JP2003501074A

JP2003501074A - 概日リズムタンパク質の変化に関するスクリーニング方法

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Publication number: JP2003501074A
Application number: JP2001501893A
Authority: JP
Inventors: ジョージ・キースラー; チェザーレ・モンダドーリ; ジャンビン・ヤーオウ; フェルナンド・カマーチョウ
Original assignee: アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2003-01-14
Anticipated expiration: 2020-06-07
Also published as: NO20100431L; NO20015972D0; US6555328B1; MXPA01011417A; NZ514603A; CA2375450C; NO330241B1; WO2000075669A1; ATE322016T1; KR20020033101A; NO20100430L; JP4583682B2; IL146729A0; BR0011437A; KR100722176B1; DE60026998D1; CA2375450A1; IL146729A; AU767800B2; EP1183541A1

Abstract

(57)【要約】本発明は哺乳類の概日リズムを変える試験化合物を同定する方法、さらに具体的には、ｈＣＫＩδおよびεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。また本発明は１種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化、それらとの相互作用、または分解を選択的に変える試験化合物の能力を、異なるヒトPeriodタンパク質のリン酸化、それとの相互作用、または分解を変えるそれの能力と比較して測定する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術的分野】

本発明は哺乳類の概日リズムを変える試験化合物、および更に具体的にはヒト
Clockタンパク質、ヒトPeriod１、ヒトPeriod２およびヒトPeriod３をリン酸化
するヒトカゼインキナーゼＩδおよび／またはεの能力を変える試験化合物を同
定する方法に関する。

【０００２】

【発明の背景】

内因性の生物学的なペースメーカーにより生じる概日リズムは、ヒト、真菌、
昆虫および細菌を含む多くの様々な生物に存在する（Dunlap, J.C. (1999) Cell
, 96, 271-290；Hastings, J.W., et al., (1991) in Neural and Integrative
Animal Physiology, ed. Prosser, C.L. (New York: Wiley-Liss), pp.435-546;
Allada, R., et al., (1998) Cell, 93, 791-804; Kondo, T., et al., (1994)
Science, 266, 1233-1236; Crosthwaite, S.K., et al., (1997) Science, 276
, 763-769）。概日時計は生物学的リズムの維持に不可欠である。概日時計は自
動的に継続し、完全に暗い条件下ですら一定であるが、光および温度変化のよう
な環境シグナルにより別の細胞周期に同調する。

【０００３】内因性時計は行動、食事の摂取および睡眠／覚醒サイクルにおける日変動およ
びホルモン分泌のような生理学的変化、および体温の変動を含む活動のパターン
を制御する（Hastings, M., (1997) Trends Neurosci. 20, 459-464; Kondo, T.
, et al., (1993) Proc. Natｌ. Acad. Sci. USA, 90, 5672-5676; Reppert, S.
M., & Weaver, D.R. (1997) Cell, 89, 487-490)。

【０００４】概日リズムに関するいくつかの遺伝子の説明のためにショウジョウバエにおけ
る遺伝学的および分子的研究が考慮されてきた。これらの研究から分かったこと
は、厳密に自動制御され、転写／翻訳に基づく負のフィードバックループから構
成される１つの経路である（Dunlap, J.C. (1999) Cell, 96, 271-290; Dunlap,
J.C. (1996) Annu. Rev. Genet. 30, 579-601; Hall, J.C. (1996) Neuron, 17
, 799-802）。中央時計の２つの重要な構成要素はPeriodまたはＰＥＲおよびTim
elessまたはＴＩＭと称される分子である。

【０００５】ショウジョウバエで最初に発見されたｐｅｒ遺伝子座は、成虫の脱蛹行動およ
び運動行動における概日リズム制御に必要な要素である（Konopka, R.J., & Ben
zer, S. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2112-2116）。ＰＥＲのミス
センス突然変異は概日リズムの周期を短縮（ｐｅｒ^s）または長くする(ｐｅｒ^L)
ことができ、一方ナンセンス突然変異（ｐｅｒ^o）はそれらの活動上の非周期性
の原因となる（Hall, J.C. (1995) Trends Neurosci. 18, 230-240）。哺乳類の
視交叉上核（ＳＣＮ）においては、３つのＰＥＲホモログであるｐｅｒ１、ｐｅ
ｒ２、およびｐｅｒ３が同定されている。これら哺乳類遺伝子のタンパク質産物
はいくつかの互いに相同な領域を共有する（zylka, M.J., et al., (1998) Neur
on 20, 1103-1110; Albrecht, U., et al., (1997) Cell 91, 1055-1064.）。Ｐ
ｅｒのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは日周期で変動するが、ＰＥＲ１およ
びＰＥＲ２のみは光に応答して変動する（Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron
20, 1103-1110., Shearman, L.P., et al., (1997) Neuron 19, 1261-1269）。

【０００６】ＰＥＲタンパク質は全て、ダイマー形成に必要なＰＡＳドメインと称するタン
パク質／タンパク質相互作用領域を含有する（Zylka, M.J., et al., (1998) Ne
uron 20, 1103-1110）。ＰＡＳを含有する他のタンパク質であるＴＩＭはベイト
としてＰＥＲを用いた酵母２−ハイブリット遺伝学的スクリーニングにより単離
された（Gekakis, N., et al., (1995) Science 270, 811-815）。ＰＥＲタンパ
ク質レベルが増加するに従い、ＰＥＲはＴＩＭと共にヘテロダイマーを形成する
。ＴＩＭ／ＰＥＲヘテロダイマー形成はＰＥＲの調節に必要である。その理由は
、ｔｉｍ変異がｐｅｒｍＲＮＡ変動喪失およびＰＥＲの核移行不能に伴って生
じる概日リズム喪失の原因となるからである（Sangoram, A.M., et al., (1998)
Neuron 21, 1101-1113; Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 21, 1115-1122)
。

【０００７】最近、ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ／ＭＯＰ３を含む概日リズムの構成要素であ
るいくつかの別の分子が、遺伝学的スクリーニングおよび生化学的特徴づけの手
法を用いて発見された（Gekakis, N., et al., (1998) Science 280, 1564-1569
; King, D.P., et al., (1997) Cell 89, 641-653; Allada, R., et al., (1998
) Cell 93, 791-804）。

【０００８】その後の研究で、ＰＥＲが転写レベルでどのように調節されるのか明らかにな
った。ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ／ＭＯＰ３は、どちらもベーシック−へリック
ス−ループ−へリックスドメインであるＰＡＳドメインを含有し、そして互い
にヘテロダイマーを形成する。ＰＥＲが転写され、翻訳され、そして蓄積すると
、ＰＥＲは核移行し、それらの共通のＰＡＳドメインを介してＣＬＯＣＫに結合
し、負のフィードバックループ形成して、それ自身の転写をダウンレギュレーシ
ョンする（Allada, R., et al., (1998) Cell 93, 791-804; Darlington, T.K.,
et al., (1998) Science 280, 1599-1603; Hao, H., et al., (1997) Mol. Cel
l. Biol. 17, 3687-3693; Jin, X., et al., (1999) Cell 96, 57-68）。

【０００９】さらに、ＰＥＲは調節され、転写後レベルで制御される。ＰＥＲおよびＴＩＭ
のどちらも概日変動に影響されるリン酸化を受けるようである（Edery, I., et
al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2260-2264; Lee, C., et al., (
1998) Neuron 21, 857-867）。ダブルタイム（ＤＢＴ）と称されるショウジョウ
バエのキナーゼが最近クローン化された（Price, J.L., et al., (1998) Cell 9
4, 83-95, Kloss, B., et al., (1998) Cell 94, 97-107）。ＤＢＴにおける変
異は行動リズムの周期を短くするかまたは長くするかのいずれかの原因となる。
ＤＢＴにおけるＰ因子挿入突然変異により、幼虫の脳におけるＰＥＲの概日変動
をなくす。これはＤＢＴがショウジョウバエ時計の不可欠な構成要素であること
を指し示している。ＰＥＲはこれらの変異体に高レベルで蓄積し、低リン酸化さ
れる。ＤＢＴはＰＥＲを直接リン酸化することが示されなかった。ＣＫＩεは哺
乳類における密接な関係があるＤＢＴのホモログである（Kloss, B., et al., (
1998) Cell 94, 97-107)。ＣＫＩεおよびＤＢＴはキナーゼドメインのアミノ
酸レベルが８６％相同である。Fishらにより最初に同定されたｈＣＫＩεはセリ
ン／スレオニンプロテインキナーゼ活性を有するＣＫＩのアイソフオーム（α,
β,γ,δ）のひとつである（Fish, K.J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270,
14875-14883; Rowles, J., et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
9548-9552)。ＣＫＩは細胞のＤＮＡ代謝制御に関連がある。ＨＲＲ２５遺伝子（
哺乳類のＣＫＩのホモログ）欠損型サッカロミセス突然変異体は二本鎖ＤＮＡ切
断に感受性を示す（Hoekstra, M.F., et al., (1991) Science 253, 1031-1034)
。ｈＣＫＩに対するインビトロの基質のいくつかが同定されており、それにはＲ
ＮＡポリメラーゼＩおよびII、ｐ５３、ＩκＢα、およびシミアンウイルス４０
ラージＴ抗原が含まれる。しかし、基質の機能を変化させるｈＣＫＩのリン酸化
に関係するという証拠はほとんど無く、そして現在まで、どのclock遺伝子もｈ
ＣＫＩδおよびε基質であると示されていない。

【００１０】概日リズムは概日経路において鍵となる特定のタンパク質の連続的なリン酸化
、およびそのタンパク質レベルの変化により制御される。概日時計経路の中心の
構成要素であるPeriod（ＰＥＲ）は、その量およびリン酸化状態における日変動
を受ける。ＰＥＲ遺伝子はショウジョウバエＰＥＲ（ｄＰＥＲと示す）、マウス
ＰＥＲ（ｍＰＥＲと示す）、およびヒトＰＥＲ（ｈＰＥＲと示す）が同定されて
いる。ショウジョウバエではＰＥＲが一種だけであり、ＰＥＲ１タンパク質と最
も相同性がある。ヒトおよびマウスの両方は３種のＰＥＲ（ＰＥＲ１、２および
３と示す）を有する。

【００１１】

【発明の概要】

本発明は、ｈＣＫＩδおよびεがヒトPeriodタンパク質をリン酸化し、リン酸
化されたヒトPeriodタンパク質が分解するという発見に関する。その結果、本発
明は、哺乳類の概日リズムを変える試験化合物を同定する方法、およびさらに具
体的には、ｈＣＫＩδおよびεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える
試験化合物の能力を測定する方法に関する。また本発明は、リン酸化されたヒト
Periodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。ま
た本発明は１種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化あるいは分解
を選択的に変える試験化合物の能力を、異なるPeriodタンパク質のリン酸化ある
いはまた分解を変え、引き続き哺乳類の概日リズムを変えるその能力に比較して
測定する方法に関する。

【００１２】添付図面において：図１．組換えｈＣＫＩεによるカゼイン、ＩκＢα、およびｈＰＥＲ１のイン
ビトロのリン酸化組換えカゼインキナーゼ（複数可）の精製およびキナーゼアッセイ条件は、後
記の“実験材料および実験方法”に記載する。(Ａ）ｈＣＫＩε（レーン１〜３)
、ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒε（レーン４〜６）、またはコントロールとしての緩衝
液（レーン７および８）は、単独で（レーン１および４）、カゼインと共に（レ
ーン２および５）、またはＩκＢαと共に（レーン３および６）インキュベート
し、そして“実験材料および実験方法”に記載のとおりにキナーゼアッセイを実
施する。分子量マーカーを左に示す。（Ｂ）ベクター（レーン１、４および８）
、ルシフェラーゼ（レーン２、５および９）またはｈＰＥＲ１（レーン３、６お
よび１０）をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞溶解物を調製し、Ｍ２抗−
フラッグモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、次いでキナーゼアッセイをｈ
ＣＫＩε（レーン１〜６）、ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒε（レーン７）またはコント
ロールとしての緩衝液（レーン８〜１０）を用いて実施する。キナーゼアッセイ
前に免疫沈降物を６５℃、３０分間の熱処理により不活化する（レーン４〜６）
。試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。ゲルをクマシーＲ−２５０で染色
し、乾燥してオートラジオグラフィーに付す。

【００１３】図２．(ＡおよびＢ)ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩεのウエスタンブロット分析２９３Ｔ細胞にｈＰＥＲ1およびベクター（レーン１）、ｈＰＥＲ１およびｈ
ＣＫＩε（レーン２）、ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒ（レーン３）、
ベクターおよびｈＣＫＩε（レーン４）、またはベクターおよびｈＣＫＩε−Ｋ
３８Ｒ（レーン５）をトランスフェクションする。トランスフェクション後２４
時間で、細胞を採集し溶解物を“実験材料および実験方法”に記載のように調製
する。４０μｇの２９３Ｔ細胞溶解物総量を３〜８％勾配ＮＵ−ＰＡＧＥにロー
ドする。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写してＭ２抗−フラッグモノクローナル抗
体（１:１０００）または抗−ｈＣＫＩεモノクローナル抗体（１:７５０）を用
いてウエスタンブロットする。（Ｃ）ｈＰＥＲ１のラムダホスファターゼ処理。
２９３Ｔ細胞にｈＰＥＲ１およびベクター（レーン１および４）、ｈＰＥＲ１お
よびｈＣＫＩε（レーン２および５）、またはｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε−Ｋ
３８Ｒ（レーン３および６）をトランスフェクションし、［³⁵Ｓ］メチオニン（
２５０μCi／ml）で標識する。溶解物をＭ２抗−フラッグモノクローナル抗体を
用いて免疫沈降し、次に組換えラムダフォスファターゼで処理（レーン４、５お
よび６）または偽処理（レーン１、２および３）のいずれかを行う。

【００１４】図３．ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションしたｈＰＥＲ１のパルス−チ
ェイス標識２９３Ｔ細胞にｈＰＥＲ１およびベクター（パネルＡ）またはｈＰＥＲ１およ
びｈＣＫＩε（パネルＢ）のいずれかを同時にトランスフェクションする。トラ
ンスフェクション後３時間で、２９３Ｔ細胞を［³⁵Ｓ］メチオニンおよびシステ
イン（１０００μCi／ml）を用いて３０分間パルス標識し、次いで各ゲルの上に
示した時間でチェイスする。細胞を溶解し、Ｍ２抗−フラッグモノクローナル抗
体を用いて免疫沈降し、ｈＰＥＲ１を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。分子量
マーカーを左に示す。（Ｃ）各レーンからのｈＰＥＲ１バンドを取り囲みかつ含
有する領域のホスホイメージングスキャンを表した棒グラフ。バー（２〜３０時
間）はゼロ時点のカウントと比較した１分当りの総カウント（cpm）の百分率に
基づく。黒いバーはベクターと同時にトランスフェクションしたｈＰＥＲ１を示
す。縞のバーは、ｈＣＫＩεと同時にトランスフェクションしたｈＰＥＲ１を示
す。

【００１５】図４．ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε間のタンパク質相互作用（Ａ、Ｂ、Ｃおよ
びＤ）２９３Ｔ細胞にベクターおよびｈＣＫＩε（レーン１）、ベクターおよびｈＰ
ＥＲ１（レーン２）、およびｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ１（レーン３）をトラン
スフェクションする。トランスフェクション後２４時間で、細胞を採集し、溶解
物を調製する。溶解物をＭ２抗−フラッグモノクローナル抗体（パネルＡおよび
Ｃ）、ＨＡモノクローナル抗体（パネルＢ）、または抗−ｈＣＫＩεモノクロー
ナル抗体（パネルＤ）を用いて免疫沈降し、抗−ＨＡモノクローナル抗体（パネ
ルＡ）、Ｍ２抗−フラッグモノクローナル抗体（パネルＢおよびＤ）、または抗
−ｈＣＫＩεモノクローナル抗体（パネルＣ）を用いてウエスタンブロットする
。レーン４では、ウエスタンブロット分析を上記のモノクローナル抗体を用いた
免疫沈降前の粗溶解物について実施する。全てのタンパク質を１０％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分離する。

【００１６】図５．ｈＣＫＩεのリン酸化部位のマッピング（Ａ）トランケーションして組換えたｈＰＥＲ１変異体の略図。トランケーシ
ョン変異体を後記の“実験材料および実験方法”に記載のとおりに構築する。Ｏ
ＲＦはｈＰＥＲ１の完全なオープン・リーデイング・フレームであるアミノ酸残
基１〜１２８９を示す。Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、およびＣ５作製のために使用
した制限酵素部位を表１に示す。白抜きのバーは分子量の移動を示さなかった変
異体を表す。黒いバーは分子量の移動を示した変異体を表す。ＯＲＦ、Ｎ２、Ｎ
３、およびＮ４の縞の領域は、ｈＣＫＩεによるｈＰＥＲ１の推定リン酸化領域
を表す。（Ｂ）同時にトランスフェクションした２９３Ｔ細胞溶解物由来のｈＰ
ＥＲ１トランケーション変異体をのウエスタンブロット分析。ｈＰＥＲ１および
ベクター（レーン１）、ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε（レーン２）、またはｈＰ
ＥＲ１およびｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒ（レーン３）を２９３Ｔ細胞に同時にトラン
スフェクションして、ｈＰＥＲ１をＭ２抗−Ｆｌａｇモノクローナル抗体を用い
たウエスタンブロット分析により分析する。分子量マーカーを左に示す。矢印は
各トランケート変異体タンパク質の移動位置を示す。ｈＰＥＲ１ＯＲＦおよび変
異体Ｎ１およびＮ２を規定通りに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、一方ｈＰＥ
Ｒ１変異体であるＮ３、Ｎ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５、およびＣ６を規定通りに１２
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。

【００１７】図６．Period ｍＲＮＡ濃度横軸に時間単位で時間を示す；縦軸は時間経過における活性、体温およびＰｅ
ｒｍＲＮＡレベルである。ＰｅｒｍＲＮＡレベルは２４時間周期で変動し、シ
ョウジョウバエでは周期長と逆相関している。同様な変動が正常Ｐｅｒマウスに
て観察される；ところが、Ｐｅｒノックアウトマウスは異常な概日リズムを有す
る。

【００１８】図７．Clockタンパク質経路これはClockタンパク質経路の略図である。ｈＣＫＩδおよび／またはεはPer
iodを、ＰＯ₄で表されるように、リン酸化し、次いでその分解に至る。Clockお
よびＢＭａｌはＰＡＳドメインで相互作用し、そしてPeriodのｍＲＮＡの転写を
開始し、Periodタンパク質レベルを増加する結果になる。

【００１９】図８．時間経過におけるPeriodタンパク質およびリン酸化のレベル横軸は２４時間周期に対する時間表示の時間であり；もう一方の軸はPeriodタ
ンパク質（白で示される）およびリン酸化レベル（色で示される）である。概日
周期の最初に、Periodタンパク質のレベルは低く、相対的にリン酸化されていな
い。Periodタンパク質のレベルが増加して午後８時ごろにピークを迎えるに従い
、Periodタンパク質の相対的なリン酸化もまた増加し、Periodタンパク質のレベ
ルが減少するにつれてそのリン酸化はなおも続く。

【００２０】図９．ＣＫＩε／ヒトPeriod１の同時トランスフェクション右上のパネルはｈＰｅｒ１のリン酸化を示す。最初のカラムは試験化合物１μ
Ｍを示す；第２カラムは試験化合物１０μＭを示す; 第３カラムは試験化合物３
０μＭを示す；第４カラムはＰｅｒのみを示す；第５カラムおよび最終カラムは
ＰｅｒおよびｈＣＫＩεを示す。右上のパネルはコントロールの試験化合物を示
す。中央のパネルはＣＫＩε阻害剤試験化合物Ｓ９４３１６６を示し、右下のパ
ネルはＣＫＩε阻害剤試験化合物Ｗ０２３６を示す。これらの結果はＰｅｒリン
酸化の阻害がタンパク質の安定性およびレベルの増加という結果になることを証
明する。

【００２１】図１０．ヒトPeriod ｍＲＮＡレベル上のグラフは下のグラフで示したデータを絵で表現したものを提供する。横軸
は時間で表された時間である；もう片方の軸はＲＴ−ＰＣＲにより測定したＲａ
ｔ１繊維芽細胞またはラットＳＣＮ（視交叉上核）のいずれかの相対的なリアル
−タイムの内因性ｈＰＥＲ１ｍＲＮＡレベルである。２つの試験化合物の説明
をする；ボックスで示される試験化合物は“Ｃ”であり、１０μＭで細胞に添加
する。三角で示される第２の試験化合物は“Ｆ”（フルオキシチン）であり、１
０μＭで細胞に添加する。培養細胞の概日リズムは時間が経過するにつれ減少し
、従って応答の振幅が時間が経過するにつれ減少する。これらの結果はコントロ
ールの化合物がＣＫＩ活性を変えないということ、また細胞の概日リズムも変え
ないということを示す。

【００２２】図１１．ヒトPeriod ｍＲＮＡレベル上のグラフは下のグラフで示したデータを絵で表現したものを提供している。
横軸は時間表示の時間である；他方の軸はＲＴ−ＰＣＲにより測定したＲａｔ１
繊維芽細胞またはラットＳＣＮ細胞のｈＰＥＲ１の相対的なリアル−タイムのｍ
ＲＮＡのレベルである。２つの試験化合物を説明する；ボックスで示される試験
化合物は“Ｃ”であり、１０μＭで細胞に添加し、三角で示される第２の試験化
合物はＳ９４３１６６であり、１０μＭで細胞に添加する。これらの結果は、試
験化合物Ｓ９４３１６６がｈＰＥＲ１のｍＲＮＡの変動をシフトすることにより
細胞の概日リズムを変化させ、そして概日リズムを約２０時間に短縮するという
結果を示す。

【００２３】

【発明の詳述】本発明は哺乳類の概日リズムを変える試験化合物を同定する方法に関し、さら
に具体的には、ｈＣＫＩδおよび／またはεによるヒトPeriodタンパク質、好ま
しくはヒトPeriod１、ヒトPeriod２および／またはヒトPeriod３に対するリン酸
化を変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。さらに、本発明はリン酸
化されたヒトPeriodタンパク質の分解を変化させる試験化合物の能力を測定する
方法に関する。また本発明は異なるヒトPeriodタンパク質のリン酸化（または分
解）を変化させる試験化合物の能力に関する１種またはそれ以上のヒトPeriodタ
ンパク質のリン酸化（または分解）を選択的に変える試験化合物の能力を測定す
る方法に関する。

【００２４】本発明はｈＣＫＩδおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／
またはｈＰＥＲ３のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法、および
細胞におけるｈＣＫＩδおよび／またはεによりリン酸化されたｈＰＥＲ１、ｈ
ＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３の分解を変える化合物を同定する方法に関す
る。また本発明はｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３の安定性を
変える、またはｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のタンパク質
分解を増加する試験化合物の能力を測定する方法に関する。本発明は哺乳類の概
日リズムを変える試験化合物の能力を測定する方法を提供する。

【００２５】本発明の特徴の１つは、ｈＣＫＩδおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰ
ＥＲ２およびｈＰＥＲ３のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定することで
ある。本発明の他の特徴はリン酸化が可能な条件下でｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２お
よびｈＰＥＲ３からなる群より１種選択されるヒトPeriodタンパク質、およびｈ
ＣＫＩδおよび／またはεからなるスクリーニング系に試験化合物を添加し、そ
してヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定することからなるｈＣＫＩ
δおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３のリン酸化
を阻害する試験化合物の能力を測定することである。一つの好ましい実施態様で
、スクリーニング系はホスフェート源を含む。好ましいホスフェート源の１つは
ＡＴＰである。

【００２６】「アミノ酸」という用語は光学異性体、すなわち天然型および非天然型アミノ
酸のＬ型異性体およびＤ型異性体をどちらも含む意味である。従って、「ペプチ
ド」という用語は、Ｌ−アミノ酸のみにより構成されるペプチドだけでなく、部
分的または完全にＤ−アミノ酸により構成されるペプチドを含む意味である。

【００２７】さらに、「アミノ酸」という用語は、天然のタンパク質を構成する２０のみの
天然型アミノ酸残基、並びに他のα−アミノ酸、β−、γ−およびδ−アミノ酸
、および非天然型アミノ酸等を含む。従って、該タンパク質、ヒトPeriodおよび
ヒトｈＣＫＩδおよび／またはεは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基すなわ
ち保存的アミノ酸残基、例えば天然タンパク質を構成するα−アミノ酸残基、並
びに他のα−アミノ酸残基、β−、γ−およびδ−アミノ酸残基、非天然型アミ
ノ酸残基等のうちの１つと同様の電荷、極性または他の性質を有するもので修飾
され得る。適当なβ−、γ−およびδ−アミノ酸の例には、β−アラニン、γ−
アミノブタン酸およびオルニチンが含まれる。天然型タンパク質を構成するもの
以外の他のアミノ酸残基または非天然型アミノ酸の例には、３,４−ジヒドロキ
シフェニルアラニン、フェニルグリシン、シクロへキシルグリシン、１,２,３,
４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸またはニペコチン酸が含ま
れる。

【００２８】「ｈＰＥＲ１」、「ｈＰＥＲ２」、「ｈＰＥＲ３」、「ｈＣＫＩδ」および「
ｈＣＫＩε」という用語は、それぞれヒトPeriod１、ヒトPeriod２、ヒトPeriod
３、ヒトカゼインキナーゼＩδおよびヒトカゼインキナーゼＩεの全長タンパク
質、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、ｈＰＥＲ３、およびｈＣＫＩδおよび／またはε
タンパク質のアレルおよび誘導体を含む。誘導体はこれらのタンパク質の天然型
からの（１種またはそれ以上の異なるアミノ酸、トランケートタンパク質、およ
び３′または５′−のいずれかに‘タグ’を含む全長またはトランケートしたタ
ンパク質との融合タンパク質、並びに前記引用文献にて提供されそしてGeneBank
等の公共のデータベースに提示された天然型および非天然型変異体の配列による
）交互変化を含む。これらのタンパク質誘導体にはリーダー、エピトープまたは
他のタンパク質の配列、例えばＭｙｃ^TM−タグ付き、ヒスチジンのタグ付き、ま
たはＦｌａｇ^TMエピトープタグ付き配列を含有するタンパク質が含まれる。ヒト
Period１配列はH. Teiにより１９９７年３月２４日に提示されたGene Bank Acce
ssion AB002107、NID g2506044で得られる。また、ヒトPeriod１配列はTei, H.,
et al., Nature 389: 512−516 (1997）に公開されている。ヒトPeriod２配列
はT. Nagaseらにより提示されたGene Bank Accession NM003894、NID g4505710
にて利用できる。また、ヒトPeriod２配列はNagase, T., et al., DNA Res. 4(2
): 141−150 (1997）およびShearman, L.P., et al., Neuron 19(6): 1261−126
9 (1997）に公開されている。ヒトPeriod３のゲノム配列はGene Bank Accession
Z98884で得られる。ヒトカゼインキナーゼＩδ配列はGene Bank Accession U29
171で得られる。またヒトカゼインキナーゼＩδはKusda, J., et al, Genomics
32: 140−143 (1996）に公開された。ヒトカゼインキナーゼＩε配列はGeneBank
Accession L37043にて得られる。またヒトカゼインキナーゼＩεはFish, K.J.
et al., J. Biol. Chem. 270: 14875-14883 (1995）に公開された。ｃ−ＭＹＣ
タグ付きＣＫＩδはDavid Virshup博士からの寄付であった。

【００２９】「塩基配列」という用語は、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、ｈＰＥＲ３、またはｈ
ＣＫＩεをコードするＲＮＡ配列並びにＤＮＡ配列、およびその誘導体を意味す
る。

【００３０】本発明に関する「ｈＣＫＩδ」および「ｈＣＫＩε」タンパク質はここに記載
されたようなヒトＰｅｒタンパク質に対して実質的に同様なリン酸化活性を有す
る、タンパク質またはその誘導体である。ｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク
質は天然に存在するｈＣＫＩδおよび／またはε、アレルおよびその誘導体と実
質的に同様な活性を有するタンパク質である。ｈＣＫＩδおよび／またはεは、
ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３に対してそのキナーゼ活性
を保持するか、またはｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３をリ
ン酸化するそれの能力が本質的には変わらない方法で修飾された他の哺乳類のカ
ゼインキナーゼＩタンパク質を含む。ヒト型ｈＣＫＩδおよび／またはεが好ま
しい。しかし、他の哺乳類型ｈＣＫＩδおよび／またはεを用いてもよい。その
理由は、例えば、ヒトｈＣＫＩδおよびラットｈＣＫＩδは９７％の相同性であ
り、そのキナーゼドメイン（２８４アミノ酸残基）の配列は完全に相同だからで
ある。修飾されたタンパク質にはｈＣＫＩδおよび／またはεのトランケート型
、アミノ酸の置換、欠失、付加等を含有するｈＣＫＩδおよび／またはεの誘導
体が含まれ、それらはｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３をリン
酸化する能力を保持している。カゼインキナーゼＩ誘導体はリーダー、エピトー
プまたは他のタンパク質配列、例えばＭｙｃ^TMタグ付き、ヒスチジンタグ付き、
またはＦｌａｇ^TMエピトープタグ配列を含有するタンパク質を含み、かつｈＰＥ
Ｒ１リン酸化活性を有する。このような誘導体は精製を容易にするか、セファロ
ースビーズへの吸着または簡単な検出を可能にする。

【００３１】ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３の誘導体にはリーダー、エ
ピトープまたは他のタンパク質配列、例えばＭｙｃ^TMタグ付き、ヒスチジンタグ
付き、またはＦｌａｇ^TMエピトープタグ配列を含有するタンパク質が含まれてお
り、ｈＣＫＩεによりリン酸化される能力を保持する。このような誘導体は精製
を容易にするか、セファロースビーズへの吸着または簡単な検出を可能にする。

【００３２】好ましいヒトPeriodタンパク質は１またはそれ以上のｈＣＫＩεリン酸化共通
配列‘ＤＸＸＳ’を有するタンパク質からなり、ここでＤはグルタミン酸残基、
Ｘはいずれかのアミノ酸残基、そしてＳはセリン残基である。Ｓ−Ｘ_n−Ｓモチ
ーフ（ここでｎは１、２、３または４である）に適合するセリンでリン酸化は起
こり、過リン酸化を生ずることもある。カゼインキナーゼＩのリン酸化優先はFl
otow, H. and Roach, P.J., J. Biol. Chem. 266(6): 3724-3727 (1991）に特徴
付けられている。本発明の好ましい実施態様において、ヒトPeriodタンパク質は
過リン酸化できる。推定ＣＫＩ相互作用ドメインの遺伝子破壊の場合にはヒトＰ
ＥＲ１では４８６〜５０３アミノ酸であるIQELSEQIHRLLLQPVH、ヒトＰＥＲ２で
は４６０〜４７７アミノ酸であるIQELTEQIHRLLLQPVH、および／またはヒトＰＥ
Ｒ３ではITELQEQIYKLLLQPVHにある。ｈＰＥＲ１のリン酸化部位はｈＰＥＲ１の
７４３〜８８９アミノ酸、好ましくはｈＰＥＲ１の８００〜８２０アミノ酸およ
び最も好ましくはｈＰＥＲ１の８０８〜８１５アミノ酸の間にあるか、あるいは
また本発明の実施態様の一つにおいて、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／または
ｈＰＥＲ３の好ましい誘導体は、ｈＰＥＲ１の７４３〜８８９アミノ酸からなる
群から選択されるリン酸化部位を含有し、または推定ＣＫＩ相互作用ドメインの
遺伝子破壊の場合にはｈＰＥＲ１では４８６〜５０３アミノ酸（IQELSEQIHRLLLQ
PVH）、ヒトＰＥＲ２では４６０〜４７７アミノ酸（IQELTEQIHRLLLQPVH）、およ
びヒトＰＥＲ３ではITELQEQIYKLLLQPVHを含有する。

【００３３】 “プロテインキナーゼ活性を有するタンパク質”という用語は、当業者ならば
プロテインキナーゼ活性を有すると評価されるタンパク質、例えば、スクリーニ
ング系で１種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質をリン酸化できるタンパク
質を意味する。スクリーニング系は後記実施例のいずれかに記載のように、同じ
（または実質的に同様な）条件であってよい。しかし、リン酸化、分解、または
概日周期アッセイのセットアップ方法は、当業者によく知られており、本発明は
ここで提供する具体的な実施例に限定されるものではない。

【００３４】本発明で用いるタンパク質は、例えば標準的遺伝子組換え技術により組換え体
として発現させ、および／または場合により化学的修飾されたヒト組織から得る
ことができる。タンパク質の組換え発現体が好ましい。

【００３５】タンパク質の「誘導体」としてはアミノ末端（Ｎ−末端）のアミノ基またはア
ミノ酸側鎖のアミノ基の全てまたは一部、および／またはカルボキシル末端（Ｃ
−末端）のカルボキシル基またはアミノ酸側鎖のカルボキシル基の全てまたは一
部、および／またはアミノ酸側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基
、例えば水素、チオール基またはアミド基が他の適当な置換基により修飾された
タンパク質を挙げることができる。他の適当な置換基による修飾は、例えばタン
パク質の官能基の保護、安全性の改良またはアッセイの促進、例えばタンパク質
をセファロースビーズに付着させる官能基の付加という目的で実施される。一例
として５′末端タグ付きプライマーまたはヒスチジンタグ付プライマーに付いた
Ｆｌａｇ^TMエピトープタグ配列の付加である。

【００３６】そのタンパク質の誘導体には以下のものが含まれる； (１) アミノ末端（Ｎ−末端）にあるアミノ基またはアミノ酸側鎖のアミノ基
の一部または全てのうちの置換または非置換のアルキル基（直鎖または分枝鎖ま
たは環状鎖であることができる）例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソ
プロピル基、イソブチル基、ブチル基、t−ブチル基、シクロプロピル基、シク
ロへキシル基またはベンジル基、置換または非置換のアシル基、例えばホルミル
基、アセチル基、カプロイル基、シクロへキシルカルボニル基、ベンゾイル基、
フタロイル基、トシル基、ニコチノイル基またはピペリジンカルボニル基、ウレ
タン型保護基、例えばｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベ
ンジルオキシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピル−オキシカルボニル基
またはｔ−ブトキシカルボニル基、または尿素型置換基、例えばメチルアミノカ
ルボニル基、フェニルカルボニル基またはシクロへキシルアミノカルボニル基で
置換されているタンパク質； (２) カルボキシル末端（Ｃ−末端）またはアミノ酸側鎖の一部または全てに
おけるカルボキシル基がエステル化されている（例えば、水素原子がメチル、エ
チル、イソプロピル、シクロへキシル、フェニル、ベンジル、ｔ−ブチルまたは
4−ピコリルにより置換される）またはアミド化されている（例えば、未置換の
アミドまたは例えばメチルアミド、エチルアミドまたはイソプロピルアミドのよ
うなＣ₁〜Ｃ₆アルキルアミドが形成される）タンパク質；または (３) アミノ酸側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基の一部また
は全て、例えば水素、チオール基またはアミノ基が、（１）に記載の置換基また
はトリチル基により置換されているタンパク質。

【００３７】「変える」という用語は、試験化合物のない場合のリン酸化に対してｈＣＫＩ
δおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３
のリン酸化を阻害または促進する試験化合物の能力を意味する。あるいは、「変
える」はまた例えば標準物質のような異なる化合物のリン酸化に対してｈＣＫＩ
δおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３
のリン酸化を阻害または促進する試験化合物の能力を意味する。ｈＰＥＲ１、ｈ
ＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化を阻害または促進する化合物の
能力は天然型ｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質に対して測定されることが
好ましい。

【００３８】「スクリーニング系」という用語はｈＣＫＩδおよび／またはεによるｈＰＥ
Ｒ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化をするのに適した条件
セットの意味である。一般的に、スクリーニング系にはいつでも利用可能なホス
フェート源が含まれる。好ましいホスフェート源はいつでも利用可能なＡＴＰ源
である。スクリーニング系は細胞をベースとしたものか、インビトロが可能であ
る。細胞をベースとしたスクリーニング系はｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、ｈＰＥＲ
３および／またはｈＣＫＩδおよび／またはεのいずれかまたは各々を発現する
細胞の使用を含む。スクリーニング方法は細胞系または無細胞系のいずれかであ
り得る。適した細胞系はS. cerevisiaeのような酵母細胞、E. coliのような細菌
細胞、バキュロウイルス発現系で使用されるような昆虫細胞、線虫細胞、ＣＯＳ
細胞のような哺乳類細胞、リンパ球、繊維芽細胞（３Ｙ１細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３
細胞、Ｒａｔ１細胞、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞等）、２９３Ｔ細胞のようなヒト胎
児腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、血球、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、脳細胞を含
む。好ましい細胞系は視交叉上核細胞、神経細胞、骨髄球、膠細胞および星状膠
細胞である。細胞をベースとした系では、細胞系がヒトPeriodタンパク質および
／またはｈＣＫＩεを発現しない場合、一方または両方のヒトPeriodタンパク質
および／またはｈＣＫＩεを発現する目的で細胞にトランスフェクションあるい
は形質転換させなければならない。あるいは、無細胞系を利用してもよい。部分
精製または精製したｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３、およ
びｈＣＫＩδおよび／またはεは、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈ
ＰＥＲ３のそれぞれ、およびｈＣＫＩδおよび／またはεを発現する組換え体源
から得ることができ、またはそのために該タンパク質をコードする元来のｍＲＮ
Ａの内在する塩基配列が修飾される。

【００３９】細胞内でのヒトPeriodタンパク質および／またはｈＣＫＩδおよび／またはε
の組換え発現は例えば、プロモーターおよびｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、ｈＰＥＲ
３および／またはｈＣＫＩδおよび／またはεをコードするｃＤＮＡを含む１つ
またはそれ以上の適当な発現ベクターを用いたトランスフェクションの結果であ
り得る。また細胞をベースとしたスクリーニング系にはヒトPeriodタンパク質お
よび／またはｈＣＫＩδおよび／またはεが、例えばＨＩＶから得られるＴＡＴ
タンパク質、アンテナペディア形質導入フラグメント、または細胞に外因性タン
パク質を導入する何か他の方法のような形質導入または形質導入配列を有する融
合タンパク質として細胞に導入または形質導入される細胞の使用がある。

【００４０】好ましいインビトロのスクリーニング系は、すぐ利用可能なホスフェート源含
有水溶性組成物を含む。好ましいインビトロのスクリーニング系はＡＴＰを含む
。

【００４１】ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定する方法の例は、タンパク質
のリン酸化の量を検出する標準方法、例えば放射性標識されたリンおよびオート
ラジオグラフィーの使用、または放射性標識されたリンの添加量と得られた非結
合リンの量を比較することにより間接的に検出する方法を含む。あるいは、カラ
ーメトリックまたは他の検出方法がリン酸化のレベルを測定するのに使用される
こともある。ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定するのに適した他
の方法は、ヒトPeriodタンパク質またはｈＣＫＩεのいずれかがセファロースビ
ーズのような固形支持体に結合し、かつｈＣＫＩεまたはヒトPeriodタンパク質
のいずれかが添加されるグルタチオンセファロースビーズを用いた無細胞系を含
む。さらに、後でヒトPeriodタンパク質の量を測定する多数の別法が利用でき、 ³⁵ Ｓで標識されたヒトPeriodタンパク質の分解、カラーメトリック検定、結合し
たヒトPeriodタンパク質の溶出などの使用が含まれる。

【００４２】ここで開示されたスクリーニング方法は、ヒトPeriodタンパク質のリン酸化の
レベルおよび／または分解を効果的に調節しまたは変え、従って哺乳類の概日リ
ズムを変える試験化合物を同定する目的で、無作為にデザインされた試験化合物
または合理的にデザインされた試験化合物のいずれかの多数の試験化合物のスル
ー−プットの高いスクリーニングを可能にし、それらが自動化できるという点で
特に有用である。

【００４３】「哺乳類」という用語はヒト、霊長類、イヌ、ブタ、牛および他の高等生物を
意味する。ヒトおよび霊長類はさらに好ましくは哺乳類である。ヒトは最も好ま
しい。

【００４４】本発明に使用される試験化合物は任意の生物学的または低分子化合物、例えば
簡単なまたは複雑な有機分子、ペプチド、ペプチド類似物、タンパク質、オリゴ
ヌクレオチド、微生物培養物由来化合物、天然型または合成有機化合物、および
／または天然型または合成無機化合物を含む。選別されるべき試験化合物の選択
は当業者に既知である。

【００４５】また本発明は一種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える
試験化合物の能力を測定する方法を提供する。この方法は以下の工程： (１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質およびｈＰＥＲ１
、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種またはそれ以上の
ヒトPeriodタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、および (２) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定することからなる。

【００４６】また本発明はヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測
定する方法を包含することも理解される。その方法は以下の工程： (１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質およびｈＰＥＲ１
、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される２種またはそれ以上の
異なるｈＰＥＲタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、および (２) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定することからなる。

【００４７】別法として、本発明はヒトPeriodタンパク質のリン酸化を選択的に変える試験
化合物の能力を測定する方法を含む。その方法は以下の工程： (１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質並びにｈＰＥＲ１
、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種のｈＰＥＲタンパ
ク質を含むスクリーニング系に添加すること、および (２) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質およびｈＰＥＲ１
、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種のｈＰＥＲタンパ
ク質からなるスクリーニング系に添加すること、但し（２）で選択されたｈＰＥ
Ｒタンパク質は（１）で選択されたｈＰＥＲタンパク質ではない； (３) （１）および（２）におけるヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベル
を測定すること；および (４) ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化を変え
るのに試験化合物が選択的であるかどうかを測定するために、（３）で得られた
各ヒトPeriodタンパク質について得られた結果を比較することからなる。

【００４８】別法として、本発明はヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力
を測定する方法を含む。それは以下の工程： (１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質並びにｈＰＥＲ１
、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種のｈＰＥＲタンパ
ク質からなるスクリーニング系に添加すること、 (２) 試験化合物の添加後ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および (３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系に
おけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較することからなる。

【００４９】別法として、本発明は試験化合物がヒトPeriodタンパク質の分解を変える能力
を測定する方法を含む。それは以下の工程： (１) 試験化合物およびｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質をｈＰＥＲ１
、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種のｈＰＥＲタンパ
ク質を含むスクリーニング系に添加すること、 (２) 試験化合物およびｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質の添加後、ヒ
トPeriodタンパク質の量を測定すること、および (３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系に
おけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較することからなる。

【００５０】別法として、本発明はヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力
を測定する方法を含む。その方法は以下の工程: (１) ｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質を試験化合物並びにｈＰＥＲ１
、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種のｈＰＥＲタンパ
ク質を含むスクリーニング系に添加すること、 (２) ｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質の添加後ヒトPeriodタンパク質
の量を測定すること、および (３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系の
ヒトPeriodタンパク質の量とを比較することからなる。

【００５１】本発明はｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質ｈＰＥＲ１の７４３〜８８９
アミノ酸、好ましくはｈＰＥＲ１の８００〜８２０アミノ酸、および最も好まし
くはｈＰＥＲ１の８０８〜８１５アミノ酸の部位で、または推定ＣＫＩ相互作用
ドメインの遺伝子破壊の場合にはヒトＰＥＲ１では４８６〜５０３アミノ酸であ
るIQELSEQIHRLLLQPVH、ヒトＰＥＲ２では４６０〜４７７アミノ酸であるIQELTEQ
IHRLLLQPVH、および／またはヒトＰＥＲ３ではITELQEQIYKLLLQPVHでｈＰＥＲ１
をリン酸化する能力を変える化合物によりｈＰＥＲ１の分解を変える方法を含む
。

【００５２】以下に記載のように、リン酸化されたｈＰＥＲ１タンパク質は急速に分解し、
それ故に本発明によるスクリーニング方法はｈＰＥＲ１の分解を選択的に活性化
または阻害する試験化合物の同定のために使用され得る。リン酸化されたｈＰＥ
Ｒ２およびｈＰＥＲ３タンパク質は急速に分解するので、本発明方法はｈＰＥＲ
２またはｈＰＥＲ３それぞれの分解を選択的に活性化または阻害する試験化合物
を同定するのに用いることができる。また本発明方法は、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ
２および／またはｈＰＥＲ３のいずれかのリン酸化の活性化または阻害に及ぼす
その化合物の効果を測定し、そして同一または異なる試験化合物を用いて得られ
た結果を比較することにより、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ
３のリン酸化を選択的に活性化または阻害する化合物を測定する方法も提供する
。

【００５３】また、リン酸化されたｈＰＥＲ１タンパク質は急速に分解するので、本発明の
方法は、試験化合物の不在下での同じまたは異なるヒトPeriodタンパク質のレベ
ルと比較して、細胞中のヒトPeriodタンパク質のレベルを選択的に増加または減
少する試験化合物の同定に用いることができる。本発明の一つの好ましい実施態
様において、その方法は試験化合物の不在下のｈＰＥＲ１レベルと比較して細胞
内ｈＰＥＲ１のレベルを選択的に増加または減少させる試験化合物の同定に用い
られる。本発明の好ましい他の実施態様において、その方法は試験化合物の不在
下のｈＰＥＲ２レベルと比較して細胞内のｈＰＥＲ２のレベルを選択的に増加ま
たは減少させる試験化合物の同定に用いられる。

【００５４】さらに、本発明は試験化合物の存在下のｈＰＥＲ２の分解量と比較して細胞中
のｈＰＥＲ１の分解量を選択的に阻害する試験化合物を同定する方法を含む。本
発明の他の実施態様において、その方法は試験化合物の存在下のｈＰＥＲ１の分
解量と比較して細胞内ｈＰＥＲ２の分解量を選択的に阻害する試験化合物の同定
に用いられる。

【００５５】あるいは、本発明は試験化合物の不在下のｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ
３それぞれのレベルと比較して、または異なるヒトPeriodタンパク質のレベルと
比較して、細胞内のｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のレベルを選択的に増
加または減少させる試験化合物を同定することに用いることができる。本発明方
法は細胞内のｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のレベルをその
本来のレベルと比較して選択的に増加または減少させる化合物を同定するのに使
用できる。またヒトPeriodタンパク質のレベルに関する種々の試験化合物の結果
の比較は、生物学的処理または化学的処理、例えば光、成長因子、転写因子等の
内因性および／または外因性刺激の添加、阻害または変質の後であってもよい。

【００５６】リン酸化されたｈＰＥＲタンパク質は哺乳類の概日周期の調節に密接に関係し
ていることが知られている。それ故に、本発明は試験化合物または刺激の不在下
で哺乳類の概日周期の生理的反応に影響を与え、調節を行い、または変化を与え
る試験化合物を同定するのに用いることができる。哺乳類の概日周期の調節は、
試験化合物の不在下で刺激に応答する哺乳類の正常の概日周期の変化の防止を含
む。従って、本発明は哺乳類の概日リズムを正常に変える刺激に応答する哺乳類
の概日リズムの変化を妨げることができる試験化合物を同定する方法を含む。

【００５７】ヒトカゼインキナーゼＩε（ｈＣＫＩε）がヒトPeriod１のリン酸化に与える
効果を証明する後記実施例を変形させてヒトPeriod２および／またはヒトPeriod
３に置き換えることができる。同様な結果がヒトカゼインキナーゼＩｈＣＫＩδ
で得られる。

【００５８】ｈＣＫＩε（ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒ）のキナーゼネガティブ変異体ではなく、
精製した組換えｈＣＫＩεは、インビトロでｈＰＥＲ１をリン酸化する。２９３
Ｔ細胞において野生型ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションすると、ｈＰＥ
Ｒ１は分子量での１つのシフトにより証明されるように、リン酸化の著しい増加
を示す。また、ｈＰＥＲ１タンパク質はトランスフェクションされたｈＣＫＩε
並びに内因性ｈＣＫＩεと共に免疫沈降することができ、それはインビボでｈＰ
ＥＲ１およびｈＣＫＩεタンパク質間の物理的会合を示している。さらに、ｈＣ
ＫＩεによるｈＰＥＲ１のリン酸化はｈＰＥＲ１でのタンパク質の安定性を減少
させる。リン酸化されないｈＰＥＲ１は、２４時間周期を通して細胞が安定なま
まであり、一方リン酸化されたｈＰＥＲ１は半減期が約１２時間である。多様な
ｈＰＥＲ１トランケート変異体を用いて、ｈＰＥＲ１のリン酸化可能な部位は７
４３〜８８９アミノ酸であり、これはＣＫＩ共通リン酸化部位を１つ含有する。

【００５９】ショウジョウバエＤＢＴの哺乳類のホモログであるｈＣＫＩεがｈＰＥＲ１を
リン酸化できるかどうか調べるために、組換えｈｉｓタグ付き野生型ｈＣＫＩε
をE. coli．で発現させ、精製し、カゼインおよびＧＳＴ−ＩκＢαのような一
組の既知の基質、並びにｈＰＥＲ１をリン酸化するその能力をアッセイした。組
換えｈＣＫＩεはカゼインおよびＩκＢα基質の両方をリン酸化する（図１Ａの
レーン２および３）。精製した野生型ｈＣＫＩεは自己リン酸化する。自己リン
酸化の能力はｈＣＫＩε活性を示す（図１Ａのレーン１および２）。組換えｈＣ
ＫＩε不存在下ではリン酸化は観察されない（図１Ａのレーン７および８）。

【００６０】キナーゼネガティブ変異体ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒ（ここではＡＴＰ結合ドメイ
ンのリジン３８をアルギニンに変異させる）をカゼインおよびＩκＢα両基質の
リン酸化についてアッセイする。ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒは自己リン酸化活性を有
さず、カゼインまたはＧＳＴ−ＩκＢα両基質をリン酸化しない（図１Ａのレー
ン４〜６）。これは前のリン酸化活性が野生型ｈＣＫＩεに特異的であることを
証明している。

【００６１】また組換えｈＣＫＩεはインビトロでｈＰＥＲ１をリン酸化することを示す。
図１Ｂに示すように、組換えｈＣＫＩεの不在下ではリン酸化は全く観察されな
い（レーン８〜１０）。インビトロでｈＣＫＩεの存在によりｈＰＥＲ１がリン
酸化されるが、Ｆｌａｇタグ付ルシフェラーゼはリン酸化されない結果になる（
レーン２および３）。ｈＣＫＩεはまた熱処理で不活化したｈＰＥＲ１免疫沈降
物をリン酸化したように、ｈＰＥＲ１のリン酸化はｈＰＥＲ１関連キナーゼ活性
が原因ではない（レーン６）。さらに、ｈＣＫＩε−Ｋ３８ＲはｈＰＥＲ１に対
するキナーゼ活性がない（レーン７）。それ故に、ｈＣＫＩεはインビトロでｈ
ＰＥＲ１を直接リン酸化する。

【００６２】ｈＣＫＩεはフラッグタグ付ｈＰＥＲ１およびベクターコントロール、野生型
ｈＣＫＩεまたはｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒのいずれかを同時にトランスフェクショ
ンした２９３Ｔ細胞においてｈＰＥＲ１を特異的にリン酸化する。トランスフェ
クションの後２４時間後に溶解し、溶解物を３〜８％のＳＤＳＮＵ−ＰＡＧＥ
で分離し、続いてウエスタンブロット解析を行う。図２Ａは野生型ｈＣＫＩεお
よびｈＰＥＲ１を同時にトランスフェクションした細胞内では、コントロールの
ベクターまたはｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒのいずれかと同時にトランスフェクション
した細胞と比較して、ｈＰＥＲ１タンパク質の分子量の著しいシフトが観察され
ることを示す（レーン１〜３）。ｈＰＥＲ１分子量の同様なシフトは、異なる百
分率のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたいくつかの同時トランスフェクション実験で常
に観察される。ウエスタンブロット解析は野生型ｈＣＫＩεおよびｈＣＫＩε−
Ｋ３８Ｒタンパク質の両方が等量で発現することを示す（図２Ｂのレーン２〜５
）。

【００６３】Ｆｌａｇタグ付ｈＰＥＲ１およびコントロールのベクター、ｈＣＫＩεまたは
ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒキナーゼネガティブ変異体のいずれかを同時にトランスフ
ェクションし、［³⁵Ｓ］メチオニンおよびシステインで放射性同位体標識した２
９３Ｔ細胞では、リン酸化後にｈＰＥＲ１の分子量に変化が生じることが証明さ
れる。³⁵Ｓで標識したｈＰＥＲ１を免疫沈降し、精製した組換えラムダフォスフ
ァターゼで処理または未処理する。図２Ｃに示すように、細胞にコントロールの
ベクターまたはキナーゼネガテイブｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒとではなく、野生型ｈ
ＣＫＩεと同時にトランスフェクションすると、³⁵Ｓ−放射性同位体標識された
免疫沈降したｈＰＥＲ１は分子量に一つのシフトを示す（レーン１、２、および
３）。ｈＰＥＲ１および野生型ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションした細
胞からのタンパク質の分子量変化は、ラムダフォスファターゼ処理の１時間後著
しく減少する。これはｈＰＥＲ１の移動性変化はリン酸化が原因であることを証
明する（図２Ｃのレーン２および５）。ラムダフォスファターゼの処理後１時間
後に、コントロールのベクターおよびキナーゼネガティブを同時にトランスフェ
クションした細胞に対する、ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションした細胞
由来の全ｈＰＥＲ１の移動性は互いに本質的に見分けがつかない（図２Ｃのレー
ン４、５および６）。

【００６４】ラムダフォスファターゼの移動性変化は汚染プロテアーゼが原因ではない。ラ
ムダフォスファターゼ反応に５０mMフッ化ナトリウム（ホスファターゼ阻害剤）
を添加することにより、ｈＰＥＲ１の移動性の変化減少がブロックされた。免疫
沈降物中には分子量のより高い形態のその他のｈＰＥＲ１は全く存在しない；こ
れはｈＰＥＲ１翻訳後の移動性シフトはリン酸化が原因ということを示している
。

【００６５】概日周期の間、ＰＥＲタンパク質が蓄積し、この蓄積に続いてＰＥＲは分解す
る（Edery, I., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2260-2264, D
embinska, M.E., et al.(1997) J. Biol. Rhythms 12, 157−172)。ＰＥＲタン
パク質が蓄積するフェイズの間に、そのタンパク質のリン酸化が原因と思われる
分子量の著しいシフトがある。ＰＥＲが消える直前に該移動性シフトはその最大
値に達する（Edery, I., et al. (1994) supra)。ｈＰＥＲ１および野生型ｈＣ
ＫＩεの両方をコードする発現プラスミド、またはコントロールのベクターを同
時にトランスフェクションした２９３Ｔ細胞は、ｈＰＥＲ１のリン酸化が細胞内
でｈＰＥＲ１が不安定になる結果であることを証明するのに用いられる。トラン
スフェクション後約２０時間経過してから、細胞を３０分間［³⁵Ｓ］メチオニン
／システインを用いてパルス標識し、次に０〜３０時間チェイスする。適切な時
間経過の後、ｈＰＥＲ１を採集し、免疫沈降してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
図３Ａで示すように、ｈＰＥＲ１およびベクターのみを同時にトランスフェクシ
ョンした細胞は、タイムコースの間の移動性についてはほとんどシフトを示さな
かった（レーン１〜７）。１２時間後そのタンパク質のスミアで示されるが、３
０時間の時点で僅かに増加した（レーン１、５、および７）分子量の僅かなシフ
トが現れた。コントロールの細胞に存在するｈＰＥＲ１量はそのタイムコースの
間相対的に一定である。放射性同位体標識後２時間経過後に、約５０％のｈＰＥ
Ｒ１タンパク質が依然として細胞内に存在し、このレベルはタイムコースの間一
定である（図３Ｃの黒い棒）。コントロールのベクターとは対照的に、ｈＰＥＲ
１および野生型ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションした細胞は放射性同位
体標識後２時間ですぐに、移動性のシフトを示した（図３Ｂのレーン１および２
）。この分子量シフトはタイムコースの間ますます顕著になり続け、２４〜３０
時間の間に移動値が最大になった（図３Ｂのレーン２〜７）。コントロールのベ
クターとは対照的に、ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションした２９３Ｔ細
胞由来ｈＰＥＲ１はタンパク質安定性の減少を示した。コントロールのベクター
と同様に、２時間の時点でＣＫＩδを同時にトランスフェクションした細胞由来
のｈＰＥＲ１総量の５０％が細胞に存在する（図３Ｂのレーン２、および図３Ｃ
の縞の棒）。コントロールのベクターとは異なり、リン酸化されたｈＰＥＲ１の
２分の１のみは１２時間後細胞に残存していた。２４時間ではリン酸化されたｈ
ＰＥＲ１の約１４％が存在する（図３Ｂのレーン５および６並びに図３Ｃの縞の
棒）。この実験は３回繰り返して同様な結果である。野生型ｈＣＫＩεによるｈ
ＰＥＲ１のリン酸化により、タンパク質の安定性が減少し、続いて、ｈＰＥＲ１
が分解するという結果になる。

【００６６】ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩεは２９３Ｔ細胞内で物理的に相互作用する。２９
３Ｔ細胞にＦｌａｇタグ付ｈＰＥＲ１およびベクターのみまたはＨＡタグ付ｈＣ
ＫＩεのいずれかを同時にトランスフェクションする。トランスフェクションし
た２９３Ｔ細胞を溶解し、ｈＰＥＲ１を抗ＦｌａｇｍＡｂを用いて免疫沈降し、
次に抗ＨＡｍＡｂを用いてイムノブロットする。あるいは、ｈＣＫＩεを抗ＨＡ
ｍＡｂで免疫沈降し、次に抗ＦｌａｇｍＡｂでイムノブロットする。図４Ａおよ
び図４Ｂには組換えｈＣＫＩεはｈＰＥＲ１と共沈するということが証明されて
いるが、これはｈＣＫＩεがｈＰＥＲ１と直接会合することを示している。２９
３Ｔ細胞にｈＰＥＲ１のみをトランスフェクションしてそのようなｈＰＥＲ１を
証明する。細胞を溶解し、ｈＰＥＲ１を抗ＦｌａｇｍＡｂを用いて免疫沈降し、
次に抗ｈＣＫＩεｍＡｂを用いてイムノブロットする。あるいは、内因性ｈＣＫ
Ｉεを抗ｈＣＫＩεｍＡｂを用いて免疫沈降し、次いで抗ＦｌａｇｍＡｂを用い
てイムノブロットする。内因性ｈＣＫＩεがｈＰＥＲ１と共に免疫沈降したが、
これはこの２つのタンパク質間の物理的な会合を示している（図４Ｃおよび図４
Ｄ）。

【００６７】ｈＣＫＩεはｈＰＥＲ１の６２１〜８８９アミノ酸をリン酸化する。図２Ａは
ｈＰＥＲ１の分子量シフトがｈＣＫＩεによるリン酸化の結果であることを示す
。ｈＣＫＩεによりリン酸化されたｈＰＥＲ１のリン酸化部位を同定するために
、トランケート型のｈＰＥＲ１を図５Ａおよび後記の実験材料および実験方法に
記載のように調製する。これらの構築物をベクター、ｈＣＫＩε、またはｈＣＫ
Ｉε−Ｋ３８Ｒのいずれかと共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、分子
量シフトを検定する。図５Ｂのレーン２に示すように、ｈＣＫＩεおよび全長オ
ープンリーデイングフレームｈＰＥＲ１（ＯＲＦ）、Ｎ２、Ｎ３またはＮ４のい
ずれかを同時にトランスフェクションした細胞は、タンパク質の分子量シフトを
示す。トランケートｈＰＥＲ１タンパク質をラムダフォスファターゼ処理すると
ｈＣＫＩεによるリン酸化が原因でシフトが消失するという結果になり、Ｎ１ま
たはＣ−末端構築物Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５またはＣ６を同時にトランスフェクション
したｈＣＫＩεは該タンパク質の分子量シフトを示さなかった（図５Ｂおよび図
５Ｃのレーン２）。分子量シフトを示したトランケート構築物（ＯＲＦ、Ｎ２、
Ｎ３、およびＮ４）は、６２１〜８８９アミノ酸の相同性のある領域を共有する
(図５Ａ参照)。５８４〜７４３アミノ酸を含有するＣ１は、シフトを示さなかっ
たので、ｈＰＥＲ１はｈＣＫＩεにより７４３〜８８９アミノ酸の間でリン酸化
される。いくつかのＣＫＩリン酸化共通配列はｈＰＥＲ１内に位置しており、ｈ
ＣＫＩεによりリン酸化される上記ｈＰＥＲ１領域内の一つ、具体的には８０８
〜８１５アミノ酸：ＤＳＳＳＴＡＰＳを含む配列を包含する。セリンおよびスレ
オニンの全てがｈＣＫＩεの基質として供され、そのことは観察された劇的な移
動性シフトを説明しているかもしれない。

【００６８】実験材料および実験方法実施例１プラスミドの構築、発現、およびタンパク質の精製野生型ｈＣＫＩεをコードするｃＤＮＡはヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから
前記方法（Fish, K.J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14875-14883）を
用いて単離する。細菌用ベクターにｈＣＫＩεをクローニングしたもの（ｐＲＳ
Ｔ−Ｂ−ＣＫＩε）および哺乳類用発現ベクターにｈＣＫＩεをクローニングし
たもの（ｐＣＥＰ４−ＣＫＩε）は前述の通りである（Cegielska, A., et al.,
(1998) J. Biol. Chem. 273, 1357-1364, Rivers, A., et al., (1998) J. Bio l. Chem. 273, 15980-15984)。ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグ（YPDYDV
PDYA）はｐＣＥＰ４−ＣＫＩεにおいてｈＣＫＩεの５′末端に付加する。全長
ｈＰＥＲ１（Tel, H., et al, (1997) Nature 389, 512-516）をEcoRＩおよびSa
lＩで切断し、プラスミドベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ^TM（Stratagene）にライゲ
ーションしてイン−フレームでＦｌａｇタグのついた融合タンパク質を作製する
。トランケートされたＮ末端変異体（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｃ５）はＰＥＲ
１をEcoRＩ／EcoRＶ、EcoRＩ／XhoＩ、EcoRＶ／XhoＩ、Pvu II／XhoＩ、またはB
amHＩ／SalＩそれぞれで切断し、同じベクターにライゲーションすることにより
生成される。変異体Ｃ１、Ｃ２およびＣ６を構築するために、鋳型としてｈＰＥ
Ｒ１ｃＤＮＡを用い、５８４〜７４３、９９８〜１１６０、または１１６１〜１
２８９アミノ酸それぞれをコードするＤＮＡフラグメントを増幅するためのＰＣ
Ｒ反応でオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。得られたフラグメントを表
１に要約する。

【００６９】

【表１】

【００７０】Ｆｌａｇ^TMエピトープタグ配列をプライマーの５′末端に付加する。ＰＣＲ産
物を哺乳類用発現ベクターｐｃＤＮＡ３ Topo vector^TM（Invitrogen）にクロー
ン化する。細菌で発現させたヒスチジンタグ付ｈＣＫＩεおよびｈＣＫＩε−Ｋ
３８Ｒを、Cegielska, A., et al, (1998) J. Biol. Chem. 273, 1357-1364に記
載のように精製する。ｃ−ＭＹＣタグ付ＣＫＩδはDavid Virshup博士の寄贈で
あった。９０％以上の相同性を有する分子量約５４kDaのタンパク質が精製され
る。

【００７１】実施例２２９３Ｔ細胞のトランスフェクションおよび放射性同位体標識ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清（Hyclone）を補充したＤＭ
ＥＭ入り６ウェルプレートで培養する。約８０％密度になった時点でlipofectAM
INE^TM reagent（Life Technologies）を用い、メーカーの使用説明書に従い、２
μｇのＤＮＡを細胞にトランスフェクションする。２９３Ｔ細胞の一過性トラン
スフェクション効率は、コントロールのＧＦＰプラスミドのトランスフェクショ
ンによりモニターされるように典型的には３０〜５０％である。

【００７２】トランスフェクションの１６時間後に２９３Ｔ細胞をメチオニンおよびシステ
イン欠乏培地で０.５μCi／ml［³⁵Ｓ］メチオニン／システインを用いて３０分
間放射性標識する。その後、細胞を洗い、指定された時間まで通常のＤＭＥＭで
培養する。細胞を溶解緩衝液（20mM Tris, １％ Triton X-100^TM, 0.5％ Igepal ^TM , 150mM NaCl, 20mM NaF, 0.2mM Na₂VO₄, １mM EDTA, １mM EGTA, Complete p
rotease inhibitor cocktail [Boeringer Mannheim], pH 7.5）を用いて溶解す
る。溶解物を１２,０００rpmで遠心分離することにより、細胞の残骸を取り除く
。上澄みを回収し、使用するまで−７０℃で保存する。

【００７３】実施例３免疫沈降およびウエスタンブロット分析等量のタンパク質を含有する溶解物（全１００μｇ）を抗−Ｆｌａｇ、抗−Ｈ
Ａ、または抗−ｈＣＫＩεｍＡｂいずれかを１：５００で希釈した５μｌと混合
し、４℃で一晩インキュベートする。抗体とのインキュベーション後、３０μｌ
のＧタンパク質セファロースビーズの１：１スラリーを添加し、更に２〜４時間
インキュベーションする。ビーズを溶解緩衝液中で５回洗浄し、その後３０μＬ
の５mM ＤＴＴ入りＳＤＳサンプルバッファーに再懸濁し、煮沸し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより分析する。タンパク質のウエスタンブロットは前述のように抗−Ｆ
ｌａｇ^TM（Sigma）（１：１０００希釈）、抗−ＨＡ（Invitrogen)（１：１００
０希釈）、または抗−ｈＣＫＩε（Transduction Laboratories）（１：７５０
希釈）のいずれかを用いてトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞由来の上澄
みまたは免疫沈降したタンパク質のいずれかについて実施する（Yao, Z., et al
, (1997) J. Biol. Chem. 272, 32378-32383)。

【００７４】実施例４キナーゼおよびフォスファターゼの検定基質としてカゼインまたはＧＳＴ−ＩκＢαのいずれかを用い、ｈＣＫＩεの
活性について検定する。カゼインまたはＧＳＴ−ＩκＢα（０.５μｇ）は、２
００nM ＡＴＰ、１０mM ＭｇＣｌ₂、０.６mM ＥＧＴＡおよび０.２５mM ＤＴＴ
を含有するＰＢＳ中でｈＣＫＩε（０.１μｇ）および５μCi［γ−³²Ｐ］ＡＴ
Ｐ（Amersham）と結合する。反応混合物を室温で３０分間インキュベートし、Ｓ
ＤＳサンプルバッファーの添加により反応を停止させ、それからＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分析する。ＧＳＴ−ＩκＢαはＳＤＳ−ＰＡＧＥでｈＣＫＩεと同じよ
うな位置まで泳動されたので、プロトコールを少し改変して実施した。３０分間
インキュベーションした後、グルタチオン−セファロースビーズの添加によりＧ
ＳＴ−ＩκＢαをキナーゼ反応から除去する。ＳＤＳサンプルバッファーの添加
前にｈＣＫＩεの汚染を除去するため、ビーズを溶解緩衝液中で５回洗浄する。
ゲルをCoomassie blue R-250で染色し、乾燥し、次いでオートラジオグラフィー
に付す。

【００７５】 ³⁵Ｓで標識されたｈＰＥＲ１の免疫沈降は上記のとおりである。ｈＰＥＲ１含
有のビーズをフォスファターゼ緩衝液（１００mM ＭＥＳ、０.５mMジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）、０.２mMフェニルメチルスルホニルフロリド、２０μｇ／ml
アプロチニン、１０μｇ／mlロイペプチン、１０μｇ／mlペプスタチンＡ、ｐＨ
６.０）で更に３回洗浄し、２０μｌのフォスファターゼ緩衝液に再懸濁する。
１０×反応溶液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、０.１mM ＥＤＴＡ、５mM ＤＴＴ、
０.０１％Ｂｒｉｊ３５、２mM ＭｎＣｌ₂、ｐＨ７.０）、および精製したラム
ダフォスファターゼ４０単位を添加することにより、フォスファターゼ処理を開
始する。その反応を３７℃で１時間続行させる。フォスファターゼ活性の阻害は
５０mMフッ化ナトリウムの添加により達成される。適切なインキュベーションの
後、ＳＤＳサンプルバッファーの添加により反応を停止する。タンパク質をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを用いて分離し；ゲルを乾燥し、次いでオートラジオグラフィーに
付す。画像はMolecular Dynamics Phospholmager^TMを用いて視覚化される。

【００７６】実施例５ｈＣＫＩεのヒトＰＥＲ１との相互作用およびリン酸化以下の例により、ｈＣＫＩεがヒトＰＥＲ２と相互作用してリン酸化すること
の証明に用いる実験材料および実験方法を示す。これらの結果を要約すると、ｈ
ＣＫＩεを２９３Ｔ細胞に同時にトランスフェクションすると、³²Ｐの取り込み
並びに分子量シフトでも分かるようにｈＰＥＲ２はリン酸化状態の著しい増加を
示す。さらにｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ１のように、ｈＣＫＩεはトランスフェ
クションされたｈＰＥＲ２と共に免疫沈降する。トランスフェクションされた細
胞をｈＣＫＩε阻害剤であるＣＫＩ−７で処理すると、ｈＰＥＲ１およびｈＰＥ
Ｒ２のリン酸化が減少する。パルス／チェイスの調査により、トランスフェクシ
ョンされたｈＣＫＩεによるｈＰＥＲ２のリン酸化の増加がｈＰＥＲ２を分解さ
せたことが明らかである。これらのデータには、ＣＫＩおよびヒトＰＥＲ１では
IQELSEQIHRLLLQPVHの４８６〜５０３アミノ酸、ヒトＰＥＲ２ではIQELTEQIHRLLL
QPVHの４６０〜４７７アミノ酸、および／またはおそらくヒトＰＥＲ３ではITEL
QEQIYKLLLQPVHの間でインビボでのｈＣＫＩεおよびヒトperiodタンパク質との
間の物理的会合並びにｈＰＥＲ１およびｈＰＥＲ２のリン酸化によるperiodの安
定性の調節が示されている。

【００７７】ｈＰＥＲ２に関する実験材料および実験方法実施例６プラスミドの構築、発現、およびタンパク質の精製ヒトperiod２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長は、Clonetech社
製ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからフォワードプライマーATCTAGATCTAGAATGAATG
GATACGCGGAATTTCCGおよびリバースプライマーTCTGCTCGAGTCAAGGGGGATCCATTTTCGT
CTTを用いたＰＣＲによりクローン化する。ＯＲＦは１２４６アミノ酸のタンパ
ク質をコードする。ＤＮＡをｐＹＧＦＰリビングカラーベクター（living color
vector）(Clonetech社）にサブクローン化して、ｈＰＥＲ２−Ｃ末端ＹＧＦＰ
タンパク質を作製する。細菌で発現させたヒスチジンタグ付ｈＣＫＩεを前記の
ように精製する。９０％以上の相同性を有する分子量約５４kDaのタンパク質が
精製された。

【００７８】実施例７２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションヒトPeriod１ＤＮＡの代わりにヒトPeriod２ＤＮＡを用いて、前記実験材料お
よび実験方法でヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。溶解物
および上澄みを前述のように回収して保存した。

【００７９】実施例８免疫沈降およびウエスタンブロット分析ｈＰＥＲ１溶解物の代わりにｈＰＥＲ２溶解物を用いて、前記実験材料および
実験方法で、溶解物は免疫沈降およびウエスタンブロット分析に使用する。その
結果を後記の表２に示す。２９３Ｔ細胞にｈＰＥＲ２およびｈＣＫＩεを同時ト
ランスフェクションした後、細胞をトランスフェクションの２４時間後に溶解し
、免疫沈降して溶解物を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次いでウエスタンブロ
ット分析をする。表２に示すように、ＨＡ−ｈＣＫＩεの免疫沈降、それに続く
ウエスタンブロット分析により、ｈＣＫＩεがｈＰＥＲ１と同様にｈＰＥＲ２と
相互作用することが明らかである。プラスは相互作用することを意味し、マイナ
スは相互作用しないことを意味する。

【００８０】実施例９ｈＣＫＩεはｈＰＥＲ２と会合してｈＰＥＲ２をリン酸化するＰＥＲ１のリン酸化の結果、そのタンパク質が不安定になり分解する。それ故
に、ｈＣＫＩεはＰＥＲ２をリン酸化するかどうか測定する目的で、２９３Ｔ細
胞にＣＫＩεおよびｈＰＥＲ２またはコントロールとしてのｈＰＥＲ１を同時に
トランスフェクションしてタンパク質をウエスタンブロット分析により視覚化し
た。ｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ２を同時にトランスフェクションした細胞では、
表２に示すように、タンパク質分子量において１つのシフトが観察され、それは
ｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ１で見られた結果と同様である。

【００８１】

【表２】

【００８２】移動性シフトがｈＰＥＲ２のリン酸化に依存するのかどうかを測定するため、
ｐ３２で標識実験を実施してｐ３２標識のｈＰＥＲ２への取り込みを検定した。
表３に示すように、ｈＰＥＲ２またはｈＰＥＲ１をＣＫＩεと同時にトランスフ
ェクションすると、両方のＰＥＲタンパク質へｐ３２が取り込まれる結果になっ
た。ｐ３２の取り込み量はｈＰＥＲ２よりもｈＰＥＲ１の方がより多いようであ
った。ｈＰＥＲ２に対するｈＰＥＲ１のこのリン酸化の違いは、ｈＰＥＲ２に対
してＣＫＩによるｈＰＥＲ１のリン酸化の増強した反応速度に起因している。他
の解釈は、ｈＰＥＲ１はｈＰＥＲ２よりも多数のＣＫＩリン酸化共通部位（ｈＰ
ＥＲ１で９個に対してｈＰＥＲ２では７個）を有するということである。

【００８３】

【表３】

【００８４】ｈＰＥＲ２のリン酸化がタンパク質を不安定にさせる：ｈＰＥＲ１のリン酸化
によりタンパク質が不安定になり分解するという結果になる。ｈＰＥＲ２はｈＣ
ＫＩεにより同様にリン酸化されるので、ｈＰＥＲ２タンパク質の安定性におけ
るリン酸化の影響を測定する目的で、ＨＥＫ２９３細胞にＰＥＲ２単独またはＰ
ＥＲ１単独のいずれかをコードするｃＤＮＡをトランスフェクションするか、ま
たはｈＣＫＩεおよびＰＥＲ２、またはｈＣＫＩεおよびＰＥＲ１の両方をコー
ドするｃＤＮＡを同時にトランスフェクションする。細胞を３５−Ｓメチオニン
でパルスし、次いで３２時間、表４に要約した時間に免疫沈降する。表４に記載
のように、ｈＰＥＲ２またはｈＰＥＲ１のシングルトランスフェクションは、ｈ
ＰＥＲ１またはｈＰＥＲ２のいずれかが内因性のキナーゼによりリン酸化されて
分解するという結果になる。各タンパク質の半減期はｈＰＥＲ１では約１４時間
でありｈＰＥＲ２では４時間である。けれども、ｈＰＥＲ１またはｈＰＥＲ２の
いずれかをｈＣＫＩεと共に同時トランスフェクションすると、両方のタンパク
質の過リン酸化という結果になる。さらに、この過リン酸化は約２〜４時間のタ
ンパク質半減期の変動ないし短縮を生じる。ｈＰＥＲ２はｈＰＥＲ１より低い程
度でリン酸化されるようであるけれども、それはｈＣＫＩεによるリン酸化後で
はもはやｈＰＥＲ１よりも安定ではないようである。

【００８５】

【表４】

【００８６】実施例１０ｈＣＫＩδおよびε阻害剤の検定以下のアッセイを用いて、ｈＰＥＲ１のリン酸化を変え、その結果、同時にト
ランスフェクションされた細胞のｈＰＥＲ１レベルを増加させる化合物の能力お
よびラットＰＥＲ１細胞内ｍＲＮＡ変動を変える化合物の能力について該化合物
を試験する。ｈＣＫＩε−ＰＥＲ１の同時トランスフェクション（一過性）検定
を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートで約８０％コンフルエントに
なるまで培養し、次にLipofectamine plus reagent（GibcoＢＲＬ）を用いてｈ
ＣＫＩεおよびＰＥＲ１またはＰＥＲ２を同時にトランスフェクションする。１
６時間後、トランスフェクション培地を除去し、それらの細胞に１、１０、また
は３０μMのＣＫＩ阻害剤および不活性の類似化合物を１６時間投与する。さら
に１６時間後、培地を除去し、細胞を２回ＰＢＳで洗浄し、溶解させ、遠心分離
し、上澄みを８〜１６％または８％トリスグリシンゲルに流す。ウエスタンブロ
ットをフラッグ−タグ付きｈＰＥＲ１またはＧＦＰ−タグの付いたｈＰＥＲ２で
実施する。ｈＣＫＩεの存在は、抗−ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロットによ
り各サンプルで検出される。

【００８７】図９に示すように、細胞にｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ１を同時にトランスフェ
クションし、増加する濃度のコントロール試験化合物（例えば、ｈＣＫＩεを阻
害しないもの）に曝しても、ｈＰＥＲ１のレベルには何の増加も観察されない。
しかし、ｈＣＫＩε阻害剤で処理した同時トランスフェクションされた細胞は、
投与量に依存したｈＰＥＲ１のレベルの相対的な増加を示す。このｈＰＥＲ１レ
ベルの増加は、ＣＫＩリン酸化活性の阻害およびｈＰＥＲ１リン酸化の相対的減
少それに続くタンパク質の安定性の増加による。ＣＫＩ阻害剤がＰＥＲ１タンパ
ク質の安定性および半減期を変える場合には、細胞のＰＥＲ１レベルの増加が概
日変動または細胞周期に何らかの効果を与えるということが論考できる。

【００８８】ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲ（Perkin Elmer Biosystems）を用いた定量的ＰＣ
ＲによりラットＰＥＲ１の変動を変えるＣＫＩ阻害剤の効果を試験するために、
ｒａｔ−１繊維芽細胞を５％ウシ胎児血清およびペニシリン−ストレプトマイシ
ン−グルタミンの混合物を補充したDulbecco's modified Eagle mediumで培養す
る。ＳＣＮ細胞を１０％ウシ胎児血清、ペニシリン−ストレプトマイシン−グル
タミン、および２％グルコースを補充したDulbecco's Minimum Eagle mediumで
培養する。本実験の３〜５日前に約５×１０⁵個の細胞を１０cmぺトリ皿に播種
する。プレートがコンフルエントになったらすぐに、それを時刻＝０と設定して
、富血清培地、即ち５０％ウマ血清含有血清に交換する。５０％ウマ血清中での
血清ショックの２時間後、この培地を無血清培地に置き換える。指示された時間
に、デイッシュをＰＢＳで洗って、全細胞ｍＲＮＡの抽出まで−８０℃で凍結保
存する。ｈＣＫＩε阻害剤またはコントロールを無血清培地が添加される時に添
加する。

【００８９】全ての細胞ｍＲＮＡをRNeasy MidiキットまたはRneasy 96キット（Qiagen）を
用いて抽出し、次いでDnase処理をする（Ambion DNA-free）。定量的ＰＣＲをリ
アルタイムTaq-Man technology（PE Biosystems）を用いて実施し［C.A. Heid e
t al., Genomes Res. 6, M (1996) 参照］、ABI PRISM 7700で分析する（T. Tak
umi et al., Genes Cells 4, 67: 1999参照)。ｒＰＥＲＩ用プライマーは以下の
通りである：フォワード5′-TCTGGTTAAGGCTGCTGACAAG-3′；リバース、5′-GTGT
AGCCCCAACCCTGTGA-3′、およびTaqMan、プローブ5′-TCCAAATCCCAGCTGAGCCCGA-3
′。ＲＮＡの内部コントロールとして、同じ条件でrActinの発現を調べる。ｒＰ
ＥＲ１対rActinの比を計算して標準化した。図１０に示すように、ＰＥＲ１のｍ
ＲＮＡ変動により示されたように、化合物なしで、または不活性なｈＣＫＩε低
分子類似物である試験化合物で処理した細胞は約２４時間の正常な概日周期を示
す。しかし、ＣＫＩ阻害剤である試験化合物で処理した細胞は、図１１の変化し
た日内振動の概日周期を示す。これらの細胞におけるＰＥＲ１のｍＲＮＡレベル
は、正常な２４時間周期の代わりに約１８〜２０時間の短縮したリズムを明らか
に示す。短縮された周期は、即ち、ＣＫＩのリン酸化の阻害が原因であり、ＰＥ
Ｒのリン酸化レベルが低いという結果になる。より少ないリン酸化を受けたＰＥ
Ｒは、ＰＥＲタンパク質の安定性の増加およびＰＥＲの細胞内レベルの増加をも
たらし、それは哺乳類の概日リズムを変える。

【００９０】全ての上記引用文献は、参照によりこの明細書に組み込まれる。上記実施例は
、本発明の特定の実施態様を限定するものではなく、単に説明のためだけのもの
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えｈＣＫＩεによるカゼイン、ＩκＢα、およびｈＰＥＲ１のインビトロ
のリン酸化を示す。

【図２】ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩεのウエスタンブロット分析（ＡおよびＢ）および
ｈＰＥＲ１のラムダホスファターゼ処理（Ｃ）を示す。

【図３】ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションしたｈＰＥＲ１のパルス−チェイス
標識を示す。

【図４】ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε間のタンパク質相互作用を示す。

【図５】ｈＣＫＩεのリン酸化部位のマッピングを示す。

【図６】 Period ｍＲＮＡ濃度を示す。

【図７】 Clockタンパク質経路を示す。

【図８】時間経過におけるPeriodタンパク質およびリン酸化のレベルを示す。

【図９】ＣＫＩε／ヒトPeriod１の同時トランスフェクションを示す。

【図１０】ヒトPeriod ｍＲＮＡレベルを示す。

【図１１】ヒトPeriod ｍＲＮＡレベルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジャンビン・ヤーオウアメリカ合衆国ニュージャージー州08889．ホワイトハウスステーション．デラウェアロード２ (72)発明者フェルナンド・カマーチョウアメリカ合衆国ニュージャージー州07083．ユニオン．ウェインテラス308 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 CA12 DA02 EA04 GA13 GA18 HA06 4B063 QA01 QA05 QQ06 QQ07 QQ08 QQ20 QQ79 QQ95 QR07 QR23 QR24 QR48 QR57 QR75 QR76 QR77 QS36

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 (１) ｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質、並
びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される一また
はそれ以上のヒトPeriodタンパク質からなるスクリーニング系に試験化合物を添
加すること、および (２) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定することからなる、一またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化
合物の能力を測定する方法。
【請求項２】該化合物がｈＣＫＩεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸
化を変えるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】該化合物がｈＣＫＩδによるヒトPeriodタンパク質のリン酸
化を促進するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】スクリーニング系が細胞系または無細胞系である、請求項１
に記載の方法。
【請求項５】スクリーニング系が無細胞系である、請求項４に記載の方法
。
【請求項６】部分精製または精製したヒトPeriodタンパク質、ｈＣＫＩδ
またはｈＣＫＩεを無細胞系で使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】ヒトPeriodタンパク質およびｈＣＫＩεが組換え体源から得
られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】スクリーニング系が細胞をベースとした系である、請求項４
に記載の方法。
【請求項９】細胞をベースとした系が原核細胞である、請求項８に記載の
方法。
【請求項１０】原核細胞が細菌細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】細胞をベースとした系が真核細胞である、請求項４に記載
の方法。
【請求項１２】真核細胞が酵母細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】酵母細胞が S. cerevisiaeである、請求項１２に記載の方
法。
【請求項１４】細胞をベースとした系が昆虫細胞である、請求項１１に記
載の方法。
【請求項１５】細胞をベースとした系が哺乳類細胞である、請求項１１に
記載の方法。
【請求項１６】哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】哺乳類細胞がリンパ球細胞、繊維芽細胞、腫瘍細胞、平滑
筋細胞、心筋細胞、胎芽腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、骨髄球細胞、グリア細胞
および星状膠細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】 (１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩε
タンパク質、並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選
択される二またはそれ以上の異なるｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング
系に添加すること、および (２) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定することからなる、ヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定す
る方法。
【請求項１９】該化合物がｈＣＫＩεによるヒトPeriodタンパク質のリン
酸化を変えるものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】該化合物がｈＣＫＩδによるヒトPeriodタンパク質のリン
酸化を変えるものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】スクリーニング系が無細胞系である、請求項１８に記載の
方法。
【請求項２２】無細胞系で部分精製または精製したヒトPeriodタンパク質
、ｈＣＫＩδまたはｈＣＫＩεを使用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】ヒトPeriodタンパク質、ｈＣＫＩδまたはｈＣＫＩεが組
換え体源から得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】スクリーニング系が細胞をベースとした系である、請求項
１８に記載の方法。
【請求項２５】細胞をベースとした系が原核細胞である、請求項２４に記
載の方法。
【請求項２６】原核細胞が細菌細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】細胞をベースとした系が真核細胞である、請求項２４に記
載の方法。
【請求項２８】真核細胞が酵母細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】酵母細胞が S. cerevisiaeである、請求項２８に記載の方
法。
【請求項３０】真核細胞が昆虫細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】真核細胞が哺乳類細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】哺乳類細胞がリンパ球細胞、繊維芽細胞、腫瘍細胞、平滑
筋細胞、心筋細胞、胎芽腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、骨髄球細胞、グリア細胞
および星状膠細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】 (１) ｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質、並
びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択されるｈＰＥ
Ｒタンパク質からなるスクリーニング系に試験化合物を添加すること、および (２) ｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質、並びにｈＰＥＲ１、
ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群から選択される一つのｈＰＥＲタンパク
質からなるスクリーニング系に試験化合物を添加すること、ただしここで（２）
で選択されたｈＰＥＲタンパク質は（１）で選択されたｈＰＥＲタンパク質では
ない； (３) （１）および（２）のヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定
すること；並びに (４) ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化を変える
上記試験化合物が選択的であるかどうかを調べる目的で、各ヒトPeriodタンパク
質について（３）で得られた結果を比較することからなる、ヒトPeriodタンパク質のリン酸化を選択的に変える試験化合物の能力
を測定する方法。
【請求項３５】該化合物がｈＣＫＩεによるヒトPeriodタンパク質のリン
酸化を変えるものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】該化合物がｈＣＫＩδによるヒトPeriodタンパク質のリン
酸化を促進するものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】スクリーニング系が細胞をベースとした系または無細胞系
である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】スクリーニング系が無細胞系である、請求項３７に記載の
方法。
【請求項３９】無細胞系で部分精製または精製したヒトPeriodタンパク質
、ｈＣＫＩδまたはｈＣＫＩεを使用するものである、請求項３８に記載の方法
。
【請求項４０】ヒトPeriodタンパク質およびｈＣＫＩεが組換え体源から
得られるものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】スクリーニング系が細胞をベースとした系である、請求項
３７に記載の方法。
【請求項４２】細胞をベースとした系が原核細胞である、請求項４１に記
載の方法。
【請求項４３】原核細胞が細菌細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】細胞をベースとした系が真核細胞である、請求項３７に記
載の方法。
【請求項４５】真核細胞が酵母細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】酵母細胞が S. cerevisiaeである、請求項４５に記載の方
法。
【請求項４７】細胞をベースとした系が昆虫細胞である、請求項３７に記
載の方法。
【請求項４８】細胞をベースとした系が哺乳類細胞である、請求項３７に
記載の方法。
【請求項４９】哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】哺乳類細胞がリンパ球細胞、繊維芽細胞、腫瘍細胞、平滑
筋細胞、心筋細胞、胎芽腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、骨髄球細胞、グリア細胞
、星状膠細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】 (１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩε
タンパク質、並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選
択される一つのｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、 (２) 試験化合物の添加後、ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、およ
び (３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系に
おけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較することからなる、ヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方
法。
【請求項５２】 (１) 試験化合物およびｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫ
Ｉεタンパク質を、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選
択される一つのｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、 (２) 試験化合物およびｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質の添
加後、ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および (３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量と、スクリーニング系
におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較することからなる、ヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方
法。
【請求項５３】 (１) ｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質を
、試験化合物並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群から選
択される一つのｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、 (２) ｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質の添加後、ヒトPeriod
タンパク質の量を測定すること、および (３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量と、スクリーニング系
におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較することからなる、ヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方
法。
【請求項５４】ヒトPeriodタンパク質がヒトPeriod１である、請求項１に
記載の方法。
【請求項５５】ヒトPeriodタンパク質がヒトPeriod２である、請求項１に
記載の方法。
【請求項５６】ヒトPeriodタンパク質がヒトPeriod３である、請求項１に
記載の方法。
【請求項５７】 (１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩε
タンパク質、並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選
択される一またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質からなるスクリーニング系に
添加すること、および (２) 試験化合物が存在しない場合の哺乳類の概日リズムを基準にして哺乳類
の概日リズムに与える効果を測定することからなる、哺乳類の概日リズムを変える試験化合物の能力を測定する方法。