DE60026998T2

DE60026998T2 - Screeningsverfahren zur änderung zirkadiane-rhythmus-eiweisse

Info

Publication number: DE60026998T2
Application number: DE60026998T
Authority: DE
Inventors: George Somerville KEESLER; Cesare Basking Ridge MONDADORI; Zhengbin Whitehouse Station YAO; Fernando Union CAMACHO
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2020-06-08
Also published as: NO20015972L; NO20100430L; CA2375450A1; NO20015972D0; KR20020033101A; ZA200108962B; EP1183541B1; MXPA01011417A; EP1183541A1; NO330241B1; CA2375450C; AU5468900A; JP4583682B2; KR100722176B1; NO20100431L; BR0011437A; IL146729A; US6555328B1; WO2000075669A1; DE60026998D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Identifizieren von Testverbindungen, welche den zirkadianen Rhythmus von Säugern verändern und insbesondere die Fähigkeit der humanen Caseinkinase I ε verändern, das menschliche Uhr-Protein, humanes PERIOD-Protein 1, zu phosphorylieren.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Zirkadiane Rhythmen, die von endogenen biologischen Schrittmachern erzeugt werden, sind in einer Reihe verschiedener Organismen vorhanden, einschließlich beim Menschen, bei Pilzen, bei Insekten und bei Bakterien (Dunlap, J. C. (1999) Cell, 96, 271–290; Hastings, J. W., et al., (1991) in Neural and Integrative Animal Physiology, Hrsg. Prosser, C. L. (New York: Wiley-Liss), S. 435–546; Allada, R., et al., (1998) Cell, 93, 791–804; Kondo, T., et al., (1994) Science, 266, 1233–1236; Crosthwaite, S. K., et al., (1997) Science, 276, 763–769). Zirkadiane Uhren sind für die Aufrechterhaltung biologischer Rhythmen von wesentlicher Bedeutung. Sie sind selbst erhaltend und konstant, selbst unter Bedingungen vollständiger Dunkelheit, lassen sich aber durch Umweltsignale wie Licht- und Temperaturveränderungen aktivieren. Endogene Uhren steuern Aktivitätsmuster einschließlich tägliche Schwankungen in Verhalten, Nahrungsmittelaufnahme und den Schlaf/Wach-Zyklus sowie physiologische Änderungen wie Hormonsekretion und Schwankungen der Körpertemperatur (Hastings, M., (1997) Trends Neurosci. 20, 459–464; Kondo, T., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5672–5676.; Reppert, S. M., & Weaver, D. R. (1997) Cell, 89, 487–490).
Genetische und molekulare Studien in Drosophila haben es ermöglicht, einige der Gene, die an zirkadianer Rhythmik beteiligt sind, aufzuklären. Was sich aus diesen Studien ergab, ist ein stark autoregulierter Signalweg, der aus einer Transkriptions-/Translations-basierten negativen Rückmeldungsschleife besteht (Dunlap, J. C. (1999) Cell, 96, 271–290; Dunlap, J. C. (1996) Annu. Rev. Genet. 30, 579–601; Hall, J. C. (1996) Neuron, 17, 799–802). Zwei wesentliche Komponente der zentralen Uhr sind Moleküle, die als Period oder PER sowie Timeless oder TIM bezeichnet werden.
Der Locus per, der zuerst in Drosophila identifiziert wurde, ist ein notwendiges Element zur Steuerung zirkadianer Rhythmen beim adulten Entpuppungsverhalten und der Lokomotionsaktivität (Konopka, R. J., & Benzer, S. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2112–2116). Missense-Mutationen von PER können den Zeitraum zirkadianer Rhythmen entweder verkürzen (per^s) oder verlängern (per^L), während Nonsense-Mutationen (per⁰) zu einer Arrhythmie in deren Verhalten führen (Hall, J. C. (1995) Trends Neurosci. 18, 230–240). Im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) von Säugern sind drei PER-Homologe identifiziert worden, per1, per2 und per3. Die Proteinprodukte dieser Säugergene weisen mehrere Homologieregionen zueinander auf (Zylka, M. J., et al., (1998) Neuron 20, 1103–1110; Albrecht, U., et al., (1997) Cell 91, 1055–1064). Die mRNA- und Proteinmengen von per oszillieren im Lauf des Tageszyklus, aber nur PER1 und PER2 oszillieren als Reaktion auf Licht (Zylka, M. J., et al., (1998) Neuron 20, 1103–1110., Shearman, L. P., et al., (1997) Neuron 19, 1261–1269).
Alle PER-Proteine enthalten eine Protein/Protein-Wechselwirkungsregion, die als PAS-Domäne bezeichnet wird und die zur Dimerbildung erforderlich ist (Zylka, M. J., et al., (1998) Neuron 20, 1103–1110.). Ein anderes PAS-enthaltendes Protein, TIM, wurde durch ein genetisches Screening mit einem Zwei-Hybrid-Hefe-System isoliert, bei dem PER als Sonde verwendet wurde (Gekakis, N., et al., (1995) Science 270, 811–815). Wenn der PER-Proteinspiegel steigt, bildet PER Heterodimere mit TIM. Die Bildung von TIM/PER-Heterodimeren ist für die Regulierung von PER erforderlich, da Mutationen in tim einen Verlust des zirkadianen Rhythmus verursachen, begleitet von einem Verlust der Oszillation von per-mRNA und der Unfähigkeit von PER, eine Kerntranslokation durchzuführen (Sangoram, A. M., et al., (1998) Neuron 21, 1101–1113; Zylka M. J., et al., (1998) Neuron 21, 1115–1122).
Kürzlich sind anhand von genetischem Screening und biochemischer Charakterisierung mehrere weitere molekulare Komponenten zirkadianer Rhythmik entdeckt worden, einschließlich CLOCK und BMAL/MOP3 (Gekakis, N., et al., (1998) Science 280, 1564–1569; King, D. P., et al., (1997) Cell 89, 641–653; Allada. R., et al., (1998) Cell 93, 791–804).
Anschließende Studien haben beleuchtet, wie PER auf Transkriptionsebene reguliert wird. CLOCK und BMAL/MOP3 enthalten beide eine einfache Helix-Schleife-Helix-Domäne und eine PAS-Domäne und bilden miteinander Heterodimere. Wenn PER transkribiert, translatiert und akkumuliert ist, wandert PER in den Kern und bindet durch die gemeinsamen PAS-Domänen an CLOCK und bewirkt eine Herunterregulierung seiner eigenen Transkription, wodurch sich eine negative Feedbackschleife bildet (Allada, R. et al., (1998) Cell 93, 791–804; Darlington, T. K., et al., (1998) Science 280, 1599–1603; Hao, H., et al., (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 3687–3693; Jin, X., et al., (1999) Cell 96, 57–68.).
Darüber hinaus wird PER auf posttranslationaler Ebene modifiziert und reguliert. Sowohl PER als auch TIM scheinen phosphoryliert zu werden, was durch zirkadiane Phosphorylierung erfolgt (Edery, I., et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2260–2264; Lee, C., et al., (1998) Neuron 21, 857–867). Kürzlich wurde eine Drosophila-Kinase mit der Bezeichnung Double Time (DBT) kloniert (Price, J. L., et al., (1998) Cell 94, 83–95, Kloss, B., et al., (1998) Cell 94, 97–107). Mutationen in DBT verursachen entweder einen verkürzten oder einen verlängerten Zeitraum des Verhaltensrhythmus. Eine P-Element-Insertionsmutation in DBT hebt die zirkadianen Oszillationen von PER im Gehirn von Larven auf, was anzeigt, dass es sich bei DBT um eine essenzielle Komponente der Uhr von Drosophila handelt. In diesen Mutanten sammelt sich PER in hohen Mengen an und wird hypophosphoryliert. Es liegen keine Hinweise darauf vor, dass DBT PER direkt phosphoryliert. CKIε ist ein eng verwandtes Homolog von DBT bei Säugern (Kloss, B., et al., (1998) Cell 94, 97–107). CKIε und DBT sind auf Aminosäureebene in der Kinasedomäne zu 86% homolog. hCKIε, erstmals identifiziert von Fish et al., ist eine von mehreren CKI-Isoformen (α, β, γ, δ), die Serin/Threonin-Proteinkinaseaktivität aufweist (Fish, K. J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14875–14883; Rowles, J., et al., (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88, 9548–9552). CKIs sind an der Regulierung des zellulären DNA-Metabolismus beteiligt. Saccharomyces-Mutanten mit defektem HRR25-Gen, einem Homolog der Säuger-CKI, zeigen Sensitivität gegenüber DNA-Doppelstrang-Brüchen (Hoekstra, M. F., et al., (1991) Science 253, 1031–1034). Es sind mehrere In-vitro-Substrate für hCKI identifiziert worden, die RNA-Polymerase I und II, p53, IkBα und Simian-Virus-40-Large-T-Antigen umfassen. Allerdings liegen sehr wenige Hinweise vor, welche die Phosphorylierung von hCKI mit Änderungen der Substratfunktion verknüpfen, und bislang sind keine Uhrgene gefunden wurden, die sich als Substrate für hCKI δ und ε erwiesen haben.
Der Artikel von Keesler et al. (2000, Neuroreport, 11 (5): 951–955) beschreibt Screeningsysteme, welche die Verwendung von hPER1 und hCKIε umfassen. WO 99/57137 beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren eines Modulators der Expression des Period-Gens. Sie erwähnen nicht die Möglichkeit, den Phosphorylierungsgrad von PER-Proteinen zu bestimmen.
Zirkadiane Rhythmen werden durch sequenzielle Phosphorylierung und Änderung der Proteinmengen von bestimmten Schlüsselproteinen im zirkadianen Signalweg gesteuert. Period (PER), ein zentraler Bestandteil des Signalwegs der zirkadianen Uhr, durchläuft täglich umfangreiche Oszillation und Phosphorylierungsstadien. PER-Gene sind für das PER-Protein von Drosophila identifiziert worden, bezeichnet als dPER, für das Maus-PER, bezeichnet als mPER, und für das PER des Menschen, bezeichnet als hPER. Bei Drosophila gibt es nur ein PER, das die größte Homologie zu den PER1-Proteinen aufweist. Sowohl Mensch als auch Maus haben drei PERs, die als PER 1, 2 und 3 bezeichnet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass hCKIε humanes Period-Protein 1 phosphoryliert und dass phosphoryliertes humanes Period-Protein 1 abgebaut wird. Als Ergebnis betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Identifizieren von Testverbindungen, welche den zirkadianen Rhythmus von Säugetieren verändern, und betrifft insbesondere Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, die hCKIε-Phosphorylierung von humanem Period-Protein 1 zu verändern. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, den Abbau eines phosphorylierten humanen Period-Proteins zu verändern. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, Phosphorylierung oder alternativ den Abbau humaner Period-Proteine 1 selektiv zu ändern, relativ zu ihrer Fähigkeit, Phosphorylierung oder alternativ den Abbau eines anderen humanen Period-Proteins zu ändern und anschließend den zirkadianen Rhythmus eines Säugers zu ändern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. In-vitro-Phosphorylierung von Casein, IkBα und hPER1 durch rekombinante hCKIε.
Reinigung rekombinanter Caseinkinase(n) und Kinaseassaybedingungen sind unten im Abschnitt „Verfahren und Methoden" beschrieben. (A) hCKIε (Spur 1 bis 3), hCKIε-K38Rε (Spur 4–6) oder Pufferkontrolle (Spur 7 und 8) werden entweder alleine (Spur 1 und 4), mit Casein (Spur 2 und 5) oder mit IkBα (Spur 3 und 6) inkubiert, und Kinaseassays werden durchgeführt, wie in „Material und Verfahren" beschrieben. Molekulargewichtsmarker sind links angezeigt. (B) Lysate von 293T-Zellen, transfiziert mit Vektor (Spur 1, 4 und 8), Luciferase (Spur 2, 5 und 9) oder hPER1 (Spur 3, 6 und 10) werden hergestellt und mit einem Anti-Flag-mAb M2 immunpräzipitiert und mit hCKIε (Spur 1 bis 6), hCKIε-K38Rε (Spur 7) oder Pufferkontrolle (Spur 8–10) werden Kinaseassays durchgeführt. Immunpräzipitate werden bei 65°C 30 Min. vor dem Kinaseassay hitzeinaktiviert (Spur 4–6). Die Proben werden per 12% SDS-PAGE aufgetrennt. Das Gel wird mit Coomassie-R-250 gefärbt, getrocknet und autoradiographiert.
2. (A und B) Western-Blot-Analyse von hPER1 und hCKIε.
293T-Zellen werden mit hPER1 und Vektor (Spur 1), hPER1 und hCIKε (Spur 2), hPER1 und hCKIε-K38R (Spur 3), Vektor und hCKIε (Spur 4) oder Vektor und hCKIε-K38R (Spur 5) transfiziert. Vierundzwanzig (24) Stunden nach der Transfektion werden die Zellen geerntet und Lysate hergestellt, wie in „Material und Verfahren" beschrieben. 40 μg 293T-Gesamtlysat werden auf ein NU-PAGE-Gel mit einem Gradienten von 3–8% geladen. Proteine werden auf PVDF-Membranen geladen, und einem Western Blotting mit Anti-Flag-mAb M2 (1:1000) oder Anti-hCKIε-mAb (1:750) unterzogen. (C) Lambda-Phosphatasebehandlung hPER1. 293T-Zellen werden mit hPER1 und Vektor (Spur 1 und 4), hPER1 und hCKIε (Spur 2 und 5) oder hPER1 und hCKIε-K38R (Spur 3 und 6) transfiziert und mit [³⁵S]-Methionin (250 μCi/ml) markiert. Lysat wird mit dem Anti-Flag-mAb M2 immunpräzipitiert und entweder mit rekombinanter Lambda-Phosphatase (Spur 4, 5 und 6) behandelt oder scheinbehandelt (Spur 1, 2 und 3).
3. Puls-Chase-Markierung von hPER1, kotransfiziert mit hCKIε.
293T-Zellen werden entweder mit hPER1 und Vektor (Tafel A) oder hPER1 und hCKIε (Tafel B) kotransfiziert. Drei Stunden nach der Transfektion werden 293T-Zellen für 30 Min. mit [³⁵S]-Methionin und Cystein (1000 μCi/ml) pulsmarkiert und dann für die Zeiträume, die oben an jedem Gel angegeben sind, nachverfolgt (Chase). Zellen werden lysiert und mit dem Anti-Flag-mAb M2 immunpräzipitiert, und hPER1 wird per 8% SDS-PAGE aufgetrennt. Molekulargewichtsmarker sind links angezeigt. (C) Balkendiagramm, das einen Phosphoimaging-Scan des Bereichs darstellt, der die hPER1-Bande aus jeder Spur umgibt und enthält. Die Balken (2–30 Std.) beruhen auf dem Prozentteil der gesamten Counts per Minute (cpm) im Vergleich zu den Counts zum Zeitpunkt Null. Die ausgefüllten Balken zeigen hPER1 an, das mit Vektor kotransfiziert wurde. Schraffierte Balken zeigen hPER1 an, das mit hCKIε kotransfiziert wurde.
4. Proteinwechselwirkung zwischen hPER1 und hCKIε (A, B, C und D)
293T-Zellen werden mit Vektor und hCKIε (Spur 1), Vektor und hPER1 (Spur 2) und hCKIε und hPER1 (Spur 3) transfiziert. Vierundzwanzig (24) Stunden nach der Transfektion werden die Zellen geerntet und Lysate hergestellt. Lysate werden mit dem Anti-Flag-mAb M2 (Tafel A und C), HA-mAb (Tafel B) oder mit Anti-hCKIε-mAb (Tafel D) immunpräzipitiert und einem Western Blotting mit Anti-HA-mAb (Tafel A), Anti-Flag-mAb M2 (Tafel B und D) oder Anti-hCKIε-mAb (Tafel C) unterzogen. In Spur 4 wird die Western-Blot-Analyse mit ungereinigten Lysaten vor der Immunpräzipitation mit den angezeigten mAb durchgeführt. Alle Proteine werden auf einem 10%igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt.
5. Kartierung der hCKIε-Phosphorylierungsstellen.
(A) Schematische Darstellung der rekombinanten trunkierten hPER1-Mutanten. Trunkierungsmutanten werden konstruiert, wie unten in „Material und Verfahren" beschrieben. ORF zeigt ein komplettes offenes Leseraster von hPER1 an, Aminosäurereste 1 bis 1289. In Tabelle 1 sind Restriktionsschnittstellen angezeigt, die zur Erzeugung von N1, N2, N3, N4 und C5 verwendet wurden. Ungefüllte Balken stellen Mutanten dar, die keine Verlagerung der Molekularmasse zeigten. Ausgefüllte Balken stellen Mutanten dar, die eine Verlagerung der Molekularmasse zeigten. Schraffierte Bereiche von ORF, N2, N3 und N4 geben die Region putativer Phosphorylierung von hPER1 durch hCKIε wieder. (B) Western-Blot-Analyse von kotransfizierten hPER1-Trunkierungsmutanten von 293T-Lysaten. 293T-Zellen werden mit hPER1 und Vektor (Spur 1), hPER1 und hCKIε (Spur 2) oder hPER1 und hCKIε-K38R (Spur 3) kotransfiziert und hPER1 werden durch Western-Blot-Analyse mit dem Anti-Flag-mAb M2 analysiert. Molekulargewichtsmarker sind links angezeigt. Pfeile weisen auf die Position der Migration jedes trunkierten mutanten Proteins. hPER1-ORF und -Mutanten N1 und N2 werden routinemäßig in einem 10%igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, während hPER1 Mutanten N3, N4, C1, C2, C5 und C6 routinemäßig in einem 12%igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt werden.
6. Period-mRNA-Konzentrationen
Die Zeit ist in Stunden auf der unteren Achse angegeben; die andere Achse zeigt die Aktivität, Körpertemperatur und die Per-mRNA-Konzentrationen über die Zeit. Per-mRNA-Konzentrationen oszillieren über einen Vierundzwanzig-Stunden-Zeitraum und korrelieren umgekehrt mit der Länge von Period in Drosophila. Bei normalen Per-Mäusen werden dieselben Oszillationen bemerkt, allerdings haben Per-Knockout-Mäuse einen veränderten zirkadianen Rhythmus.
7. CLOCK-PROTEIN-SIGNALWEG
Hierbei handelt es sich um eine schematische Darstellung des Clock-Protein-Signalwegs. hCKI δ und/oder ε phosphorylieren Period, wie durch PO₄ dargestellt, was zu dessen Abbau führt. Clock und BMa1 wechselwirken in der PAS-Domäne und initiieren Transkription von Period-mRNA, was zu erhöhten Konzentrationen von Period-Protein führt.
8. PERIOD-PROTEIN- UND PHOSPHATSPIEGEL ÜBER DIE ZEIT
Die untere Achse gibt die Zeit in Stunden über einen Zeitraum von vierundzwanzig Stunden wieder; die andere Achse gibt den Spiegel von Period-Protein (in weiß) und den Phosphorylierungsgrad (in Farbe) wieder. Zu Beginn des zirkadianen Zyklus ist der Spiegel des Period-Proteins niedrig und relativ unphosporyliert. Wenn der Period-Proteinspiegel etwa um 20.00 Uhr bis auf den Spitzenwert ansteigt, erhöht sich auch die relative Phosphorylierung des Period-Proteins und steigt weiter, während der Period-Proteinspiegel fällt.
9. KOTRANSFEKTION VON CKIε UND HUMANEM PERIOD-PROTEIN 1
Die Tafel oben rechts zeigt die Phosphorylierung von hPER1. Die erste Spalte zeigt 1 μM der Testverbindung; die zweite Spalte zeigt 10 μM der Testverbindung; die dritte Spalte zeigt 30 μM der Testverbindung; die vierte Spalte zeigt Per alleine; die fünfte und letzte Spalte zeigen Per und hCKIε. Die Tafel oben rechts zeigt eine Kontrolltestverbindung. Die mittlere Tafel zeigt CKIε-Inhibitor-Testverbindung S943166 und die Tafel unten rechts zeigt CKIε-Inhibitor-Testverbindung W0236. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hemmung der Per-Phosphorylierung zu erhöhter Proteinstabilität und erhöhtem Proteinspiegel führen.
10. MENGE VON mRNA VON HUMANEM PERIOD-PROTEIN
Die obere Grafik zeigt eine bildliche Darstellung der in der unteren Grafik dargestellten Daten. Die untere Achse gibt die Zeit in Stunden an, die andere Achse zeigt die relative endogene mRNA-Menge von hPER1 in Echtzeit an, entweder aus Rat1-Fibroblasten oder aus Ratten-SCN (Nucleus suprachiasmaticus), wie bestimmt durch RT-PCR. Es sind zwei Testverbindungen dargestellt, die durch die Kästchen wiedergegebene Testverbindung ist „C", welche den Zellen in einer Konzentration von 10 μM zugegeben wird, die zweite, durch Dreiecke wiedergegebene Testverbindung ist „F" (Fluoxitin), welche den Zellen in einer Konzentration von 10 μM zugegeben wird. Der zirkadiane Rhythmus der Zellen verringert sich im Lauf der Zeit, deshalb verringert sich auch die Amplitude der Reaktion im Lauf der Zeit. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kontrollverbindung die CKI-Aktivität und auch den zirkadianen Rhythmus von Zellen nicht verändert.
11. MENGE VON mRNA VON HUMANEM PERIOD-PROTEIN
Die obere Grafik zeigt eine bildliche Darstellung der in der unteren Grafik dargestellten Daten. Die untere Achse gibt die Zeit in Stunden an, die andere Achse zeigt die relative endogene mRNA-Menge von hPER1 in Echtzeit an, entweder aus Rat1-Fibroblasten oder aus Zellen des Ratten-SCN (Nucleus suprachiasmaticus), wie bestimmt durch RT-PCR. Es sind zwei Testverbindungen dargestellt, die durch die Kästchen wiedergegebene Testverbindung ist „C", welche den Zellen in einer Konzentration von 10 μM zugegeben wird, die zweite, durch Dreiecke wiedergegebene Testverbindung ist S943166, welche den Zellen in einer Konzentration von 10 μM zugegeben wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Testverbindung S941366 den zirkadianen Rhythmus von Zellen verändert, indem sie die mRNA-Oszillation von hPER1 verschiebt, und den zirkadianen Rhythmus auf etwa 20 Std. verkürzt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Testverbindungen, welche die zirkadianen Rhythmen von Säugern verändern, und betrifft insbesondere Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, die hCKIε-Phosphorylierung eines humanen Period-Proteins 1 zu verändern. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, den Abbau eins phosphorylierten humanen Period-Proteins 1 zu ändern. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, Phosphorylierung oder alternativ den Abbau von humanem Period-Protein 1 selektiv zu verändern, relativ zu ihrer Fähigkeit, Phosphorylierung oder alternativ den Abbau eines anderen humanen Period-Proteins zu ändern.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, die hCKIε-Phosphorylierung von hPER1 zu verändern, und Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche den Abbau von hCKIε-phosphoryliertem hPER1 in einer Zelle verändern. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, die Stabilität von hPER1, hPER2 und/oder hPER 3 zu verändern oder/und den Proteinabbau von hPER1, hPER2 und/oder hPER 3 zu erhöhen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, die Fähigkeit einer Testverbindung zum Ändern der Phosphorylierung von hPER1 durch hCKIε zu bestimmen. Ein anderer Aspekt dieser Erfindung ist es, die Fähigkeit einer Testverbindung zur Hemmung der Phosphorylierung von hPER1 durch hCKIε zu bestimmen, umfassend das Hinzufügen einer Testverbindung zu einem Screeningsystem, umfassend ein humanes Period-Protein hPER1 und hCKIε, unter Bedingungen, welche Phosphorylierung erlauben, und Bestimmen des Phosporylierungsgrades in dem humanen Period-Protein. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Screeningsystem eine Phosphatquelle. Eine bevorzugte Phosphatquelle ist ATP.
Der Begriff „Aminosäure" bezieht sich auf die Bedeutung, die alle optischen Isomere, d. h. ein L-Isomer und ein D-Isomer natürlich vorkommender und nicht-natürlich vorkommender Aminosäuren einschließt. Der Begriff „Peptid" bezieht sich damit auf die Bedeutung, die nicht nur Peptide einschließt, die nur aus L-Aminosäuren bestehen, sondern auch auf Peptide, die teilweise oder vollständig D-Aminosäuren aufweisen.
Des Weiteren umfasst der Begriff „Aminosäuren" nur zwanzig natürlich vorkommende Aminosäuren, aus denen natürliche Proteine bestehen, sowie andere Alpha-Aminosäuren, Beta-, Gamma- und Delta-Aminosäuren und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren und dergleichen. Die Proteine, humanes Period-Protein und humane hCKIε können daher mit einem oder mehreren konservativen Aminosäureresten modifiziert werden, beispielsweise mit einem Aminosäurerest mit gleicher Ladung, Polarität oder einer anderen Eigenschaft eines der Alpha-Aminosäurereste, aus denen natürliche Proteine bestehen, sowie anderen Alpha-Aminosäure-Resten und Beta-, Gamma- und Delta-Aminosäureresten, nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten und dergleichen. Beispiele geeigneter Beta-, Gamma- und Delta-Aminosäuren umfassen Beta-Alanine, Gamma-Aminobuttersäure und Ornithin. Beispiele anderer Aminosäurereste, außer denen, aus denen natürliche Proteine bestehen, oder die nicht-natürlichen Aminosäuren umfassen 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylglycin, 1,2,3,4-Tetrahydroisoquinolin-3-carbonsäure oder Nipecotinsäure.
Die Begriffe „hPER1", „hPER2", „hPER3", hCKIδ" und „hCKIε" umfassen Vollängenproteine von humanem Period-Protein 1, humanem Period-Protein 2, humanem Period-Protein 3, humaner Caseinkinase Iδ und humaner Caseinkinase Iε, Allele und Derivate von hPER1-, hPER2-, hPER3- und hCKIδ- und/oder -ε-Protein. Derivate umfassen Änderungen von natürlich vorkommenden Formen dieser Proteine durch eine oder mehrere andere Aminosäuren, trunkierte Proteine und Fusionsproteine der Volllängenproteine oder trunkierten Proteine, die entweder 3'- oder 5'-Markierungen enthalten, sowie natürlich vorkommende und nicht natürlich vorkommende mutante Sequenzen, die in der oben zitierten Literatur bereit gestellt und bei öffentlichen Datenbanken wie beispielsweise in GeneBank eingereicht wurden. Derivate dieser Proteine umfassen Proteine, die eine Leadersequenz, ein Epitop oder eine andere Proteinsequenz enthalten, wie beispielsweise eine Myc^TM-markierte Sequenz, eine His-markierte Sequenz oder eine Flag^TM-Epitop-Markierungssequenz. Die Sequenz des humanen Period-Proteins 1 ist verfügbar unter GeneBank-Zugangsnummer AB002107, NID g2506044, eingereicht von H. Tei am 24. März 1997. Die Sequenz des humanen Period-Proteins 1 wurde auch veröffentlicht in Tei, H. et al., Nature 389: 512–516 (1997). Die Sequenz des humanen Period-Proteins 2 ist verfügbar unter der GeneBank-Zugangsnummer NM003894, NID g4505710, eingereicht von T. Nagase et al. Die Sequenz des humanen Period-Proteins 2 wurde auch veröffentlicht in Nagase. T., et al., DNA Res. 4 (2): 141–150 (1997) und in Shearman, L. P., et al., Neuron 19 (6): 1261–1269 (1997). Die Sequenz des humanen Period-Proteins 3 ist verfügbar unter der GeneBank-Zugangsnummer Z98884. Die Sequenz der humanen Caseinkinase I ist verfügbar unter der GeneBank-Zugangsnummer U29171. Die humane Caseinkinase I delta wurde auch veröffentlicht in Kusda, J., et. al., Genomics 32: 140–143 (1996). Die Sequenz der humanen Caseinkinase I ε ist verfügbar unter der GeneBank-Zugangsnummer L37043. Die humane Caseinkinase I epsilon wurde auch veröffentlicht in Fish, K. J., et al., J. Biol. Chem. 270: 14875–14883 (1995). Die c-MYC-markierte CKI δ war ein Geschenk von Dr. David Virshup.
Der Begriff „Basensequenz" bezieht sich auf RNA-Sequenzen sowie auf DNA-Sequenzen, die hPER1, hPER2, hPER3 oder hCKIε codieren, einschließlich deren Derivate.
Bei den Proteinen „hCKIδ" und „hCKIε" nach der vorliegenden Beschreibung handelt es sich um ein Protein oder dessen Derivat mit im wesentlichen gleicher Phosphorylierungsaktivität im Hinblick auf ein humanes Per-Protein wie hierin beschrieben. Die Proteine hCKI δ und/oder ε sind Proteine mit im wesentlichen gleicher Aktivität im Hinblick auf natürlich vorkommende hCKI δ und/oder ε, deren Allele und Derivate. hCKI δ und/oder ε umfassen andere Säuger-Caseinkinase-Proteine I, die ihre Kinaseaktivität im Hinblick auf hPER1, hPER2 und/oder hPER3 behalten oder derart modifiziert sind, dass ihre Fähigkeit, hPER1, hPER2 und/oder hPER3 zu phosphorylieren, nicht wesentlich verändert ist. Humane Formen von hCKI δ und/oder ε sind bevorzugt. Dennoch wäre die Verwendung anderer Säugerformen von hCKI δ und/oder ε annehmbar, da beispielsweise humane hCKI δ und Ratte-hCKI δ zu 97% homolog sind, und ihre Sequenzen in der Kinasedomäne (284 Aminosäuren) vollständig identisch wären. Modifizierte Proteine umfassen eine trunkierte Form von hCKI δ und/oder ε, Derivate von hCKI δ und/oder ε, die Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -additionen und dergleichen enthalten, die ihre Kinaseaktivität im Hinblick auf hPER1, hPER2 und/oder hPER3 behalten. Derivate von Caseinkinase I umfassen Proteine, die eine Leadersequenz, eine Epitopsequenz oder eine andere Proteinsequenz enthalten, wie beispielsweise eine Myc^TM-markierte Sequenz, eine His-markierte Sequenz oder eine Flag^TM-Epitop-Markierungssequenz, und hPER1-Phosphorylierungsaktivität aufweisen. Solche Derivate vereinfachen die Reinigung oder ermöglichen die Anbringung an Sepharose-Kügelchen oder erlauben einen einfachen Nachweis.
Derivate von hPER1, hPER2 und/oder hPER3 umfassen Proteine, die eine Leadersequenz, eine Epitopsequenz oder eine andere Proteinsequenz enthalten, wie beispielsweise eine Myc^TM-markierte Sequenz, eine His- markierte Sequenz oder eine Flag^TM-Epitop-Markierungssequenz, die ihre Fähigkeit beibehalten, durch hCKIε phosphoryliert zu werden. Solche Derivate vereinfachen die Reinigung oder ermöglichen die Anbringung an Sepharose-Kügelchen oder erlauben einen einfachen Nachweis. Bevorzugte humane Period-Proteine umfassen Proteine mit einer oder mehreren der hCKIε-Phosphorylierungs-Konsensussequenz „DXXS", wobei D ein Glutaminsäurerest, X ein beliebiger Aminosäurerest und S ein Serinrest ist. Phosphorylierung findet an Serinen nach dem S-X_n-S-Motif statt, wobei n 1, 2, 3 oder 4 ist und zu Hyperphosphorylierung führen kann. Phosphorylierungspräferenzen für Caseinkinase I sind in Flotow, H. and Roach, P. J., J. Biol. Chem. 266 (6): 3724–3727 (1991) charakterisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das humane Period-Protein zu Hyperphosphorylierung fähig. Phosphorylierungsstellen in hPER1 liegen zwischen Aminosäure 743 und 889 von hPER1, vorzugsweise zwischen Aminosäure 800 und 820 von hPER1 und am meisten bevorzugt zwischen Aminosäure 808 und 815 von hPER1, oder alternativ zur Unterbrechung der putativen CKI-Wechselwirkungsdomäne für humanes PER1 an IQELSEQIHRLLLQPVH an Aminosäure 486–503, für humanes PER2 an IQELTEQIHRLLLQPVH Aminosäure 460–477 und/oder für humanes PER3 an ITELQEQIYKLLLQPVH. In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen bevorzugte Derivate von hPER1 eine Phosphorylierungsstelle, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus hPER1 Aminosäure 743 und 889 besteht, oder zur Unterbrechung der putativen CKI-Wechselwirkungsdomäne auf hPER1 an Aminosäure 486–503 (IQELSEQIHRLLLQPVH).
Der Begriff „Proteine mit Proteinkinaseaktivität" bezieht sich auf ein Protein, bei dem ein Fachmann festgestellt hat, dass es Proteinkinaseaktivität aufweist, z. B. ein Protein, das eines oder mehrere humane Period-Proteine in einem Screeningsystem phosphorylieren kann. Das Screeningsystem kann die gleichen oder die im Wesentlichen gleichen Bedingungen aufweisen, wie in einem der obigen Beispiele ausgeführt ist. Verfahren zum Einrichten von Assays für Phosphorylierung, Abbau oder zirkadiane Rhythmen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt, und die vorliegende Erfindung soll nicht auf die hierin bereit gestellten spezifischen Ausführungsformen beschränkt sein.
Proteine zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können beispielsweise aus humanem Gewebe erhalten, mit Standardrekombinationstechniken rekombinant exprimiert und/oder wahlweise chemisch modifiziert werden. Rekombinante Expression der Proteine ist bevorzugt.
„Derivate" von Proteinen umfassen Proteine, bei denen eine Aminogruppe an einem aminoterminalen Ende (N-terminal) oder alle oder ein Teil von Aminogruppen von Seitenketten von Aminosäuren und/oder eine Carboxylgruppe an einem carboxyterminalen Ende (C-terminal) oder alle oder ein Teil von Carboxylgruppen an Seitenketten von Aminosäuren und/oder funktionelle Gruppen außer den Aminogruppen und Carboxylgruppen der Seitenketten der Aminosäuren wie Wasserstoff, eine Thiolgruppe oder eine Aminogruppe durch geeignete andere Substituenten modifiziert worden sind. Die Modifikation durch geeignete andere Substituenten erfolgt, um beispielsweise funktionelle Gruppen in dem Protein zu schützen, Sicherheit zu verbessern oder die Testung zu vereinfachen, beispielsweise eine Addition funktioneller Gruppen, um ein Protein an ein Sepharose-Kügelchen anzubringen. Ein Beispiel ist die Addition einer Flag^TM-Epitopmarkierungssequenz, die am 5'-Ende den Primern hinzugefügt wird, oder eine His-Markierung.
Zu den Derivaten der Proteine gehören:

(1) Proteine, in denen eines oder mehrere Wasserstoffatome der Aminogruppe am aminoterminalen Ende (N-terminal) oder ein Teil oder alle der Aminogruppen an den Seitenketten der Aminosäuren durch substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppen (welche geradkettig oder verzweigtkettig sein oder eine zyklische Kette aufweisen können), wie beispielsweise eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Propylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine Isobutylgruppe, eine Butylgruppe, eine t-Butylgruppe, eine Cyclopropylgruppe, eine Cyclohexylgruppe oder eine Benzylgruppe, substituierte oder unsubstituierte Acylgruppen wie beispielsweise eine Formylgruppe, eine Acetylgruppe, eine Caproylgruppe, eine Cyclohexylcarbonylgruppe, eine Benzoylgruppe, eine Phthaloylgruppe, eine Tosylgruppe, eine Nicotinoylgruppe oder eine Piperidincarbonylgruppe, Schutzgruppen vom Urethantyp wie beispielsweise eine p-Nitrobenzyloxycarbonylgruppe, eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, eine p-Biphenylisopropyloxycarbonylgruppe oder eine t-Butoxycarbonylgruppe oder Substituenten vom Harnstofftyp wie beispielsweise eine Methylaminocarbonylgruppe, eine Phenylcarbonylgruppe oder eine Cyclohexylaminocarbonylgruppe ersetzt sind;
(2) Proteine, bei denen die Carboxylgruppen am C-terminalen Ende (C-terminal) oder ein Teil oder alle der Seitenketten der Aminosäuren verestert sind (beispielsweise sind das Wasserstoffatom oder die Wasserstoffatome durch Methyl, Ethyl, Isopropyl, Cyclohexyl, Phenyl, Benzyl, t-Butyl oder 4-Picolyl ersetzt) oder amidiert (beispielsweise werden unsubstituierte Amide oder C₁-C₆-Alkylamid wie beispielsweise ein Methylamid, ein Ethylamid oder ein Isopropylamid gebildet), oder
(3) Proteine, bei denen ein Teil oder alle der funktionellen Gruppen außer den Aminogruppen und den Carboxylgruppen der Seitenketten der Aminosäuren, beispielsweise Wasserstoff, eine Thiolgruppe oder eine Aminogruppe durch die in (1) beschriebenen Substituenten oder eine Tritylgruppe ersetzt sind.

Der Begriff „Verändern" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Testverbindung, Phosphorylierung von hPER1, hPER2 und/oder hPER3 durch hCKI δ und/oder ε relativ zu der Phosphorylierung in Abwesenheit der Testverbindung zu hemmen oder zu verstärken. Alternativ bezieht sich „Verändern" auch auf die Fähigkeit einer Testverbindung, Phosphorylierung von hPER1, hPER2 und/oder hPER3 durch hCKI δ und/oder ε relativ zu der Phosphorylierung einer anderen Verbindung, wie beispielsweise einem Standard, zu hemmen oder zu verstärken. Es ist bevorzugt, dass die Fähigkeit einer Verbindung, Phosphorylierung von hPER1, hPER2 und/oder hPER3 zu hemmen oder zu verstärken, in Bezug auf eine natürlich vorkommende Form von hCKI-Protein δ und/oder ε zu bestimmen.
Der Begriff „Screeningsystem" bezieht sich auf einen Satz von Bedingungen, die geeignet sind, um Phosphorylierung von hPER1, hPER2 und/oder hPER3 durch hCKI δ und/oder ε zu erlauben. Im Allgemeinen enthält ein Screeningsystem eine bereite Phosphatquelle. Eine bevorzugte Phosphatquelle ist eine bereite Quelle von ATP. Das Screeningsystem kann zellbasiert oder in vitro sein. Zellbasierte Screeningsysteme umfassen die Verwendung von Zellen, die ein beliebiges oder jedes von hPER1, hPER2, hPER3 und/oder hCKI δ und/oder ε exprimieren. Ein Verfahren zum Screening kann entweder ein Zellsystem oder ein zellfreies System sein. Geeignete Zellsysteme umfassen Hefezellen, wie beispielsweise S. cerevisiae, Bakterienzellen wie E. coli, Insektenzellen, wie die in Bakulovirusexpressionssystemen verwendeten, Nematodenzellen, Säugerzellen wie COS-Zellen, Lymphozyten, Fibroblasten (3Y1-Zellen, NIH/3T3-Zellen, Rat1-Zellen, Balb/3T3-Zellen, etc.), humane embryonale Nierenzellen wie beispielsweise 293T-Zellen, CHO-Zellen, Blutzellen, Tumorzellen, Glattmuskelzellen, Herzmuskelzellen, Gehirnzellen. Bevorzugte Zellsysteme sind Zellen des Nucleus suprachiasmaticus, Nervenzellen, Myelozyten, Gliazyten und Astrozyten. In einem zellbasierten System muss die Zelle transfiziert oder transformiert werden, um eines oder beide humane Period-Proteine und/oder hCKIε zu exprimieren, wenn das Zellsystem das humane Period-Protein und/oder hCKIε nicht exprimiert. Alternativ kann ein zellfreies System verwendet werden. Partiell gereinigtes oder gereinigtes hPER1, hPER2 und/oder hPER3 und hCKI δ und/oder ε kann aus rekombinanten Quellen erhalten werden, die hPER1, hPER2 und/oder hPER3 und hCKI δ und/oder ε exprimieren, wobei die zugrunde liegende Basensequenz der ursprünglichen mRNA, welche das Protein kodiert, modifiziert wird.
Rekombinante Expression eines humanen Period-Proteins und/oder von hCKI δ und/oder ε in einer Zelle kann das Ergebnis einer Transfektion mit einem oder mehreren geeigneten Expressionsvektoren sein, die beispielsweise einen Promotor und cDNA enthalten, welche hPER1, hPER2, hPER3 und/oder hCKI δ und/oder ε kodieren. Zellbasierte Screeningsysteme umfassen auch die Verwendung von Zellen, in denen das humane Period-Protein und/oder hCKI δ und/oder ε als ein Fusionsprotein mit einer Transduktionssequenz oder einer transduzierenden Sequenz, wie beispielsweise von HIV erhaltenes TAT-Protein, das Antennapedia-Transduktionsfragment, oder einem anderen Mittel zum Einführen exogenen Proteins in eine Zelle in die Zelle transudiert oder transduziert wird.
Bevorzugte In-vitro-Screeningsysteme umfassen wässrige Zusammensetzungen, die eine bereite Phosphatquelle umfassen. Bevorzugte In-vitro-Screeningsysteme umfassen ATP.
Beispiele von Verfahren zum Bestimmen des Phosphorylierungsgrades eines humanen Period-Proteins umfassen Standardverfahren zum Feststellen der Menge von Proteinphosphorylierung, wie beispielsweise Verwendung radioaktiv markierten Phosphors und Autoradiographie, oder indirekt durch Vergleich der Menge von zugegebenem radioaktiv markiertem Phosphor und der resultierenden Menge ungebundenen Phosphors. Alternativ können kolorimetrische Mittel oder andere Feststellungsmittel verwendet werden, um den Phosphorylierungsgrad zu bestimmen. Ein weiteres geeignetes Verfahren zum Feststellen des Phosphorylierungsgrades eines humanen Period-Proteins umfasst ein zellfreies System unter Verwendung von Glutathion-Sepharose-Kügelchen, wobei entweder das humane Period-Protein oder hCKIε an einen festen Trägerstoff wie beispielsweise Sepharose-Kügelchen gebunden sind und entweder hCKIε oder das humane Period-Protein zugegeben werden. Darüber hinaus sind zahlreiche alternative Verfahren zum Bestimmen der Menge an humanem Period-Protein nach verfügbar und umfassen die Verwendung von ³⁵S-markiertem humanem Period-Protein-Abbau, kolorimetrische Assays, Elution von gebundenem humanem Period-Protein und dergleichen.
Die hierin beschriebenen Screeningverfahren sind insofern besonders nützlich, als sie automatisiert werden können, was das Screening einer großen Anzahl von Testverbindungen, entweder zufällig konstruierten Testverbindungen oder rational konstruierten Testverbindungen, mit hohem Durchsatz ermöglicht, um solche Testverbindungen zu identifizieren, die den Phosphorylierungsgrad und/oder Abbau des humanen Period-Proteins effektiv modulieren oder verändern und damit den zirkadianen Rhythmus eines Säugers verändern.
Der Begriff „Säuger" bezieht sich auf Mensch, Primat, Hund, Schwein, Rind und andere höhere Organismen. Menschen und Primaten sind mehr bevorzugte Säuger. Der Mensch ist am meisten bevorzugt.
Testverbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen alle biologischen oder kleinmolekularen chemischen Verbindungen, wie beispielsweise einfache oder komplexe organische Moleküle, Peptide, Analoge von Peptiden, Proteine, Oligonukleotide, Verbindungen, die aus Mikroorganismenkultur stammen, natürlich vorkommende oder synthetische organische Verbindungen und/oder natürlich vorkommende oder synthetische anorganische Verbindungen. Die Wahl der zu screenenden Testverbindung ist aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, um die Fähigkeit einer Testverbindung zum Verändern der Phosphorylierung eines oder mehrerer humaner Period-Proteine zu bestimmen, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst:

(1) Zugabe einer Testverbindung zu einem Screeningsystem, welches das Protein hCKI ε und humanes Period-Protein 1 enthält, und
(2) Bestimmung des Phosphorylierungsgrads des humanen Period-Proteins 1.

Alternativ umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, die Phosphorylierung eines oder mehrerer humaner Period-Proteine selektiv zu verändern, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst:

(1) Zugabe einer Testverbindung zu einem Screeningsystem, welches das Protein hCKI ε sowie ein hPER-Protein, bestehend aus hPER1, enthält, und
(2) Zugabe einer Testverbindung zu einem Screeningsystem, welches das Protein hCKI ε sowie ein hPER-Protein, ausgewählt aus der aus hPER1, hPER2 und hPER3 bestehenden Gruppe, enthält, wobei das in (2) ausgewählte hPER-Protein nicht identisch ist mit dem in (1) ausgewählten hPER-Protein,
(3) Bestimmung des Phosphorylierungsgrads des humanen Period-Proteins in (1) und in (2) und
(4) Vergleich der in (3) für die verschiedenen humanen Period-Proteine erhaltenen Ergebnisse um zu ermitteln, ob die Testverbindung hinsichtlich der Veränderung der Phosphorylierung von hPER1, hPER2 und/oder hPER3 eine Selektivität aufweist.

Alternativ umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, den Abbau eines oder mehrerer humaner Period-Proteine zu verändern, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst:

(1) Zugabe einer Testverbindung zu einem Screeningsystem, welches das Protein hCKI ε sowie ein hPER-Protein, bestehend aus hPER1, enthält,
(2) Bestimmung der Menge an humanem Period-Protein nach Zugabe der Testverbindung und
(3) Vergleichen der in Schritt (2) erhaltenen Menge an humanem Period-Protein mit der Menge an humanem Period-Protein im Screeningsystem.

Alternativ umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, den Abbau eines humanen Period-Proteins zu verändern, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst:

(1) Zugabe einer Testverbindung und des Proteins hCKI ε zu einem Screeningsystem, welches ein hPER-Protein, bestehend aus hPER1, enthält,
(2) Bestimmung der Menge an humanem Period-Protein nach Zugabe der Testverbindung und des Proteins hCKI ε und
(3) Vergleichen der in Schritt (2) erhaltenen Menge an humanem Period-Protein mit der Menge an humanem Period-Protein im Screeningsystem.

(1) Zugabe des Proteins hCKI ε zu einem Screeningsystem, welches eine Testverbindung und ein hPER-Protein, bestehend aus hPER1, enthält,
(2) Bestimmung der Menge an humanem Period-Protein nach Zugabe des Proteins hCKI ε und
(3) Vergleichen der in Schritt (2) erhaltenen Menge an humanem Period-Protein mit der Menge an humanem Period-Protein im Screeningsystem.

Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zum Ändern des Abbaus von hPER1 durch eine Verbindung, welche die Fähigkeit des Proteins hCKI ε zur Phorphorylierung von hPER1 an einer Stelle zwischen Aminosäure 743 und 889 von hPER1, vorzugsweise zwischen Aminosäure 800 und 820 von hPER1 und am meisten bevorzugt zwischen Aminosäure 808 und 815 von hPER1 verändert, oder alternativ für die Unterbrechung der putativen CKI-Wechselwirkungsdomäne von humanem PER1 an IQELSEQIHRLLLQPVH.
Wie unten beschrieben, wird phosphoryliertes hPER1-Protein rasch abgebaut, daher kann das Screeningverfahren nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Testverbindungen zu identifizieren, die den Abbau von hPER1 selektiv aktivieren oder hemmen. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Bestimmen von Verbindungen bereit, welche die Phosphorylierung von hPER1 selektiv aktivieren oder hemmen, indem der Effekt dieser Verbindung auf Aktivierung oder Hemmung der Phosphorylierung eines beliebigen hPER1 bestimmt und die Ergebnisse mit denen verglichen werden, die mit derselben oder einer anderen Testverbindung erhalten werden.
Da phosphoryliertes hPER1-Protein rasch abgebaut wird, kann das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um Testverbindungen, die den Spiegel eines humanen Period-Proteins in einer Zelle selektiv erhöhen oder reduzieren, relativ zum Spiegel desselben oder eines anderen humanen Period-Proteins in Abwesenheit der Testverbindung zu identifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren verwendet, um Testverbindungen, die den Spiegel eines hPER1 in einer Zelle selektiv erhöhen oder reduzieren, relativ zu dem hPER1-Spiegel in Abwesenheit der Testverbindung zu identifizieren.
Darüber hinaus umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Testverbindungen, welche den Grad des Abbaus von hPER1 in einer Zelle relativ zum Grad des Abbaus von hPER2 in Anwesenheit der Testverbindung selektiv hemmen. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren verwendet, um Testverbindungen zu identifizieren, welche den Grad des Abbaus von hPER2 in einer Zelle relativ zum Grad des Abbaus von hPER1-Abbau in Anwesenheit der Testverbindung selektiv hemmen.
Das vorliegende Verfahren kann verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche die Menge von hPER1 in einer Zelle relativ zu seiner nativen Menge erhöhen oder reduzieren. Der Vergleich der Ergebnisse verschiedener Testverbindungen auf die Menge an humanem Period-Protein kann auch nach einer biologischen oder chemischen Behandlung erfolgen, beispielsweise nach Zugabe, Hemmung oder Verändern endogener und/oder exogener Stimuli wie beispielsweise Licht, Wachstumsfaktoren, Transkriptionsfaktoren und dergleichen.
Es ist bekannt, dass phosphorylierte hPER-Proteine eng an der Regulierung des zirkadianen Zyklus von Säugern beteiligt sind. Die vorliegende Erfindung kann daher verwendet werden, um Testverbindungen zu identifizieren, welche die physiologische Reaktion des zirkadianen Zyklus eines Säugers in Abwesenheit einer Testverbindung oder von Stimuli beeinflussen, modulieren oder anderweitig verändern. Die Modulierung des zirkadianen Zyklus eines Säugers umfasst die Prävention der Veränderung des normalen zirkadianen Zyklus eines Säugers als Reaktion auf einen Reiz in Abwesenheit der Testverbindung. Die vorliegende Erfindung umfasst daher Verfahren zum Identifizieren von Testverbindungen, die in der Lage sind, eine Änderung des zirkadianen Zyklus von Säugern als Reaktion auf Reize zu verhindern, die normalerweise den zirkadianen Zyklus eines Säugers verändern.
Die folgenden Beispiele, welche den Effekt von humaner Caseinkinase I ε (hCKIε) auf die Phosphorylierung von humanem Period-Protein 1 zeigen, können modifiziert werden, um humanes Period-Protein 2 und/oder humanes Period-Protein 3 zu substituieren. Gleiche Ergebnisse werden erhalten mit der humanen Caseinkinase I hCKIδ.
Gereinigte rekombinante hCKIε, aber nicht eine kinasenegative Mutante von hCKIε (hCKIε-K38R), phosphoryliert hPER1 in vitro. Bei Kotransfektion mit Wildtyp hCKIε in 293T-Zellen zeigt hPER1 eine signifikante Erhöhung der Phosphorylierung, was sich an einer Verschiebung der molekularen Masse zeigt. hPER1-Protein kann auch mit transfizierter hCKIε sowie endogener hCKIε koimmunpräzipitiert werden, was auf eine physikalische Assoziation zwischen hPER1- und hCKIε-Proteinen in vivo hinweist. Darüber hinaus verursacht Phosphorylierung von hPER1 durch hCKIε eine Abnahme der Proteinstabilität in hPER1. Unphosphoryliertes hPER1 bleibt in der Zelle während eines 24-Stunden-Zyklus stabil, wohingegen phosphoryliertes hPER1 eine Halbwertszeit von etwa 12 Std. hat. Bei Verwendung verschiedener hPER1-Trunkierungsmutanten sind mögliche Phosphorylierungsstellen in hPER1 Aminosäuren 743 bis 889, welche eine CKI-Phosphorylierungs-Konsensusstelle enthalten.
Um zu untersuchen, ob hCKIε, das Säugerhomolog von Drosophila DBT, hPER1 phosphorylieren kann, wird rekombinante His-markierte Wildtyp-hCKIε von E. coli exprimiert, gereinigt und hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Phosphorylierung eines Paares bekannter Substrate, Casein und GST-IkBα sowie hPER1 getestet. Rekombinante hCKIε phosphoryliert sowohl Casein als auch IkBα-Substrate (1A, Spur 2 und 3). Gereinigte Wildtyp-hCKIε führt eine Autophosphorylierung durch. Die Fähigkeit zur Autophosphorylierung weist auf hCKIε-Aktivität hin (1A, Spur 1 und 2). Ist rekombinante hCKIε abwesend, wird keine Phosphorylierung beobachtet (1A, Spur 7 und 8).
Eine kinasenegative Mutante von hCKIε-K38R, in der Lysin 38 in der ATP-Bindungsstelle zu einem Arginin mutiert ist, wird hinsichtlich der Phosphorylierung von Casein- und IkBα-Substrat getestet. hCKIε-K38R weist keine Autophosphorylierungsaktivität auf und phosphoryliert entweder Casein- oder GST-IkBα-Substrat (1A, Spur 4–6). Dies zeigt, dass die vorherige Phosphorylierungsaktivität spezifisch für Wildtyp-hCKIε ist.
Es wurde auch gezeigt, dass rekombinante hCKIε hPER1 in vitro phosphoryliert. Wie in 1B gezeigt ist, wird in Abwesenheit von rekombinantem hCKIε keine Phosphorylierung beobachtet (Spur 8–10). Das Vorhandensein von hCKIε führt in vitro zu Phosphorylierung von hPER1, aber nicht von Flag-markierter Luciferase (Spur 2 und 3). Phosphorylierung von hPER1 ist nicht auf hPER1-assoziierte Kinaseaktivität zurückzuführen, da hCKIε auch hitzeinaktivierte hPER1-Immunpräzipitate phosphoryliert (Spur 6). Darüber hinaus weist hCKIε-K38R keine Kinaseaktivität gegenüber hPER1 auf (Spur 7). Darum wird hPER1 in vitro von hCKIε direkt phosphoryliert.
hPER1 wird in 293T-Zellen, die mit Flag-markiertem hPER1 und entweder Vektorkontrolle, Wildtyp-hCKIε oder hCKIε-K38R kotransfiziert sind, durch hCKIε spezifisch phosphoryliert. Zellen werden 24 Std. nach der Transfektion lysiert und die Lysate auf einem 3–8%igen SDS-NU-PAGE aufgetrennt, gefolgt von Western-Blot-Analyse. 2A zeigt, dass in Zellen, die mit Wildtyp-hCKIε und hPER1 kotransfiziert sind, im Vergleich zu Zellen, die entweder mit Vektorkontrolle oder hCKIε-K38R transfiziert sind, eine signifikante Verschiebung der molekularen Masse des hPER1-Proteins beobachtet wird (Spur 1–3). Ähnliche Verschiebungen der molekularen Masse von hPER1 werden bei mehreren Kotransfektionsexperimenten, in denen SDS-PAGE in verschiedenen Prozentanteilen verwendet wird, immer beobachtet. Western-Blot-Analyse zeigte, dass sowohl Wildtyp-hCKIε als auch hCKIε-K38R-Proteine in gleichem Maß exprimiert werden (2B, Spur 2–5).
Mit Flag-markiertem hPER1 und entweder Vektorkontrolle, hCKIε oder der kinasenegativen Mutante von hCKIε-K38R kotransfizierte und mit [³⁵S]-Methionin und -Cystein radioaktiv markierte 293T-Zellen zeigen die Ursache für die Veränderung der molekularen Masse von hPER1 nach Phosphorylierung. ³⁵S-radioaktiv markiertes hPER1 wird immunpräzipitiert und entweder mit gereinigter rekombinanter Lambda-Phosphatase behandelt oder nicht behandelt. Wie in 2C gezeigt ist, zeigt immunpräzipitiertes ³⁵S-radioaktiv markiertes hPER1 eine Verschiebung der molekularen Masse, wenn Zellen mit Wildtyp-hCKIε kotransfiziert werden, aber nicht mit Vektor- oder kinasenegativen hCKIε-K38R-Kontrollen (Spur 1, 2 und 3). Die Verschiebung der molekularen Masse des Proteins von Zellen, die mit hPER1 und Wildtyp-hCKIε kotransfiziert wurden, ist nach 1-stündiger Behandlung mit Lambda-Phosphatase signifikant verringert. Dies zeigt, dass die Verschiebung der Mobilität von hPER1 auf Phosphorylierung zurückzuführen ist (2C, Spur 2 und 5). Nach 1-stündiger Behandlung mit Lambda-Phosphatase ist die Mobilität aller hPER1 bei hCKIε-kotransfizierten Zellen gegenüber mit Vektorkontrolle und kinasenegativen kotransfizierten Zellen im Wesentlichen nicht voneinander zu unterscheiden (2C, Spur 4, 5 und 6).
Die Lambda-Phosphatase-Mobilitätsverschiebung ist nicht auf kontaminierende Proteinasen zurückzuführen. Zugabe von 50 mM Natriumfluorid (ein Phosphataseinhibitor) zu der Lambda-Phosphatase-Reaktion blockierte die Reduzierung der Mobilitätsverschiebung von hPER1. In den Immunpräzipitaten sind keine anderen Formen höherer molekularer Masse von hPER1 vorhanden, was darauf hinweist, dass die posttranslationale Mobilitätsverschiebung von hPER1 auf die Phosphorylierung zurückzuführen ist.
Während des zirkadianen Zyklus sammelt sich PER-Protein an, und diese Ansammlung führt zu seinem anschließenden Abbau (Edery. I., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2260–2264, Dembinska. M. E., et al. (1997) J. Biol. Rhythms 12, 157–172). Während der Phase, wenn sich PER-Protein ansammelt, gibt es eine signifikante Verschiebung der molekularen Masse, die auf die Phosphorylierung des Proteins zurückführbar sein könnte. Die Mobilitätsverschiebung erreicht kurz, bevor PER verschwindet, ihr Maximum (Edery, I., et al. (1994) oben). Um zu zeigen, dass Phosphorylierung von hPER1 zu dessen Instabilität in Zellen führt, sind 293T-Zellen verwendet worden, die mit Expressionsplasmiden, die sowohl hPER1 als auch Wildtyp-hCKIε exprimieren, oder Vektorkontrolle kotransfiziert wurden. Etwa 20 Std. nach der Transfektion werden die Zellen für 30 Min. mit [³⁵S]-Methionin/Cystein pulsmarkiert und anschließend 0–30 Std. lang nachverfolgt (chase). Nach den geeigneten Zeiträumen wird hPER1 geerntet, immunpräzipitiert und durch SDS-PAGE analysiert. Wie in 3A gezeigt ist, zeigten Zellen, die mit hPER1 ko- und Vektor alleine transfiziert wurden, eine sehr geringe Mobilitätsverschiebung während des gesamten Zeitverlaufs (Spur 1–7). Nach 12 Std. schien eine leichte Verschiebung der molekularen Masse vorhanden zu sein, wie sich an einem Verschmieren des Proteins zeigte, die sich zum Zeitpunkt 30 Std. leicht erhöhte (Spur 1, 5 und 7). Die in den Kontrollzellen vorhandene Menge von hPER1 blieb während der gesamten Zeitverläufe relativ konstant. Zwei Stunden nach der radioaktiven Markierung sind noch immer etwa 50% hPER1-Protein in der Zelle vorhanden, und diese Menge bleibt während des gesamten Zeitverlaufes konstant (3C, ausgefüllte Balken). Gegenüber den Vektorkontrollzellen zeigten Zellen, die mit hPER1 und Wildtyp-hCKIε kotransfiziert wurden, bereits 2 Std. nach der radioaktiven Markierung eine Mobilitätsverschiebung (3B, Spur 1 und 2). Diese Verschiebung der molekularen Masse nimmt an Ausprägung während des Zeitverlaufes zu, wobei die größte Verschiebung nach 24 bis 30 Std. auftritt (3B, Spur 2–7). Gegenüber der Vektorkontrolle zeigte hPER1 aus 293T-Zellen, die mit hCKIε kotransfiziert wurden, eine Verringerung der Proteinstabilität. Ähnlich wie bei der Vektorkontrolle sind zum Zeitpunkt nach 2 Std. 50% des gesamten hPER1 aus mit CKIε kotransfizierten Zellen in der Zelle vorhanden (3B, Spur 2 und 3C, schraffierte Balken). Gegenüber der Vektorkontrolle bleibt nur die Hälfte des phosphorylierten hPER1 nach 12 Std. in der Zelle. Nach 24 Std. sind etwa 14% von phosphoryliertem hPER1 vorhanden (3B, Spur 5 und 6 und 3C, schraffierte Balken). Dieses Experiment wird drei Mal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Phosphorylierung von hPER1 durch Wildtyp-hCKIε führt zu verringerter Proteinstabilität und zu seinem anschließenden Abbau.
hPER1 und hCKIε gehen in 293T-Zellen eine physikalische Wechselwirkung ein. 293T-Zellen werden mit Flag-markiertem hPER1 und entweder Vektor alleine oder HA-markiertem hCKIε kotransfiziert. Transfizierte 293T-Zellen werden lysiert, und hPER1 wird mit Anti-Flag-mAb immunpräzipitiert und anschließend mit Anti-HA-mAb immungeblottet. Alternativ wird hCKIε mit Anti-HA-mAb immunpräzipitiert und anschließend mit Anti-Flag-mAb immungeblottet. 4A und 4B zeigen, dass rekombinante hCKIε mit hPER1 kopräzipitiert, was anzeigt, dass hCKIε sich direkt mit hPER1 verbindet. 293T-Zellen werden mit hPER1 transfiziert, nur um zu zeigen, dass hPER1. Zellen werden lysiert, und hPER1 wird mit Anti-Flag-mAb immunpräzipitiert und anschließend mit Anti-hCKIε-mAb immungeblottet. Alternativ wird endogene hCKIε mit Anti-hCKIε-mAb immunpräzipitiert und anschließend mit Anti-Flag-mAb immungeblottet. Endogene hCKIε kopräzipitierte mit hPER1, was anzeigt, dass zwischen den beiden Proteinen eine physikalische Verbindung besteht (4C und 4D).
hCKIε phosphoryliert hPER1 zwischen Aminosäure 621 und 889. 2A zeigt, dass die Verschiebung der molekularen Masse von hPER1 auf die Phosphorylierung durch hCKIε zurückführbar ist. Um die Phosphorylierungsstelle(n) von hPER1 zu identifizieren, die von hCKIε phosphoryliert wird/werden, werden trunkierte Versionen von hPER1 hergestellt, wie in 5A und unter „Material und Verfahren" unten beschrieben ist. Diese Konstrukte werden zusammen mit Vektor, hCKIε oder hCKIε-K38R in 293T-Zellen transfiziert und hinsichtlich einer Verschiebung der molekularen Masse getestet. Wie in 5B, Spur 2, dargestellt, zeigten Zellen, die mit hCKIε und entweder mit dem vollständigen offenen Leseraster von hPER1 (ORF) oder N2, N3 oder N4 kotransfiziert wurden, eine Verschiebung der molekularen Masse des Proteins. Lambda-Phosphatase-Behandlung von trunkiertem hPER1-Protein führte zu einem Verschwinden der Verschiebung, was auf Phosphorylierung durch hCKIε zurückzuführen ist. hCKIε, kotransfiziert mit N1 oder C-terminalen Konstrukten C1, C2, C5 oder C6, zeigte keine Verschiebung der molekularen Masse der Proteine (5B und 5C, Spur 2). Trunkierte Konstrukte, die eine Verschiebung der molekularen Masse zeigten (ORF, N2, N3 und N4) haben eine Homologieregion von Aminosäure 621 bis 889 gemeinsam (siehe 5A). Da C1, das Aminosäure 584–743 enthält, keine Verschiebung zeigte, ist hCKIε phosphoryliertes hPER1 zwischen Aminosäure 743 und 889. Im gesamten hPER1 befinden sich mehrere CKI-Phosphorylierungs-Konsensussequenzen, einschließlich eine in der Region von hPER1, von der oben gezeigt ist, dass sie von hCKIε phosphoryliert wird, insbesondere die Sequenz, die Aminosäure 808–815 umfasst: DSSSTAPS. Alle Serine und das Threonin könnten als Substrat für hCKIε dienen, was die drastische Mobilitätsverschiebung erklären könnte, die beobachtet wird.
MATERIAL UND VERFAHREN
Beispiel 1 Plasmidkonstruktion, Expression und Reinigung von Proteinen
Die cDNA, die Wildtyp-hCKIε codiert, wird aus einer humanen plazentalen cDNA-Bibliothek mithilfe zuvor beschriebener Verfahren isoliert, Fish, K. J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14875–14883, Klonierung von hCKIε in einen bateriellen Vektor (pRST-B-CKIε) und einen Säuger-Expressionsvektor (pCEP4-CKIε) erfolgt wie zuvor beschrieben (Cegielska, A., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 1357–1364, Rivers, A., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 15980–15984). Dem 5'-Ende von hCKIε in pCEP4-CKIε wird ein Hämagglutinin(HA)-Epitopmarker (YPDYDVPDYA) hinzugefügt. Volllängen-hPER1 (Tel, H., et al., (1997) Nature 389, 512–516) wird mit EcoRI und SalI geschnitten und in Plasmidvektor pCMV-Tag^TM (Stratagene) ligiert, um eine im Leseraster (in frame) liegende Fusion mit dem Flag-Marker zu erzeugen. Trunkierte N-terminale Mutanten (N1, N2, N3, N4, C5) werden hergestellt, indem PER1 respektive mit EcoRI/EcoRV, EcoRI/XhoI, EcoRV/XhoI, PvuII/XhoI oder BamHI/SalI geschnitten und in denselben Vektor ligiert wird. Um Mutanten C1, C2 oder C6 zu konstruieren, werden Oligonukleotidprimer in PCR-Reaktionen verwenden, um DNA-Fragmente zu amplifizieren, die respektive Aminosäure 584 bis 743, 998 bis 1160 oder 1161 bis 1289 codieren, indem hPER1-cDNA als Vorlage verwendet wird. Die resultierenden Fragmente sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1 Volllängenformen und trunkierte Formen von hPER1
Am 5'-Ende wird den Primern eine Flag^TM-Epitopmarkersequenz hinzugefügt. Die PCR-Produkte werden in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA3 Topo vector^TM (Invitrogen) kloniert. Bakteriell exprimierte Histidin-markierte hCKIε und hCKIε-K38R werden exprimiert und gereinigt, wie beschrieben in Cegielska, A., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 1357–1364. Die c-MYC-markierte CKI δ war ein Geschenk von Dr. David Virshup. Es wird ein Protein mit einer Homogenität von mehr als 90% und einem ungefähren Molekulargewicht von 54 kDA gereinigt.
Beispiel 2 Transfektion und radioaktive Markierung von 293T-Zellen
Humane embryonale Nierenzellen 293T-Zellen werden in DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (Hyclone), in Platten mit 6 Vertiefungen kultiviert. Bei einer Dichte von etwa 80% werden Zellen mit 2 μg DNA transfiziert, wobei das Reagens LipofectAMINE^TM (Life Technologies) nach den Anleitungen des Herstellers verwendet wurde. Wie sich durch Überwachung anhand einer GFP-Kontrollplasmidtransfektion ergab, liegt die transiente Transfektionseffizienz von 293T-Zellen typischerweise bei 30–50%.
293T-Zellen werden 16 Std. nach der Transfektion mit 0,5 μCi/ml [³⁵S]-Methionin/Cystein 30 Min. in Medium ohne Methionin und Cystein radioaktiv markiert. Anschließend werden die Zellen gewaschen und für den angezeigten Zeitraum in regulärem DMEM kultiviert. Zellen werden unter Verwendung von Lysepuffer (20 mM Tris, 1% Triton X-100^TM, 0,5% Igepal^TM, 150 mM NaCl, 20 mM NaF, 0,2 mM Na₂VO₄, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, kompletter Proteasinhibitorcocktail [Boeringer Mannheim], pH 7,5) lysiert. Lysate werden durch Zentrifugation bei 12.000 Umdrehungen pro Minute von Zelltrümmern befreit. Überstände werden abgenommen und bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
Beispiel 3 Immunpräzipitationen und Western-Blot-Analyse.
Lysate, die gleiche Proteinmengen enthalten (insgesamt 100 μg) werden mit 5 μl einer 1:500-Verdünnung von Anti-Flag-, Anti-HA- oder Anti-hCKI-mAb gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation mit dem Antikörper werden 30 μl einer 1:1-Schlämme von G- Protein-Sepharose-Kügelchen zugegeben und für weitere 2–4 Std. inkubiert. Die Kügelchen werden fünfmal in Lysepuffer gewaschen und anschließend in 30 μl SDS-Probenpuffer mit 5 mM DTT resuspendiert und durch SDS-PAGE analysiert. Western-Blotting von Proteinen wird entweder mit Überständen oder mit immunpräzipitierten Proteinen aus transfizierten 293T-Zellen unter Verwendung von Anti-Flag^TM (Sigma) in einer Verdünnung von 1:1000, Anti-HA (Invitrogen) in einer Verdünnung von 1:1000 oder mit Anti-hCKIε (Transduction Laboratories) in einer Verdünnung von 1:750 wie zuvor beschrieben (Yao, Z., et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 32378–32383) durchgeführt.
Beispiel 4 Kinase- und Phosphataseassays.
Unter Verwendung von Casein oder GST-IkBα als Substrat wird hCKIε hinsichtlich seiner Aktivität getestet. Casein oder GST-IkBα (0,5 μg) werden mit hCKIε (0,1 μg) und 5 μCi [γ-³²P]ATP (Amersham) in PBS enthaltend 200 nM ATP, 10 mM MgCl₂, 0,6 mM EGTA und 0,25 mM DTT kombiniert. Die Reaktionen werden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, durch Zugabe von SDS-Probenpuffer gestoppt und anschließend durch SDS-PAGE analysiert. Da GST-IkBα bei einer ähnlichen Position wie hCKIε im SDS-PAGE wandert, wurde das Protokoll etwas modifiziert. Nach der 30-minütigen Inkubation wird GST-IkBα durch die Zugabe von Glutathion-Sepharose-Kügelchen aus der Kinasereaktion entfernt. Die Kügelchen werden fünfmal in Lysepuffer gewaschen, um etwaiges verunreinigende hCKIε vor der Zugabe von SDS-Probenpuffer zu entfernen. Die Gele werden mit Coomassie-Blau R-250 gefärbt, getrocknet und autoradiographiert.
Immunpräzipitation von ³⁵S-markiertem hPER1 ist oben beschrieben. hPER1-enthaltende Kügelchen werden drei weitere Male in Phosphatasepuffer (100 mM MES, 0,5 mM Dithiothreitol DTT, 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 20 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Pepstatin A, pH 6,0) gewaschen und in 20 μl Phosphatasepuffer aufgenommen. Die Phosphatasebehandlung wird durch Zugabe einer 10-fach konzentrierten Reaktionslösung (50 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,01% Brij 35, 2 mM MnCl₂ pH 7,0) und 40 Einheiten gereinigte Lambda-Phosphatase gestartet. Die Reaktion konnte 1 Stunde bei 37°C ablaufen. Durch Zugabe von 50 mM Natriumfluorid wird eine Hemmung der Phosphataseaktivität erreicht. Nach den entsprechenden Inkubationen wird die Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer gestoppt. Die Proteine werden durch SDS-PAGE aufgetrennt, das Gel wird getrocknet und autoradiographiert. Das Bild wird mit einem PhosphoImager^TM von Molecular Dynamics visualisiert.
Beispiel 5 Wechselwirkung mit und Phosphorylierung von humanem PER1 durch hCKIε.
Die folgenden Beispiele zeigen die Materialien und Verfahren, die verwendet worden sind um zu zeigen, dass hCKIε mit humanem PER2 interagiert und humanes PER2 phosphoryliert. Zusammengefasst zeigten die Ergebnisse, dass hPER2 bei Kotransfektion mit hCKIε in 293T-Zellen eine signifikante Erhöhung des Phosphorylierungszustands, bewiesen durch ³²P-Einbau, sowie eine Verschiebung der molekularen Masse aufweist. Wie bei hCKIε und hPER1 findet des Weiteren eine Koimmunopräzipitation von hCKIε mit transfiziertem hPER2 statt. Behandlung transfizierter Zellen mit dem hCKIε-Inhibitor CKI-7, führte zu einem Rückgang der Phosphorylierung von hPER1 und hPER2; Puls/Chase-Studien ergaben, dass erhöhte Phosphorylierung von hPER2 durch transfizierte hCKIε zum Abbau von hPER2 führt. Diese Daten zeigen eine physikalische Verknüpfung zwischen hCKIε und den humanen Period-Proteinen in vivo zwischen CKI und humanem PER1 an IQELSEQIHRLLLQPVH an Aminosäure 486–503, für humanes PER2 an IQELTEQIHRLLLQPVH an Aminosäure 460–477, und/oder vermutlich für humanes PER3 an ITELQEQIYKLLLQPVH, und eine Regulierung der Stabilität der Period-Proteine durch Phosphorylierung von hPER1 und hPER2.
Materialien und Verfahren für hPER2
Beispiel 6 Plasmidkonstruktion, Expression und Reinigung von Proteinen.
Das offene Leseraster (ORF) in Volllänge von humanem Period-Protein 2 wurde durch PCR aus einer cDNA-Bibliothek von menschlichem Gehirn von Clonetech kloniert, wobei der Vorwärts-Primer ATCTAGATCTAGAATGAATGGATACGCGGAATTTCCG und der Rückwärts-Primer TCTGCTCGAGTCAAGGGGGATCCATTTTCGTCTT verwendet wurden. Das ORF codiert ein Protein mit 1246 Aminosäuren. Die DNA wurde in den pYGFP Living Color Vector (Clonetech) subkloniert, wodurch ein hPER2-C-terminales YGFP-Protein entstand. Bakteriell exprimierte Histidin-markierte hCKIε werden exprimiert und gereinigt, wie oben beschrieben ist. Es wurde ein Protein mit einer Homogenität von mehr als 90% und einem ungefähren Molekulargewicht von 54 kDA gereinigt.
Beispiel 7 Transfektion von 293T-Zellen
Transfektionen humaner embryonaler Nierenzellen 293T-Zellen erfolgten anhand der oben beschriebenen Verfahren und Materialien, wobei die DNA von humanem Period-Protein 2 durch DNA von humanem Period-Protein 1 ersetzt wurde. Lysate und Überstände werden wie oben beschrieben gesammelt und aufbewahrt.
Beispiel 8 Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse.
Für Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse werden anhand der oben beschriebenen Verfahren und Materialien mit Lysaten durchgeführt, wobei das hPER2-Lysat durch das hPER1-Lysat ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 2 gezeigt. Nach Kotransfektion von hPER2 und hCKIε in 293T-Zellen werden die Zellen 24 Std. nach der Transfektion lysiert, immunpräzipitiert und die Lysate auf einem 8%igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, gefolgt von Western- Blot-Analyse. Die in Tabelle 2 dargestellt, zeigte Immunpräzipitation von HA-hCKIε, gefolgt von Western-Blot-Analyse, dass hCKIε mit hPER2 sowie mit hPER1 wechselwirkt. Ein Plus-Zeichen bezeichnet Wechselwirkung, ein Minus-Zeichen bezeichnet keine Wechselwirkung.
Beispiel 9 hCKIε assoziiert mit hPER2 und phosphoryliert hPER2
Die Konsequenz der Phosphorylierung von PER1 sind Instabilität und Abbau des Proteins. Um daher zu bestimmen, ob hCKIε PER2 phosphoryliert, wurden 293-Zellen mit CKIε und hPER2 oder hPER1 als Kontrolle kotransfiziert und die Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse visualisiert. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wird in Zellen, die mit hCKIε und hPER2 kotransfiziert wurden, eine Verschiebung der molekularen Masse des Proteins beobachtet, was den mit hCKIε und hPER1 beobachteten Ergebnissen entspricht.
Tabelle 2
Um zu bestimmen, ob die Veränderung der Mobilität auf die Phosphorylierung von hPER2 zurückzuführen war, haben wir p³²-Markierungsexperimente durchgeführt und auf Einbau von p³²-Marker in hPER2 getestet. Wie in Tabelle 3 dargestellt führte die Kotransfektion von hPER2 oder hPER1 mit CKIε zum Einbau von p³² in beide PER-Proteine. Die Menge mit eingebautem p³² schien bei hPER1 höher zu sein als bei hPER2. Dieser Unterschied in Bezug auf die Phosphorylierung von hPER1 gegenüber hPER2 könnte auf eine beschleunigte kinetische Rate der Phosphorylierung von hPER1 durch CKI im Vergleich zu hPER2 zurückführbar sein. Eine andere Erklärung ist, dass hPER1 über eine höhere Anzahl an CKI-Phosphorylierungs-Konsensusstellen verfügt als hPER2 (9 bei hPER1 im Vergleich zu 7 bei hPER2).
Tabelle 3
Phosphorylierung von hPER2 führt zu Proteininstabilität: Phosphorylierung von hPER1 führt zu Proteininstabilität und -abbau. Da hPER2 von hCKIε ähnlich phosphoryliert wird, wurden HEK-293-Zellen mit cDNA transfiziert, die entweder PER2 alleine oder PER1 alleine codierte, oder mit cDNAs kotransfiziert, die hCKIε und PER2 oder hCKIε und PER1 codierten, um den Effekt der Phosphorylierung auf die Stabilität von hPER2-Protein zu bestimmen. Zellen werden mit ³⁵S-Methionin gepulst und zu den in Tabelle 4 zusammenfassten Zeitpunkten für 32 Std. immunpräzipitiert. Wie in Tabelle 4 dargestellt, führt die Transfektion von entweder nur hPER2 oder nur hPER1 dazu, dass entweder hPER1 oder hPER2 von endogenen Kinasen phosphoryliert und abgebaut werden. Die Halbwertszeit jedes Proteins liegt bei hPER1 bei etwa 14 Stunden und bei hPER2 bei 4 Stunden. Kotransfektion von entweder hPER1 oder hPER2 mit hCKIε führt jedoch zu einer Hyperphosphorylierung beider Proteine. Diese Hyperphosphorylierung bewirkt darüber hinaus eine leichte Änderung und Verkürzung der Halbwertszeiten der Proteine von etwa 2–4 Stunden. Nach Phosphorylierung mit hCKIε scheint hPER2 nicht stabiler zu sein als hPER1, obwohl es zu einem geringeren Grad phosphoryliert zu sein scheint als hPER1. Tabelle 4

* S-35-markiertes hPER1 oder hPER2 in cpm über die Zeit zur Bestimmung der Halbwertszeit des Proteins

Beispiel 10 Assay zur auf Inhibitoren von hCKI δ und ε
Der folgende Assay wird verwendet, um Testverbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Veränderung der Phosphorylierung von hPER1 zu testen, wobei dadurch die hPER1-Menge in kotransfizierten Zellen erhöht und die zelluläre Oszillation von PER1-mRNA der Ratte verändert wird. Anhand eines Assays mit Kotransfektion von hCKIε und Per1 (transient) wurden HEK293T-Zellen in Platten mit sechs Vertiefungen bis zu einer Konfluenz von 80% gezüchtet und anschließend mit hCKIε und Per1 oder Per1 mit dem Reagens LipofectAMINE (Gibco BRL) kotransfiziert. Nach 16 Stunden wurde das Transfektionsmedium entfernt, und 1, 10 oder 30 μM CKI-inhibitorische und inaktive Analogverbindungen wurden für 16 Std. zu den Zellen gegeben. Nach weiteren 16 Stunden wurde das Medium entfernt und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, lysiert, zentrifugiert und die Überstände auf 8–16%igen oder 8%igen Tris-Glycin- Gelen aufgetrennt. Mit Flag-markiertem hPER1 oder GFP-markiertem hPER2 wurden Western-Blots durchgeführt. Das Vorhandensein von hCKIε in jeder Probe wird durch Western-Blotting mit Anti-HA-Antikörpern festgestellt.
Wie in 9 gezeigt, wird in Zellen, die mit hCKIε und hPER1 kotransfiziert wurden und steigenden Konzentrationen einer Kontrolltestverbindung ausgesetzt wurden, beispielsweise einer, die hCKIε nicht hemmt, kein Anstieg der hPER1-Menge beobachtet. Kotransfizierte Zellen, die jedoch mit hCKIε-Inhibitoren behandelt werden, zeigen dagegen eine relative Erhöhung der hPER1-Menge in dosisabhängiger Weise. Diese Erhöhung der hPER1-Menge ist auf eine Hemmung der Phosphorylierungsaktivität der CKI und eine relative Abnahme der Phosphorylierung von hPER1, gefolgt von einer Erhöhung der Proteinstabilität, zurückzuführen. Wenn CKI-Inhibitoren die Proteinstabilität und Halbwertszeit von PER1 verändern, kann man argumentieren, dass eine Erhöhung der zellulären PER1-Menge gewisse Auswirkung auf die zirkadiane Oszillation oder den Zellzyklus haben wird.
Um den Effekt von CKI-Inhibitoren hinsichtlich einer Änderung der PER1-Oszillation bei der Ratte durch PCR mit Taq-Man-RT-PCR (Perkin Elmer Biosystems) zu testen, wurden Rat-1-Fibroblasten in Dulbecco's Modified Eagle-Medium, ergänzt mit 5% fetalem Kälberserum und einer Mischung von Penicillin-Streptomycin-Glutamat, gezüchtet. SCN-Zellen wurden in Dulbecco's Minimum Eagle-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, Penicillin-Streptomycin-Glutamat und 2% Glucose, gezüchtet. Etwa 5 × 10⁵ Zellen werden 3–5 Tage vor dem Experiment in 10-cm-Petrischalen ausplattiert. Wenn die Platten konfluent sind, was als Zeitpunkt 0 bezeichnet wird, wird das Medium durch serumreiches Medium, d. h. Medium mit 50% Pferdeserum, ersetzt. Nach 2-stündigem Serumschock in 50% Pferdeserum wird dieses Medium durch serumfreies Medium ersetzt. Zu den angezeigten Zeitpunkten werden die Schalen mit PBS gewaschen und eingefroren bei –80°C bis zur Extraktion von Gesamtzell-mRNA aufbewahrt. hCKIε-Inhibitor oder Kontrolle wird zur gleichen Zeit wie serumfreies Medium zugegeben.
Gesamtzell-mRNA wird mit dem RNeasy Midi Kit oder dem RNeasy 96 Kit (Qiagen) extrahiert und DNase-behandelt (Ambion DNA-free). Mit der Taq-Man-Echtzeit-Technologie (PE Biosystems) [C. A. Heid et al., Genomes Res. 6, M (1996)] wird eine quantitative PCR durchgeführt und auf einem ABI PRISM 7700 (T. Takumi et al., Genes Cells 4, 67: 1999) analysiert. Die Primer für rPer1 sind wie folgt: Vorwärts 5'-TCTGGTTAAGGCTGCTGACAAG-3'; Rückwärts 5'-GTGTAGCCCCAACCCTGTGA-3' und der Taq-Man-Sonde 5'-TCCAAATCCCAGCTGAGCCCGA-3'. Als interne Kontrolle für die RNA wird die Expression von rAktin unter denselben Bedingungen untersucht. Es wurden die Verhältnisse von rPer1 zu rAktin berechnet und normalisiert.
Wie in 10 dargestellt, zeigten Zellen, die mit keiner Verbindung oder mit einer Testverbindung behandelt wurden, bei der es sich um ein inaktives kleinmolekulares hCKIε-Analog handelt, zeigten einen normalen zirkadianen Zyklus von etwa 24 Stunden, wie sich an der Oszillation der PER1-mRNA zeigte. Zellen, die mit einer Testverbindung behandelt wurden, bei der es sich um einen CKI-Inhibitor handelte, zeigten dagegen einen veränderten täglichen oszillatorischen zirkadianen Zyklus (11). Die Mengen an PER1-mRNA in diesen Zellen zeigten einen verkürzten Rhythmus von etwa 18 bis 20 Stunden anstelle des normalen 24-Stunden-Zyklus. Der verkürzte Zyklus ist auf die CKI-Hemmung der Phosphorylierung zurückzuführen, was zu einem niedrigeren Grad an PER-Phosphorylierung führt. Ein geringerer Phosphorylierungsgrad von PER führt zu erhöhter Stabilität des PER-Proteins und zu erhöhten zellulären Mengen von PER, was den zirkadianen Rhythmus eines Säugers ändert.
Die obigen Beispiele sollen nicht einschränkend sein, sondern lediglich die spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsformen veranschaulichen.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit einer Testverbindung, die Phosphorylierung eines oder mehrerer humaner PERIOD-Proteine zu verändern, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst: (1) Zugabe einer Testverbindung zu einem Screeningsystem, welches das Protein hCKI ε (humane Casein-Kinase I ε) sowie ein oder mehrere humane PERIOD-Proteine, ausgewählt aus der aus hPER1 (humanes PERIOD-Protein 1) bestehenden Gruppe, enthält, und (2) Bestimmung des Phosphorylierungsgrads des humanen PERIOD-Proteins.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Phosphorylierung des humanen PERIOD-Proteins durch hCKI ε verändert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Phosphorylierung des humanen PERIOD-Proteins durch hCKI δ verstärkt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Screeningsystem ein Zellsystem oder ein zellfreies System ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Screeningsystem ein zellfreies System ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei für das zellfreie System teilweise gereinigtes oder gereinigtes humanes PERIOD-Protein hCKI ε verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das humane PERIOD-Protein und hCKI ε aus rekombinanten Quellen erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Screeningsystem ein System auf Zellbasis ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das System auf Zellbasis eine prokaryotische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die prokaryotische Zelle eine Bakterienzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das System auf Zellbasis eine eukaryotische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die eukaryotische Zelle eine Hefezelle ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Hefezelle S. cerevisia ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das System auf Zellbasis eine Insektenzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das System auf Zellbasis eine Säugerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Säugerzelle eine humane Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Säugerzelle eine Lymphocyten-Zelle, eine Fibroblasten-Zelle, eine Tumorzelle, eine glatte Muskelzelle, eine Herzmuskelzelle, eine embryonale Nierenzelle, eine Hirnzelle, eine Nervenzelle, eine Myelocyten-Zelle, eine Gliacyten-Zelle oder eine Astrocyten-Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, das folgende Schritte umfasst: (1) Zugabe einer Testverbindung zu einem Screeningsystem, welches das Protein hCKI ε sowie hPER1 enthält, und (2) Zugabe einer Testverbindung zu einem Screeningsystem, welches das Protein hCKI ε sowie ein hPER-Protein, ausgewählt aus der aus hPER1, hPER2 und hPER3 bestehenden Gruppe, enthält, wobei das in (2) ausgewählte hPER-Protein nicht identisch ist mit dem in (1) ausgewählten hPER-Protein, (3) Bestimmung des Phosphorylierungsgrads des humanen PERIOD-Proteins in (1) und in (2) und (4) Vergleich der in (3) für die verschiedenen humanen PERIOD-Proteine erhaltenen Ergebnisse um zu ermitteln, ob die Testverbindung hinsichtlich der Veränderung der Phosphorylierung von hPER1, hPER2 und/oder hPER3 eine Selektivität aufweist.
Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit einer Testverbindung, den Abbau eines humanen PERIOD-Proteins zu verändern, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst: (1) Zugabe einer Testverbindung zu einem Screeningsystem, welches das Protein hCKI ε sowie hPER1 enthält, (2) Bestimmung der Menge an humanem PERIOD-Protein nach Zugabe der Testverbindung und (3) Vergleich der in Schritt (2) erhaltenen Menge an humanem PERIOD-Protein mit der Menge an humanem PERIOD-Protein im Screeningsystem.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Protein hCKI ε zusammen mit der Testverbindung zu dem ein hPER-Protein enthaltenden Screeningsystem gegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Protein hCKI ε zu dem die Testverbindung sowie ein hPER-Protein enthaltenden Screeningsystem gegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das humane PERIOD-Protein humanes PERIOD1 ist.