in vitro auftretende Kinase-Aktivität bezüglich des AMARA-Peptids gemessen, wie dies in „Materialen und Methoden" beschrieben ist. Die Ergebnisse sind als Prozent-Werte bezüglich der Aktivität dargestellt, die in nicht stimulierten Zellen beobachtet wurde, und sind Mittelwerte +SEM von zwei unabhängigen Experimenten. 100 entspricht den folgenden, absoluten Aktivitäten; AMPKα1; 135 mU/mg, NUAK2; 0,25 mU/mg, QIK; 0,76 mU/mg, SIK; 2,73 mU/Mg; MARK1; 0,14 mU/mg, MARK2/3; 3,5 mU/mg und MARK4; 1,6 mU/mg. (D) Ein Immuno-Blotting von AMPK wurde wie im Teil A beschrieben durchgeführt.
29. Aktivität von mit AMPK verwandten Kinasen in HeLa-Zellen. Kontroll-HeLa-Zellen, die keine LKB1-Expression aufwiesen (–) oder HeLa-Zellen die in stabiler Weise Wildtyp-LKB1 (WT) oder kinase-inaktivtes LKB1 (KI) exprimieren, wurden unbehandelt gelassen (schwarze Balken) oder mit 10 mM Phenformin (Phen, weiße Balken) eine Stunde lang stimuliert. AMPKα1 und mit AMPK verwandte Kinasen wurden aus den Zell-Lysaten immuno-ausgefällt und die in vitro auftretende Kinase-Aktivität bezüglich des AMARA-Peptids wurde gemessen, wie in „Materialien und Methoden" beschrieben (Beispiel 4). Um eine gleiche Expression der Kinasen in jeder Probe zu bestätigen, wurden die Zell-Lysate (AMPKα1, MARK2/3 und MARK4) oder die immuno-ausgefällten Proteine (NUAK2, QIK, QSK, SIK und MARK1) SDS-PAGE- und Western-Immunoblot-Analysen unterzogen. Alle mit AMPK verwandten Kinasen wanderten mit der erwarteten molekularen Masse. Im Fall von AMPKα1 wurden Zell-Lysate mit einem pThr172-Antikörper (P-AMPK) immuno-geblottet, der die phosphorylierte T-Schleife erkennt. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte +SA von 2 bis 4 Untersuchungen und sind repräsentativ für wenigstens zwei unabhängige Experimente.
30. Analyse der Phosphorylierung von BRSK2, NUAK2 und MARK4 und MELK. (A) Katalytisch inaktive Mutanten von BRSK2[D159A] und NUAK2[D193A], die zur Autophosphorylierung unfähig sind, wurden mit dem LKB1-Komplex 30 Minuten mit Mg² ⁺-[γ³²P]ATP inkubiert und durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-Gel getrennt, das dann autoradiographiert wurde. Die mit ³²P markierten Proteine wurden mit Trypsin aufgeschlossen und die sich ergebenden Peptide wurden auf einer C₁₈-Säule chromatographiert. Fraktionen, welche die mit ³²P markierten Hauptpeptide enthalten, sind markiert. (B) Peptide P₁, P₂ und P₃ wurden einer Festphasen-Sequenzierung unterworfen und die ³²P-Radioaktivität wurde nach jedem Zyklus der Edman-Degradation gemessen. Wir waren nicht in der Lage, die Identität des NUAK2-Peptids zu ermitteln, das mit „?" gekennzeichnet ist. (C) Die angegebenen Peptide wurden durch MALDI TOF-TOF-Massenspektrometrie analysiert, wie oben beschrieben. Die abgeleitete Aminosäuren-Sequenz und die Stelle der Phosphorylierung sind angegeben, zusammen mit der beobachteten und der theoretischen Masse. Das mit „MARK4" gekennzeichnete Peptid wurde von MARK4 abgeleitet, das durch LKB1 phosphoryliert war, wie in der Legende von 25G beschrieben. Dieses Peptid umschließt das T-Schleifen-Motiv von MARK4, das nur am Thr-Residuum phosphoryliert ist. Das mit „MELK" bezeichnete Peptid ist von einem tryptischen Abbauprodukt von nicht markierter MELK abgeleitet, die von E. coli exprimiert und gereinigt wurde, wie oben beschrieben. Dieses Peptid umfasst die T-Schleife von MELK, phosphoryliert an dem Thr-Residuum. Abkürzungen: m, Methioninsulfon; (p) zeigt an, dass das vorausgehende Thr-Residuum phosphoryliert ist.
Beispiel 1: MO25-Isoformen treten mit den mit STE20 verwandten Pseudokinasen STRADα/β in Wechselwirkung und erhöhen deren Fähigkeit, den LKB1-Tumor-Suppressor im Zytoplasma zu binden, zu aktivieren und zu lokalisieren
Mutationen in der LKB1-Protein-Kinase führen zu dem vererbten Peutz-Jeghers-Krebs-Syndrom. Die Forschung hat bis heute gezeigt, das LKB1 als Tumor-Unterdrückungs-Protein wirkt, doch ist wenig darüber bekannt, wie LKB1 reguliert wird. Jüngste Arbeiten enthüllten, das LKB1 durch seine Wechselwirkung mit einer mit STE20 in Beziehung stehenden, katalytisch inaktiven Pseudokinase aktiviert werden kann, die als STRADα bezeichnet wird, und dass diese Wechselwirkung erforderlich war, damit LKB1 das Zell-Wachstum unterdrückte. In diesem Beispiel haben wir gefunden, dass der endogene LKB1-STRADα-Komplex, der aus einer Reihe von Säugetier-Zellen immuno-ausgefällt wird, auch mit einem 40-kDa-Protein unbekannter Funktion in Verbindung steht, das nicht identifizierbare funktionale Domänen enthält und als MO25α bezeichnet wird. Wir zeigen, das MO25α sich nicht direkt an LKB1 bindet, sondern stattdessen mit LKB1 durch dessen Wechselwirkung mit STRADα assoziiert ist. MO25α erkennt insbesondere die letzten drei Residuen von STRADα (Trp-Glu-Phe), da eine Mutation oder eine Abtrennung dieser drei Aminosäuren die Wechselwirkung von STRADα mit MO25α aufhebt. Zelluläre Lokalisationsstudien zeigen, dass MO25α und STRADα einen zytoplasmischen Komplex bilden, der LKB1 im Zytoplasma verankert und es aus dem Zellkern ausschließt. Die Menge von LKB1, die STRADα in Zellen zugeordnet ist, wird deutlich durch Überexpression von MO25α erhöht, was darauf hinweist, dass MO25α die Ausbildung des LKB1-STRADα-Komplexes in vivo verstärkt. Wir zeigen auch, dass die Assoziierung von LKB1 mit STRADα und MO25α die katalytische Aktivität von LKB1 um nahezu das 10-fache stimuliert. Darüber hinaus liefern wir Beweise dafür, dass die eng verwandte Isoform von STRADα (auch als ILPIP- oder PAP-Kinase bekannt), die wir mit STRADβ bezeichnen, und MO25β-Isoformen ebenfalls in der Lage sind, LKB1 in einem aktiven Komplex zu stabilisieren, und wir zeigen, dass es möglich ist, heterotrimere Komplexe von LKB1 gebunden an STRAD und MO25-Isoformen zu isolieren, in denen die Untereinheiten in äquimolaren Mengen vorhanden sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das MO25 als Gerüstkomponente des LKB1-STRAD-Komplexes dienen und eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der LKB1-Aktivität und der zellulären Lokalisation spielen kann, die durch seine Wechselwirkung mit den STRAD-Pseudokinasen vermittelt wird.
Ergebnisse
Identifizierung von MO25α in einem LKB1-Komplex
Um die Proteine zu identifizieren, die mit LKB1 assoziiert sind, haben wir zuvor beschriebene HeLa-Zellen verwendet, die in stabiler Weise niedrige Pegel entweder des Wildtyps von LKB1 oder des katalytisch inaktiven LKB1 mit einer N-terminalen FLAG-Epitop-Markierung exprimieren, um eine leichte Immuno-Reinigung der mit LKB1 assoziierten Proteine unter Verwendung des FLAG-Antikörpers zu ermöglichen (Boudeau et al., 2003a). Flag-LKB1 wurde von einhundert Scheiben mit einem Durchmesser von 10 cm mit HeLa-Zell-Lysat immuno-gereinigt, das von den Zellen abgeleitet worden war, die Wildtyp-LKB1 oder kinase-dead LKB1 exprimieren, oder von der zur Kontrolle dienenden parentalen HeLa-Zell-Linie, die LKB1 nicht exprimiert (siehe „Materialien und Methoden"). Die Zubereitungen wurden einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-Gel unterworfen, das mit Kolloidal-Blau gefärbt wurde (1A). Eine Probe der kinase-dead LKB1-Zubereitung wurde auch weiter konzentriert, um eine bessere optische Darstellung der in geringerer Menge vorhandenen Proteine zu ermöglichen. Es wurden mehrere Bänder beobachtet, die sowohl bei den Wildtyp- als auch den Kinase-dead-LKB1-Zubereitungen nicht aber in der Kontrollprobe vorhanden waren (1A). Die Identität der mit Kolloidal-Blau gefärbten Bänder, die in 1A markiert sind, wurde durch tryptische Peptid-Massen-Spektral-Fingerprint-Verfahren nachgewiesen (1B) und durch Immuno-Blotting mit geeigneten Antikörpern (1C) bestätigt. Es wurden Proteine entdeckt, von denen schon zuvor nachgewiesen wurde, dass sie mit LKB1 in Verbindung stehen, einschließlich den Hsp90- und Cdc37-Chaperon-Proteinen (Boudeau et al., 2003a) und ebenso STRADα (Bass et al., 2003). Zusätzlich wurde ein Protein von ~40 kDa, das als MO25α identifiziert wurde, gemeinsam sowohl mit dem Wildtyp-LKB1 als auch dem kinase-dead LKB1 immunogereinigt, doch war es in der Kontroll-Reinigung (1A und 1C) nicht vorhanden.

Zunächst wurde MO25α als Protein identifiziert, das im frühen Teilungsstadium der Embryonalentwicklung von Mäusen genetisch exprimiert wird (Miyamoto et al., 1993) und es wurde gezeigt, dass es ein hoch evolutionäres, konserviertes Protein ist (Karos und Fischer, 1999; Nozaki et al., 1996), dem keine zelluläre Funktion zugeschrieben worden war. Aus der Analyse von Datenbanken haben wir eine eng verwandte Isoform von MO25α identifiziert, die wir als MO25β bezeichneten, und eine Sequenzausrichtung von beiden MO25-Isoformen zusammen mit ihren vermutlichen Homologen in Drosophila und C. elegans ist in 2A dargestellt. Eine Northern-Blot-Analyse zeigte, dass MO25α in menschlichen Geweben im umfangreichen Maße exprimiert wird, wobei die höchsten Pegel der Expression in Skelettmuskeln auftreten (2B). Eine Immuno-Blot-Analyse unter Verwendung eines gegen das MO25α-Protein erzeugten Antikörpers, der keine Kreuzreaktion mit MO25β zeigt (2C und D), und die Analyse von EST-Datenbanken (Tabelle 1) bestätigten, dass MO25α in vielen Geweben und Zell-Linien exprimiert wird. Obwohl wir durch eine Northern-Blot-Analyse keine signifikanten Pegel von MO25β-RNA entdecken konnten, wies ein Immuno-Blotting, bei dem ein gegen das MO25β-Protein erzeugter Antikörper, der keine Kreuzreaktion mit MO25α zeigte, darauf hin, dass MO25β auch in einer Vielzahl von Geweben und getesteten Zell-Linien exprimiert wird (2D). Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass MO25β-EST-Sequenzen in einer Reihe von menschlichen Geweben identifiziert wurden (Tabelle 1). Es kann jedoch sein, dass die Expression von MO25β stärker eingeschränkt ist als die von MO25α, da sie nicht in der Leber und einigen Zell-Linien detektiert wurde, einschließlich den HeLa-Zellen (2D), was vielleicht erklärt, warum es nicht mit dem in diesen Zellen exprimierten LKB1 ko-gereinigt wurde (1). Tabelle 1. Gewebeursprung von ESTs, die menschliches MO25α und MO25β kodieren.

Protein		Gewebe NCBI-Zugangsnummer

MO25α	Zwölffingerdarm-AdenokarzInom	NM_016289
	Leiomyosarkom	BM474393, BU167673, BE884976
	Embryonalkarzinom	BQ433499, BM905560, BG259357
	Plattenepithelkarzinom	BG679680
	Melanotisches Melanom	BQ432236
	Brust-AdenokarzInom	BM013638, BG034567
	Chronische Iymphotische Leukämie	AI760873
	Ductalkarzinom	BU190932
	Osteosarcom	BG108474
	AdenokarzInom	BG250662. BG121835, AW188515
	Metastatisches Chondrosarkom	CA436298
	EpithelioidkarzInom	BQ433038
	Retinoblastom	BM480142
	Neuroblastom	BE383169
	Uterustumor	BF095794
	Melanotisches Melanom	BE891921, BQ231688
	Astrozytom	BM913690, BM560554
	Übergangs-Zell-Papillom	G260085
	Hauttumor	AA379224
	Hoden	BG773506, BG719459
	Grenzstrang	BQ718408
	Knochenmark	BI019682, BI019684
	Normal pigmentiertes Retinaleplthelium	BG750933, BM050770
	Nacken	BI089979
	Hypothalamus	AV722015, AV729226
	Fötales Gehirn	BM927264, AA351866
	Alternde Fibroblastsen	W47588
	Kindergehirn	AA434013, R21390, R46486
	Keimzentrum-B-Zellen	AA280522. AA280264, AA262054
	Eierstocktumor	AA442950, AA165271, AA164403
	Plazenta	R67490, R66347, BG435220
	Osteosarkom	BG025988
	Brust, normal	BE004664, AW373436
	Fötale Leber und Milz	T86658, T86848
	Nacken	BE538532
	Magen	BM822360, BM833391, BM766941
	Fötale Augen	BM711209
	Gereinigte Bauchspeicheldrüsen-Insel	8BU079122, 8BU078843
	Prostata, normal	BE835801
	Lunge	BM979124, BM982100, BM985320
	Niere	AW235071, AA961 656

MO25β	Prostata	BF680686
	Plazenta, Choriokarzinom	BC010993, BE281207, BF107447
	Teratokarzinom	AU125107, AU148840, AK022639
	Nebenschilddrüsentumor	W37952
	Ischiasnerv	BQ899617
	Keimzentrum-B-Zellen	AA278473, AA279145
	Lungentumor	BF879769
	Epiderrnoidkarzinom	B0669953
	Lunge, normal	BF845952, BE042886,
	Dickdarm	BE928225, AW008806
	Metastatisches Chondrosarkom	BQ021348
	Fibrosarkom	CA441154
	Niere	AW242839
	Magen	BM820071, BM831835, BM822014
	Leber und Milz	AI247543
	Hoden	AA781806
	Bauchspeicheldrüse	AI956166
	Retina	AA001436, AA018841

Endogenes MO25α ist in einem Komplex mit endogenem LKB1 vorhanden. Als nächstes führten wir eine Immuno-Ausfällung von endogenem LKB1 aus 293-Zellen (3A, linker Kasten) oder Rat-2-Zellen aus (3A, rechter Kasten), worauf ein Immuno-Blotting hinsichtlich LKB1, STRADα und MO25α erfolgte. Die Experimente zeigten, dass sowohl MO25α als auch STRADα gemeinsam mit LKB1 immuno-ausgefällt wurden, aber nicht mit Preimmun-IgG. Wir führten auch eine Immuno-Präzipitation von endogenem MO25α aus 293-Zellen (3B, linker Kasten) oder Rat-2-Zellen durch (3B, rechter Kasten) und führten ein Immuno-Blotting hinsichtlich der Anwesenheit von LKB1, STRADα und MO25α durch (3B). Endogenes LKB1 und STRADα wurden gemeinsam mit MO25α immuno-ausgefällt, aber nicht mit Preimmun-IgG, was mit der Erkenntnis übereinstimmt, dass diese Proteine einen Komplex bilden.
MO25 steht in Wechselwirkung mit STRAD statt mit LKB1.
Um zu verifizieren, welche Komponente des LKB1-STRAD-Komplexes mit MO25α in Wechselwirkung tritt, ko-transfizierten wir 293-Zellen mit Konstrukten, die MO25α und entweder mit N-terminaler Glutathion-S-Transferase (GST) markiertes LKB1, STRADα oder die eng verwandte Pseudokinase STRADβ ebenso exprimieren wie Cdc37, ein Chaperon, von dem zuvor gezeigt worden war, dass es sich an LKB1 bindet (Boudeau et al., 2003a). Eine Sequenz-Ausrichtung von STRADα und STRADβ ist in 10 dargestellt, und beiden fehlen die gleichen konservierten Schlüssel-Residuen in den Sub-Domänen VI und VII in der Kinase-Domäne, die für eine Katalyse erforderlich sind. Die mit GST markierten Proteine wurden affinitäts-gereinigt und in Bezug auf MO25α immuno-geblottet (4A). Wir fanden, dass MO25α nur mit STRADα und STRADβ aber nicht mit LKB1 oder Cdc37 in Wechselwirkung tritt.
Als nächstes exprimierten wir LKB1 in 293-Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von STRADα, und die Protein-Zusammensetzung des affinitäts-gereinigten LKB1 wurde analysiert, worauf eine Elektrophorese und eine Anfärbung mit Kolloidal-Blau erfolgte. Wie erwartet, wurde STRADα zusammen mit LKB1 ko-gereinigt. Es wurde jedoch zusätzlich ein nur schwach färbendes Band im LKB1-STRADα-Komplex beobachtet, das einem endogenen Protein von ~40 kDa entsprach und das in der keinen Komplex aufweisenden LKB1-Zubereitungen nicht vorhanden war. Eine Massen-Spektral-Fingerabdrucks-Untersuchung mit tryptischen Peptid zeigte, dass dieses Protein endogenem MO25α entspricht. Dies wurde durch ein Immuno-Blotting mit einem Anti-MO25α-Antikörper (4B) bestätigt, was weiter darauf hinwies, dass MO25α mit LKB1 durch STRADα assoziiert ist. In 4C zeigten wir durch die Durchführung entsprechender Ko-Transfektionen, dass es möglich ist, einen heterotrimeren LKB1-Komplex zu reinigen, in welchem LKB1, STRADα und MO25α in äquivalenten, äquimolaren Anteilen vorhanden sind. Wir zeigen auch, dass es möglich ist, ähnliche Komplexe aus LKB1-STRADα-MO25β, LKB1-STRADβ-MO25α und LKB1-STRADβ-MO25β (4C) zu bilden, was darauf hinweist, dass beide Isoformen von STRAD und MO25 in der Lage sind, sich sowohl aneinander als auch an LKB1 zu binden.
MO25α arbeitet mit STRADα zusammen, um LKB1 im Zytoplasma zu lokalisieren
Kürzlich wurde gezeigt, dass die Zytoplasma-Fraktion von LKB1 einen G1-Zellen-Halt steuert (Tiainen et al., 2002). Daher waren wir daran interessiert, zu untersuchen, wie die Bildung eines Komplexes von LKB1, STRADα und MO25α die Lokalisierung dieses Proteins beeinflusste. Es wurden HeLa-Zellen mit Kombinationen von markiertem MO25α, STRADα und LKB1 transfiziert, und diese Proteine wurden in den Zellen durch konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie sichtbar gemacht, wobei die MO25α-, STRADα- und LKB1-Proteine voneinander unabhängig in der gleichen Zelle erkannt werden konnten. MO25α (5A) und STRADα (5E) für sich alleine exprimiert, waren im gesamten Zytoplasma und Nukleus lokalisiert. Erstaunlicherweise waren jedoch dann, wenn MO25α und STRADα gemeinsam exprimiert wurden, beide Proteine im Zytoplasma re-lokalisiert und aus dem Kern ausgeschlossen (5G und 5H). Wie zuvor berichtet, war alleine exprimiertes LKB1 in COS-Zellen hauptsächlich im Kern (5L), und eine Ko-Expression mit STRADα förderte in signifikanter Weise die zytoplasmische Lokalisation von LKB1, doch verbleiben unter diesen Bedingungen signifikante Mengen von LKB1 im Kern (50) (Bass et al., 2003). In der Anwesenheit sowohl von MO25α als auch STRADα war LKB1 im Wesentlichen nur im Zytoplasma lokalisiert und aus dem Kern so gut wie ausgeschlossen (5R). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass MO25α und STRADα einen Komplex bilden, der LKB1 wirksamer im Zytoplasma verankert, als STRADα allein.
MO25α erkennt die letzten drei Residuen von STRADα.
Um die Bindungsstelle von MO25α an STRADα zu definieren, wurde eine Reihe von Beseitigungs-Mutationen von STRADα hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, mit MO25α in einer Ko-Transfektions-Bindungs-Untersuchung zu Wechselwirken. Erstaunlicherweise zerstörte die Beseitigung von nur den letzten drei Aminosäuren von STRADα (Trp-Glu-Phe) die Bindung von MO25α an STRADα. Darüber hinaus verminderte auch eine Mutation des C-terminalen Trp-Residuums zu Phe in weitem Ausmaß die Bindung von MO25α an STRADα (6A). Wir testeten dann, ob es möglich war, endogen exprimiertes MO25α aus drei verschiedenen Säugetierzellen-Lysaten durch Affinitäts-Reinigung zu erhalten, wobei biotinylierte Peptide verwendet wurden, welche die C-terminalen Residuen von STRADα konjugiert zu Streptavidin-Sepharose umgeben. Wir fanden, dass ein Peptid, das die 12 C-terminalen Residuen (6B) aber nicht die letzten 6 Residuen (Daten nicht gezeigt und 6C) von STRADα umgibt, in wirksamer Weise aus allen untersuchten Zell-Lysaten endogenes MO25α reinigte (6B). Um noch weiter die MO25α-Bindestelle an dem STRADα-Peptid zu beschreiben, führten wir einen Alanin-Scan durch, wobei jedes Residuum des Peptids individuell zu Ala mutiert wurde und verifizierten, in welcher Weise dies die Bindung an MO25α beeinflusste (6B). In Konsistenz damit, dass die Trp-Glu-Phe-Residuen für eine MO25α-Erkennung erforderlich sind, zerstörte eine Mutation von irgendeinem dieser drei Residuen in dem C-terminalen STRADα-Peptid die MO25α-Bindung in drei verschiedenen Zell-Lysaten oder verminderten sie in sehr starkem Maße, während eine Mutation der anderen Residuen die Bindung entweder nicht beeinflusste oder nur einen sehr geringen Effekt zeigte. Diese Befunde wurden auch durch eine mehr quantitative Oberflächen-Plasmon-Resonanz-BiaCore-Eindungs-Untersuchung bestätigt (6C).
Bindung von LKB1 an STRADα erzeugt wenigstens eine neue Bindungsstelle für MO25α.
Als nächstes untersuchten wir, wie die Bindung von LKB1 an STRADα die Wechselwirkung mit MO25α beeinflusst, wobei wir eine Ko-Expressions-Bindungs-Untersuchung in 293-Zellen verwendeten, bei der die volle Länge besitzende Wildtyp-GST-STRADα und Tilgungs-Mutanten hiervon in Anwesenheit oder Abwesenheit von MO25α und LKB1 ko-exprimiert wurden. In Konsistenz mit früheren Feststellungen banden STRADα-Mutanten, denen entweder die C-terminalen 12 oder 48 Residuen fehlten, in Abwesenheit von LKB1 das MO25α nicht (7, Kasten 1). Erstaunlicherweise wurde jedoch dann, wenn diese STRADα-Mutanten gemeinsam mit LKB1 ko-exprimiert wurden, MO25α in den gereinigten Komplexen gefunden (7, Kasten 2), was anzeigt, dass die Bindung von LKB1 an STRADα wenigstens eine zusätzliche Bindungsstelle für MO25α innerhalb des LKB1-STRADα-Komplexes erzeugt. Wir erkannten auch in konsistenter Weise, dass die Menge von LKB1, die in den GST-STRADα-Ausfällungen enthalten war, in Anwesenheit von MO25α signifikant höher war (7, vergleiche Kästen 2 und 3), was darauf hinweist, dass MO25α möglicherweise die Ausbildung eines heterotrimeren LKB1-Komplexes stabilisiert. Darüber hinaus trat ein katalytisches Fragment von LKB1, das nur die Kinase-Domäne (Residuen 44–343) umfasst, mit STRADα in Anwesenheit von MO25α in wesentlich wirksamerer Weise in Wechselwirkung (7, vergleiche Kästen 4 und 5). Diese Beobachtungen zeigen, dass MO25α den LKB1-STRADα-Komplex dadurch stabilisiert, dass es eine oder mehrere zusätzliche MO25α-Bindestellen an STRADα und/oder LKB1 erzeugt. Ein Mutant von STRADα, dem die C-terminalen 88 Residuen fehlten, was einen Bereich der Pseudokinasen-Domäne abschneidet, war nicht länger in der Lage, mit LKB1 oder MO25α in Wechselwirkung zu treten, wenn diese Proteine gemeinsam exprimiert wurden (7). Dies deutet darauf hin, dass entweder eine sekundäre MO25α-Bindungsstelle zum C-Terminus von STRADα hin lokalisiert ist, oder dass die Integrität der Pseudokinasen-Domäne, die durch das Abschneiden der 88 C-terminalen Residuen von STRADα unterbrochen wird, erforderlich ist, um eine Ausbildung des heterotrimeren LKB1-STRADα-MO25α-Komplexes zu ermöglichen.
Weitere Beweise, dass MO25 den LKB1-STRAD-Komplex stabilisiert.
Um weitere Beweise zu erhalten, das MO25α die Bindung von LKB1 an STRADα stabilisieren kann, wurden 293-Zellen mit Konstrukten ko-transfiziert, die LKB1 und STRADα in Abwesenheit oder in Anwesenheit von zunehmenden Mengen des MO25α-DNA-Konstrukts exprimieren. LKB1 wurde gereinigt und die Mengen von assoziiertem STRADα und MO25α wurden durch Immuno-Blotting gemessen. Als Kontrolle wurden auch die Expressionspegel von LKB1, STRADα und MO25α in den Zell-Lysaten vor der Affinitäts-Reinigung von LKB1 gemessen. In Abwesenheit von MO25α war eine mäßige Menge von STRADα mit LKB1 assoziiert, was dadurch in einer von der Dosis abhängigen Weise deutlich erhöht wurde, dass die Expression von MO25α erhöht wurde, (8A, oberer Kasten). Eine erhöhte Assoziation von STRADα mit LKB1 beruhte nicht auf einer erhöhten Expression von LKB1 oder STRADα, da diese in Zell-Lysaten in ähnlichen Mengen in Abwesenheit oder Anwesenheit von zunehmenden Mengen von MO25α exprimiert waren (8A, unterer Kasten). MO25β waren in ähnlicher Weise in der Lage, eine Wechselwirkung zwischen LKB1 und STRADα zu erhöhen (8B).
Wir untersuchten auch, wie MO25α und MO25β die Bindung von LKB1 an STRADβ stabilisierten (11). In Abwesenheit von MO25 wurde keine erkennbare Assoziation von STRADβ zu LKB1 beobachtet, während eine Ko-Expression von MO25α oder MO25β zu einer von der Dosis abhängigen Erhöhung der STRADβ-Bindung an LKB1 führte. Im Gegensatz zu STRADα waren jedoch die Pegel der STRADβ-Expression in 293-Zellen in Abwesenheit von MO25-Isoformen niedrig und nahmen bei deren Anwesenheit in signifikanter Weise zu, was die erhöhte Bindung von LKB1 an STRADβ in Anwesenheit von MO25-Isoformen erklären könnte (ergänzende 2). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn STRADβ als GST-Fusionsprotein von einem anderen Expressionsvektor exprimiert wurde (Daten nicht gezeigt).
Stabilisierung des LKB1-STRAD-Komplexes durch MO25-Isoformen steht in Korrelation mit erhöhter Aktivität.
Um zu ermitteln, wie die Bindung von MO25α und MO25β an den LKB1-STRADα- oder den LKB1-STRADβ-Komplex die Aktivität von LKB1 beeinflusst, wurden 293-Zellen mit Wildtyp-GST-LKB1 in Anwesenheit oder Abwesenheit von STRAD- und/oder MO25- Isoformen transfiziert. Die Aktivität von gleichen Mengen von affinitäts-gereinigtem GST-LKB1 wurde durch die Messung der Autophosphorylierungs-Aktivität und auch der Transphosphorylierung von Myelin-Basisprotein (MBP) in der Anwesenheit von [γ-³²P]ATP bewertet, einem nicht spezifischen exogenen Substrat von LKB1. Wir überprüften auch die MBP-Phosphorylierung unter Verwendung eines phosphorspezifischen Antikörpers, der die Haupt-Phosphorylierungsstelle von LKB1 an MBP (Thr65) erkennt (Bass et al., 2003). Die verschiedenen LKB1-Aktivitäts-Untersuchungen führten zu vergleichbaren Ergebnissen (9). In Abwesenheit von STRAD-Isoformen war LKB1 nur schwach aktiv (9, Spur 1) und, wie zuvor gezeigt (Bass et al., 2003) induzierte eine Ko-Expression mit STRADα eine ~4-fache Erhöhung der LKB1-Aktivität (9, Spur 2). In Anwesenheit von STRADα und entweder MO25α oder MO25β war die Aktivität von LKB1 weiter um ungefähr das Doppelte erhöhte, so dass dieses LKB1 ungefähr 9 Mal mehr aktiv war als allein exprimiertes LKB1 (9, Spuren 6 oder 7). LKB1 wurde durch STRADβ nur in Anwesenheit der MO25-Isoformen aktiviert (9, vergleiche Spuren 3 mit den Spuren 8 und 9), was mit der Beobachtung konsistent ist, dass in Abwesenheit von MO25 LKB1 mit STRADβ kaum assoziiert ist (11). Es wurde früher gezeigt, dass LKB1 STRADα phosphoryliert (Bass et al., 2003) und wir zeigten, dass die durch MO25 vermittelte Erhöhung in der Assoziation von STRADα an LKB1 zu eine erhöhten STRADα-Phosphorylierung führt (9, vergleiche Spuren 2 mit den Spuren 6 und 7). Im Gegensatz zu STRADα wurde STRADβ durch LKB1 in Anwesenheit von MO25 nicht merklich phosphoryliert (9, Spuren 8 und 9). LKB1 phosphoryliert STRADα an Thr329 und Thr419 (Baas et al., 2003), d. h. an Stellen, die in STRADβ nicht konserviert sind (10). Dies erklärt, warum STRADβ durch LKB1 nicht phosphoryliert wird. Wir zeigten auch, dass katalytisch inaktives LKB1 in der Lage ist, sich mit beiden STRAD-Isoformen in Anwesenheit einer jeden Isoform von MO25 zu assoziieren. Wie erwartet, ist es jedoch zu einer Autophosphorylierung oder einer Phosphorylierung von STRADα oder MBP nicht in der Lage (9, Spuren 10–13).
Diskussion
Eine der Hauptfeststellungen dieser Studie ist die Erkenntnis, dass das stark konservierte MO25α-Protein, das in vielen eukaryotischen Arten gefunden wird und dem bisher keine Funktion zugeordnet wurde, in vivo in einem Komplex mit STRADα und LKB1 vorhanden ist. Interessanterweise erkennt in Abwesenheit von LKB1 das MO25α spezifisch die letzten drei Aminosäuren von STRADα, die in einer Thr-Glu-Phe-Sequenz liegen, und eine Mutation von irgendeinem dieser drei Residuen zu Ala verhindert im Wesentlichen die Bindung von MO25α and STRADα. In dieser Hinsicht wirkt MO25α ähnlich wie eine PDZ-Domäne, die ebenfalls die äußersten C-terminalen Residuen seines Protein-Bindungspartners erkennt (Songyang et al., 1997). Es besteht jedoch keine Homologie zwischen einer PDZ-Domäne und MO25α, und, soweit wir wissen, besitzen bisher beschriebene andere Domänen diese Eigenschaften nicht. Die ungefähr 50 C-terminalen Residuen, die zur Nicht-Pseudokinase-Domäne von STRADα und STRADβ gehören, werden nur schlecht konserviert, doch enden beide signifikanterweise mit der Trp-Glu-Phe-Sequenz (10), was betont, dass sich STRADα und STRADβ wahrscheinlich herausgebildet haben, um speziell mit MO25-Isoformen in Wechselwirkung zu treten. Die am nächsten verwandten Proteine von STRADα und STRADβ sind die aktiven STE20-Mitglieds-Kinasen, die als SPAK bezeichnet werden (Johnston et al, 2000) und die als OSR1 bezeichneten Kinasen (Tamari et al., 1999), die alle Residuen besitzen, die für eine Protein-Kinasen-Katalyse erforderlich sind (10), und bei denen sich daher um aktive Enzyme handelt. Obwohl weder SPAK noch OSR1 in einer Trp-Glu-Phe-Sequenz enden, besitzen beide eine Phe-Glu-Phe-Sequenz in einem ähnlichen Bereich ihrer C-terminalen, nicht katalytischen Domäne (10). Diese Beobachtung veranlasste uns, die C-terminale Trp-Glu-Phe-Sequenz von STRADα in Phe-Glu-Phe zu mutieren, und wir fanden, dass dies MO25α daran hinderte, sich an STRADα zu binden (6A). Dies betont weiter, dass das Vorhandensein eines Trp-Residuums in einem Abstand von drei Residuen vom Ende des Proteins wesentlich für die Bindung von STRADα an MO25α ist, was darauf hindeutet, dass MO25α mit SPAK oder OSR1 nicht in Wechselwirkung treten wird.
Unsere Daten zeigen, dass eine der Schlüsselrollen von MO25α darin besteht, die Wechselwirkung zwischen LKB1 und STRADα zu stabilisieren. Dies basiert auf der Beobachtung, dass die Menge von STRADα, die in Zellen mit LKB1 assoziiert ist, durch die Expression von MO25α (8) signifikant erhöht wird. Der Befund, dass STRADα, dem die C-terminalen Trp-Glu-Phe-Residuen fehlen, in Anwesenheit von LKB1 einen Komplex mit MO25α bilden kann (7), zeigt, dass die Wechselwirkung von LKB1 mit STRADα wenigstens eine neue Bindungsstelle für MO25α erzeugt, was erklären könnte, wie MO25α die Assoziation von LKB1 mit STRADα stabilisiert. Unsere Befunde ermöglichten es uns nicht, zu unterscheiden, ob die wenigstens eine zusätzliche MO25α-Bindungsstelle innerhalb von STRADα und/oder LKB1 angeordnet ist. Detaillierte strukturelle Studien dieses Komplexes werden erforderlich sein, um sich mit diesem Gesichtspunkt zu befassen. Unsere Beobachtungen sind konsistent mit der Erkenntnis, dass MO25α oder MO25β als Gerüst-Komponente des LKB1-STRAD-Komplexes wirken kann.
Es wurde früher gezeigt, dass eine Ko-Expression von STRADα mit LKB1 die in vitro auftretende Aktivität von LKB1 erhöhte (Bass et al., 2003) und wir zeigten hier, dass die Assoziation von LKB1-STRAD mit MO25-Isoformen die LKB1-Aktivität zusätzlich um das 2-fach erhöht (9). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Stabilisierung des LKB1-STRADα-Komplexes durch MO25 von einer Aktivierung von LKB1 begleitet wird. Es ist jedoch wichtig, darauf hinzuweisen, dass der Komplex von LKB1 und STRADα, der aus Säugetier-293-Zellen gereinigt wird, die markiertes LKB1 und STRADα überexprimieren, ebenfalls mit signifikanten Pegeln von endogenem MO25α einhergeht (4B). Es ist daher nicht möglich, die Aktivität des LKB1-STRADα-Komplexes in Abwesenheit von MO25α durch die Expression dieser Proteine in Säugetier-Zellen zu messen. Somit können wir nicht quantifizieren, wie die Assoziation von STRADα mit LKB1 bei völligem Fehlen von MO25α die Aktivität von LKB1 beeinflusst. Um das Problem der Assoziation von überexprimiertem STRADα mit endogenem MO25α in Säugetier-Zellen zu überwinden, haben wir versucht, durch E. coli exprimiertes LKB1, STRADα und MO25α zu kombinieren, um zu sehen, ob wir einen Komplex bilden konnten, in welchem LKB1 aktiviert werden konnte. Dieser Versuch war jedoch nicht erfolgreich (JB Daten nicht dargestellt), was darauf hindeutet, dass die Assoziation von LKB1 mit STRADα und MO25α ein komplizierter Prozess ist, der zusätzliche Faktoren erfordern kann, und/oder das dieser Komplex in vivo zusammengesetzt werden muss. Wir waren in der Lage, aus Säugetier-Zellen einen heterotrimeren Komplex zu isolieren, indem LKB1-, STRAD- und MO25-Untereinheiten in einer ähnlichen Stöchiometrie vorhanden sind (4C), was auf eine relativ hohe Affinität der einzelnen Untereinheiten in Bezug aufeinander hinweist.
Wir zeigten auch, dass MO25α und STRADα dann, wenn sie allein in Zellen exprimiert werden, sowohl im Zytoplasma als auch im Kern lokalisiert sind, doch sind sie nur im Zytoplasma lokalisiert und vom Kern ausgeschlossen, wenn sie gemeinsam exprimiert werden (5). Der molekulare Mechanismus, der dieser Beobachtung zugrunde liegt, wurde nicht untersucht. Es ist möglich, dass die Wechselwirkung von MO25α und STRADα zu einer Maskierung eines zu einer Lokalisierung im Kern führenden Signals oder zur Freilegung eines neuen zum Export aus dem Kern führenden Signals oder zu einem Verankerungsmotiv im Zytoplasma führt, oder dass der STRADα-MO25α-Komplex zu groß ist, um sich frei in den Nukleus zu verschieben. Unter den Bedingungen, unter denen wir unsere Lokalisationsstudien in HeLa-Zellen durchgeführt haben, haben wir gefunden, dass MO25α in signifikanter Weise mit STRADα zusammenwirkt, um LKB1 im Zytoplasma von Zellen zu lokalisieren und es vom Zellkern auszuschließen, da der Nukleus-Ausschluss und die zytoplasmische Lokalisierung von LKB1, die nach einer Expression von LKB1 und STRADα beobachtet wurden, in Anwesenheit von MO25α in markanter Weise erhöht waren (5). Frühere Studien in COS-Zellen zeigten auch, dass STRADα LKB1 im Zytoplasma von Zellen lokalisieren konnte (Bass et al., 2003). Da jedoch unsere Daten zeigen, dass signifikante Pegel von endogenem MO25α den LKB1-STRADα-Komplex binden (4B), ist es nicht möglich, auszuschließen, dass endogene MO25-Isoformen zur zytoplasmischen Lokalisierung von LKB1 beitragen können, wenn es mit STRADα ko-transfiziert wird. Die zytoplasmische Lokalisierung von LKB1 kann wichtig sein, da Mutanten von LKB1, die nicht in den Kern eintreten können, immer noch das Zellwachstum unterdrücken (Tiainen et al., 2002). Es können auch zusätzliche Mechanismen existieren, um LKB1 im Zell-Zytoplasma zurück zu halten. Es wurde gezeigt, dass die Wechselwirkung von LKB1 mit dem LIP1-Protein eine zytoplasmische Lokalisierung von LKB1 induziert (Smith et al., 2001). Es muss jedoch noch getestet werden, ob LIP1 mit dem heterotrimeren LKB1-STRAD-MO25-Komplex in Wechselwirkung tritt, doch wurde nicht berichtet, dass LIP1 die LKB1-Aktivität beeinflusst. LKB1 wird auch an seinem C-Terminus prenyliert (Collins et al., 2000; Sapkota et al., 2001), was die Wechselwirkungen mit Zellmembranen fördern könnte. Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass die Prenylation des von Drosophila stammenden LKB1-Homologs wichtig für eine Assoziation von LKB1 mit Membranen bei der Steuerung der Zell-Polarität ist (Martin und St. Johnston, 2003). Vermutliche MO25-Homologe werden nicht nur bei Säugetieren, Drosophila und C. elegans sondern auch in Spalthefen (NCBI-Zugangsnummer NP_594685, 51%-ige Identität mit menschlichem MO25α), Knospen treibenden Hefen (HYM1, NCBI-Zugangsnummer P32464, 33%-ige Identität mit menschlichem MO25α) und Pflanzen (NCBI-Zugangsnummer Q9M0M4, 43%-ige Identität mit menschlichem MO25α) gefunden. Nach unserer Kenntnis wurde nur das vermutete MO25-Homolog von knospender Hefe, das als HYM1 bezeichnet wird, untersucht, und es spielt offensichtlich eine Schlüsselrolle bei der Regulierung von polarisiertem Zellwachstum und Zelltrennung (Bidlingmaier et al., 2001; Dorland et al., 2000; Jorgensen et al., 2002). Nach unserer Kenntnis wurde nicht berichtet, dass in Hefe LKB1- und STRAD-Homologe gefunden wurden, und somit ist nicht klar, ob eine Verbindung zwischen der Regulierung der Polarität durch LKB1 bei C. elegans und Drosophila (Martin und St. Johnston, 2003; Watts et al., 2000) und der Regulierung der Zell-Polarität in Hefe durch HYM1 besteht.
Es ist auch möglich, dass MO25 Funktionen haben könnte, die unabhängig von seiner Fähigkeit sind, LKB1 zu regulieren. MO25 könnte mit anderen Proteinen Wechselwirken, die in einem ähnlichen Motiv wie STRADα, STRADβ enden, und es gibt mehr als 20 menschliche Proteine, die in einem Trp-Glu/Asp-Phe-Motiv enden. Es kann interessant sein zu untersuchen, ob irgendeines dieser Proteine an MO25-Isoformen bindet. Es ist auch wahrscheinlich, dass STRADα und STRADβ noch andere Funktion als die Regulierung von LKB1 besitzen. In dieser Hinsicht haben jüngste Arbeiten gezeigt, dass eine Überexpression von STRADβ in 293-Zellen diese dadurch gegen Apoptose schützte, dass die Fähigkeit des JNK-Pfades erhöht wurde, durch Überexpression von XIAP aktiviert zu werden, einer vorgeschalteten Komponente des JNK-Pfades (Sanna et al., 2002). Darüber hinaus wurde in einer anderen Studie berichtet, dass eine Überexpression von STRADβ zur Aktivierung von JNK und p38γ-MAP-Kinasen führt (Nishigaki et al., 2003). Der Mechanismus, durch den STRADβ die Aktivierung von JNK/p38γ erhöht, wurde in diesen Studien nicht definiert, und es wäre interessant, zu testen, ob LKB1 und/oder MO25 in diesem Prozess eine Rolle spielt.
Eine signifikante Anzahl von vererblichen PJS-Formen, die bei bestimmten Familien gefunden werden, zeigen keine Mutationen in den LKB1-Genen (Buchet-Poyau et al., 2002), was darauf hinweist, dass es einen zweiten verursachenden Ort für PJS gibt. Eine genetische Analyse hat bis heute LIP1 ausgeschlossen, und lieferte keinen Beweis, dass andere Proteine, von denen berichtet wird, dass sie mit LKB1 in Wechselwirkung treten, bei diesen Patienten mutiert sind (Buchet-Poyau et al., 2002; Resta et al., 2002). Die Ergebnisse in dieser Studie zeigen, dass es der Mühe wert wäre, zu verifizieren, ob Mutationen in den Genen, die STRAD- oder MO25-Isoformen kodieren, bei irgendeiner der PJS-Familien auftreten, die keine Mutationen im LKB1-Gen besitzen.
Zusammenfassend definieren wir MO2 als eine neue Komponente des LKB1-Komplexes in vivo. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Isoformen von MO25 in der Weise funktionieren, dass sie die Wechselwirkung von LKB1 mit den katalytisch inaktiven STRAD-Pseudokinase-Isoformen stabilisieren. Dies erhöht in markanter Weise die LKB1-Aktivität und seine zytoplasmische Lokalisation. In künftigen Studien, die dazu dienen, weiterhin die physiologischen Funktionen der MO25- und STRAD-Homologe bei der Regulierung der LKB1-Funktion zu definieren, wäre es auch wichtig, Mäuse zu erzeugen, denen diese Gene fehlen. Die Fähigkeit, stärker aktive Formen des heterotrimeren Komplexes von LKB1 zu exprimieren, eröffnet auch die Möglichkeit, biochemische Vorgehensweisen zu verwenden, um nach neuen LKB1-Substraten zu suchen.
Materialien. Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten wurden von Roche bezogen. Dimethyl-Pimelimidat und das Anti-Flag-M2-Agarose-Affinitätsgel wurden von Sigma gekauft. Tetracyclin-freies, fötales Rinderserum (FBS) stammte von Perbio, und andere Gewebekultur-Reagenzien wurden von Biowhittaker bezogen, wenn nichts anderes erwähnt wird. Precast SDS/4–12% und -10%-Polyacrylamid-Bis-Tris-Gele und Myelin-Basisprotein (MBP) wurden von Invitrogen bezogen. Sensorchips SA stammten von BiaCore AB (Stevenage, UK). [γ-³²P]ATP, Glutathion-Sepharose, Protein-G-Sepharose, und Streptavidin-Sepharose High Performance wurden von Amersham Biosciences gekauft.
Peptide. Die biotinylierten Peptide STRADα-C12 (Biotin-Cospacer-NLEELEVDDWEF), und STRADα-C6 (Biotin-C6spacer-VDDWEF), deren Sequenzen die letzten 12 bzw. 6 Residuen von STRADα umfassen, das Flag-Peptid (DYKDDDDK) und die Peptide, die zur Erzeugung von Antikörpern verwendet wurden, wurden von Dr. G. Bloomberg (University of Bristol, UK) synthetisiert. Die biotinylierten Peptide, welche die letzten 12 Residuen von STRADα umfassten, bei denen jedes Residuum einzeln durch ein Alanin ersetzt wurden, wurden unter Verwendung von früher beschriebenen Verfahren synthetisiert (Lizcano et al., 2002).
Antikörper. Der LKB1-Antikörper, der für das Immuno-Blotting verwendet wurde, wurde gegen das Maus-LKB1-Protein erzeugt wie zuvor beschrieben (Sapkota et al., 2001). Da dieser Antiköper das menschliche LKB1-Protein nicht in wirksamer Weise immuno-präzipitiert, erzeugten wir einen Antikörper in Schafen gegen das menschliche LKB1-Protein, exprimiert als ein GST-Fusionsprotein in E. coli, das in wirksamer Weise LKB1 sowohl von Menschen als auch von Ratten immuno-präzipitierte. Dieser Antikörper wurde für alle Immuno-Ausfäll-Experimente in dieser Studie verwendet. Die Anti-MO25α- und Anti-MO25β-Antikörper wurden in Schafen gegen MO25α- und MO25β-Human-Proteine erzeugt, exprimiert in E. coli, wie unten beschrieben. Die LKB1- und MO25-Antikörper wurden auf CH-Sepharose affinitäts-gereinigt, kovalent gebunden an das Protein-Antigen, das zur Erzeugung des Antikörpers verwendet worden war. Der monoklonale Antikörper, der das STRADα-Protein erkennt, wurde früher beschrieben (Bass et al., 2003). Der phosphor-spezifische Antikörper, der bei Thr65 phosphoryliertes MBP erkennt (T65-P) wurde in Schafen gegen Peptide GHHAARTTHYGSLPQ erzeugt, die den Residuen 58–72 von bovinem MBP entsprechen, wobei das unterstrichene Residuum Phosphothreonin ist. Der Antikörper wurde auf CH-Sepharose affinitäts-gereinigt, kovalent gekoppelt an das phosphorylierte Peptid und dann durch eine Säule von CH-Sepharose geleitet, gekoppelt an das nicht phosphorylierte Peptid. Antikörper, die sich nicht an die letztgenannte Säule banden, wurden selektiert. Monoklonale Antikörper, die das GST und die Flag-Epitop-Markierungen erkannten, wurden von Sigma bezogen, die monoklonalen Antiköper, welche die Myc-Epitop-Markierung erkannten, wurden von Roche gekauft, und sekundäre Antiköper, die an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt sind und für das Immuno-Blotting verwendet wurden, wurden von Pierce bezogen. Das bei Kontroll-Immuno-Präzipitations-Experimenten verwendete Preimmune-IgG wurde von Preimmune-Serum unter Verwendung von Protein G-Sepharose erhalten.
Allgemeine Verfahren und Puffer. Restriktions-Enzym-Auszüge, DNA-Ligationen und andere rekombinante DNA-Verfahren wurden unter Verwendung von Standardprotokol len durchgeführt. DNA-Konstrukte, die für eine Transfektion verwendet wurden, wurden von E. coli DH5α unter Verwendung des Qiagen-Plasmid-Mega-Teilesatzes entsprechend den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Alle DNA-Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert, was durch The Sequencing Service, School of Life Sciences, University of Dundee, Scotland, UK, unter Verwendung der DYEnamic ET Terminator-Chemie (Amersham Biosciences) auf Applied Biosystems automatisierten DNA-Sequenzern durchgeführt wurde. Der Lysis-Puffer enthielt 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% (Gew./Vol.) Triton-X 100, 1 mM Natriumorthovanadat, 50 mM Natriumfluorid, 5 mM Natriumpyrophosphat, 0,27 M Sucrose, 0,1% (Vol/Vol.) 2-Mercaptoethanol und einen „vollständigen" Proteinase-Inhibitor-Cocktail (eine Tablette/50 ml). Der Puffer A enthielt 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, 0,1 mM EGTA, und 0,1% (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol. Der SDS-Proben-Puffer enthielt 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 6,8, 2% (Gew./Vol.) SDS, 10% (Vol/Vol.) Glycerol, 0,005% (Gew./Vol.) Bromophenol-Blau, und 1% (Vol/Vol) 2-Mercaptoethanol.
DNA-Konstrukte. Konstrukte, welche die volle Länge besitzende LKB1 vom Wildtyp und kinase-dead Mäuse-LKB1 exprimieren, wurden früher beschrieben (Sapkota et al., 2002a; Sapkota et al., 2002b; Sapkota et al., 2001). Um die N-terminal mit Myc markierte MO25α-cDNA zu erzeugen, wurde ein PCR mit Primern durchgeführt: 5'-ggatccgccaccatggagcagaagctgatctctgaagaggacttgccgttcccgtttgggaagtctcacaaa t-3' und 5'-ggatccttaagcttcttgctgagctggtctcttc-3' unter Verwendung eines IMAGE-Konsortium-EST-Klons (IMAGE Klon 4822388, NCBI-Zugangsnummer BG719459) als Template. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vector eingebunden (Invitrogen) und als ein BamH1-BamH1-Fragment in die pEBG-2T-(Sanchez et al., 1994), pCMV5-(Anderson et al., 1989) und pGEX-6T-(Amersham)Vektoren subkloniert. Um die N-terminal mit Myc gekennzeichnete MO25β cDNA zu erzeugen, wurde ein PCR mit folgenden Primern durchgeführt: 5'-caccggatccgccaccatggagcagaagctgatctctgaagaggacttgcctttgtttagtaaatcacacaa aaatcc-3' und 5'-ggatcctcaaggggccgttttcttcaagtctcgg-3' unter Verwendung eines IMAGE-Konsortium-EST-Klons (IMAGE 1958217, NCBI-Zugangsnummer AI252223) als Template. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde in einen pENTR/D-TOPO Gateway-Intermediate-Vektor eingeführt (Invitrogen) und in gateway-modifizierte pEBG-2T-, pCMV5- und pGEX-6T-Expressionsvektoren konvertiert. Es sei darauf hingewiesen, dass der menschliche MO25β-IMAGE-Klon, den wir erhielten, ein Ala statt ein Val an der Position 153 kodiert, im Vergleich mit der eingereichten Sequenz (NCBI-Zugangsnummer Q9H9S4). Eine Sequenzanalyse der Nukleotid-Sequenzen von mehreren unabhängigen MO25β-Sequenzen, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, zeigte, dass diese alle ein Ala an der Position 153 besitzen. Expressions-Konstrukte für Flag-markiertes STRADα wurden durch PCR verstärkt mit Primern 5'ggatccgccaccatggactacaaggacgacgatgacaagtcatttcttgtaagtaaaccagagcgaatc-3' und 5'-ggatcctcagaactcccaatcgtccacctccagct-3 unter Verwendung von menschlicher STRADα cDNA als Template (Bass et al., 2003). Das PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt und als ein BamH1-Not1-Fragment in pEBG-2T oder als BamH1-Xba1-Insert in pCMV5 subkloniert.
Um STRADβ zu klonieren, wurden zwei IMAGE-EST-Klone (5301936 und 5501540) als Templates verwendet, die zusammen die vollständige Kodierungssequenz umschließen, um eine die volle Länge besitzende, Flag-markierte STRADβ-cDNA durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-ggatccgccaccatggactacaaggacgacgatgacaagtctcttttggattgcttctgcacttcaag-3' und 5'-ggatccctagaattcccagtatgagtcritttcatc-3' zu erzeugen. Das PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingebunden und als ein BamH1-BamH1-Fragment in die pEBG-2T- und pCMV5-Vektoren subkloniert. Das katalytische Fragment von Mäuse-LKB1 (Residuen 44–343), das eine N-terminale FLAG-Epitop-Markierung aufweist, wurde durch PCR aus einer Mäuse-LKB1-cDNA amplifiziert (Sapkota et al., 2001), unter Verwendung der Primer: 5'-actagtgccaccatggactacaaggacgacgatgacaagaagctcatcggcaagtacctgatgggg-3' und 5'-actagttcagtcctccaggtagggcactacagtcat-3' und in einen pCMV5-Vektor als ein SpeI-SpeI-Fragment subkloniert. Das Konstrukt, das für die Expression von mit GFP markierter menschlicher LKB1 mit keiner anderen Epitop-Markierung kodiert, wurde früher beschrieben (Boudeau et al., 2003b). Eine ortsgerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung von Standard-Verfahren mit dem Quickchange-Mutagenese-Kit (Stratagene) durchgeführt. Beseitigungs-Mutationen wurden durch das Einführen von STOP-Kodonen an den angegebenen Stellen erzeugt.
Zellkultur-Bedingungen und Zell-Lysis. Die Erzeugung von HeLa-Zellen, die in stabiler Weise LKB1 vom Wildtyp oder kinase-dead LKB1 exprimieren wurde früher beschrieben (Sapkota et al., 2002b). Die Zellen wurden in Minimum Essential Medium Eagle kultiviert, das mit 10% (Vol./Vol.) tetracyclin-freiem FBS ergänzt war; in der Anwesenheit von 1 × nicht-essentieller Aminosäuren-Lösung, 1 × Penicillin/Streptomycin-Lösung (Invitrogen), 100 μg/ml Zeocin und 5 μg/ml Blasticidin (Invitrogen). Humane, embryonale Nieren-293-Zellen (HEK), embryonale Fibroblast-Rat-2-Zellen und HeLa-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium aufbewahrt, das mit 10% (Vol./Vol.) FBS ergänzt war. Für alle Experimente wurden die Zellen für eine Kultur auf einer 10 cm im Durchmesser messenden Scheibe angesetzt und in 0,5 bis 1 ml eiskaltem Lysis-Puffer lysiert. Die Lysate wurden durch eine Zentrifugation bei 4°C, 10 Minuten lang bei 14 000 g geklärt.
Immuno-Blotting. Die Mengen von Proteinen, die in den Figurenbeschreibungen angegeben sind, wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen und auf Nitrozellulose übertragen. Die Membranen wurden 1 Stunde lang in 50 mM Tris/HCl (pH-Wert 7,5), 0,15 M NaCl, 0,5% (Vol/Vol) Tween, das 10% (Gew./Vol.) entrahmtes Milchpulver enthielt, blockiert. Die Membranen wurden in dem gleichen Puffer, der 1 μg/ml Antikörper (LKB1-, MO25α- und MO25β-Antikörper) oder 0,1 μg/ml (STRADα-Antikörper) enthielt, 8 Stunden bei 4°C inkubiert. Das Immuno-Blotting mit dem Antiköper T65-P wurde so durchgeführt, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass das nicht phosphorylierte Peptid, das dem zur Erzeugung des Antikörpers verwendeten Antigen entsprach, mit einer Konzentration von 10 μg/ml enthalten war. Das Immuno-Blotting mit dem GST-, Flag- und Myc-Antikörpern wurde wie oben mit 0,5 μg/ml mit der Ausnahme durchgeführt, dass das entrahmte Milchpulver durch 5% (Gew./Vol.) BSA ersetzt wurde. Die Detektion wurde unter Verwendung der geeigneten Meerrettich-Peroxidase-konju gierten, sekundären Antikörper und des verstärkten Chemolumineszenz-Reagens (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt.
Immuno-Präzipitation von endogenem LKB1 and MO25α. Die LKB1- und MO25α-Antikörper wurden kovalent an Protein-G-Sepharose in einem Verhältnis von 1 mg Antikörper to 1 ml Harz unter Verwendung eines Dimethyl-Pimelimidat-Vernetzungs-Verfahrens (Harlow and Lane, 1988) gekoppelt. Geklärte Lysate von 293- und Rat-2-Zellen, die wie oben beschrieben mit der Ausnahme erzeugt worden waren, dass 2-Mercaptoethanol aus dem Lysis-Puffer weggelassen wurde, und die 2 mg des Ganzzellen-Proteins enthielten, wurden bei 4°C 1 Stunde lange auf einer vibrierenden Plattform mit 10 μl des LKB1-Protein-G-Sepharose-Konjugats oder 15 μl des MO25α-Protein-G-Sepharose-Konjugats inkubiert. Die Immuno-Ausfällungen wurden zweimal mit 1 ml des Lysis-Puffers (der kein 2-Mercaptoethanol enthielt) gewaschen, der 150 mM NaCl enthielt, und zweimal mit 1 ml Puffer A (der kein 2-Mercaptoethanol enthielt). Die Kügelchen wurden dann in einem Volumen von 20 μl des Puffers A resuspendiert, dem 5 ml von SDS-Proben-Puffer zugegeben wurden, der kein 2-Mercaptoethanol enthielt. Die Proben wurden einer Elektrophorese unterzogen und dann in Bezug auf LKB1, STRADα und MO25α immuno-geblottet, wie oben beschrieben.
Expression von GST-Fusions-Proteinen in 293-Zellen und Affinitäts-Reinigung. Scheiben mit 10 cm Durchmesser von 293-Zellen wurden transient mit 3 bis 10 μg der pEBG-2T-Konstrukte unter Verwendung eines modifizierten Kalzium-Phosphat-Verfahrens transfiziert (Alessi et al., 1996). 36 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die geklärten Lysate wurde 1 h lang auf einer rotierenden Plattform mit Glutathion-Sepharose (25 μl/Scheibe des Lysats) inkubiert, die zuvor in Lysis-Puffer ausgeglichen worden war. Die Kügelchen wurden viermal mit Lysis-Puffer gewaschen, der 150 mM NaCl enthielt, und zweimal mit Puffer A. Für die Immunoblott-Analyse wurden die Kügelchen nach diesem Schritt in SDS-Proben-Puffer resuspendiert, so dass sich ein Endvolumen des Schlamms von 75 μl ergab, und die Proben wurden immuno-geblottet wie oben beschrieben. Für Protein-Kinase-Untersuchungen und eine Gel-Elektrophorese wurden die Kügelchen weiterhin zweimal mit Puffer A gewaschen, der 0,27 M Sucrose enthielt, und die Proteine wurden aus dem Harz durch Inkubation mit dem gleichen Puffer ausgespült, der 20 mM Glutathion enthielt. Die Kügelchen wurden dann durch Filtration durch einen 0,44 μm Filter entfernt und die Spülflüssigkeit in gleiche Mengen aufgeteilt und bei –80°C gelagert.
Expression und Reinigung von GST-MO25-Isoformen in E. coli. Die pGEX-6T-Konstrukte, die N-terminal mit GST markierte MO25α oder mit GST markierte MO25β kodieren, wurden in BL21-Zellen von E. coli transformiert und es wurde eine 0,5 Liter umfassende Kultur bei 37°C in Luria-Bertani-Nährlösung wachsengelassen bis die Absorbanz bei 600 nm ungefähr 0,7 betrug. Dann wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid mit einer Konzentration von 250 μM zugegeben, um eine Protein-Expression zu induzieren, und die Zellen wurden weitere 16 h bei 26°C kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation über 30 min hinweg bei 5000 g gesammelt und in 25 ml von Lysis-Puffer resuspendiert. Die Lysis wurde durch einen Zyklus von Einfrieren und Auftauen und dann durch 10 15-sekündige Sonifikations-Zyklen (Beschallung mit Ultraschall) vervollständigt. Das Lysat wurde bei 4°C 30 min lang mit 20000 g zentrifugiert, der Überstand durch ein 0,44 μm-Filter gefiltert und dann 1 h lang auf einer rotierenden Plattform mit 1 ml einer zuvor in Lysis-Puffer abgeglichenen Glutathion-Sepharose inkubiert. Die Kügelchen wurden viermal mit Lysis-Puffer gewaschen, der 150 mM NaCl enthielt, zweimal mit Puffer A und dann zweimal mit Puffer A, der 0,27 M Sucrose enthielt. Um die MO25-Isoformen aus dem Harz auszuspülen, wurden 15 μg von GST-markierter PreScissions-Protease zugegeben, welche die N-terminale GST-Markierung an den GST-Fusions-Proteinen abspaltet. Das Harz wurde mit der Protease 16 h lang bei 4°C auf einer rotierenden Plattform inkubiert und die ausgewaschenen MO25-Proteine durch eine Filtration durch einen 0,44 μm-Filter gesammelt. Die ausgespülten MO25-Isoformen wurden weiterhin mit 0,25 ml Glutathion-Sepharose 30 min lang bei 4°C inkubiert, um jegliche Spuren von nicht gespaltenem GST-Fusionsprotein und GST-PreScissions-Protease zu entfernen. Es wurde typischerweise 1 mg des homogenen MO25 isoliert und nach einem Schnell-Einfriervorgang in flüssigem Stickstoff in gleichen Mengen bei –80°C gelagert.
Reinigung von Flag-LKB1 und Massenspektrometrie-Analyse. Flag-LKB1 wurde aus HeLa-Zellen immuno-gereinigt, die stabil LKB1 vom Wildtyp oder kinase-dead LKB1 exprimieren, oder aus Vergleichs-HeLa-Zellen unter Verwendung von Anti-Flag-M2-Affinitätsagarose-Gel, wie zuvor beschrieben (Boudeau et al., 2003a). Für jede Reinigung wurden 100 Scheiben mit 10 cm Durchmesser einer jeden HeLa-Zell-Linie verwendet, und es ergaben sich 0,4 ml ausgespülter affinitäts-gereinigter LKB1-Lösung. 40 μl einer jeden Probe (1A, Spuren 1 bis 3) wurden auf einem Precast-4–12%-SDS-Polyacrylamid-Gel elektrophoresziert und das Gel mit Kolloidal-Blau gefärbt und photographiert. Für die konzentrierte Probe (1A, Spur 4) wurden 250 μl der KD-LKB1-Zubereitung mit Methanol ausgefällt, in 1 × SDS-Proben-Puffer resuspendiert und analysiert. Die in 1A dargestellten Bänder wurden ausgeschnitten, gewaschen und mit Trypsin verdaut bzw. aufgeschlossen, wie zuvor beschrieben (Woods et al., 2001). Tryptische Peptide wurden auf einem PerSeptive Biosystems Elite STR Massenspektrometer durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert, wobei α-Cyanozimtsäure als Matrix verwendet wurde. Die Spektren wurden im Reflektron-Modus erfasst und intern kalibriert, und die Massen der tryptischen Peptide wurden gegen NCBInr- und SwissProt-Datenbanken unter Verwendung des MS-FIT-Programms von Protein Prospector (UCSF, CA) abgeglichen, das auf einem örtlichen Server lief. Die Identität von STRADα und MO25α wurde auch durch eine LC-MS/MS-Sequenzanalyse auf einem Q-TOF2-Massenspektrometer bestätigt, wie dies bereits früher beschrieben wurden (Way et al., 2002).
Affinitäts-Reinigung von MO25α mit Peptiden. Streptavidin-Sepharose, die zuvor in PBS abgeglichen worden war, wurde mit jedem biotinylierten Peptid in einem Verhältnis von 1 μg Peptid zu 1 μl Harz auf einer vibrierenden Plattform 30 min lang inkubiert und die Kügelchen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen, um jegliches unkonjugierte Peptid zu entfernen. Die angegebenen Zell-Lysate (0,5 mg) wurden mit Streptavidin-Sepharose-Peptid-Konjugat (5 μl) 1 h lang bei 4°C auf einer vibrierenden Plattform inkubiert. Die Kügelchen wurden zweimal mit 1 ml Lysis-Puffer, der 150 mM NaCl enthielt, und zweimal mit 1 ml Puffer A gewaschen und dann in einem Volumen von 20 μl des Puffers A resuspendiert, zu dem 5 μl SDS-Proben-Puffer zugegeben wurden. Die Proben wurden dann einer Elektrophorese unterzogen und in Bezug auf MO25α immuno-geblottet, wie oben beschrieben.
Biacore-Analyse. Die Bindung wurde in einem BiaCore-3000-System analysiert (Bia-Core AB, Stevenage, UK). Die angegebenen, biotinylierten Peptide wurden an einem mit Streptavidin beschichteten Sensorchip (SA) gebunden (20 Antwort-Einheiten, RU). Verschiedene Konzentrationen von bakteriell exprimiertem MO25α, die zuvor in Puffer HBS-EP (10 mM HEPES pH-Wert 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% (Vol./Vol.) Polysorbat-20) dialysiert worden waren, wurden über die immobilisierten Peptide mit einer Strömungsrate von 30 μl/min injiziert. Wechselwirkungen zwischen jedem Peptid und dem MO25α-Protein wurden über einen Bereich von MO25α-Konzentrationen von 6,25–3200 nM analysiert, und es wurde eine dauerhafte Bindung bei jeder Konzentration ermittelt. Die Dissoziation von MO25α von jedem Peptid wurde über eine 1-minütige Periode hinweg überwacht. Die Regeneration der Sensorchip-Oberfläche zwischen jeder Injektion wurde mit 3 aufeinander folgenden Injektionen von 5 μl von 10 mM NaOH, 1 M NaCl durchgeführt.
LKB1-Autophosphorylierung und Phosphorylierung von MBP. 0,5 μg von GST-LKB1 des Wildtyps oder katalytisch inaktiver GST-LKB1 der angegebenen Komplexe von LKB1 (8), die aus 293-Zellen auf Glutathion-Sepharose affinitäts-gereinigt worden waren, wurden in der Anwesenheit von 3.3 μg von bovinem MBP in einer 30 μl umfassenden Reaktionsmischung inkubiert, die 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 0,1% 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM EGTA, 10 mM Mangan-Chlorid, 0,5 μM Microcystin-LR, und 100 μM [γ-³²P] ATP (1000 cpm/pmol) enthielt. Nach einer Inkubation für 40 min bei 30°C wurden die Reaktionen durch die Zugabe von 8 μl Proben-Puffer beendet. 30 μl wurden auf SDS-Polyacrylamid-Gelen elektrophoresziert, die dann getrocknet und durch Autoradiographie analysiert wurden, um die LKB1-Autophosphorylierung sowie die MBP- und STRADα-Phosphorylierung zu quantifizieren. 5 μl einer jeden Reaktion wurden in 45 μl von 1 × SDS-Probenpuffer verdünnt. Von der sich ergebenden Lösung wurden 10 μl für Immuno-Blotting mit den Anti-GST-(erkennt LKB1), Anti-Flag-(erkennt STRADα und STRADβ) und Anti-Myc-Antikörpern (erkennt MO25α und MO25β) verwendet. 30 μl der Probe wurden für ein Immuno-Blotting mit dem T65-P-MBP-Antikörper verwendet.
Lokalisationsstudien. HeLa-Zellen wurden auf Glas-Abdeckplättchen (No. 1,5) auf 10 cm Durchmesser aufweisenden Scheiben bis zu einer 50%igen Konfluenz kultiviert und mit insgesamt 2 μg eines Konstrukts, das Wildtyp-GFP-LKB1 kodiert, zusammen mit den angegebenen pCMV5-Konstrukten unter Verwendung des Effectene-Transfection-Reagens (Qiagen) gemäß den Vorschriften des Herstellers transfiziert. Ein zweiter Satz von Scheiben wurde für jeden Zustand verwendet. Die Zellen wurden 20 h nach der Transfektion mit PBS gewaschen und 10 min lang in frisch zubereitetem 4%igem (Vol./Vol.) Paraformaldehyd in PHEM-Puffer fixiert (60 mM Pipes, 25 mM Hepes, 10 mM EGTA und 2 mM Magnesiumsulfat, pH-Wert 7,0). Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen und mit 1% (Vol.) NP40 in PBS permeabilisiert und mit 10% normalem Ziegenserum blockiert. Die Zellen wurden sowohl mit dem MO25α-Antiköper als auch dem Anti-Flag-Antikörper immuno-markiert (um mit Flag markierte STRADα zu erkennen) in PBS gewaschen und mit Texas Red Anti-Schaf-IgG- und Cy5-Anti-Maus-IgG-Antikörpern ge gengefärbt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines konfokalen LSM 510 META-Mikroskops von Zeiss abgebildet. Jeder Kanal wurde unabhängig gescannt, um ein Übersprechen zu vermeiden (Multi-Tracking).
Northern-Blot-Analyse. Eine cDNA entsprechend dem menschlichen MO25α (NCBI-Zugangsnummer N. NM_016289, Nucleotid-Residuen 1550 bis 2500), wurde durch Random-Priming unter Verwendung eines Hi Prime DNA Labelling Kits (Roche) mit ³²P markiert. Diese Probe wurde verwendet, um einen Multiple Tissue Northern-Blot (Clontech, 13T1200-1) unter Verwendung von Rapid-Hyb-Puffer (Amersham Pharmacia) gemäß dem vom Hersteller gelieferten Protokoll zu durchmustern. Nach der Autoradiographie wurde die Probe gestripped und der Blot wurde dann wie oben mit einer β-Actin-Probe re-hybridisiert, die vom Hersteller geliefert wurde.
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Beispiel 2: Komplexe zwischen dem LKB1-Tumor-Suppressor, STRADα/β und MO25 α/β sind vorgeschaltete Kinasen in der durch AMP aktivierten Protein-Kinase-Kaskade
Die durch AMP aktivierte Protein-Kinase-Kaskade (AMPK) ist ein Sensor für die zelluläre Energieladung, der als ein „metabolischer Hauptschalter" wirkt, und die Zellausbreitung hemmt. Eine Aktivierung erfordert eine Phosphorylierung in der Aktivierungschleife (Thr-172) durch vorgeschaltete Kinasen (AMPKKs), die nicht identifiziert wurden. Kürzlich identifizierten wir drei verwandte Protein-Kinase die stromauf vom Hefe-Homolog von AMPK wirken, die aber keine offensichtlichen Säugetier-Homologe besitzen. Eine eng verwandte Säugetier-Kinase ist jedoch LKB1, für die keine physiologischen Substrate identifiziert wurden. LKB1 wirkt als Tumor-Suppressor und ist beim menschlichen Peutz-Jeghers-Syndrom mutiert. Wir zeigen im Beispiel 1, dass es als Komplex mit zwei Zugangs-Untereinheiten STRADα/β und MO25α/β existier.
Wir berichten, dass: (i) zwei AMPKK-Aktivitäten, die aus Rattenleber gereinigt wurden, LKB1, STRADα und MO25α enthalten und unter Verwendung von LKB1-Antikörpern immuno-ausgefällt werden können; (ii) die beiden endogenen und rekombinanten Komplexe von LKB1, STRADα/β und MO25α/β AMPK über eine Phosphorylierung von THR-172 aktivieren; (iii) katalytisch aktives LKB1 und STRADα oder STRADβ und MO25α oder MO25β für eine volle Aktivität erforderlich sind; (iv) die Medikamente AICA-Riboside und Phenformin AMPK in HeLa-Zellen (die kein LKB1 besitzen) nicht aktivieren, doch dass dies dadurch wieder erreicht werden kann, dass in diesen Zellen in stabiler Weise LKB1 vom Wildtyp exprimiert wird, dass dies aber nicht erfolgt, wenn LKB1 katalytisch inaktiv ist.
Diese Ergebnisse liefern die erste Beschreibung eines physiologischen Substrats für den LKB1-Tumor-Suppressor und deuten darauf hin, dass er als vorgeschalteter Regulator von AMPK arbeitet. Unsere Befunde zeigen, dass sich die Ausbildung von Tumoren beim Peutz-Jeghers-Syndrom aus einer fehlenden Aktivierung von AMPK in Folge einer LKB1-Inaktivation ergeben könnte.
Ergebnisse
Herauslösung von zwei AMPKKs aus Rattenleberextrakten
Als wir mit verschiedenen Bedingungen experimentierten, um die Rückgewinnung beim Q-Sepharose-Schritt unseres vorausgehenden Reinigungsprotokolls für AMPKK [14] zu optimieren, haben wir gefunden, dass wir in der Lage waren, zwei Aktivitäts-Scheitel aufzulösen (13A). Weil der zweite Scheitel anscheinend mit dem ursprünglich gereinigten AMPKK korrespondiert [14], bezeichnen wir ihn als AMPKK1, wobei sich der erste Pegel aus der als AMPKK2 bezeichneten Säule ergibt. Die AMPKK-Untersuchungen in 13A wurden so durchgeführt, dass als Substrat eine bakteriell exprimierte Glutathion-S-Transferase-Fusion (GST) der katalytischen Domäne von Ratten-AMPKα1 verwendet wurde. Dies ist bequemer als das natürliche Rattenleber-AMPK-Heterotrimer, das zuvor verwendet wurde [14] weil die katalytische Domäne von AMPKα1 vollständig dephosphoryliert und daher inaktiv ist, wenn sie in Bakterien exprimiert wird. Es ist auch möglich, die Untersuchungen mit dem an Glutathion-Sepharose-Kügelchen gebundenes Substrat durchzuführen, was es ermöglicht, jegliche endogene AMPK in der AMPKK-Fraktion wegzuwaschen, die ansonsten stören könnte. Bei einer Größen-Exklusions-Chromatographie auf Sephacryl-S-200 ergaben sich AMPKK1 und AMPKK2 als große Proteine mit unterschiedlicher Größe. Durch Vergleich mit Standards wurden die Stokes-Radien für AMPKK1 und AMPKK2 als 5.2 nm bzw. 5,7 nm abgeschätzt. Ca²⁺ und Calmodulin stimulierten weder AMPKK1 noch AMPKK2, und keines von beiden wurde unter Verwendung eines Antikörpers gegen CaMKK immuno-ausgefällt (nicht dargestellt).
AMPKK1 und AMPKK2 enthalten beide LKBI, STRADα und MO25α
Um zu untersuchen, ob eine dieser beiden Fraktionen LKB1 enthalten könnte, untersuchten wir Blots von Fraktionen quer über die Q-Sepharose-Chromatographie unter Verwendung von Antikörpern gegen LKB1, STRADα und MO25α (13B–D). Dies zeigte, dass die Aktivität von AMPKK2 in Anwesenheit von einem die Größe von ungefähr 50 kDa besitzenden Polypeptid von LKB1 (≈ 50 kDa) sowie in Anwesenheit von STRADα (≈ 45/48 kDa) und Mo25a (≈ 40 kDa) in den Fraktionen 18–22 korreliert war. STRADα wurde als Dublett detektiert, wie bereits früher berichtet [30]; der Grund für dieses Verhalten ist nicht bekannt. Wir erhielten bei Verwendung von Anti-MO25β-Antikörper ein Signal für die richtige Molekularmasse in diesen Fraktionen (nicht dargestellt), was mit unseren Beobachtungen konsistent ist, dass die MO25β-Isoform in Mäuseleber nicht exprimiert wird (Beispiel 1). Wir erhielten auch ein schwaches Signal für LKB1 und STRADα in den Fraktionen 27–29, die AMPKK1 enthielten, doch bei dieser Beladung war MO25α in diesen Fraktionen unterhalb der Nachweisgrenze. Das Vorhandensein von LKB1, STRADα und MO25α in AMPKK1 wurde jedoch durch die Analyse einer höheren Beladung der Fraktionen 26–30 bestätigt (12E–G). Ein interessanter Befund war, dass das LKB1-Polypeptid mit einer etwas größeren Beweglichkeit in AMPKK1 als in AMPKK2 wanderte; dies ergibt sich aus einer Inspektion der 13B (siehe auch 14B und 14D).
AMPKK-Aktivität kann aus AMPKK1 und AMPKK2 immuno-ausgefällt werden
Unter Verwendung eines Anti-LKB1-Antikörpers aber nicht des Pre-Immune-Kontroll-IgG, waren wir in der Lage, AMPKK-Aktivität sowohl aus AMPKK1 als auch AMPKK2 immuno-auszufällen. 14A zeigt die Ergebnisse eines Experiments, bei dem die Menge der Kinase-Kinasen begrenzend war und die Antikörper im Überschuss vorhanden waren, und sie zeigt, dass wir in der Lage waren durch Immuno-Ausfällung mit einem Anti-LKB1-Antikörper > 80% der Aktivität aus den Scheitel-Fraktionen zu entfernen, die AMPKK1 und AMPKK2 enthielten, während bei Verwendung des Pre-Immune-Kontroll-Immunoglobulins keine Aktivität entfernt wurde. Wir konnten unter den gleichen Bedingungen > 95% der AMPKK-Aktivität eines rekombinanten, mit GST markierten LKB1-STRADα-MO25α-Komplexes entfernen (siehe nächster Abschnitt). Die kleine Menge von Aktivität, die in den Überständen der AMKK1- und AMPKK2-Fraktionen zurückblieb, konnte der Tatsache zugeordnet werden, dass die Immuno-Ausfällung in diesen Fällen nicht quantitativ war, da ungefähr 20% des LKB1-Polypeptids im Überstand zurückblieben (14B).
Aufgrund der kleinen Mengen von AMPKK1 und AMPKK2, die bei diesem Experiment verwendet wurden, war es schwierig, die Pellets in Anwesenheit der anderen Polypeptide auf AMPKK-Aktivität zu analysieren. Wir wiederholten daher das Experiment mit mehr Kinase-Kinase und weniger Antikörper (nun war die Menge des Antikörpers begrenzend) und analysierten die Pellets. Dies zeigte, dass wir nahezu ebenso viel AMPKK-Aktivität im Pellet aus den Scheitel-Fraktionen, die AMPKK1 und AMPKK2 enthielten, gewinnen konnten, wie dies aus dem rekombinanten LKB1-STRADα-MO25α-Komplex möglich war, wobei keinerlei Aktivität bei Verwendung des Pre-Immune-Kontroll-Immunoglobulins gewonnen wurde (14C). Western-Blotting der AMPKK1- und AMPKK2-Pellets zeigte, dass sie LKB1, STRADα und MO25α enthielten, obwohl das STRADα-Dublett im AMPKK1-Pellet äußerst schwach war (14D).
Rekombinante LKB1-STRAD-MO25-Komplexe aktivieren die katalytische Domäne von AMPKα1 in zellfreien Untersuchungen
Um zu überprüfen, ob LKB1 AMPK selbst aktivierte oder ob die zusätzlichen Untereinheiten STRADα/β und MO25α/β erforderlich waren, exprimierten wir mit GST markiertes LKB1, mit FLAG markiertes STRADα/β und mit myc markiertes MO25α/β in verschiedenen Kombinationen in HEK-293T-Zellen, und reinigten die Komplexe auf Glutathion-Sepharose. Wir verwendeten auch als Kontrollen einen mit GS markierten, kinase-inaktiven Mutanten von LKB1 (D194A) und ein Plasmid, das GST alleine exprimiert. Die gereinigten Komplexe wurden mit der katalytischen Domäne von STRADα1 in Anwesenheit von MgATP inkubiert und die Aktivierung der katalytischen Domäne sowie die Phosphorylierung von Thr172 (unter Verwendung eines phosphor-spezifischen Anti-pT172-Antikörpers) wurden gemessen. 15A zeigt, dass LKB1 alleine die Aktivität oder Phosphorylierung von Thr172 der katalytischen AMPKα1-Domäne nicht wesentlich über die Basisaktivität hinaus erhöhte, die in Anwesenheit von GST alleine beobachtet wurde (vergleiche Spuren 1 und 14). Die gleichen Ergebnisse wurden mit LKB1 erhalten, das gemeinsam mit MO25α oder MO25β exprimiert worden war (Spuren 4 und 5), was den Erwartungen entsprach, da diese Proteine bei Fehlen von STRADα/β nicht mit LKB1 in Wechselwirkung treten (Beispiel 1). Ein LKB1-STRADα-Komplex ergab eine kleine aber signifikante Aktivierung und Thr172-Phosphorylierung der katalytischen Domäne von AMPKα1 über den Basiswert hinaus (vergleiche Spuren 1 und 2). Um jedoch eine starke Aktivierung und Phosphorylierung der katalytischen Domäne von AMPKα1 zu erzeugen, war ein Heterotrimer-Komplex erforderlich, der LKB1, STRADα oder STRADβ und MO25α oder MO25β enthielt (Spuren 6 bis 9). Mit den heterotrimeren Komplexen erfolgte die Aktivierung in der Reihenfolge LKB1-STRADα-MO25α > LKB1-STRADα-MO25β LKB1-STRADβ-MO25α > LKB1-STRADβ-MO25β. Es ist wichtig, dass die Fähigkeit der LKB1-STRAD-MO25-Komplexe, AMPKα1 zu aktivieren, vollständig von der katalytischen Aktivität von LKB1 abhängig war, weil Komplexe eines katalytisch inaktiven Mutanten von LKB1 (D194A) mit den verschiedenen Kombinationen von STRADα/β und MO25α/β (Spuren 10–13) nicht in der Lage waren, AMPKα1 zu aktivieren oder zu phosphorylieren. Das Ausmaß der Aktivierung, das mit diesen verschiedenen Komplexen von Wildtyp-LKB1 erhalten werden konnte, korrelierte gut mit der Phosphorylierung von Thr172. Eine Untersuchung mit einem Antikörper gegen die gesamte katalytische Domäne von AMPKα1 (mit GST markierte AMPKα1-KD in 15A) bestätigte, dass die Beladung in diesen Proben gleichförmig war. Die drei unteren Kästen in 15A bestätigen, dass die relevante STRAD- und MO25-Untereinheit gemeinsam mit LKB1 ausfiel, wenn DNAs, die diese Untereinheiten kodieren, co-transfiziert worden waren. Wenn STRADα gemeinsam mit LKB1 in Abwesenheit einer MO25-Untereinheit exprimiert wurde, war die Menge der gemeinsam mit LKB1 ausgefällten STRADα-Untereinheit vermindert (Spuren 1 und 3). Dies ist konsistent mit den früheren Befunden, dass die Anwesenheit einer MO25-Untereinheit die LKB1-STRAD-Komplexe stabilisiert (1).
15B beweist, dass Thr-172 die einzige Stelle an der katalytischen Domäne von AMPKα1 war, die durch den LKB1-STRADα-MO25α-Komplex phosphoryliert wurde. Wenn die beiden Proteine gemeinsam in Anwesenheit von [γ-³²P]ATP inkubiert wurden, wurde die katalytische Domäne des Wildtyp-AMPKα1 mit ³²P markiert, doch trat dies nicht bei einem Mutanten der katalytischen Domäne von AMPKα1 ein, bei dem Thr-172 zu Ala mutiert war.
AMPKK1, AMPKK2 und rekombinante LKB1-STRADβ-MO25-Komplexe aktivieren auch heterotrimere AMPK-Komplexe
Obwohl die meisten AMPKK-Untersuchungen in dieser Studie unter Verwendung der katalytischen Domäne von AMPKα1 als Substrat durchgeführt wurden, zeigt 16 dass AMPKK1, AMPKK2 und der rekombinante GST-LKB1:STRADα:MO25α-Komplex auch heterotrimere AMPK-Komplexe aktivierte. Plasmide, welche die α1-, β1- und γ1- oder α2-, β1- und γ1-Untereinheiten von AMPK kodieren, wurden in CCL13-Zellen ko-exprimiert und mit Hilfe einer myc-Markierung an den α-Untereinheiten gereinigt. Die rekombinanten AMPK-Komplexe, die an Protein-G-Sepharose-Kügelchen gebunden waren, wurden mit MgATP und AMPKK1, AMPKK2 oder GST-LKB1:STRADα:MO25α inkubiert, die vorgeschaltete Kinase wurde weggewaschen und die Aktivität des AMPK-Komplexes wurde ermittelt. 16 zeigt, dass sowohl der α1β1γ1- als auch der α2β1γ1-Komplex durch alle drei vorgeschalteten Kinase-Zubereitungen aktiviert wurde, und dies steht in Korrelation mit der Phosphorylierung von Thr-172 an den α-Untereinheiten, was unter Verwendung des Anti-pT172-Antikörpers gezeigt wurde (der phosphoryliertes Thr-172 sowohl an α1 als auch an α2 erkennt). Der Blot, der Anti-α1- und Anti-α2-Antikörper verwendet, bestätigt eine gleichförmige Beladung (es sei darauf hingewiesen, dass mit dem Anti-α2- im mer ein stärkeres Signal erzielt wird als mit dem Anti-α1-Antikörper, selbst wenn die Protein-Beladung die gleiche ist). Obwohl die Aktivität des verwendeten AMPKK2 3,5-fach höher war als die von AMPKK1 und nur 30% niedriger als die von GST-LKB1-STRADα-MO25α in Ausdrücken der Fähigkeit, die katalytische Domäne von AMPKα1 zu aktivieren, schien AMPKK2 bei der Aktivierung des α1β1γ1-Komplexes weit weniger wirksam zu sein. Diese Unterschiede waren weniger offensichtlich, wenn der α2β1γ1-Komplex als Substrat verwendet wurde.
Endogene LKB1, die AMPK aktiviert, kann aus 293-Zellen aber nicht aus HeLa-Zellen immuno-ausgefällt werden
17 zeigt, dass eine Aktivität, welche die katalytische Domäne von AMPKα1 aktivierte und Thr-172 phosphorylierte, aus dem Extrakt von nicht transfizierten HEK-293T-Zellen unter Verwendung von Anti-LKB1-Antikörper (Spur 1), aber nicht durch Preimmune-Kontroll-Immunoglobulin (Spur 2) immuno-ausgefällt werden konnte. Wie früher berichtet [30, Beispiel 1], führte eine Immuno-Ausfällung von endogenem LKB1 zur Ko-Ausfällung von STRADα und MO25α (Spur 1). Als weitere Kontrolle verwendeten wir normale HeLa-Zellen als eine LKB1-Null-Zelllinie, da es bekannt ist, dass LKB1 in diesen Zellen [23] nicht exprimiert wird. In Konsistenz hiermit wurden aus der gleichen Menge von Extrakt-Protein von HeLa-Zellen unter Verwendung des Anti-LKB1-Antikörper keine LKB1-, STRADα- und MO25α-Untereinheiten oder AMPKK-Aktivität immuno-ausgefällt (Spur 3). Die AMPKK-Aktivität und Thr-172-Phosphorylierung wurden ebenso wie erkennbare STRADα- und MO25α-Untereinheiten nach einer Immuno-Ausfällung von LKB1 aus HeLa-Zellen [34] wiedergewonnen, die in stabiler Weise Wildtyp-LKB1 exprimieren [32] (Spur 5). In Zellen, die einen katalytisch inaktiven Mutanten von LKB1 exprimieren, wurden die LKB1-, STRADα- und MO25α-Polypeptide durch Immuno-Ausfällung unter Verwendung eines Anti-LKB1-Antikörpers wiedergewonnen, aber keine AMPKK-Aktivität (Spur 7). Obwohl das LKB1-Polypeptid in den HeLa-Zellen im Vergleich mit den endogenen Pegeln, die in 293-Zellen beobachtet werden (14, vergleiche Spuren 1 und 5) in starkem Maße überexprimiert wurde, ist klar, dass bei diesen Zellen die Menge von STRADα und MO25α in den Zellen begrenzend ist. Es gab in HeLa-Zellen, die LKB1 exprimieren, eine geringere Menge von AMPKK-Aktivität und Thr-172-Phosphorylierung sowie von gemeinsam ausgefälltem STRADα und MO25α als in 293-Zellen, obwohl LKB1 selbst überexprimiert war. Die AMPKK-Aktivität in den Immuno-Präzipitaten aus 293-Zellen und HeLa-Zellen, die Wildtyp-LKB1 exprimieren, korrelierte mit den Pegeln von STRADα und MO25α in dem Komplex statt mit den Pegeln von LKB1. Dies betont weiterhin die wesentliche Natur der STRAD- und MO25-Untereinheiten bei Erhöhung der AMPKK-Aktivität von LKB1.
Expression von LKB1 stellt die Aktivierung von AMPK in HeLa-Zellen wieder her
Wir haben zuvor gefunden (unveröffentlichte Ergebnisse), dass, obwohl AMPK in HeLa-Zellen exprimiert wird, es nicht durch die Medikamente 5-Aminoimidazol-4-carboxamid(AICA)-Riboside und Metformin aktiviert wird, die ohne weiteres die Kinase in anderen Zellarten aktivieren [33; 34]. Da HeLa-Zellen LKB1 nicht exprimieren [23], könnte dies eine mögliche Erklärung für diese Anomalie sein. Um zu untersuchen, ob die Expression von rekombinantem LKB1 die Fähigkeit von HeLa-Zellen wiederherstellen konnte, auf diese Medikamente anzusprechen, verwendeten wir HeLa-Zellen, die in sta biler Weise Wildtyp-LKB1 exprimieren, und solche, die den katalytisch inaktiven Mutanten [32] exprimieren, sowie eine Kontroll-HeLa-Zelllinie, die LKB1 nicht exprimiert. Bei diesen Experimenten verwendeten wir Phenformin, das eng mit Metformin verwandt ist, von dem wir gefunden haben, dass es AMPK schneller und stärker aktiviert als Metformin in anderen Zelltypen. 18A zeigt, dass weder AICA-Riboside noch Phenformin AMPK in den Kontroll-HeLa-Zellen aktivierte. In Zellen, die Wildtyp-LKB1 aber nicht den kinase-inaktiven Mutanten exprimieren, verursachten sowohl AICA-Riboside als auch Phenformin eine kräftige Aktivierung von AMPK. Dies korrelierte mit der Phosphorylierung von Thr-172 an AMPKα, was durch einen Test mit Anti-pP172-Antikörper (18B) und auch durch Untersuchungen mit der Phosphorylierung eines nachgeschalteten Targets von AMPK, Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) gezeigt wurde, gezeigt durch einen Test mit einem phosphorspezifischen Antikörper gegen Ser-79 an der primären AMPK-Stelle an diesem Protein (Anti-pACC, 18C). Interessanterweise bewirkte eine stabile Expression von Wildtyp-LKB1 in HeLa-Zellen ein kleines aber reproduzierbares Maß einer Hochregulierung von Expression von AMPKα1 und eine deutliche Abwärts-Regulierung der Expression von ACC (nicht dargestellt). Weil die Expression dieser Proteine in diesen Zellen nicht gleichförmig war, testeten wir zur genauen Quantifizierung ihres Phosphorylierungsstatus gleichzeitig einzelne Blots von Lysaten, wobei wir entweder Anti-pT172- und Anti-α1/α2-Antikörper verwendeten (, um die Thr-172-Phosphorylierung und das gesamte AMPKα zu detektieren), oder mit Anti-pACC und Avidin (um die Ser-79-Phosphorylierung und das gesamte ACC zu detektieren). Die beiden Testreagenzien, die bei jedem dieser Doppel-Markierungs-Verfahren verwendet wurden, wurden mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Farben markiert, die in verschiedenen Bereichen des Infrarot-Spektrums (IR) emittieren, und die Ergebnisse wurden in zwei getrennten Kanälen unter Verwendung eines IR-Laser-Scanners quantifiziert. In den 18B und 18C sind die Ergebnisse als Verhältnisse des Signals, das unter Verwendung des phosphorspezifischen Antikörpers erhalten wurde, zu dem Signal ausgedrückt, das für das Gesamtprotein erhalten wurde. Dieses Verfahren korrigiert unterschiedliche Pegel der Expression der Proteine und zeigt, dass eine gute Korrelation zwischen der Aktivierung von AMPK and der Phosphorylierung von Thr-172 bestand. Es gab auch eine Korrelation mit der Phosphorylierung von ACC, obwohl in diesem Fall AICA-Riboside einen größeren Einfluss zu haben schien als Phenformin.
Diskussion
Unsere Ergebnisse liefern einen deutlichen Beweis, dass LKB1-STRAD-MO25-Komplexe die hauptsächlichen, vorgeschalteten Kinase-Aktivitäten darstellen, die auf AMPK einwirken. Die Schlüsselbeweise können folgendermaßen zusammengefasst werden:

1. Während der vorausgehenden, über 10 Jahre hinweg erfolgenden Bemühungen, aus Rattenleber-Extrakten Aktivitäten zu reinigen, die dephosphoryliertes AMPK aktivieren, ([14] und nachfolgende, unpublizierte Arbeiten) haben wir zumindest unter den verwendeten Untersuchungs-Bedingungen keinerlei andere Aktivitäten als AMPKK1 und AMPKK2 gefunden.
2. Sowohl AMPKK1 als auch AMPKK2 enthielten LKB1, STRADα und MO25α, die durch Western-Blotting detektierbar waren und mit der Aktivität korrelierten (13).
3. Entscheidend war, dass die Fähigkeit der AMPKK1- und AMPKK2-Fraktionen, die katalytische Domäne von AMPKα1 zu aktivieren, durch Immuno-Ausfällung mit einem Anti-LKB1-Antikörper aber nicht durch Kontroll-Immunoglobulin nahezu vollständig beseitigt wurde. Die Aktivität wurde in den Anti-LKB1-Immunopräzipitaten zusammen mit den LKB1-, STRADα- und MO25α-Polypeptiden aber nicht in den Kontroll-Immunopräzipitaten detektiert (14).
4. Die AMPKK-Aktivität in AMPKK1 und AMPKK2 war keine Verschmutzung, die mit Anti-LKB1-Antikörper gemeinsam ausgefällt wurde, weil rekombinante Komplexe von GST-LKB1, STRAD und MO25, die in 293-Zellen exprimiert und auf Glutathion-Sepharose gereinigt worden waren, die katalytische Domäne von AMPKα1 in wirksamer Weise aktivierten und Thr-172 phosphorylierten (15). Diese Aktivität hing von der Integrität der katalytischen Domäne von LKB1 ab, weil Komplexe, die aus einer katalytischen inaktiven LKB1 mit einer STRAD- und MO25-Untereinheit gebildet worden waren, nicht in der Lage waren, AMPK zu aktivieren oder zu phosphorylieren. Die Phosphorylierung der katalytischen α1-Domäne schien nur bei Thr-172 aufzutreten, weil die katalytische Domäne von Wildtyp-AMPKα1, aber nicht die eines T172A-Mutanten, unter Verwendung von [γ-³²P]ATP und des GST-LKB1-STRADα-MO25α-Komplexes phosphoryliert werden konnte.
5. Obwohl die meisten in dieser Beschreibung wiedergegebenen Experimente unter Verwendung der bakteriell exprimierten, katalytischen Domäne von AMPKα1 als Substrat durchgeführt wurden, aktivierten AMPKK1, AMPKK2 und rekombinante LKB1-STRADα-MO25α-Komplexe ebenfalls heterotrimere AMPK-Komplexe (α1β1γ1 und α2β1γ1) in wirksamer Weise und phosphorylierten sie bei Thr-172 an den α-Untereinheiten (16).
6. HeLa-Zellen exprimieren LKB1 nicht (17), und daher stellen sie eine natürliche „knock-out"-Zelllinie dar. Die Medikamente AICA-Riboside und Phenformin, die AMPK in anderen Zelltypen vermittels unterschiedlicher Mechanismen aktivieren [33, 34], aktivierten AMPK in HeLa-Zellen nicht. Doch war bei Zellen, die stabil mit einer DNA transfiziert waren, die Wildtyp-LKB1 (aber nicht einen katalytisch inaktiven Mutanten) von einem induzierbaren Promoter exprimiert, war die Fähigkeit von AICA-Riboside und Phenformin wiederhergestellt, AMPK zu aktivieren, Thr-172 an der AMPKα-Untereinheit zu phosphorylieren und eine Phosphorylierung eines nachgeschalteten Targets (ACC) zu verursachen (18). Obwohl Phenformin in diesen Zellen eine stärkere Aktivierung von AMPK und eine stärkere Phosphorylierung von Thr-172 verursachte, als AICA-Riboside traf für die Phosphorylierung von ACC das Gegenteil zu. Der Grund hierfür ist nicht bekannt, doch liegt eine Möglichkeit darin, dass die beiden Wirkstoffe in unterschiedlicher Weise verschiedene Pools von AMPK an verschiedenen sub-zellulären Orten aktivieren.

Obwohl das LKB1-Polypeptid in den HeLa-Zellen überexprimiert war, war das Ausmaß der AMPK-Aktivierung und die Menge von STRADα und MO25α, die zusammen mit dem LKB1 ausgefällt wurden, tatsächlich niedriger als in 293-Zellen (17). Dies stützt in starkem Maße die Befunde in 15, die zeigen, dass beide Zubehör-Untereinheiten erforderlich sind, um die Fähigkeit von LKB1 zu erhöhen, AMPK zu aktivieren, und zeigt auch, dass die aktive Form von LKB1 im Vergleich zu 293-Zellen nicht überexprimiert wird. Die Ergebnisse in den HeLa-Zellen deuten darauf hin, dass LKB1 und seine Zubehör-Untereinheiten erforderlich und ausreichend für eine Aktivierung von AMPK in intakten Zellen sind. Sie beweisen dies jedoch nicht in formeller Hinsicht, weil es dann, wenn andere Kinasen vorhanden sind, die stromaufwärts von AMPK wirken, denkbar ist, dass diese in HeLa-Zellen nicht vorhanden sind. Unsere zahlreichen Versuche bei der Reinigung von AMPKKs aus Rattenleber-Extrakten haben immer nur AMPKK1 und AMPKK2 detektiert, die nunmehr beide LKB1-STRADα-MO25α-Komplexe darzustellen scheinen. Wie in jedem Protein-Reinigungs-Protokoll ist jedoch die Rückgewinnung der Aktivität nicht quantitativ, und wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, dass andere vorgeschaltete Kinasen gefehlt haben könnten. Wir würden auch keine vorgeschaltete Kinase detektieren, die unter den verwendeten Untersuchungsbedingungen nicht aktiv war. Wenn beispielsweise die Untersuchung in Anwesenheit von EGTA durchgeführt worden wären, so hätten wir keinerlei von Ca²⁺-abhängige Protein-Kinasen detektiert. Wir haben bereits gezeigt, dass eine von Ca²⁺/Kalmodulin abhängige Protein-Kinase-Kinase (CaMKK) aus Schweinegehirn AMPK in zellfreien Untersuchungen aktivieren kann [17], obwohl es bei der Aktivierung von von Kalmodulin abhängiger Protein-Kinase wesentlich wirksamer war und es keinen Beweis gibt, dass es AMPK in vivo phosphoryliert.
Sowohl AMPKK1 als auch AMPKK2 scheinen LKB1, STRADα und MO25α zu enthalten, und somit ist zurzeit nicht klar, warum sie bei einer Q-Sepharose-Chromatographie auflösen. Ein interessanter Unterschied war, dass das LKB1-Polypeptid in AMPKK1 signifikant schneller auf SDS-PAGE wanderte als AMPKK2 (13 und 14). Es ist bekannt, dass LKB1 an bis zu 8 Stellen phosphoryliert wird, und es wird auch an Cys-433 in der Nähe des C-Terminus farnesyliert [34–37]. Wir vermuten daher, dass der Unterschied in der Mobilität auf einem Unterschied in der kovalenten Modifikation beruhen kann. Ein anderer Unterschied zwischen AMPKK1 und AMPKK2 waren ihre Stokes-Radien, die durch Größen-Exklusions-Chromatographie abgeschätzt wurden (5,7 gegenüber 5,2 nm). Wir schätzten vorher, dass der Stokes-Radius von AMPKK1 5,6 nm sein würde, und wenn man dies mit einem Sedimentations-Koeffizienten von 8,5 S kombiniert, der durch eine Glycerol-Gradienten-Zentrifugation erhalten wurde, so erhält man eine Abschätzung von 195 kDa für die molekulare Masse [14]. Nimm man an, dass AMPKK1 und AMPKK2 eine ähnliche Form besitzen, so würde dies zu einer molekularen Masse von ungefähr 175 kDa für AMPKK2 führen, was in vernünftiger Nähe zur berechneten molekularen Masse (ohne Berücksichtigung der kovalenten Modifikation) eines 1:1:1 LKB1-STRADα-MO25α-Komplexes von 140 kDa liegt. Obwohl wir die Möglichkeit nicht ausschließen können, dass AMPKK1 ein zusätzliches assoziiertes Protein enthält, ist es möglich, dass die Unterschiede in kovalenten Modifikationen zwischen AMPKK1 und AMPKK2 die Form des Komplexes und somit den Stokes-Radius beeinflussen können. In Konsistenz mit dem Verhalten der AMPKK1- und AMPKK2-Komplexe bei der Größen-Exklusions-Chromatographie wurde früher gezeigt, dass endogenes LKB1 bei Gel-Filtration mit einer offen sichtlichen molekularen Masse von 150–250 kDa wandert, was in deutlichem Kontrast zu LKB1 steht, das in E. coli exprimiert wurde und eine offensichtliche molekulare Masse von 50 kDa besitzt [38]. Unsere vorliegenden Ergebnisse bestätigen unter Verwendung eines wahrscheinlichen physiologischen Substrats frühere Befunde, die ein künstliches Substrat (Myelin-Basisprotein) verwendeten, dass eine STRAD-Untereinheit die Kinase-Aktivität von LKB1 stimuliert [30], und dass die MO25-Untereinheit diese Aktivität weiter stimuliert; dies erfolgt wahrscheinlich dadurch, dass sie den LKB1-STRAD-Komplex stabilisiert (Beispiel 1). Keine AMPKK-Aktivität wurde mit rekombinantem LKB1 erhalten, außer es wurde auf eine STRAD-Untereinheit exprimiert, und die Aktivität war bei der zusätzlichen Anwesenheit einer MO25-Untereinheit beträchtlich erhöht (15). Es konnte auch festgestellt werden, dass die Mengen von STRADα und STRADβ die mit LKB1 gemeinsam ausgefällt wurden, durch die Co-Expression von MO25α oder MO25β stark anwuchsen (15), konsistent mit unseren früheren Befunden (Beispiel 1). Der genaue Mechanismus, durch den die STRAD- und MO25-Untereinheiten LKB1 aktivieren, bleibt unklar, doch führen die Zusatz-Untereinheiten einen zusätzlichen Handlungsspielraum für die Regulierung der Kinase ein. Es ist bereits bekannt, dass LKB1 STRADα an zwei verschiedenen Stellen phosphoryliert [30], und dass STRADα und MO25α einen Komplex bilden, der LKB1 im Zytoplasma zurückhält (Beispiel 1). Es ist auch interessant festzustellen, dass sowohl AMPK als auch seine vorgeschaltete Kinase Heterotrimere sind. Erklärt die Aktivierung von AMPK die Fähigkeit von LKB1, als Tumor-Suppressor zu wirken und das Zellwachstum und die Zellausbreitung anzuhalten? Dies scheint sicherlich plausibel, weil außer der Tatsache, dass AMPK ein allgemeiner Inhibitor für die Biosynthese ist [1,2], es auch zunehmende Beweise gibt, dass AMPK das Fortschreiten durch den Zellzyklus regulieren kann. Beispielsweise hemmt die Aktivierung von AMPK die Ausbreitung von HepG2-Zellen durch Stabilisierung von p53 [13], und vermindert den Pegel des RNA-Bindeproteins HuR im Zytoplasma, was die Stabilität von mRNAs vermindert, welche die Zykline A und B1 kodieren [12]. Interessanterweise bewirkt die Expression von LKB1 in G361-Zellen, welche die Kinase nicht exprimieren, ein Anhalten in der G1-Phase, das mit einer Induktion von p21 einhergeht und von p53 abhängig ist [23, 24].
Eine weitere aufregende Möglichkeit ist, dass die LKB1-STRAD-MO25-Komplexe auch als vorgeschaltete Kinasen für andere Protein-Kinasen in der gleichen Weise wirken können, in welcher PDK1 Threonin-Residuen in der Aktivierungsschleife einer Reihe von Kinasen der „AGC"-Unterfamilie phosphoryliert [39]. Ein Dendrogram, das die Verhältnisse zwischen katalytischen Domäne-Sequenzen von 518 humanen Protein-Kinasen wiedergibt, die im humanen Genom kodiert werden [40] zeigt, dass die AMPKα1- und AMPKα2-Untereinheiten in einem kleinen Nebenzweig liegen, der auch acht andere Protein-Kinasen enthält (NuaK1, NuaK2, BrsK1, BrsK2, SIK, QIK, QSK und MELK; hinsichtlich der Einzelheiten siehe [41]), von denen die meisten zuvor entweder nicht untersucht wurden oder über die sehr wenig bekannt ist. Eine Ausrichtung der Aktivierungsschleifen-Sequenzen dieser Kinasen ist in 19 zusammen mit denjenigen der eng verwandten katalytischen Cα-Untereinheit der „AGC"-Unterfamilie von zyklischer, von AMP abhängiger Protein-Kinase (PKAα, die in der Aktivierungsschleife durch Autophosphorylierung phosphoryliert werden kann) und der α-Isoform von Protein-Kinase C (PKCα) dargestellt, die durch Phosphorylierung in der aktiven Schleife durch PDK1 aktiviert wird. Auch sind in 19 die Aktivierungsschleifen-Sequenzen der von Arabidopsis thaliana (AtSnRK1α1, AtSnRKα2) und Saccharomyces cerevisiae (ScSnf1) stammenden Homologe von AMPK dargestellt. Von beiden wurde früher gezeigt, dass sie in zellfreien Untersuchungen durch Rattenleber-AMPKK aktiviert werden [42, 43]. Alle diese Sequenzen sind an der C-terminalen Seite des Threonin-Residuums, welches das Ziel der Phosphorylierung ist, gut konserviert, doch sind die Mitglieder der AMPK/Snf1-Unterfamilie an der N-terminalen Seite zwischen dem invarianten „DFG"-Motiv und dem Threonin-Residuum noch stärker konserviert. Sequenz-Merkmale, die in der AMPK/SNF1-Unterfamilie aber nicht in der „AGC"-Familie konserviert sind, umfassen Paare von hydrophoben Residuen an den -3-, -2- und den -9-, -8-Positionen. NuaK1 und NuaK2 und die vom Menschen, Pflanzen und Hefen stammenden AMPK/SNF1-Kinasen haben auch ein konserviertes "LSN"-Motiv an den -12- bis -10-Stellen. Es muss noch ermittelt werden, ob die anderen humanen Kinasen in der AMPK-Unterfamilie durch Phosphorylierung der äquivalenten Aktivierungsschleifen-Threonin-Residuen aktiviert werden, und ob sie auch nachgeschaltete Ziele für die LKB1/STRAD/MO25-Komplexe sein können. Wenn dies der Fall ist, könnten diese anderen Kinasen einige der Tumor-Unterdrückungs-Funktionen von LKB1 vermitteln. Da die katalytischen Domänen in dieser Unterfamilie eng verwandt sind, die anderen Bereich aber die Tendenz für eine stärkere Variabilität besitzen, könnte man vermuten, dass diese Kinasen durch unterschiedliche Stressbelastungen oder andere Stimuli über eine Phosphorylierung durch LKB1/STRAD/MO25-Komplexe aktiviert werden können, und dass sie gemeinsam die verschiedenen zellulären Effekte vermitteln könnten, die durch LKB1 ausgelöst werden. Es ist auch möglich, dass sie sich mit AMPK einige gemeinsame nachgeschaltete Ziele teilen könnten.
Schlussfolgerungen
Unsere Ergebnisse liefern sowohl bei den zellfreien Untersuchungen als auch bei denen an ganzen Zellen einen deutlichen Beweis, dass Komplexe zwischen LKB1, STRADα/β und MO25α/β die lang gesuchten vorgeschalteten Kinase bilden, die AMPK über eine Phosphorylierung an Thr-172 in der Aktivierungsschleife aktivieren. Da es bereits bekannt ist, dass ein pharmakologische Aktivierung von AMPK eine allgemeine Hemmung der Biosynthese ebenso wie ein von p53-abhängiges Anhalten in der G1-Phase bewirkt, kann die Aktivierung von AMPK durch LKB1 zumindest teilweise die Fähigkeit letzterer erklären, als Tumor-Suppressor zu wirken. LKB1 kann auch als vorgeschaltete Kinase für andere Mitglieder der AMPK/SNF1-Unterfamilie von Protein-Kinasen wirken.
Materialien und Methoden
Materialien, Proteine und Antikörper
Protein-G-Sepharose und vorverpackte Q-Sepharose-Säulen stammten von Amersham Pharmacia Biotech, UK. Die katalytische Domäne von GST-AMPKα1 wurde in E. coli exprimiert und gereinigt, wie zuvor beschrieben [44]. Schaf-Antikörper gegen die α1- und α2-Untereinheiten von AMPK [45], humanes LKB1, MO25α und MO25β (Beispiel 1), und phosphorspezifische Antikörper gegen die Thr-172-Stelle an der AMPKα-Untereinheit (Anti-pT172) [46] wurden früher beschrieben. Schaf-Antikörper gegen die katalytische Domäne von AMPKα1 wurden gegen das Peptid CDPMKRATpIKDIRE-(Cystein + Residuen 252–264 von Ratten-α1, Tp = Phosphothreonin) unter Verwendung von Verfahren erzeugt, die für Anti-pT172 beschrieben sind [46]. Obwohl er als phosphorspezifischer Antikörper konstruiert wurde, erkennt er die katalytische Domäne von GST-AMPKα1, exprimiert in Bakterien, und die Erkennung wird nicht durch eine Protein-Phosphatase-Behandlung beeinflusst. Der monoklonale Antikörper gegen STRADα wurde früher beschrieben [30]. Quellen für andere Materialen und Proteine wurden früher beschrieben [14].
Enzym-Untersuchungen
AMPK [14] und AMPKK [34] wurden ebenso untersucht wie definierte Einheiten wie zuvor beschrieben. Die schnelle Lysis von Zellen für AMPK-Untersuchungen wurde früher beschrieben [47]. Die Untersuchungen wurden dreifach ausgeführt und die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.
Reinigung von AMPKK1 und AMPKK2
AMPKK wurde bis zum Blau-Sepharose-Stadium gereinigt, wie früher beschrieben [14]. Der Durchfluss durch diese Säule wurde auf 160 mM NaCl durch Verdünnung im Puffer A eingestellt (50 mM Hepes, 10% (Gew./Vol.) Glycerol, 0,02% (Gew./Vol.) Brij-35, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Benzamidin, 0,1 mM PMSF, 1 μg/ml Sojabohnen-Trypsin-Hemmer), und auf eine Hochleistungs-Säule Q-Sepharose HiLoad 16/10 in Puffer A plus 160 mM NaCl bei 3 ml/min angewendet. Die Säule wurde in Puffer A plus 160 mM NaCl gewaschen, bis A₂₈₀ < 0,05 war, und die AMPKK-Aktivität wurde dann mit einem linearen Gradienten (120 ml) aus 160 bis 400 mM NaCl in Puffer A ausgewaschen.
Expression des rekombinanten LKB1-Komplexes in HEK-293T-Zellen
Verschiedene Kombinationen von mit GST markiertem LKB1, mit FLAG markiertem STRADα oder STRADβ und mit myc markiertem MO25α oder MO25β wurden in HEK-293T-Zellen exprimiert und die Komplexe auf Glutathion-Sepharose gereinigt, wie in Beispiel 1.
Phosphorylierung der katalytischen Domäne von GST-α1 unter Verwendung von [γ-³²P]ATP
Die katalytische Domäne entweder von Wildtyp-GST-α1 (50 μg/ml) oder eines T172A-Mutanten [44] wurde 30 min lang bei 30°C mit 5 mM MgCl₂ und [γ-³²P]ATP (200 μM; ~750 cpm/pmol) in Anwesenheit oder Abwesenheit des GST-LKB1:STRADα:MO25α-Komplexes (20 Einheiten/ml) inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von SDS-Proben-Puffer (Invitrogen) beendet, die Polypeptide durch SDS-PAGE aufgelöst und das getrocknete Gel einer Autoradiographie unterzogen.
Zubereitung von rekombinanten AMPK-Heterotrimeren
Plasmide, die myc-α1, -β1 und -γ1 kodieren, wurden in CCL13-Zellen ko-exprimiert [45], und die Zellen wurden durch das schnelle Lysis-Verfahren [47] gewonnen. Die Lysate wurden mit einem Anti-Myc-Antikörper immuno-ausgefällt und in 50 mM NaHEPES, 1 mM Dithiothreitol, 0,02% (Gew./Vol.) Brij-35, pH-Wert 7,5, immuno-präzipitiert.
Immuno-Ausfällung von endogenem LKB1
Die Immuno-Ausfällung von endogenem LKB1 unter Verwendung eines Anti-human Antikörpers und Protein-G-Sepharose wird in Beispiel 1 beschrieben. Die Kinase-Kinase-Untersuchungen wurden unter Verwendung der katalytischen Domäne von GST-α1 als Substrat in Schüttet-Inkubatoren durchgeführt, wie dies früher für Immuno-Präzipitations-Untersuchungen von AMPK beschrieben wurde [47].
HeLa-Zellen die LKB1 exprimieren
Die Erzeugung von HeLa-Zellen, die stabil in induzierbarer Weise (Tet-ON) LKB1 vom Wildtyp oder einen kinase-inaktiven Mutanten exprimieren, und die Bedingungen für ihre Kultur wurden früher beschrieben [32].
Protein-Analyse und Elektrophorese
Die Protein-Konzentration wurde unter Verwendung des Farbstoff-Binde-Verfahrens von Bradford ermittelt [48]. SDS-PAGE wurde unter Verwendung von vorgegossenen Bis-Tris 4–12% Gradient-Polyacrylamid-Gelen in dem MOPS-Puffer-System (Invitrogen) durchgeführt, außer bezüglich der Analyse von Acetyl-CoA-Carboxylase, bei der vorgegossene 3–8% Tris-Acetat-Gele (Invitrogen) verwendet wurden. Die Proteine wurden auf Nitrozellulose-Membranen (BioRad) unter Verwendung des Xcell II Blot Module (Invitrogen) übertragen.
Detektion von Western Blots durch Infrarot-Abbildung
Um die Phosphorylierung von ACC zu analysieren, wurden Proben durch SDS-PAGE analysiert, auf Nitrozellulose (BioRad) übertragen und in Odyssey^TM Blocking-Puffer 1 h lang inkubiert, der 0,2% Tween-20 enthielt. Dann wurde Anti-pACC-Antikörper (1,46 μg/ml in Blocking-Puffer) zugegeben und 1 h lang geschüttelt. Die Membranen wurden 6 mal jeweils 5 min mit TBS (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 0,5 M NaCl) plus Tween-20 (0,2%) gewaschen. Die Membranen wurden in Blocking-Puffer eingetaucht, der 0,2% Tween-20 und 1 μg/ml Anti-Schaf-IgG konjugiert zu IR Färbemittel 680 (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) und 1 μg/ml Streptavidin konjugiert zu IR Färbemittel 800 (Rockland Inc., Philadelphia, PA) enthielt, und 1 h lang geschützt gegen Licht geschüttelt. Die Membranen wurden dann 6 mal jeweils 5 min unter Verwendung von TBS-Tween (0,2%) und 1 mal 5 min in PBS gewaschen. Die Membranen wurden in zwei verschiedenen Kanälen unter Verwendung des Odyssey^TM IR-Bildgerätes gescannt und die Ergebnisse unter Verwendung von Odyssey^TM-Software quantifiziert und als Verhältnis des Signals, das mit dem pACC-Antikörper erhalten wurden, zu dem Signal ausgedrückt, das mit Streptavidin erhalten wurde. Die Analyse der katalytischen Domäne von GST-α1 war ähnlich mit der Ausnahme, dass 4–12% Bis-Tris-Gele verwendet wurden und dass die Membranen gleichzeitig 1 h lang mit den Schaf-Anti-pT172- und den Anti-AMPKα1-catalytic-domain-Antikörpern getestet wurden, die direkt mit IR Färbemittel 680 und IR Färbemittel 800 gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert worden waren.
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Beispiel 3: Peptid-Substrat für LKB1
Eine Kinase-Untersuchung für LKB1 kann unter Verwendung eines Peptid-Substrats durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung des T-Schleifen-Peptids von AMPK, dessen Sequenz ist
LSNMMSDGEFLRTSCGSPNRRR
(HUMAN AMPKalpha-1 Residuen 163–181 mit 3 zusätzlichen Arg-Residuen, welche dem C-Terminal hinzugefügt sind um eine Bindung an P81-Papier zu ermöglichen).
Eine Untersuchung kann in der folgenden Weise durchgeführt werden. Andere Untersuchungen, die ein solches Substrat-Peptid verwenden, können verwendet werden beispielsweise solche mit einem hohen Durchsatz. Die Standard-Untersuchung (50 μl) enthielt: 0,3 μg gereinigten GST-LKB1-STRADα-MO25α-Komplex, 50 mM Tris/HCl pH-Wert 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1% (Vol.) 2-Mercaptoethanol, 10 mM Magnesiumacetat, 0,1 mM [γ³²P]ATP (~200 cpm/pmol) und T-Schleifen-Peptid (LSNMMSDGEFLRTSCGSPRRR, 10–2000 mM). Die Untersuchungen wurden 30 min lang bei 30°C durchgeführt und dann durch Pipettieren der Reaktionsmischung auf eine 1 cm² große Fläche von p81-Papier beendet, das mit 6 Chargen von 250 ml von 50 mM Phosphor-Säure (2 min bei jeder Waschung) gewaschen wurde, wobei das Papier einmal in 200 ml Aceton gewaschen und getrocknet wurde. Die an das p81-Papier gebundene Radioaktivität wurde durch Cherenkov-Zählung quantifiziert. Eine Einheit von Aktivität ist die Menge von Enzym, welche die Phosphorylierung von 1 nmol Peptid pro Minute katalysiert.
Der K_m-Wert für das Peptid wurde auf 1,80 ± 0,48 und der V_max-Wert auf 23,4 ± 3,5 abgeschätzt.
Beispiel 4: Aktivierung von mit AMPK verwandten Kinasen durch LKB1.
12 andere Protein-Kinasen (NUAK1, NUAK2, BRSK1, BRSK2, QIK, QSK, SIK, MARK1, MARK2, MARK3, MARK4 und MELK) sind nahe mit der durch AMP aktivierten Protein-Kinase (AMPK) verwandt. Wir zeigen hier, dass LKB1 die T-Schleife alle Mitglieder der AMPK-Unterfamilie (nicht für MELK gezeigt) phosphorylieren kann, wodurch ihre Aktivität mehr als 50-fach gesteigert wird. Die katalytische Aktivität von LKB1 und die Anwesenheit von MO25 und STRAD sind erforderlich, um alle mit AMPK verwandten Kinasen zu aktivieren. Eine Mutation des T-Schleifen-Thr, das durch LKB1 phosphoryliert wird zu Ala, verhinderte eine Aktivierung, während eine Mutation zu Glu konstitutiv aktive Formen von vielen der mit AMPK verwandten Kinasen erzeugte. Wir entwickelten Untersuchungen, um die Aktivitäten von endogenen NUAK2-, QIK-, QSK-, SIK-, MARK1-, MARK2/3- und MARK4-Kinasen in Zellen zu messen, die LKB1 exprimieren, und schöpften diese aus, um zu zeigen, dass die Aktivitäten dieser Enzyme in LKB1^–/–-Fibroblasten oder in HeLa-Zellen deutlich vermindert waren, die LKB1 nicht exprimieren. Interessanterweise wird weder die LKB1-Aktivität noch die von irgendeiner der mit AMPK verwandten Kinasen durch Phenformin oder AICA-Riboside stimuliert, d. h. von zwei Medikamenten, welche die Phosphorylierung und Aktivierung von AMPK induzieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass LKB1 als Haupt-Vorschalt-Protein-Kinase wirkt, welche die Aktivitäten von mit AMPK verwandten Kinasen sowie von AMPK reguliert. Unter sich können diese Kinasen einige der physiologischen Effekte von LKB1, einschließlich ihrer Tumor-Unterdrückungs-Funktion vermitteln.
Die Inspektion des menschlichen Kinoms zeigt an, dass es zwölf Protein-Kinasen (BRSK1, BRSK2, NUAK1, NUAK2, QIK, QSK, SIK, MARK1, MARK2, MARK3, MARK4 und MELK) gibt, die eng mit AMPKα1 und AMPKα2 verwandt sind (21A und B). Die Nomenklatur, die wir für die mit "AMPK verwandten Kinasen" verwenden, basiert auf der, die von Manning und Kollegen verwendet wird (Manning et al., 2002). MARK3 ist auch als PAR1A oder C-TAK1 (Peng et al., 1998; Spicer et al., 2003), NUAK1 als ARK5 (Suzuki et al., 2003b), NUAK2 als SNARK (Lefebvre et al., 2001) und QIK als SIK2 (Horike et al., 2003) bekannt. Das T-Schleifen-Thr-Residuum von AMPKα1 und AMPKα2, das durch LKB1 phosphoryliert wird, und viele der umgebenden Residuen sind in den mit AMPK verwandten Kinasen konserviert (21A & B). Dies deutet darauf hin, dass LKB1 auch diese T-Schleifen-Thr-Residuen phosphorylieren und somit die mit AMPK verwandten Kinasen in der gleichen Weise regulieren kann, wie PDK1 die Aktivität einer Gruppe von Verwandten AGC-Kinasen reguliert (Alessi, 2001). Es wurde vermutet dass die MARK-Kinasen Schlüsselrollen bei der Steuerung der Zellpolarität spielen, und es ist auch bekannt, dass sie durch die Phosphorylierung ihres T-Schleifen-Thr-Residuums reguliert werden (Lrewes and Nurse, 2003; Spicer et al., 2003). Studien an Drosophila zeigten zunächst, dass MARK3 stromaufwärts von LKB1 angeordnet sein kann (Martin and St Johnston, 2003), doch bestritten jüngere Arbeiten an Säugetierzellen diese Schlussfolgerung und schlugen vor, dass LKB1 MARK3 vorgeschaltet ist und dessen Aktivität steuert (Spicer et al., 2003). Über die Funktion oder den Regulationsmechanismus der verbleibenden mit AMPK verwandten Enzyme ist wenig bekannt. In diesem Beispiel versuchten wir daher, die Rolle zu erforschen, die LKB1 bei der Regulierung der Aktivität der mit AMPK verwandten Kinasen spielt.
Ergebnisse
Aktivierung von mit AMPK verwandten Kinasen durch den LKB1-Komplex. Wir klonierten und exprimierten in E. coli die die volle Länge besitzenden Versionen aller zwölf mit AMPK verwandten Kinasen und entwickelten Studien für diese Enzyme, bei denen das AMARA-AMPK-Peptid-Substrat für AMPK verwendet wurde (Dale et al., 1995), das durch den LKB1-Komplex nicht phosphoryliert wird (JML, Daten nicht dargestellt). Wir fanden, dass alle der mit AMPK verwandten Kinasen, die aus E. coli gereinigt wurden, dieses Peptid phosphorylierten und niedrige Basis-Aktivitäten von < 1 U/mg (1 Einheit = 1 nmol Peptid phosphoryliert pro Minute) besaßen, mit Ausnahme von MELK, das eine Aktivität von 40 U/mg besaß (21). Nach einer Inkubation der mit AMPK verwandten Kinasen mit dem LKB1:STRAD:MO25-Komplex und MgATP, war die Aktivität der mit AMPK verwandten Kinasen um das 50- bis 200-fache erhöht, mit Ausnahme von MELK, dessen Aktivität fast überhaupt nicht erhöht war (21). Katalytisch inaktive LKB1 im Komplex mit STRADα und MO25α erhöhte die Grundaktivität der mit AMPK verwandten Kinasen nicht, was anzeigt, dass die Kinasen-Aktivität von LKB1 erforderlich war (21).
Aktivierung von mit AMPK verwandten Kinasen durch LKB1 erfordert STRAD und MO25. Um die Bedeutung der STRAD- und MO25-Untereinheiten dafür zu untersuchen, ob LKB1 die mit AMPK verwandten Kinasen aktivieren kann, exprimierten wir mit GST markierte LKB1, mit FLAG markierte STRADα/β und mit myc markierte MO25α/β in verschiedenen Kombinationen in 293-Zellen und führten eine Affinitäts-Reinigung der Komplexe auf Glutathion-Sepharose durch (22). Die gereinigten Komplexe wurden in Anwesenheit MgATP mit den mit AMPK verwandten Kinasen inkubiert und ihre Aktivierung wurde gemessen. LKB1 für sich alleine aktivierte keine der mit AMPK verwandten Kinasen in merklicher Weise (22, vergleiche Spuren 1 und 14). Das gleiche Ergebnis wurde mit LKB1 erzielt, das mit MO25α oder MO25β ko-exprimiert worden war (22, Spuren 4 und 5). Dies wurde erwartet, da diese Proteine in Abwesenheit von STRADα/β mit LKB1 nicht in Wechselwirkung treten (Beispiel 1; Boudeau et al., 2003a). Ein LKB1:STRADα-Komplex ergab eine kleine Aktivierung (22, vergleiche Spuren 1 und 2), doch ein heterotrimerer Komplex, der LKB1, STRADα oder STRADβ und MO25α oder MO25β enthielt, war erforderlich, um eine starke Aktivierung zu erzielen (22, Spuren 6 bis 9). Wie zuvor für AMPKα1 berichtet (22 und Beispiel 2; Hawley et al., 2003), wurden alle mit AMPK verwandten Kinasen am wirksamsten durch den LKB1:STRADα:MO25α-Komplex aktiviert, obwohl die relative Wirksamkeit von verschiedenen heterotrimeren Komplexen von Substrat zu Substrat variierte (22). Heterotrimere Komplexe, die einen katalytisch inaktiven Mutanten von LKB1 enthielten, waren nicht in der Lage, irgendein Enzym zu aktivieren (22, Spuren 10 bis 13). Es sei darauf hingewiesen, dass dann, wenn STRAD-Isoformen gemeinsam mit LKB1 in Abwesenheit von MO25 exprimiert wurden, die Menge von STRAD, das gemeinsam mit LKB1 ausgefällt wurde, deutlich vermindert war (22, vergleiche Spuren 2 und 3 mit Spuren 6 und 7), da MO25 erforderlich war, um den LKB1:STRAD-Komplex zu stabilisieren (Beispiel 1; Boudeau et al., 2003a).
Der LKB1-Komplex phosphoryliert mit AMPK verwandte Kinasen an der Aktivierungsschleife
Da früher gezeigt worden war, dass der LKB1-Komplex AMPKα1-spezifisch am Thr172 in seiner Aktivierungsschleife phosphoryliert haben wir zuerst das äquivalent T-Schleifen-Residuum in den mit AMPK verwandten Kinasen (21A + B) zu Ala mutiert und getestet wie dies die Phosphorylierung dieser Enzyme durch den LKB1-Komplex beeinflusste. Wir zeigten, dass die mit AMPK verwandten Kinase vom Wildtyp durch den LKB1-Komplex phosphoryliert wurden und dass eine Mutation des T-Schleifen-Thr-Residuums zu Ala die Phosphorylierung völlig beseitigte oder erheblich verminderte (23). Wir führten auch eine detaillierte Phosphorylierungs-Stellen-Analyse der katalytisch inaktiven BRSK2- und NUAK2-Mutanten durch, die in vitro durch den LKB1-Komplex phosphoryliert worden waren (30). Die mit ³²P markierten BRSK2- und NUAK2-Proteine wurden mit Trypsin abgebaut und die sich ergebenden Peptide durch Chromatographie auf einer C₁₈-Säule getrennt. Die hauptsächlichen mit ³²P markierten Peptide wurden durch MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometrie und Festphasen-Edman-Sequenzierung analysiert, was zeigte, dass diese Enzyme an ihrem T-Schleifen-Thr-Residuum phosphoryliert waren (30).
T-Schleifen-Phosphorylierung aktiviert die mit AMPK verwandten Kinasen. Um die Rolle zu studieren, welche die T-Schleifen-Phosphorylierung von BRSK1, BRSK2, NUAK1, NUAK2, QIK, QSK, SIK und MELK bei ihrer Regulierung spielt, wurden die T-Schleifen-Thr-Residuen dieser Enzyme entweder zu Ala mutiert, um eine Phosphorylierung zu verhindern, oder zu Glu, um eine Phosphorylierung zu imitieren. In allen Fällen war die Basis-Aktivität der Ala-Mutanten niedrig, und ihre Aktivität erhöhte sich durch eine Inkubation mit dem LKB1-Komplex nicht (24). Im Gegensatz hierzu war die Basis-Aktivitat der Glu-Mutanten ähnlich zu der des Wildtyp-Enzyms, das durch LKB1 phosphoryliert wurde, und wurde nach einer Inkubation mit dem LKB1-Komplex und MgATP nicht weiter erhöht (24). Im Fall von MELK besaß der Ala-Mutant eine niedrige Aktivität und der Glu-Mutant war von ähnlicher Aktivität wie das Wildtyp-Enzym, was darauf hinweist, dass Wildtyp-MELK (wie andere mit AMPK verwandte Kinasen) eine T-Schleifen-Phosphorylierung für seine Aktivität erfordert. Da in E. Coli exprimiertes Wildtyp-MELK aktiv war, kann MELK in der Lage sein, die Phosphorylierung seines eigenen T-Schleifen-Thr-Residuums zu katalysieren. In Konsistenz hiermit zeigte eine MALDI-TOF-TOF-Analyse des in E. coli exprimierten Wildtyp-MELKs, dass die T-Schleife tatsächlich phosphoryliert wurde (30C).
Phosphorylierung und Aktivierung der MARK-Kinasen durch LKB1. Frühere Studien haben gezeigt, dass die MARK3 und MARK3-Kinasen zusätzlich dazu, dass sie am T-Schleifen-Thr-Residuum phosphoryliert werden, auch an einem nahe gelegenen Ser-Residuum phosphoryliert werden (21A und B und (Drewes et al., 1997; Johnson et al., 1996; Timm et al., 2003)). Eine Peptid-Kartierung von katalytisch inaktiver MARK3, die durch den LKB1-Komplex phosphoryliert war, zeigte, dass sowohl das Thr211- als auch das Ser215-Residuum in der T-Schleife phosphoryliert war (25A). Interessanterweise wurde ein katalytisch inaktiver MARK3[T211A]-Mutant durch LKB1 bei Ser215 nicht phosphoryliert, doch wurde der katalytisch inaktive MARK3[S215A]-Mutant weiterhin an Thr211 phosphoryliert (25A). Als nächstes untersuchten wir, wie eine Mutation der T- Schleifen-Thr- oder -Ser-Residuen die Aktivierung von MARK3 durch den LKB1-Komplex beeinflusste (25C). Der MARK3[T211A]-Mutant konnte durch den LKB1-Komplex nicht aktiviert werden, doch wurde der MARK3[S215A]-Mutant in geringem Maße aktiviert. Der MARK3[T211E]-Mutant besitzt nur ungefähr 15% der Aktivität des durch den LKB1-Komplex aktivierten Wildtyp-Enzyms und konnte durch LKB1 nicht weiter aktiviert werden. Der MARK3[S215E]-Mutant war inaktiv und konnte durch LKB1 nicht aktiviert werden (25C). Erwartungsgemäß fanden wir auch, dass eine Mutation des T-Schleifen-Thr zu Ala in MARK1, MARK2 und MARK4 ihre Aktivierung durch LKB1 verhinderte (25D bis F). Eine Mutation des T-Schleifen-Thr-Residuums zu Glu in MARK1, MARK2 und MARK3, führte entweder zu keiner oder nur zu einer geringen Aktivierung dieser Enzyme (25D bis F). Im Gegensatz erhöhte eine äquivalente Mutation von MARK4 die Aktivität sehr stark (25F). Peptid-Kartierungs-Studien und eine MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometrie zeigten, dass LKB1 die T-Schleife von MARK4 nur am Thr-Residuum und nicht am Ser-Residuum phosphorylierte (25G und 30C).
Identifizierung von Peptid-Substraten für LKB1. Als nächstes untersuchten wir, ob der LBK1-Komplex in der Lage war, Peptide zu phosphorylieren, welche die Aktivierungsschleife von AMPKα1, BRSK2, NUAK2, SIK, MARK3 und MELK umgeben. Alle diese Peptide wurden phosphoryliert, aber mit unterschiedlichen Wirksamkeiten (26A). Eine Festphasen-Edman-Sequenzierung bestätigte, dass jedes Peptid spezifisch durch LKB1 am T-Schleifen-Thr-Residuum phosphoryliert war (26B). Das optimale Peptid-Substrat, das von der T-Schleife von NUAK2 abgeleitet worden war, wurde durch LKB1 mit einem K_m-Wert von 150 μM phosphoryliert und war ein besseres Substrat, als das von der T-Schleife von AMPKα1 abgeleitete Peptid (K_m, 1,4 mM) (26A). Das MELK-Peptid war das schlechteste Substrat. Wir untersuchten auch die verschiedenen, in 22 verwendeten Kombinationen von LKB1-STRADα/β- und MO25α/β-Komplexen mit den T-Schleifen-Peptiden als Substrate, und das Muster der LKB1-Aktivität spiegelte das wieder, was unter Verwendung der die gesamte Länge besitzenden Proteine beobachtet worden war (vergleiche 22 und 26C). Diese Ergebnisse zeigen, dass die T-Schleifen-Peptide als Bona-Fide-Substrate verwendet werden können, um die LKB1-Aktivität in einer einfachen, Ein-Schritt-Untersuchung zu messen. Das NUAK2-T-Schleifen-Peptid wurde durch LKBtid abgeschlossen.
Rolle von LKB1 beim Regulieren von mit AMPK verwandten Kinasen in Fibroblasten. Um die Rolle von LKB 1 bei der Regulierung von mit AMPK verwandten Kinasen in intakten Zellen zu untersuchen, erzeugten wir Peptid-Antikörper gegen spezielle Sequenzen in den zwölf mit AMPK verwandten Kinasen. Die Fähigkeit dieser Antikörper, die aktiven Formen der mit AMPK verwandten Kinasen durch Immuno-Präzipitation auszufällen, wurde durch die Verwendung von HEK-293-Zell-Lysaten abgeschätzt, bei denen die Kinasen überexprimiert worden waren und von denen festgestellt wurde, dass sie aktiv sind (Daten nicht dargestellt). Unter Verwendung dieser Vorgehensweise waren wir in der Lage, Antikörper zu entwickeln, die selektiv zu einer Immuno-Präzipitation von allen mit AMPK verwandten Kinasen mit Ausnahme von MARK2 und MARK3 führten, deren Aktivität unter Verwendung eines handelsüblichen Antikörpers abgeschätzt wurde, der zu einer Immuno-Präzipitation von diesen beiden Kinasen aber nicht von MARK1 und MARK4 führte (Daten nicht dargestellt). Unter Verwendung der spezifischen Antikörper waren wir in der Lage, endogen exprimierte NUAK2, QIK, QSK, SIK MARK1, MARK2/3 und MARK4 in embryonalen LKB1^+/+-Mäuse-Fibroblasten (MEFs) durch Immuno-Präzipitation auszufällen (27). Wir verglichen dann die Aktivitäten dieser Kinasen, die aus LKB1^+/+- und LKB1^–/–-MEFs durch Immuno-Präzipitation ausgefällt worden waren, und fanden, dass die Aktivität von NUAK2, QIK, QSK, SIK, MARK1 und MARK4 bei den LKB1^–/–-MFEs um das 7- bis 35-fache vermindert war (27). Die kombinierte MARK2/3-Aktivität war in den LKB1^–/–-MEFs ungefähr 3-fach vermindert (27G). Ein Immuno-Blotting zeigte, dass die verminderte Aktivität von mit AMPK verwandten Kinasen in LKB1^–/–-Zellen nicht durch eine Verringerung in der Expression der Enzyme verursacht war, die entweder mit den gleichen oder geringfügig verminderten Pegeln in den Knockout-Zellen vorhanden waren.
Interessanterweise wurden im Gegensatz zu AMPKα1 (27A), die untersuchten, mit AMPK verwandten Kinasen durch Phenformin nicht merklich stimuliert (27B bis 27H). Dies deutet darauf hin, dass Phenformin die Aktivierung von AMPK nicht durch Aktivierung von LKB1 auslöst. In Übereinstimmung hiermit zeigten wir, dass zunehmende Dosen von Phenformin, die fortschreitend AMPK aktivierten (und die Phosphorylierung von Thr172 erhöhten), die LKB1-Aktivität jedoch nicht stimulierten (28A). Das Medikament 5-Aminoimidazol-4-Carboxamid(AICA)-Riboside aktiviert AMPK in intakten Zellen dadurch, dass es aufgenommen und durch Adenosin-Kinase in AICA-Riboside-Monophosphat umgewandelt wird, das den Effekt von AMP auf das AMPK-System nachahmt (Corton et al., 1995). AICA-Riboside aktivierte AMPK in LKB1^+/+-MEFs, war aber nicht in der Lage, irgendeine der mit AMPK verwandten Kinasen in deutlicher Weise zu aktiveren (28B).
Expression von LKB1 stellt die Aktivierung von mit AMPK verwandten Kinasen in HeLa-Zellen wieder her. Um weitere genetische Beweise dafür zu erhalten, das LKB1 als vorgeschalteter Regulator der mit AMPK verwandten Kinasen wirkt, verglichen wir die Aktivität von mit AMPK verwandten Kinasen in HeLa-Zellen, die LKB1 nicht exprimieren, mit HeLa-Zellen, die in stabiler Weise entweder Wildtyp-LKB1 oder katalytisch inaktives LKB1 exprimieren (Beispiel 2; Hawley et al., 2003; Sapkota et al., 2002). In Kontroll-HeLa-Zellen, die LKB1 nicht exprimieren, oder Zellen, die katalytisch inaktives LKB1 exprimieren, war die Aktivität von NUAK2, QIK, QSK und SIK 20-mal bis 40-mal niedriger als sie in HeLa-Zellen beobachtet wurde, welche Wildtyp-LKB1 exprimieren (29B bis 29E). Die MARK1-, kombinierte MARK2/3- und MARK4-Aktivität in Kontroll-HeLa-Zellen war ungefähr 2- bis 3-mal geringer als in Zellen, die LKB1 exprimieren (29F bis 29H). Im Gegensatz zu AMPKα1 (29A) wurde keine der mit AMPK verwandten Kinasen signifikant aktiviert, wenn die HeLa-Zellen mit Phenformin stimuliert wurden (29B bis 29H).
Diskussion
In diesem Beispiel liefern wir einen Beweis dafür, dass LKB1 in der Weise arbeitet, dass es die Aktivität von 11 der 12 Mitglieder der Familie der mit AMPK verwandten Protein-Kinasen reguliert. In zellfreien Systemen zeigten wir, dass alle mit AMPK verwandten Kinasen, die wir untersuchten, mit Ausnahme von MELK, nach der Phosphorylierung ihres T-Schleifen-Thr-Residuums durch den LKB1:STRAD:MO25-Komplex mehr als 50-fach aktiviert wurden. Im Fall von MELK zeigen unsere Resultate, dass dieses Enzym eine T-Schleifen-Phosphorylierung für seine Aktivität benötigt, doch dass es in der Lage ist, sein eigenes T-Schleifen-Residuum zu phosphorylieren. Nach unserer Kenntnis ist dies das erste Mal, dass gezeigt wird, dass die BRSK1-, BRSK2-, NUAK1-, NUAK2-, QIK-, QSK-, SIK-Enzyme ebenso wie das MELK-Enzym durch Phosphorylierung aktiviert werden können. Eine Mutation des T-Schleifen-Thr-Residuums zu Ala verhinderte die Aktivierung von allen diesen Enzymen durch den LKB1-Komplex, während seine Mutation zu Glu ausreichend war, um BRSK1, BRSK2, NUAK1, NUAK2, SIK, QIK, QSK und MARK4 zu speziellen Aktivitäten zu aktivieren, die ähnlich der Aktivität waren, die für die von LKB1 phosphorylierten Formen dieser Enzyme beobachtet wurde (24). Dieser letztere Befund könnte bei einer künftigen Überexpression oder bei Knock-in-Studien ausgenützt werden, um konstitutiv aktive Formen dieser Enzyme in Zellen einzuführen, um ihre zelluläre Rolle zu untersuchen.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass MARK2 und MARK3 an dem T-Schleifen-Thr-Residuum ebenso wie an dem benachbarten Ser-Residuum phosphoryliert wurden (Drewes et al., 1997; Johnson et al., 1996). Das in MARK2/MARK3 phosphorylierte T-Schleifen-Ser-Residuum ist in AMPKα1, AMPKα2 und allen mit AMPK verwandten Kinasen konserviert (21A & B), aber zumindest für AMPKα1 gibt es keinen Beweis, dass dieses Residuum in vivo phosphoryliert wird (Woods et al., 2003b). Sowohl unsere Analyse (25A und 25B), als auch die einer vor kurzem durchgeführten Studie (Timm et al., 2003), zeigte, dass die Phosphorylierung des T-Schleifen-Thr-Residuums der MARK-Kinasen die wichtigste Rolle bei der Regulierung der Aktivität dieser Klasse von Kinasen spielte. Der LKB1-Komplex phosphorylierte einen katalytisch inaktiven MARK3-Mutanten sowohl am Thr- als auch T-Schleifen-Ser-Residuum (25A). Das isolierte MARK3-T-Schleifen-Peptid wurde jedoch durch LKB1 nur am Thr-Residuum phosphoryliert (26), was zeigt, dass die Hauptsequenz des Peptids nicht ausreichend war, um es LKB1 zu ermöglichen, das Ser-Residuum zu phosphorylieren. Der Befund, dass eine Mutation des T-Schleifen-Thr211 zu Ala an MARK3 eine Phosphorylierung von Ser215 durch den LKB1-Komplex verhinderte, deutet an, dass eine Phosphorylierung von Thr211 für eine Phosphorylierung von Ser215 erforderlich ist. Es ist möglich, dass MARK4 auf andere Weise reguliert wird, da Peptid-Kartierungs-Studien zeigten, dass MARK4 durch LKB1 nur am T-Schleifen-Thr phosphoryliert wurde (25G), und dass eine Mutation des T-Schleifen-Thr zu Glu die Aktivität auf einen wesentlich größeren Pegel erhöhte, als dies für andere MARK-Isoformen beobachtet wurde (25F). Es wurde früher für MARK2 berichtet, dass eine Mutation der T-Schleife zu Glu seine spezifische Aktivität 3-fach erhöht (Timm et al., 2003), und wir machten ähnliche Feststellungen mit dieser Mutation, welche die MARK2-Aktivität von 2,2 U/mg auf 6,7 U/mg erhöhte (25D). Im Gegensatz zu TAO1, welches MARK2 nur 10-fach aktivierte (Timm et al., 2003), erhöhte der LKB1-Komplex die Aktivierung von MARK2 200-fach, was zeigt, dass eine Mutation des MARK2 T-Schleifen-Thr zu Glu die Kinase nicht merklich aktiviert.
Wie für die Aktivierung von AMPKα1 und AMPKα2 beobachtet wurde (Hawley et al., 2003), war die Anwesenheit von STRAD- und MO25-Untereinheiten entscheidend dafür, dass LKB1 alle mit AMPK verwandten Kinasen in zellfreien Untersuchungen aktivierte. Dies ist ein deutlicher Nachweis, dass viele Protein-Kinasen auf Residuen angewiesen sind, die als Docking-Stellen bezeichnet werden, und außerhalb des katalytischen Kerns liegen, um die Kinase und das Substrat zusammenzubringen. Es ist möglich, das die STRAD- und MO25-Untereinheiten eine Rolle bei der Erleichterung der Wechselwirkung mit und somit der Phosphorylierung durch LKB1 spielen. Der Befund, dass der LKB1:STRAD:MO25-Komplex das kurze T-Schleifen-Peptid von AMPKα1 und von mit AMPK verwandten Kinasen mit wesentlich höherer Rate phosphorylierte als LKB1 alleine, zeigte, dass die STRAD- und MO25-Untereinheiten das LKB1 direkt aktivieren. Dieses Ergebnis schließt jedoch die Möglichkeit nicht aus, dass STRAD und MO25 auch eine Rolle bei der Substrat-Erkennung spielen.
Dadurch, dass wir LKB1^–/–-MEFs und/oder HeLa-Zellen verwendeten, denen LKB1 fehlt, konnten wir zeigen, dass die Aktivitäten von endogen exprimierten NUAK1, NUAK2, QIK, QSK und SIK 7 bis 40-mal niedriger waren als bei LKB^+/+MEFs oder HeLa-Zellen, die stabil Wildtyp-LKB1 exprimieren. Dies liefert einen genetischen Beweis dafür, dass LKB1 die Rate bei der Aktivierung dieser Enzyme in intakten Zellen begrenzt. Unsere Daten schließen jedoch die Möglichkeit nicht aus, dass andere Kinasen die Aktivität von mit AMPK verwandten Kinasen in vivo zusätzlich zu LKB1 regulieren können. Kürzlich wurde die TAO1-Kinase aus Schweinegehirn als die Hauptaktivität gereinigt, welche das T-Schleifen-Thr-Residuum von MARK2 phosphoryliert, was zu dessen Aktivierung führt (Timm et al., 2003). Obwohl TAO1 in Überexpressions-Studien auch MARK2 aktivierte (Timm et al., 2003), wurde bisher kein genetischer Beweis berichtet, der darauf hinweist, wie das Fehlen von TAO1 die Aktivität der MARK-Familien-Kinasen in vivo beeinflusst. Ein solcher Beweis ist möglicherweise schwer zu erbringen, da Säugetier-Zellen drei nahe verwandte TAO-Isoformen besitzen (Manning et al., 2002). Das Fehlen von spezifischen immuno-ausfällenden Antikörpern bedeutete, dass wir nicht in der Lage waren, zu zeigen, wie ein Mangel von LKB1 die individuellen Aktivitäten von MARK2 oder MARK3 beeinflusst. Der Befund, dass die kombinierte Aktivität von MARK2 und MARK3 in LKB1 und Kontroll-HeLa-Zellen beträchtlich war, zeigt jedoch, dass andere Kinasen, wie z. B. TAO1 die Aktivitäten dieser Enzyme regulieren könnten. Es soll darauf hingewiesen werden, dass LKB1 und TAO1 keine offensichtliche Aminosäuren-Sequenz-Homologie gemeinsam haben und in unterschiedlichen Bereichen des menschlichen Kinase-Dendrograms liegen (Manning et al., 2002). TAO1 gehört zu der STE20-Gruppe von Kinasen und ist daher mit STRADα und STRADβ verwandt, doch ist nicht bekannt, ob dies signifikant ist.
Die Mitglieder der MARK-Kinasen-Familie (MAP/microtubule-affinity regulierende Kinase) sind die am häufigsten untersuchten Familien-Mitglieder der mit AMPK verwandten Kinasen, und man nimmt an, dass sie Schlüsselrollen bei der Ausbildung der Zell-Polarität spielen. Beispielsweise zeigen genetische Studien, dass MARK-Homologe die Teilung der C. elegans Zygote (Guo and Kemphues, 1995) und die Ausbildung der embryonalen Achse bei Drosophila (Shulman et al., 2000; Tomancak et al., 2000) steuern. In neuronalen Zellen phosphorylieren die MARK-Kinasen das dem neuronalen Mikrotubule zugeordnete Protein Tau, was zur Destabilisierung von Mikrotubules führt (Drewes et al., 1997). Interessanterweise wurde das Gegenstück zu Säugetier-LKB1 bei C. elegans (Watts et al., 2000), das als PAR4 bezeichnet wurde, ursprünglich als Mitglied der müt terlicherseits exprimierten PAR-Gen-Familie (Teilungs-effektiv) identifiziert, das für die Ausbildung der Zell-Polarität während des ersten Zyklus der Embryogenese von C. elegans erforderlich ist (Kemphues et al., 1988). Es wurde gezeigt, dass maternale letale Mutationen in dem PAR4-kodierenden Gen von C. elegans mehrere Aspekte der Zell-Polarität beeinflussen (Morton et al., 1992). Diese führen zu Phänotypen, ähnlich denen, die bei C. elegans beobachtet wurden, bei denen das PAR1-Gen mutiert war, welches die Homologen von MARK3 kodiert (Guo and Kemphues, 1995). In noch jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass die Homologen des menschlichen LKB1 sowohl bei Drosophila (Martin and St. Johnston et al., 2003) als auch bei Xenopus (Ossipova et al., 2003) wichtige Rollen bei der Regulierung der Zell-Polarität spielen. Ursprünglich wurde vorgeschlagen, dass Drosophila-LKB1 stromabwärts von PAR1/MARK3 funktioniert, da eine Überexpression von Drosophila-LKB1 den Polaritäts-Phänotyp von PAR1/MARK3-Mutanten unterdrückte (Martin and St. Johnston et al., 2003). Es wurde jedoch in HeLa-Zellen, die LKB1 nicht exprimieren, gefunden, dass MARK3 in einem dephosphorylierten Zustand existiert und dass eine Wiedereinführung von LKB1 die Phosphorylierung von MARK3 an seiner T-Schleife förderte (Spicer et al., 2003), was anzeigt, dass sich das LKB1 stromaufwärts von MARK3 befindet, bzw. diesem vorgeschaltet ist. Eine Erklärung, welche die offensichtliche Diskrepanz zwischen den Studien an Drosophila und an Säugetieren lösen könnte, wäre, dass dann, wenn eine Überexpression von Drosophila-LKB1 den Polaritäts-Phänotyp von PAR1/MARK3-Mutanten unterdrückt, dennoch die Aktivierung von anderen mit AMPK verwandten Kinasen in der Lage sein könnte, den Verlust der PAR1/MARK3-Funktion zu kompensieren.
Hinsichtlich der Funktion der anderen, mit AMPK verwandten Kinasen, beispielsweise von BRSK1, BRSK2, NUAK1, NUAK2, QIK, QSK und SIK ist weit weniger bekannt. Ein Northern-Blotting von NUAK1, NUAK2, QIK und SIK, das von anderen Gruppen durchgeführt wurde (siehe unten) und eine Analyse von EST-Klonen (Tabelle 2), zeigten, dass die mit AMPK verwandten Kinasen mit Ausnahme von BRSK1, BRSK2 und MELK wahrscheinlich in vielen Geweben exprimiert werden. BRSK1 und BRSK2-EST-Klone wurden hauptsächlich von neuronalen Geweben abgeleitet, und nach einer Immuno-Blot-Analyse einer Vielzahl von Rattengeweben wurden diese Enzyme nur im Gehirn und, mit geringen Pegeln, im Hoden entdeckt (K. Sakamoto, unveröffentlichte Ergebnisse). Bis heute wurde von MELK (maternale, embryonale Leucin-Zipper-Kinase) nur berichtet, das es während der Säugetier-Embryogenese exprimiert wird, wobei die stärkste Expression während der Reifung der Oozyten und während der Präimplantations-Entwicklung detektiert wurde (Heger et al., 1999; Heger et al., 1997). Obwohl unsere gegen BRSK1, BRSK2 und MELK erzeugten Antikörper ohne weiteres die rekombinanten Enzyme zur Immuno-Präzipitation brachten, waren wir nicht in der Lage, ihre Aktivität in MEFs oder HeLa-Zellen zu detektieren (OG, Daten nicht dargestellt). SIK (durch Salz induzierbare Kinase) wurde zuerst aus den Adrenal-Drüsen von Ratten kloniert, die mit stark salzreicher Diät gefüttert worden waren (Wang et al., 1999). SIK-mRNA wurde auch durch Membran-Depolarisation im Gehirn induziert (Feldman et al., 2000), und jüngste Studien haben gezeigt, dass SIK dann, wenn es in Zellen überexprimiert wird, eine Rolle bei der Steroidogenese spielen kann (Takemori et al., 2003). Die mRNA, die QIK exprimiert (das auch als SIK2 bezeichnet wird) war am höchsten im Körperfettgewebe und in Überexpressions-Studien wurde berichtet, dass QIK menschliches IRS1 und Ser794 phosphoryliert (Horike et al., 2003), das Residuen-Äquivalent zu Ser789 in Ratten-IRS1, von dem gezeigt wurde, dass es durch AMPK phosphoryliert wird (Jacobsen et al., 2001). In Überexpressions-Studien wurde gezeigt, dass NUAK1 (ARK5) die durch gewisse Stimulierungen (einschließlich Nährstoff-Aushungerung) induzierte Apoptose unterdrückt (Suzuki et al., 2003a). Darüber hinaus wurde behauptet, dass Akt/PKB NUAK1 an einer C-terminalen Stelle außerhalb der katalytischen Domäne phosphoryliert, was zu einer dreifachen Aktivierung des Enzyms führt (Suzuki et al., 2003b). NUAK2 (SNARK) wurde am stärksten in den Nieren exprimiert und es wurde berichtet, dass seine Aktivität durch Glukose-Aushungerung von Zellen stimuliert wurde (Lefebvre et al., 2001; Suzuki et al., 2003b). Nach unserem Wissen haben sich keine früheren Studien mit den Rollen von BRSK1, BRSK2 und QSK befasst.
Es ist klar, dass weitere Arbeiten durchgeführt werden müssen, um die Mechanismen der Regulierung und Funktion der mit AMPK verwandten Kinasen weiter zu beschreiben. Unsere Studien zeigen, dass zumindest in MEFs und HeLa-Zellen die stabil LKB1 exprimieren, die mit AMPK verwandten Kinasen im Gegensatz zu AMPK in Reaktion auf die Medikamente Phenformin und AICA-Riboside nicht aktiviert wurden. Dies deutet darauf hin, dass die nützlichen, gegen Diabetes wirkenden Effekte von Phenformin und Metformin durch die Aktivierung von AMPK statt durch die Aktivierung von mit AMPK verwandten Kinasen vermittelt werden kann. Der Befund, dass die mit AMPK verwandten Kinasen durch Phenformin oder AICA-Riboside nicht aktiviert werden, ist in Übereinstimmung mit unseren Befunden, dass diese Behandlungen LKB1 nicht direkt in LKB1^+/+-MEFs (28A) oder in COS7-Zellen aktivieren (Woods et al., 2003a). in weiteren Studien wird es wichtig sein, die physiologischen Stimuli zu definieren, welche eine Aktivierung der mit AMPK verwandten Kinasen bewirken, um festzustellen, ob diese Enzyme ebenso wie AMPK regulatorische Untereinheiten besitzen, welche ihre Aktivierung steuern.
Eine signifikante Anzahl von vererbten Formen von PJS, die sich in bestimmten Familien finden, zeigen keine Mutationen im LKB1-Gen (Buchet-Poyau et al., 2002; Resta et al., 2002), was darauf hinweist, dass es einen zweiten verursachenden Lokus für PJS geben sollte. Es wird klarerweise nun wichtig sein, herauszufinden, ob PJS-Familien, welche das normale LKB1-Protein exprimieren, Mutationen in anderen mit AMPK verwandten Kinasen aufweisen.
Zusammenfassend gesagt, haben wir gezeigt, dass LKB1 als vorgeschaltete Haupt-Kinase wirkt, welche 11 mit AMPK verwandte Kinasen zusätzlich zu AMPKα1 und AMPKα2 aktiviert. Es ist möglich, dass diese Enzyme einige der physiologischen Effekte vermitteln, die früher LKB1 zugeschrieben wurden, und das eine oder mehrere dieser Kinasen selbst als Tumor-Unterdrücker wirken.
Materialien. Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten und Sequenzier-Grade-Trypsin wurden von Roche bezogen. N-Octyl-glukosid stammte von Calbiochem und Gewebe-Kultur-Reagenzien von Life Technologies. Tetracyclin-freies fötales Rinderserum (FBS) stammte von Perbio und andere Gewebekultur-Reagenzien von Biowhittaker. Precast-4–12% und 10% Polyacrylamid-Bis-Tris-Gele wurden von Invitrogen bezogen; P81- Phosphocellulose-Papier stammte von Whatman; Phenformin von Sigma und AICA-Riboside von TorontoXX. [γ-³²P]ATP, Glutathion-Sepharose, Protein G-Sepharose wurden von Amersham Biosciences gekauft. Alle Peptide wurden von Dr. Graham Bloomberg an der Universität von Bristol synthetisiert.
Antikörper. Die folgenden Antikörper wurden in Schafen erzeugt und auf dem geeigneten Peptid-Antigen affinitäts-gereinigt: BRKS1 (MVAGLTLGKGPESPDGDVS, Residuen 1–20 von humanem BRSK1), BRSK2 (LSWGAGLKGQKVATSYESSL, Residuen 655–674 von humanem BRSK2), NUAK1 (MEGAAAPVAGDRPDLGLGAPG, Residuen 1–21 von humanem NUAK1), NUAK2 (TDCQEVTATYRQALRVCSKLT, Residuen 653–673 von humanem NUAK2), QIK (MVMADGPRHLQRGPVRVGFYD, Residuen 1–21 von humanem QIK), SIK (MVIMSEFSADPAGQGQGQQK, Residuen 1–20 von humanem SIK, verwendet für die Immuno-Präzipitation aus humanen Zellen), SIK (GDCEMEDLMPCSLGTFVLVQ, Residuen 765–784 von humanem SIK, verwendet für Immuno-Präzipitation aus Mäusezellen), QSK (TDILLSYKHPEVSFSMEQAGV, Residuen 1349–1369 von humanem QSK), MARK1 (SGTSIAFKNIASKIANELKL, Residuen 776–795 von humanem MARK1), MARK4 (MSSRTVLAPGNDRNSDTHGT, Residuen 1–20 von humanem MARK4), MELK (MKDYDELLKYYELHETIGTG, Residuen 1–20 von humanem MELK). Der spezifische AMPKα1-Antikörper, der in den 27, 28B und 29 verwendet wurde, wurde gegen das Peptid (CTSPPDSFLDDHHLTR, Residuen 344–358 von Ratten-AMPKα1) erzeugt, während der Antikörper, der sowohl AMPKα1 und AMPKα2 erkennt und in 28A verwendet wurde, gegen das Peptid (CDPMKRATIKDIRE, Residuen 252–264 von Ratten-AMPKα1) erzeugt wurde. Die Anti-MARK2- und MARK3-Peptid-Antikörper, die wir erzeugten, waren nicht spezifisch, da sie auch andere MARK-Isoformen zur Immuno-Präzipitation brachten. Es wurde gefunden, dass der Anti-MARK3-Antikörper von Upstate Biotech (Anti-c-TAC #05-680), der gegen das humane MARK3-Protein erzeugt worden war, MARK2 ebenso wirksam zur Immuno-Präzipitation bringt, wie MARK3, jedoch nicht MARK1 und MARK4 (Daten nicht dargestellt). Die phosphorspezifischen Antikörper, die an der T-Schleife phosphoryliertes AMPK erkennen, wurden, wie zuvor beschrieben, gegen das Peptid (KFLRT(P)SCGSPNYA, Residuen 168–180 von Ratten-AMPKα1) erzeugt (Sugden et al., 1999). Der LKB1-Antikörper, der für das Immuno-Blotting verwendet wurde, wurde in Schafen gegen Mäuse-LKB1 erzeugt (Sapkota et al., 2001) und der für die Immuno-Präzipitation verwendete Antikörper wurde in Schafen gegen das menschliche LKB1-Protein erzeugt (Boudeau et al., 2003). Monoklonale Antikörper, welche die HA-Epitop-Markierung erkennen, stammten von Roche, monoklonale Antikörper, welche die GST- und FLAG-Epitope erkennen, stammten von Sigma. Anti-Myc-Antikörper wurden durch Ammoniumsulfat-Ausfällung aus Medium von Myc1-9E10-Hybridoma-Zellen zubereitet, die in einem RPMI 1640-Medium ergänzt mit 2 mM Glutamin und 15% (Vol./Vol.) fötalem Rinderserum gewachsen waren. Sekundäre Antikörper, die an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt waren und für Immuno-Blotting verwendet wurden, wurden von Pierce bezogen.
Allgemeine Verfahren und Puffer. Restriktions-Enzym-Aufschlüsse, DNA-Ligationen und andere rekombinante DNA-Verfahren wurden unter Verwendung von Standard-Protokollen durchgeführt. Die gesamte Mutagenese wurde unter Verwendung des Quik-Change stellengerichteten Mutagenese-Verfahrens durchgeführt (Stratagene). DNA- Konstrukte, die für eine Transfektion verwendet wurden, wurden aus E. coli DH5α unter Verwendung von Qiagen-Plasmid-Mega-Kit gemäß den Vorschriften des Herstellers gereinigt. Alle DNA-Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt, die von The Sequencing Service, School of Life Sciences, University of Dundee, Scotland, UK unter Verwendung von DYEnamic ET-terminator chemistry (Amersham Biosciences) auf automatisierten DNA-Sequencern von Applied Biosystems durchgeführt wurde. Die Lysis-Puffer enthielten 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% (Gew./Vol.) Triton-X-100, 1 mM Natriumorthovanadat, 50 mM Natriumfluorid, 5 mM Natriumpyrophosphat, 0,27 M Sucrose, 0,1% (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol und „vollständigen" Proteinase-Inhibitor-Cocktail (eine Tablette/50 ml). Der Puffer A enthielt 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, 0,1 mM EGTA, und 0,1% (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol. Der SDS-Proben-Puffer enthielt 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 6,8, 2% (Gew./Vol.) SDS, 10% (Vol./Vol.) Glycerol, 0,005% (Gew./Vol.) Bromophenol-Blau und 1% (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol.
Klonierung von mit AMPK verwandten Kinasen.
NUAK1. Um den kodierenden Bereich von humanem NUAK1-cDNA (NCBI-Zugangsnummer NM_014840) zu erhalten, wurde eine PCR-Reaktion unter Verwendung einer Gehirn-cDNA-Bibliothek (Clontech) als Template und des Sense-Primers 5'-actgcagccctggagcccaggaagc-3' und des Antisense-Primers 5'-ctagttgagcttgctgcagatctccagcgc-3' verwendet. Das sich ergebende PCR-Produkt überdeckte den kodierenden Bereich von NUAK1 von den Aminosäure-Residuen 31–661. Die cDNA der fehlenden N-terminalen 31 Aminosäuren wurde in den 5'-Primer einer anderen PCR-Reaktion aufgenommen, dann wurde die HA-Markierung durch PCR unter Verwendung des Sense-Primers 5'-actagtgccaccatgtacccatacgatgtgccagattacgccgaaggggccgccgcgcctgtggcgggg-3' und des Antisense-Primers 5'-ctagttgagcttgctgcagatctccagcgc-3' hinzu gegeben. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor (Invitrogen) eingefügt und als Spe1-Not1-Fragment in einen pEBG2T-Expressions-Vektor (Sanchez et al., 1994) und als EcoR1-EcoR1-Insert in einen pGEX6P-1-Expressions-Vektor (Amersham) subkloniert.
NUAK2. Der kodierende Bereich von humaner NUAK2-cDNA (NCBI-Zugangsnummer NP_112214) mit einer N-terminalen HA-Markierung wurde durch PCR aus dem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 6718982 (NCBI-Zugangsnummer CA487493) mit dem Primern 5'-actagtgccaccatgtacccatacgatgtgccagattacgccgagtcgctggttttcgcgcggcgctcc-3' und 5'-tcaggtgagctttgagcagaccctcagtgcctg-3' amplifiziert. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde in einem pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt, sequenziert und als Spe1-Spe1-Fragment in einen pEBG2T-Expressions-Vektor und als ein EcoR1-EcoR1-Insert in einen pGEX6P-1-Expressions-Vektor subkloniert.
QIK. Der kodierende Bereich von humaner QIK-cDNA (NCBI-Zugangsnummer XM_041314) mit einer N-terminalen HA-Markierung wurde aus dem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 5495545 (NCBI-Zugangsnummer BM799630) unter Verwendung des Sense-Primers 5'-gcgtcgactacccatacgatgtgccagattacgccgtcatggcggatggcccgag-3' oder 5'- gcactagttacccatacgatgtgccagattacgccgtcatggcggatggcccgag-3' für eine nachfolgende Klonierung in Vektoren pGEX6P-3 bzw. pEBG2T und des Antisense-Primers 5'-gagcggccgctaattcaccaggacatacccgttgtg-3' amplifiziert. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden in einem pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt, sequenziert und als Sal1-Not1- oder Spe1-Not1-Insert in pGEX6P-3 bzw. pEBG2T subkloniert.
SIK. Der kodierende Bereich von humaner SIK-cDNA (NCBI-Zugangsnummer NM_173354) mit einer N-terminalen HA-Markierung wurde aus dem IMAGE-Konsortium EST-Klon 4831049 (NCBI-Zugangsnummer NM_173354) unter Verwendung der Primer 5'-gcggatcctacccatacgatgtgccagattacgccgttatcatgtcggagttcagcgcgg-3' und 5'-gagcggccgctcactgcaccaggacaaacgtgcc-3' amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt, sequenziert und als BamH1-Not1-Insert in pGEX6P-1 und pEBG2T subkloniert.
MELK. Der kodierende Bereich von humaner MELK-cDNA (NCBI-Zugangsnummer nM_014791) mit einer N-terminalen HA-Markierung wurde aus dem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 4547136 (NCBI-Zugangsnummer BC014039) unter Verwendung der Primer 5'-gcggatcctacccatacgatgtgccagattacgccaaagattatgatgaacttctcaaatattatgaattacatg-3' und 5'-gtgcggccgcttataccttgcagctagataggatgtcttcc-3' amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in einen pPCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt, sequenziert und als BamH1-Not1-Insert in pGEX6P-1 und pEBG2T subkloniert.
BRSK1. Die Nukleotide 60–1010 des kodierenden Bereichs der humanen BRSK1-cDNA (NCBI-Zugangsnummer NM_032430) wurden aus dem IMAGE-Konsortium-Klon 6154749 (NCBI-Zugangsnummer BQ434571) unter Verwendung der Primer 1. 5'-ccacccccacccaccccagcacgcccaatatgtgggcccctatcggctggagaagacgctgggcaaagg-3' und 2. 5'-cgatgcagcctctcgcggtccctgaagcagc-3' amplifiziert, wobei die Nukleotide 60–106 durch den Primer 1 hinzugefügt wurden. Die Nukleotide 980–2337 von BRSK1 wurden aus dem gleichen EST-Klon unter Verwendung der Primer 3. 5'-gctgcttcagggaccgcgagaggctgcatcg-3' und 4. 5'-tcagggcagaggggtcccgttggtggcc-3' amplifiziert. Jedes PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt und sequenziert. Eine einzelne Nukleotid-Differenz im Vergleich mit der BRSK1 NM_032430-Sequenz, die in dem EST-Klon vorhanden ist, wurde durch eine stellengerichtete Mutagenese in dem pCR2.1-TOPO-Klon „korrigiert", der die 5'-Hälfte von BRSK1 enthält. Die verbleibenden 5' 59 Nukleotide von BRSK1 und die HA-Markierung wurden zur 5'-Hälfte von BRSK1 durch PCR unter Verwendung der Sense-Primer 5. 5'-ggtgggggctctcccgcctaccacctcccccacccccacccccacccaccccagcacgcccaatatg-3' und 6. 5'-ggatcctacccatacgatgtgccagattacgcctcgtccggggccaaggagggaggtgggggctctcccgcctacc-3' hinzugefügt. Das PCR-Endprodukt wurde in einem pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt und sequenziert. Dann wurde eine Überlappungs-PCR unter Verwendung der 5'-Hälfte und 3'-Hälfte von BRSK1 als Templates und des Primers 7. 5'-gcggatcctacccatacgatgtgcc-3' und Primers 4 durchgeführt, und das PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt und sequenziert. Die volle Länge besitzende BRSK1-cDNA mit einer N-terminalen HA-Markierung wurde dann in pGEX6P-1 und pEBG2T als BamH1-BamH1-Insert subkloniert.
BRKS2. Der kodierende Bereich einer HA-markierten humanen BRSK2-cDNA (NCBI-Zugangsnummer AF533878) wurde durch PCR aus einem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 6144640 (NCBI-Zugangsnummer BU193218) unter Verwendung der Primer 5'-ggatccgccaccatgtacccatacgatgtgccagattacgccacatcgacggggaaggacggcggcgcg-3' und 5'-gcggccgctcagaggctactctcgtagctggtggccaccttctggcccttaagccca-3' amplifiziert. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde in einem pCR2.1-TOPO-Vektor kloniert, sequenziert und als BamH1-Not1-Insert in pEBG2T- und pGEX6P-1-Vektoren subkloniert.
QSK. Die Nukleotide 55–640 des kodierenden Bereichs von humaner QSK-cDNA (Sequenz erhalten aus der Sugen-Datenbank www.kinase.com (Manning et al., 2002)) wurden aus dem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 4396995 (NCBI Zugangsnummer BF983268) unter Verwendung der Primer 1. 5'-ggagccgggcccgcgggccgcctgctgcctccgcccgcgccggggtccccagccgcccccgctgccgtgtcccctgcggccggccagccg-3' und 2. 5'-tgaagaggttactgaaaccaaaatctgctattttgatattc-3' amplifiziert, wobei die Nukleotide 55–110 durch den Primer 1 hinzugefügt werden. Die verbleibenden 5' 54 Nukleotide und die HA-Markierung wurden danach durch PCR unter Verwendung der Primer 3. 5'-gattacgccgcggcggcggcggcgagcggagctggcggggctgccggggccgggactgggggagccgggcccgcgggccgcctgctg-3' und 4. 5'-gcggatcctacccatacgatgtgccagattacgccgcggcggcggcggcgagcgg-3' hinzugefügt. Das endgültige PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt und sequenziert, um einen pCR2.1-QSK-Klon 1 zu erzeugen. Die Nukleotide 610–865 von QSK wurden aus einem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 6247938 (NCBI-Zugangsnummer BQ685213) unter Verwendung der Primer 5. 5'-atagcagattttggtttcagtaacctcttcactcctgggcagctgctgaagacctggtgtggcagccctccctatgctgcacctgaactc-3' und 6. 5'-ctgtggacataaaaaatgggatgcggaactttcc-3' amplifiziert, wobei die Nukleotide 610–674 durch den Primer 5 hinzugefügt wurden. Das PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt und sequenziert. Eine einzelne Nukleotid-Auslassung an dem offenen QSK-Leserahmen der Position 696, die im EST-Klon vorhanden ist, wurde durch eine stellengerichtete Mutagenese korrigiert, um einen pCR2.1-QSK-Klon 2 zu erzeugen. QSK PCR-Produkte von den pCR2.1-QSK-Klonen 1 und 2 wurden in ein Überlappungs-PCR unter Verwendung der Primer 4 und 6 eingeführt. Dieses Produkt (QSK-Nukleotide 4–865 mit N-terminaler HA-Markierung) wurden in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingeführt und sequenziert, um einen pCR2.1-QSK-Klon 3 zu erzeugen.
Die QSK-Nukleotide 832–4110 wurden von einem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 360441 (NCBI-Zugangsnummer AA015726) unter Verwendung der Primer 7. 5'-ggaaagttccgcatcccattttttatgtccacag-3' und 8. 5'-gagcggccgcttacacgcctgcctgctccatgc-3' amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt und sequenziert, um den pCR2.1-QSK-Klon 4 zu erzeugen.
QSK-PCR-Produkte von den pCR2.1-Klonen 3 und 4 wurden unter Verwendung der Primer 4 und 8 in eine Überlappungs-PCR eingeführt, um eine die volle Länge besitzende QSK-cDNA im einer N-terminalen HA-Markierung zu erzeugen. Das PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingeführt und sequenziert, um den pCR2.1-QSK-Klon 5 zu erzeugen. Die volle Länge besitzende QSK mit einer N-terminalen HA-Markierung wurde von dem pCR2.1-QSK-Klon 5 als BamH1-BamH1-Insert in pEGX6P-1- und pEBG2T-Vektoren subkloniert. Um die T-Schleifen-Mutationen in QSK zu erzeugen, wurde am pCR2.1-QSK-Klon 3 eine Mutagenese durchgeführt, worauf eine Überlappungs-PCR erfolgte, um die die volle Länge besitzenden mutanten Formen von QSK zu erzeugen. Das Überlappungs-PCR-Produkt wurde in pCR2.1-TOPO eingefügt, sequenziert und in pGEX6P-1 und pEBG2T als BamH1-BamH1-Insert subkloniert.
MARK1. Die Nukleotide 4–1078 des kodierenden Bereichs von humaner MARK1-cDNA (NCBI-Zugangsnummer NM_018650) mit einer N-terminalen HA-Markierung wurden aus einer humanen Gehirn-cDNA-Bibliothek unter Verwendung der Primer 5'-gcgaattctacccatacgatgtgccagattacgcctcggcccggacgccattgc-3' und 5'-catcatacttctgatttattaaggcatcatttatttc-3' amplifiziert. Die Nukleotide 1042–2388 von MARK wurden aus einem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 48109 (NCBI-Zugangsnummer H11850) unter Verwendung der Primer 5'-gaaataaatgatgccttaataaatcagaagtatgatg-3' und 5'-gagtcgacttacagcttaagctcatttgctatttttgatgc-3' amplifiziert. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden in eine Überlappungs-PCR eingebracht, um eine die volle Länge besitzende, HA-markierte MARK1-cDNA zu erzeugen. Das PCR-Produkt wurde in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt, sequenziert und als EcoR1-Sal1-Insert in pGEX6P-1 subkloniert. Die volle Länge besitzende, HA-markierte MARK1 wurde aus dem pCR2.1-TOPO-MARK1-Klon für eine nachfolgende Klonierung in pEBG2T als ein Kpn1-Not1-Insert unter Verwendung der Primer 5'-gcggtacctacccatacgatgtgccagattacgcctcggcccggacgccattgc-3' und 5'-gagcggccgcttacagcttaagctcatttgctatttttgatgc-3' amplifiziert.
MARK2. Der kodierende Bereich von humaner MARK2-cDNA (NCBI-Zugangsnummer NM_004954) wurde aus einem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 4591688 (NCBI-Zugangsnummer BG419875) unter Verwendung der Sense-Primer 5'-gcgtcgactacccatacgatgtgccagattacgccattcggggccgcaactcagcc-3' oder 5'-gcactagttacccatacgatgtgccagattacgccattcggggccgcaactcagcc-3' für eine nachfolgende Klonierung in Vektoren pGEX6P-3 bzw. pEBG2T und des Antisense-Primers 5'-gagcggccgcttaaagcttcagctcgttggctattttgg-3' amplifiziert. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden in einen pCR2.1-TOPO-Vektor eingefügt, sequenziert und als Sal1-Not1 oder Spe1-Not1-Insert in pGEX6P-3 bzw. pEBG2T-Vektoren subkloniert.
MARK3. Der kodierende Bereich von humaner MARK3-cDNA (NCBI-Zugangsnummer NM_002376) mit einer N-terminalen HA-Markierung wurde aus IMAGE-EST-5104460 (NCBI-Zugangsnummer 81223323) unter Verwendung der Primer 5'-gcggccgcagccaccatgtacccatacgatgtgccagattacgcctccactaggaccccattgccaacggtga-3' und 5'-gcggccgcttacagctttagctcattggcaattttggaagc-3 amplifiziert. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde in einem pCR2.1-TOPO-Vektor kloniert, sequenziert und als Not1-Not1-insert in pEBG2T- und pGEX6P-2-Vektoren subkloniert.
MARK4. Um den die volle Länge besitzenden kodierenden Bereich von humaner MARK4-cDNA (NCBI-Zugangsnummer AK075272) zu erhalten, wurden zwei EST-Klone als Templates für PCR-Reaktionen verwendet. Die ersten 228 Aminosäuren mit einer N-terminalen HA-Markierung wurden aus dem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 6301902 (NCBI-Zugangsnummer BQ709130) unter Verwendung der Primer 1. 5'- agatctgccaccatgtacccatacgatgtgccagattacgcctcttcgcggacggtgctggccccggg-3' und 2. 5'-tgccctgaaacagctccggggcggc-3' amplifiziert. Der restliche, kodierende Bereich wurde aus dem IMAGE-Konsortium-EST-Klon 5503281 (NCBI-Zugangsnummer BM467107) mit den Primern 3. 5'-gggatcgaagctggacacgttctgc-3' und 4. 5'-gcggccgctcacactccaggggaatcggagcagccgggg-3 amplifiziert. Die sich ergebenden PCR-Produkte wurden als Schablonen in einer Überlappungs-PCR- mit den Primern 1 und 4 verwendet. Das PCR-Produkt wurde in pCR2.1-TOPO eingefügt, sequenziert und dann weiter als Bgl2-Not1-Insert in die BamH1-Not1-Stelle von pEBG2T- und pGEX6P-1-Vektoren subkloniert.
Andere DNA-Konstrukte. Die DNA-Konstrukte, die Wildtyp-GST-LKB1 oder katalytisch inaktive GST-LKB1 [D194A] im pEBG-2T-Vektor (Sapkota et al., 2001), FLAG-STRADα, FLAG-STRADβ, myc-MO25α, myc-MO25β im pCMV5-Vektor (Beispiel 1; Boudeau et al., 2003) oder die Kinase-Domäne von AMPKα1 [Residuen 1–308] im pGEX-Vektor (Scott et al., 2002) kodieren, wurden zuvor beschrieben.
Zellkultur, Stimulation und Zell-Lysis. Die Erzeugung von HeLa-Zellen, die stabil LKB1 vom Wildtyp oder kinase-dead LKB1 exprimieren, wurden zuvor beschrieben (Sapkota et al., 2002). Die Zellen wurden in Minimum Essential Medium Eagle, ergänzt um 10% (Vol./Vol.) tetracyclin-freies FBS, 1 × nicht-essentielle Aminosäurelösung, 1 × Penicillin/Streptomycin-Lösung (Invitrogen), 100 μg/ml Zeocin und 5 μg/ml Blasticidin (Invitrogen), kultiviert. Die Produktion und Kultur von immortalisierten LKB1^+/+- und LKB1^–/–-MEF-Zellen aus E9.5-Embryonen wurde früher beschrieben (Beispiel 2; Hawley et al., 2003). Embryonale humane Nieren-293-Zellen wurden in Dulbecco's modified Eagle's Medium kultiviert, das 10% FBS enthielt. Zellen, die auf einer Scheibe mit 10 cm Durchmesser in 10% (Vol./Vol.) Serum kultiviert worden waren, wurden unstimuliert gelassen oder stimuliert mit 10 mM Phenformin oder 2 mM AICA-Riboside für 1 Stunde, und in 1 ml eiskaltem Lysis-Puffer nach einer Schnellspülung in PBS lysiert. Die MEF-Zell-Lysate wurden in flüssigem Stickstoff schnellgefroren, vor der Verwendung aufgetaut und bei 4°C 30 Minuten lang bei 23.000 × g zentrifugiert, um Zellabfall zu entfernen. HeLa-Zellen-Lysate wurden sofort bei 4°C 15 Minuten lang bei 13.000 Umdrehungen/min zentrifugiert. Protein-Konzentrationen wurden durch das Bradford-Verfahren mit Rinderserum-Albumin als Standard ermittelt (Bradford, 1976).
Immuno-Blotting. Die Gesamtzellen-Lysate (10–50 μg) oder immuno-präzipitiertes Protein (aus 1 mg des Zell-Lysats) wurden in SDS-Sample-Puffer erhitzt und SDS-PAGE unterworfen; dann wurde ein Elektrotransfer auf Nitrocellulose-Membranen durchgeführt. Die Membranen wurden dann in 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M Natriumchlorid (TBS), 0,5% (Vol.) Tween, das 10% (Masse) entrahmte Milch enthielt blockiert und dann 16 Stunden lang bei 4°C in TB, 0,5% (Vol.) Tween, 5% (Masse) entrahmte Milch und 1 μg/ml der angegebenen Antikörper getestet. Die Detektion von Proteinen wurde unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern und dem verstärkten Chemolumineszenz-Reagens durchgeführt (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK).
Expression und Reinigung von mit AMPK verwandten Kinasen in E. coli. Wenn nicht anders angegeben, wurden pGEX-Konstrukte, welche die volle Länge besitzende, Wildtyp- oder mutante Formen von GST-HA-markierten, mit AMPK verwandten Kinasen oder GST-AMPKα1 [1–308] kodierten, wurden in E. coli BI21-Zellen transformiert. Ein-Liter-Kulturen wurden bei 37°C in Luria-Nährlösung wachsen gelassen, die 100 μg/ml Ampicilin enthielt, bis die Absorbanz bei 600 nm 0,8 betrug. 100 μM Isopropyl-β-D-Galactosid wurde zugegeben und die Zellen wurden für weitere 16 Stunden bei 26°C kultiviert. Für pGEX-Konstrukte, die das GST-HA-markierte QSK vom Wildtyp oder einen Mutanten hiervon kodieren, wurde die Induktion der Protein-Expression dadurch ausgeführt, dass die Zellen kultiviert wurden, bis die Absorbanz bei 600 nm den Wert 1 hatte, und dann wurde 1 mM Isopropyl-β-D-Galactosid zugegeben und die Zellen wurden für eine weitere Stunde bei 30°C kultiviert. Zu Kügelchen geformte Zellen wurden in 35 ml von eiskaltem Lysis-Puffer resuspendiert und in einer Einfrier-Auftau-Runde lysiert, worauf die Lysate zu Fragment-DNA sonifiziert (mit Ultraschall zertrümmert) wurden. Die Lysate wurden 30 Minuten lang bei 20.000 × g zentrifugiert und die rekombinanten Proteine wurden auf Glutathion-Sepharose affinitäts-gereinigt und im Puffer A ausgespült, der 20 mM Glutathion und 0,27 M Sucrose enthielt.
Expression und Reinigung von mit AMPK verwandten Kinasen in 293-Zellen. 20 Scheiben mit 10 cm Durchmesser und 293-Zellen wurden kultiviert und jede Scheibe mit 5 μg des pEBG-2T-Konstrukts transfiziert, das mit AMPK verwandte Kinase vom Wildtyp kodiert, unter Verwendung eines modifizierten Calciumphosphat-Verfahrens (Alessi et al., 1996). 36 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in 1 ml von eiskaltem Lysis-Puffer lysiert, die Lysate gepoolt und 4°C 10 Minuten lang bei 13.000 × g zentrifugiert. Die GST-Fusions-Proteine wurden durch Affinitäts-Chromatographie auf Glutathion-Sepharose gereinigt und in Puffer A ausgespült, der 20 nm Glutathion und 0,27 M Sucrose enthielt.
Expression und Reinigung von LKB1:STRAD:MO25-Komplex in 293-Zellen. Verschiedene Kombinationen von mit GST markierten LKB1, FLAG markierten STRADα oder STRAD1 und Myc markierten MO25α oder MO25β wurden in 293-Zellen exprimiert, und die Zellen wurden auf Glutathion-Sepharose gereinigt, wie zuvor beschrieben (Beispiel 1; Boudeau et al., 2003).
Messung der Aktivierung von mit AMPK verwandten Kinasen. Nach ihrer Phosphorylierung mit LKB1 wurde die katalytische Subeinheit von AMPKα1 und von mit AMPK verwandten Kinasen in der folgenden Weise gemessen. 1–2 μg der katalytischen Domäne von AMPKα1 oder einer mit AMPK verwandten Kinase wurden mit oder ohne 0,1–1 μg des Wildtyps des angegebenen LKB1-Komplexes im Puffer A in einem Endvolumen von 20 μl inkubiert, der 5,5 mM MgAcetat und 0,1 mM ATP enthielt. Nach der Inkubation bei 30°C über die in der Figurenbeschreibung angegebenen Zeiten wurden die Aktivitäten der katalytischen Domäne von AMPKα1 oder der mit AMPK verwandten Kinasen dadurch ermittelt, dass 30 μl von 5 mM Magnesiumacetat, 0,1 mM [γ-³²P]-ATP (300 cpm/pmol) und 200 μM AMARA-Peptid (AMARAASAAALARRR (Dale et al., 1995)) als Substrat zugegeben wurden. Nach einer Inkubation über 25 Minuten bei 30°C wurde die Aufnahme von ³²P-Phosphat in das Peptid-Substrat dadurch ermittelt, dass die Reaktionsmischung auf P81-Phosphocellulose-Papier aufgebracht und eine Szintillationszählung nach dem Waschen des Papiers in Phosphorsäure wie zuvor beschrieben durchgeführt wurde (Alessi et al., 1995). Eine Einheit (U) der Aktivität wurde als diejenige Aktivität definiert, welche die Aufnahme von 1 nmol von ³²P in das Substrat katalysierte. Zeitverlauf-Reaktionen für die zweite Stufe der Untersuchung wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Phosphorylierungs-Rate in der Zeit linear verlief. Die kinetischen Daten wurden gemäß der Michaelis-Menten-Relation durch nichtlineare Regression unter Verwendung des Computerprogramms GraphPad (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) analysiert.
Kartierung der Stellen auf BRKS2, NUAK2 und MARK3, die durch den LKB1-Komplex phosphoryliert sind. Die mit AMP verwandten Kinasen vom Wildtyp und ihre Mutanten (5 μg) wurden 30 Minuten lang mit 1–2 μg des Wildtyp-LKB1:STRADα:MO25β in Puffer A inkubiert, der 5 mM Magnesiumacetat und 100 μM [γ-³²P]-ATP (5000 cpm/pmol) in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 30 μl enthielt. Nach 30 Minuten wurden die Reaktionen durch die Zugabe von SDS auf eine Endkonzentration von 1% (Gew./Vol.) und Dithiothreitol auf 10 Mm beendet und 1 Minute lang 100°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde 4-Vinylpyridin bis zu einer Konzentration von 50 mM zugegeben, und die Proben wurden 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur auf eine Schüttelplattform gesetzt, um die Cystein-Residuen zu alkylieren, und dann einer Elektrophorese auf einem BisTris 4–12% Polyacrylamid-Gel unterzogen. Die Gele wurden mit Coomassie-R250 gefärbt, autoradiographiert und die den phosphorylierten, mit AMPK verwandten Kinasen entsprechenden Bänder ausgeschnitten und in kleinere Teile zerteilt. Diese wurden sequentiell 15 Minuten auf eine vibrierenden Plattform mit 1 ml den folgenden Flüssigkeiten gewaschen: Wasser, einer 1:1-Mischung von Wasser und Acetonitril, 0,1 M Ammoniumbicarbonat, einer 1:1-Mischung von 0,2 M Ammoniumbicarbonat und Acetonitril und schließlich mit Acetonitril. Die Gelstücke wurden durch Rotationsverdampfung getrocknet und in 0,1 ml von 50 mM Ammoniumbicarbonat, 0,1% (Masse) n-Octyl-Glukosid, das 1 μg alkyliertes Trypsin enthielt, inkubiert. Nach 16 Stunden wurden 0,1 ml Acetonitril zugegeben und die Mischung auf einer Schüttelplattform 10 Minuten lang inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und die Gelstücke wurden weiter 10 Minuten lang in 0,3 ml von 50 mM Ammoniumbicarbonat und 0,1% (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure gewaschen. Die kombinierten Überstände, die > 90% der ³²P-Radioaktivität enthielten, wurden auf einer Vydac-218TP5215-C₁₈-Säule (Separations Group, Hesperia, CA) chromatographiert, in 0,1% (Vol.) Trifluoressigsäure in Wasser equilibriert. Die Säule wurde mit einem linearen Acetonitril-Gradienten (diagonale Linie) bei einer Strömungsrate von 0,2 ml/min entwickelt und es wurden Fraktionen von 0,1 ml gesammelt.
Phosphorpeptid-Sequenz-Analyse. Isolierte Phosphorpeptide wurden auf einem Applied Biosystems-4700-Proteomics Analyser (MALDI-TOF-TOF) unter Verwendung von 5 mg/ml Alpha-Cyanozimtsäure als Matrix analysiert. Die Spektren wurden sowohl im reflektierenden als auch im linearen Modus erfasst und die Sequenz von möglichen Phosphorpeptiden wurde durch die Durchführung von MALDI-MS/MS auf ausgewählten Massen bestätigt. Der charakteristische Verlust von Phosphorsäure (M-98 Da) aus dem Ausgangs-Phosphorpeptid sowie der neutrale Verlust von Dehydroalanin (–69) für Phosphorserin oder Dehydroaminobuttersäure (–83) für Phosphothreonin wurden verwendet, um die Position der Phosphorylierungs-Stelle bzw. -Stellen zuzuordnen. Die Stelle der Phosphorylierung aller mit ³²P markierten Peptide wurde durch Festphasen-Edman-Degradation auf einem Applied Biosystems 494A-Sequenator des Peptids gekoppelt an eine Sequelon-AA-Membran (Milligen) ermittelt, wie zuvor beschrieben (Campbell and Morrice, 2002).
Identifizierung der T-Schleifen-Phosphorylierungs-Stelle in MELK. Der tryptische Aufschluss von GST-MELK, das von E. coli exprimiert und gereinigt worden war, wurde mit 0,25 M Essigsäure in 30% Acetonitril (Vol./Vol.) angesäuert und es wurden 2 μl (abgeklärtes Volumen) PHOS-select-Iron-Chelate-Gel (Sigma) zugegeben. Die Probe wurde 30 Minuten geschüttelt und das Harz in einem MikroC18-ZipTip (Millipore) gesammelt, mit 2 × 25 μl 0,25 M Essigsäure in 30% Acetonitril (Vol./Vol.) gewaschen und mit 25 μl 0,4 M NH₄OH ausgespült. Die Ausspülflüssigkeit wurde durch MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometrie analysiert, und das T-Schleifen-Phosphorpeptid wurde durch MS/MS identifiziert und sequenziert.
Immuno-Ausfällung und Untersuchung von endogener AMPK und mit AMPK verwandter Kinase.
0,1–1 mg von HeLa- oder MEF-Lysat-Protein wurde bei 4°C eine Stunde lang auf einer Plattform mit 5 μg des entsprechenden Antikörpers inkubiert, der zuvor auf 5 μl von Protein-G-Sepharose konjugiert worden war. Die Immuno-Präzipitate wurden 2 × mit 1 ml Lysis-Puffer gewaschen, der 0,5 M Natriumchlorid enthielt, und 2 × mit 1 ml des Puffers A. Phosphotransferase-Aktivität gegenüber dem AMARA-Peptid wurde dann in einem Gesamt-Untersuchungsvolumen von 50 μl gemessen, wie oben beschrieben.
Immuno-Ausfällung und Untersuchung von endogenem LKB1 unter Verwendung von LKBtide-Substrat.
0,1–1 mg HeLa- oder MEF-Zellen-Lysat-Protein wurde bei 4°C eine Stunde lang auf einer Schüttelplattform mit 5 μl von Protein-G-Sepharose konjugiert auf 5 μg von humanem LKB1-Antikörper inkubiert. Die Immuno-Präzipitate wurden 2 × mit 1 ml Lysis-Puffer gewaschen, der 0,5 M Natriumchlorid enthielt und 2 × mit 1 ml des Puffers A. Die Phosphotransferase-Aktivität in Bezug auf das LKBtide-Peptid (LSNLYHQGKFLQTFCGSPLYRRR Residuen 241–260 von humanem NUAK2 mit drei zusätzlichen Arg-Residuen, die am C-Terminus hinzugefügt waren, um eine Bindung an P81-Papier) zu ermöglichen, wurden dann in einem Gesamt-Untersuchungs-Volumen von 50 μl gemessen, das aus 50 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1% (Vol.) 2-Mercaptoethanol, 10 mM Magnesiumacetat, 0,1 mM [γ-³²P]-ATP (~200 cpm/pmol) und 200 μM LKB1tide-Peptid bestand. Die Untersuchungen wurden bei 30°C unter kontinuierlichem Schütteln ausgeführt, um die Immuno-Präzipitate in Suspension zu halten, und wurden nach 10 Minuten durch das Aufbringen von 40 μl der Reaktionsmischung auf p81-Membranen beendet. Die p81-Membranen wurden in Phosphorsäure gewaschen und dann wurde die aufgenommene Radioaktivität durch Szintillationszählung gemessen, wie dies zuvor für AMPK-Kinase beschrieben wurde (Alessi et al., 1995) Ergänzende Tabelle Gewebeverteilungen von ESTs, welche die angegebenen, mit AMPK verwandten Kinasen kodieren, Abkürzung No., Zahl
Literaturangaben für den Abschnitt Materialien und Methoden

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Sequenzlisting

Claims

Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung zur Verwendung beim Ändern, beispielsweise Fördern der Aktivierung oder der Phosphorylierung von AMPK (durch AMP aktivierte Protein-Kinase) oder einem Mitglied der AMPK-Unterfamilie in einer Zelle, wobei das Verfahren die Schritte umfasst (1) Ermitteln, ob eine Testverbindung die Proteinkinase-Aktivität von LKB1 verändert, beispielsweise fördert, und (2) Auswählen einer Verbindung, welche die Protein-Kinase-Aktivität von LKB1 verändert, beispielsweise fördert, wobei sich das LKB1 in einer Zubereitung mit STRAD und MO25 befindet, wobei das MO25 rekombinant ist und von einer rekombinanten Nukleinsäure exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das LKB1 oder das STRAD rekombinant ist und von einer rekombinanten Nukleinsäure exprimiert wird.
Zelle, die in der Lage ist, LKB1, STRAD und überexprimiertes oder rekombinantes MO25 zu exprimieren, die von einer rekombinanten Nukleinsäure exprimiert sind.
Zelle nach Anspruch 3, die eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, welche MO25 kodiert.
Zelle nach Anspruch 3 oder 4, die eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die LKB1 kodiert.
Zelle nach einem der Ansprüche 3 bis 5, die eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die STRAD kodiert.
Eine Zelle, die LKB1, STRAD und überexprimiertes oder rekombinantes MO25 umfasst, die von einer rekombinanten Nukleinsäure exprimiert sind.
Zelle nach Anspruch 7, die rekombinantes LKB1 umfasst, das von einer rekombinanten Nukleinsäure exprimiert ist.
Zelle nach Anspruch 7 oder 8, die rekombinantes STRAD umfasst, das von einer rekombinanten Nukleinsäure exprimiert ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Zelle eine Zelle nach einem der Ansprüche 3 bis 6 ist.
Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, die LKB1, STRAD und rekombinantes MO25 umfasst, exprimiert von einer rekombinanten Nukleinsäure, wobei das Verfahren den Schritt der Reinigung der Zubereitung aus einer Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 10 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Zubereitung rekombinantes LKB1 umfasst, exprimiert von einer rekombinanten Nukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Zubereitung rekombinantes STRAD umfasst, exprimiert von einer rekombinanten Nukleinsäure.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Verhältnisse von LKB1:STRAD:MO25 in der Zubereitung 1:1:1 sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das LKB1 in einer Zubereitung vorhanden ist, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14 erhalten wird oder erhalten werden kann, oder in einer Zelle nach einem der Ansprüche 3 bis 10.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 11 bis 15, wobei die Zubereitung einen Komplex umfasst, der LKB1, STRAD und MO25 umfasst.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung zur Veränderung der zellulären LKB1-Aktivität, wobei das Verfahren die Schritte umfasst (1) Ermitteln, ob eine Testverbindung die LKB1 Protein-Kinase-Aktivität einer Zubereitung oder eines Komplexes verändert, die bzw. der durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder 16 erhalten wurde, oder in einer Zelle nach einem der Ansprüche 3 bis 10 und (2) Auswählen einer Verbindung, welche die besagte LKB1-Protein-Kinase-Aktivität verändert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 17, wobei die LKB1-Protein-Kinase-Aktivität unter Verwendung von AMPK oder eines Mitglieds der AMPK-Unterfamilie oder eines Fragmentes hiervon als Substrat gemessen wird.
Teilesatz, der LKB1 oder ein rekombinantes Polynukleotid umfasst, das LKB1, STRAD kodiert, oder ein rekombinantes Polynukleotid, das STRAD kodiert und ein rekombinantes Polynukleotid, das MO25 kodiert.
Teilesatz, der Folgendes umfasst (1) AMPK oder ein Mitglied der AMPK-Unterfamilie oder ein rekombinantes Polynukleotid, das AMPK oder ein Mitglied der AMPK-Unterfamilie oder ein Fragment hiervon kodiert, und (2) einen Teilesatz nach Anspruch 19 oder eine Zelle nach einem der Ansprüche 3 bis 10.
Verfahren zur Zubereitung eines LKB1/STRAD/MO25-Komplexes, das folgende Schritte umfasst (1) Auswählen eines Zelltyps in dem LKB1 überexprimiert werden soll, einschließlich der Schritte der Ermittelung, ob der Zelltyp ein Zelltyp ist, der STRAD und MO25 exprimiert, (2) Zubereiten eines LKB1/STRAD/MO25-Komplexes durch Überexprimieren von LKB1 in dem ausgewählten Zellentyp.
Verfahren zum Zubereiten eines LKB1/STRAD/MO25-Komplexes, das die Schritte umfasst (1) Überexprimieren von LKB1 in einer Zelle unter Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 21 und (2) Zubereiten des Komplexes aus der Zelle.
Verfahren zur Identifizierung eines genetischen Unterschiedes, der mit PJS (Peutz-Jeghers-Syndrom) verbunden ist, das folgende Schritte umfasst (1) Aufspüren der Sequenz eines Gens, das eine MO25-Isoform kodiert bei wenigstens einem Patienten, der PJS aufweist, (2) Identifizieren irgend eines Unterschieds zwischen der Sequenz dieses Patienten und einer äquivalenten Sequenz von einer Person ohne PJS.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die AMPK oder ein Mitglied der AMPK-Unterfamilie durch einen Mechanismus aktiviert, der zu Metformin oder Phenformin oder AICA-Riboside ähnlich ist, bei dem der Einfluss einer Testverbindung auf die Aktivierung von AMPK oder einem Mitglied der AMPK-Unterfamilie durch eine Zubereitung oder einen Komplex, die bzw. der durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder 16 oder aus einer Zelle gewonnen wurde, wie in einem der Ansprüche 3 bis 10 definiert, mit dem Einfluss von Metformin oder Phenformin oder AICA-Riboside auf die Aktivierung von AMPK oder einem Mitglied der AMPK-Unterfamilie verglichen wird und bei dem eine Verbindung mit einem ähnlichen Effekt ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 18 oder 24 oder Teilesatz nach Anspruch 20, bei dem das Mitglied der AMPK-Unterfamilie ein AMPKα1- oder AMPKα2-Polypeptid ist oder umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 18 oder 24 oder Teilesatz nach Anspruch 20, bei dem das Mitglied der AMPK-Unterfamilie ein NUAK1-, NUAK2-, BRSK1-, BRSK2-, SIK-, QIK-, QSK-, MARK1-, MARK2-, MARK3-, MARK4 oder ein MELK-Polypeptid ist oder umfasst.