NO330241B1 - Fremgangsmate for a identifisere forbindelser som endrer fosforylering av det humane klokkeproteinet hPERIODE1 (hPER1) - Google Patents
Fremgangsmate for a identifisere forbindelser som endrer fosforylering av det humane klokkeproteinet hPERIODE1 (hPER1) Download PDFInfo
- Publication number
- NO330241B1 NO330241B1 NO20015972A NO20015972A NO330241B1 NO 330241 B1 NO330241 B1 NO 330241B1 NO 20015972 A NO20015972 A NO 20015972A NO 20015972 A NO20015972 A NO 20015972A NO 330241 B1 NO330241 B1 NO 330241B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cell
- hckie
- protein
- hper1
- phosphorylation
- Prior art date
Links
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 title claims abstract description 83
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 101000882921 Homo sapiens Circadian locomoter output cycles protein kaput Proteins 0.000 title claims description 4
- 102000051667 human CLOCK Human genes 0.000 title claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 title description 23
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 126
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 111
- 101000579484 Homo sapiens Period circadian protein homolog 1 Proteins 0.000 claims description 110
- 102100028293 Period circadian protein homolog 1 Human genes 0.000 claims description 107
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 102
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 101
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 18
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 11
- 102000005403 Casein Kinases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010031425 Casein Kinases Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003887 myelocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 52
- 102000007001 Period Circadian Proteins Human genes 0.000 abstract description 26
- 108010047728 Period Circadian Proteins Proteins 0.000 abstract description 26
- 230000027288 circadian rhythm Effects 0.000 abstract description 19
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 8
- 101001073216 Homo sapiens Period circadian protein homolog 2 Proteins 0.000 description 64
- 102100035787 Period circadian protein homolog 2 Human genes 0.000 description 60
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 35
- 101000601274 Homo sapiens Period circadian protein homolog 3 Proteins 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 27
- 102100037630 Period circadian protein homolog 3 Human genes 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- OGKYMFFYOWUTKV-UHFFFAOYSA-N N-(2-aminoethyl)-5-chloroisoquinoline-8-sulfonamide Chemical compound C1=NC=C2C(S(=O)(=O)NCCN)=CC=C(Cl)C2=C1 OGKYMFFYOWUTKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 102100031065 Choline kinase alpha Human genes 0.000 description 18
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 16
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 15
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 12
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 12
- -1 hydrogen Chemical class 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 10
- 108010049812 Casein Kinase I Proteins 0.000 description 9
- 102000008122 Casein Kinase I Human genes 0.000 description 9
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 102100037398 Casein kinase I isoform epsilon Human genes 0.000 description 8
- 101710176553 Casein kinase I isoform epsilon Proteins 0.000 description 8
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 8
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 8
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 8
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 8
- 230000002060 circadian Effects 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 101001126582 Homo sapiens Post-GPI attachment to proteins factor 3 Proteins 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 210000000221 suprachiasmatic nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 6
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102000002131 PAS domains Human genes 0.000 description 4
- 108050009469 PAS domains Proteins 0.000 description 4
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 4
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 102000057681 human PER2 Human genes 0.000 description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 4
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000018745 NF-KappaB Inhibitor alpha Human genes 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 102000044565 human PER1 Human genes 0.000 description 3
- 102000050276 human PER3 Human genes 0.000 description 3
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 3
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 102100037211 Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100034476 CCA tRNA nucleotidyltransferase 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 101000831686 Drosophila melanogaster Protein cycle Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000740484 Homo sapiens Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000849001 Homo sapiens CCA tRNA nucleotidyltransferase 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101000640050 Homo sapiens Protein strawberry notch homolog 1 Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101150091206 Nfkbia gene Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008632 circadian clock Effects 0.000 description 2
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000027405 negative regulation of phosphorylation Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- WAMWSIDTKSNDCU-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-azaniumyl-2-cyclohexylacetate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1CCCCC1 WAMWSIDTKSNDCU-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- XJLSEXAGTJCILF-RXMQYKEDSA-N (R)-nipecotic acid zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCNC1 XJLSEXAGTJCILF-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2CNC(C(=O)O)CC2=C1 BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLLYLQLDYORLBB-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-n-methylthiophene-2-sulfonamide Chemical compound CNS(=O)(=O)C1=CC=C(Br)S1 JLLYLQLDYORLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100113633 Arabidopsis thaliana CKL9 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000008025 CLOCK Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010075228 CLOCK Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010047048 Casein Kinase Idelta Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108700013908 Drosophila PER Proteins 0.000 description 1
- 108700029558 Drosophila dco Proteins 0.000 description 1
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101710199605 Endoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 101150077699 HRR25 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150074181 PER2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229940122907 Phosphatase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101710113029 Serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 101000965899 Simian virus 40 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000037037 animal physiology Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006557 circadian rhythm pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000032669 eclosion Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000006742 locomotor activity Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000004458 methylaminocarbonyl group Chemical group [H]N(C(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N methylazanide Chemical compound [NH-]C MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000006187 phenyl benzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000612 phthaloyl group Chemical group C(C=1C(C(=O)*)=CC=CC1)(=O)* 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000030716 positive regulation of phosphorylation Effects 0.000 description 1
- XUWVIABDWDTJRZ-UHFFFAOYSA-N propan-2-ylazanide Chemical compound CC(C)[NH-] XUWVIABDWDTJRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000021907 regulation of circadian rhythm Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 1
- 230000007958 sleep Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Electrophonic Musical Instruments (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
OPPFINNELSENS OMRÅDE
Denne oppfinnelse angår fremgangsmåter for å identifisere testforbindelser som endrer døgnrytmen hos pattedyr, og mer spesielt, som endrer evnen til kasein kinase I e til å fosforylere de humane klokkeproteiner, human Periode 1.
OPPFINNELSENS BAKGRUNN
Døgnrytmer dannet ved endogene, biologiske pacemakere er tilstede i et antall av ulike organismer inkludert menneske, sopp, insekter og bakterier (Dunlap, J. C. (1999) Celle, 96, 271-290; Hastings, J. W., et al., (1991) in Neural and Integrative Animal Physiologi, red. Prosser, C. L. (New York: Wiley-Liss), s.435-546; Allada, R. et al, (1998) Cell, 93, 791-804; Kondo, T., et al, (1994) Science, 266, 1233-1236; Crosthwaite, S. K., et al., (1997) Science, 276, 763-769). Døgnklokke er viktig for opprettholdelse av biologiske rytmer. De er selvopprettholdende og konstante, selv under betingelser som totalt mørke, men kan forstyrres ved miljøsignaler som lys og temperaturendringer. Endogene klokker kontrollerer aktivitetsmønsteret, inkludert daglig variasjon i adferd, matinntak og søvn/våkensyklus så vel som fysiologiske endringer som hormonsekresjon og variasjoner i kroppstemperatur (Hastings, M., (1997) Trends Neurosci. 20, 459-464; Kondo, T. et al, (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, F90, 5672-5676; Reppert, S. M, & Weaver, D. R. (1997) Cell, 89, 487-490).
Genetiske og molekylære studier av Drosophila har muliggjort utredning av noen gener involvert i døgnrytmen. Av disse studier har en funnet en reaksjonsvei som er tilnærmet autoregulert og omfatter en transkripsjons/translasjonsbasert negativ feedback-sløyfe (Dunlap, J. C. (1999) Celle, 96, 271-290; Dunlap, J. C. (1996) Annu. Rev. Genet. 30, 579-601; Hall, J. C. (1996) Neuron, 17, 799-802). To kritiske komponenter av den sentrale klokke er molekylene betegnet periode eller PER og tidsløs (timeless) eller
TIM.
per-locuset, først oppdaget i Drosophila, er et nødvendig element for kontroll av døgnrytmer ved voksen "eclosion" adferd og lokomotorisk aktivitet (Konopka, R. J., & Benzer, S. (1971) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 68, 2112-2116). Missense-mutasjonene i PER kan enten forkorte ( per^) eller forlenge ( per1) døgnrytmeperiodene, mens nonsense-mutasjoner ( per0) forårsaker rytmeforstyrrelser i deres adferd (Hall, J. C.
(1995) Trends Neurosci. 18,230-240). I den suprachiasmatiske kjerne (SCN) hos pattedyr er tre PER-homologer,peri, per2 og per3 identifisert. Proteinproduktene til disse pattedyrgener har flere homologiregioner med hverandre (Zylka, M. J. et al,
(1998) Neuron 20, 1103-1110; Albrecht, U., et al, (1997) Cell 91,1055-1064). Per-mRNA og proteinnivåene oscillerer under den daglige syklus, men bare PER1 og PER2 oscillerer som respons på lys (Zylka, M. J. et al., (1998) Neuron 20, 1103-1110; Shearman, L. P., et al, (1997) Neuron 19, 1261-1296).
Alle PER-proteiner inneholder et protein/proteininteragerende område kalt PAS-domenet som er nødvendig for dimerdannelse (Zylka, M. J. et al, (1998) Neuron 20, 1103-1110). Et annet PAS-inneholdende protein, TIM ble isolert ved en gjær to-hybrids genetisk screening ved PER som "lokkemat" (Gekakis, N., et al., (1995) Science 270, 811-815). Når PER-proteinnivåene øker, danner PER heterodimerer med TIM. TIM/PER-heterodimerdannelse er nødvendig for PER-regulering fordi mutasjoner i tim forårsaker tap av døgnrytme, som følges av et tap av />er-mRNA-svingning ,og PERs manglende evne til å gjennomgå kjernetranslokasjon (Sangoram, A. M., et al., (1998) Neuron 21, 1101-1113; Zylka, M. J., et al, (1998) Neuron 21, 1115-1122).
Flere ytterligere molekylære komponenter av døgnrytme inkludert CLOCK og BMAL/MOP3 har nylig blitt oppdaget ved genetisk screening og biokjemisk karakterisering (Gekakis, N., et al, (1998) Science 280, 1564-1569; King, D. P., et al,
(1997) Cell 89, 641-653,Allada R., et al, (1998) Cell 93, 791-804).
Etterfølgende studier belyste hvordan PER reguleres ved transkripsjonsnivåer. CLOCK og BMAL/MOP3, begge inneholder basalheliks-sløyfeheliks-domene, et PAS-domene og danner heterodimerer med hverandre. Når PER er transkribert, translatert og akkumulert forflyttes PER til kjernen og binder til CLOCK gjennom deres felles PAS-domener og nedregulerer sin egen transkripsjon, ved å danne en negativ feedbacksløyfe (Allada R., et al, (1998) Cell 93, 791-804; Darlington, T. K., et al, (1998) Science 280, 1599-1603; Hao, H., et al, (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 3687-3693; Jin, X., et al, (1999) Cell ¥96, 57-68).
I tillegg modifiseres og reguleres PER ved post-translasjonsnivået. Både PER og TIM synes å gjennomgå fosforylering som er fremkalt ved døgnsvingninger (Edery, I., et al,
(1994) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 91, 2260-2264; Lee, C, et al, (1998) Neuron 21, 857-867). A Drosophila- kinase betegnet dobbel tid (DBT) ble nylig klonet (Price, J. L., et al, (1998) Cell 94, 83-95, Kloss., et al, (1998) Celle 94,97-107). Mutasjoner i DBT forårsaket enten forkortede eller forlengede perioder av adferdsrytme. En P-element innføyelsesmutasjon i DBT opphevet døgnvariasjonene i PER i larvehjerne, hvilket indikerer at DBT er en essensiell komponent i Drosophila- ldolsken. PER akkumulerer i disse mutanter til høye nivåer og er hypofosforylert. DBT er ikke vist å direkte fosforylere PER. CKIe er en nær beslektet homolog av DBT hos pattedyr (Kloss., et al.,
(1998) Celle 94, 97-107). CKIe og DBT er 86 % homologe på aminosyrenivå i kinasedomenet. hCKIe, først identifisert av Fish et al, er en av flere CKI-isoformer (a, p, y, 8) som har serin/treonin protein kinaseaktivitet (Fish, K. J., et al, (1995) J. Biol. Chem. 270,14875-14883; Rowles, J., et al, (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88, 9548-9552). CKI er involvert i regulering av cellulær DNA-metabolisme. Saccharomyces- mutanter med et defekt HRR25-gen, en homolog til pattedyr CKI, viser sensitivitet til dobbelt-trådete DNA-brudd (Hoekstra, M. F., et al., (1991) Science 253, 1031-1034). Flere in vitro substrater for hCKI er identifisert, som inkluderer RNA-polymerasene I og II, p53, IkBa og apevirus 40 stort T-antigen. Imidlertid finnes svært få bevis som korrelerer hCKI-fosforylering til endringer i substratfunksjon, og fram til nå, er ingen klokkegener vist å være hCKI8- og e-substrater. Sugano, S.et al., (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 95, 11020-11025, beskriver at CK2 interagerer med CCA1 og fosforylerer denne, en slik interaksjon og fosforylering kan modulere aktiviteten til CCA1. Modulering av CCAls aktivitet er nødvendig i reguleringen av cirkadisk rytme i Arabidopsis thaliana.
Døgnrytmer kontrolleres av sekvensiell fosforylering av, og endringer av proteinnivåene til, visse nøkkelproteiner i reaksjonsveien for cirkadisk rytme. Periode (PER), en sentral komponent i reaksjonsveien for den cirkadiske klokke, gjennomgår daglige oscillasjoner i overflods- og fosforyleringstilstand. PER-gener er identifisert i Drosophila- PER, betegnet dPER, musePER, betegnet mPER og humant PER, betegnet hPER. I Drosophila er det bare en PER som har mest homologi med PER 1-proteinene. Både mennesker og mus har tre PER, betegnet PER1, 2 og 3.
KORT OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for å identifisere forbindelser som endrer fosforylering av det humane klokkeproteinet hPERIODEl (hPERl),
kjennetegnet ved at den omfatter
(1) plassering av forbindelsen som skal screenes i et screeningsystem inneholdende humant kasein kinase hCKIe-protein og hPERl -protein, og (2) måle graden av fosforylering av hPERl-protein eller måle graden av degradering av hPERl-protein.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1. In vitro fosforylering av kasein, IkBa, og hPERl ved rekombinant hCKIe.
Rensing av rekombinant kaseinkinase og kinaseanalysebetingelser er beskrevet i materialer og metoder nedenfor. (A) hCKIe (felt 1 til 3), hCKIe-K38Re (feltene 4 -6), eller bufferkontroll (feltene 7 og 8) er inkubert enten alene (feltene 1 og 4), med kasein (feltene 2 og 5), eller IkBa (feltene 3 og 6), og kinaseanalysene utføres som beskrevet i materiale og metoder. Molekylvektsmarkører er antydet til venstre. (B) lysater fra 293T-celler transfektert med vektor (feltene 1,4 og 8), luciferase (feltene 2,5 og 9), eller hPERl (feltene 3,6 og 10) tilberedes og immunpresipiteres ved M2-antiflag-mAb og kinaseanalyser utføres med hCKIe (feltene 1 til 6), hCKIe-K36Re (felt 7) eller bufferkontroll (feltene 8-10). Immunpresipitatene varmeinaktiveres ved 65 °C i 30 minutter før kinaseanalysen (feltene 4-6). Prøvene oppløses med 12 % SDS-PAGE. Gelen farges med Coomassie R-250, tørkes og autoradiografi utføres.
Figur 2. (A og B) Western blot analyse av hPERl og hCKIe.
293T-celler transfekteres med hPERl og vektor (felt 1), hPERl og hCKIe (felt 2), hPERl og hCKIe-K38R (felt 3), vektor og hCKIe (felt 4) eller vektor hCKIe-K38R (felt 5). Cellene høstes 24 timer etter transfeksjonen og lysater tilberedes som beskrevet i materialer og metoder. 40 ug av totalt 293T-lysat settes på en 3-8 % gradient NU-PAGE. Proteiner overføres til PVDF-membraner og western blot utføres med M2-anti-Flag-mAb (1:1000) eller anti-hCKIe-mAb (1:750). (C) Lambda fosfatase behandling av hPERl. 293t-celler transfekteres med hPERl og vektor (felt 1 og 4), hPERl og hCKIe (felt 2 og 5), eller hPERl og hCKIe-K38R (feltene 3 og 6) og merket med [<35>S]metionin (250 uCi/ml). Lysatet immunpresipiteres med M2-anti-Flag-mAb og behandles deretter enten med rekombinant lambda fosfatase (feltene 4,5 og 6) eller kontrollbehandlet (feltene 1,2 og 3).
Figur 3. "Puls-chase"-merking av hPERl kotransfektert med hCKIe.
293T-celler kotransfekteres med enten hPERl og vektor (panel A) eller hPERl og hCKIe (panel B). Tre timer etter transfeksjon pulsmerkes 293T-celler med [<35>S]metionin og -systein (1000 uCi/ml) i 30 minutter og fordrives (chase) for tidsperioden antydet på toppen av hver gel. Celler lyseres og immunpresipiteres med M2-ant-Flag-mAb og hPERl oppløses på 8 % SDS-PAGE. Molekylvektsmarkører er
antydet til venstre. (C) Stolpediagrammet representerer et fosfo-imaging scan av arealet rundt og inkluderer hPERl-båndet fra hvert felt. Stolpene (2-30 timer) baseres på prosentandelen av totaltellinger pr. minutt (cpm) sammenliknet med tellinger ved tidspunkt 0. Fylte stolper antyder hPERl kotransfektert med vektor. Skråstripede stolper antyder hPERl kotransfektert med hCKIe.
Figur 4. Proteininteraksjon mellom hPERl og hCKIe. (A, B, C og D)
293T-celler transfekteres med vektor og hCKIe (felt 1), vektor og hPERl (felt 2), og hCKIe og hPERl (felt 3). Cellene høstes 24 timer etter transfeksjon og lysater tilberedes. Lysatene immunpresipiteres med M2-anti-Flag-mAb (panel A og C), HA mAb (panel B) eller med anti-hCKIe-mAb (panel D), og western blottes med anti-HA-mAb (panel A), M2-anti-Flag-mAb (panel B og D) eller anti-hCKIe-mAb (panel C). I felt 4 utføres western blot analysen på urensede lysater før immunpresipitering med det antydede mAb. Alle proteiner oppløses på en 10 % SDS-PAGE.
Figur 5. Kartlegging av hCKIe-fosforyleringsseter.
(A) Skjematisk presentasjon av de rekombinante, avkortede hPERl-mutanter. Avkortede mutanter konstrueres som beskrevet i materialer og metoder nedenfor. ORF
antyder den fullstendig åpne leseramme til hPERl, aminosyrerestene 1 til 1289. Restriksjonsseter anvendt for dannelse av NI, N2, N3, N4 ogC5 er antydet i tabell 1. Åpne stolper representerer mutanter som ikke viste molekylmasseskift. Fylte stolper representerer mutanter som viste molekylmasseskift. Skraverte områder av ORF, N2, N3 og N4 representerer området av antatt fosforylering av hPERl av hCKIe. (B) Western blot-analyse av kotransfekterte hPERl-avkortede mutanter fra 293T-lysater. 293T-celler kotransfekteres med hPERl og vektor (felt 1), hPERl og hCKIe (felt 2) eller hPERl og hCKIe-K38R (felt 3) og hPERl analyseres ved western blot analyse ved anvendelse av M2-anti-Flag-mAb. Molekylvektsmarkører antydes til venstre. Piler antyder posisjon for migrering av hvert avkortet, mutant protein. hPERl ORF og mutantene NI og N2 oppløses rutinemessig på en 10 % SDS-PAGE, mens hPERl-mutantene N3, N4, Cl, C2, C5 og C6 oppløses rutinemessig på en 12 % SDS-PAGE.
FIGUR 6 Periode-mRNA-konsentrasjon
Tiden angis i timer på den nedre akse; de andre aksene er aktivitet, kroppstemperatur og Per-mRNA-nivåer over tid. Per-mRNA-nivåene varierer over en 24 timers periode, og er omvendt korrelert med periodelengden i Drosophila. Tilsvarende variasjoner observeres i normale Per-mus; imidlertid har Per-knockoutmus en endret cirkadisk rytme.
FIGUR 7 KLOKKEPROTEIN-RE AKS JON SVEI
Dette er en skjematisk fremstilling av klokke-proteinreaksjonsveien. hCKI8 og/eller -e fosforylerer periode, som betegnet med PO4, hvilket resulterer i dens degradering. Klokke og BMal interagerer i PAS-domenet, og initierer transkripsjon av periode-mRNA, hvilket resulterer i økte nivåer av periodeprotein.
FIGUR 8 PERIODEPROTEIN OG FOSFATNIVÅER OVER TID
Bunnaksen er tid i timer over en 24 timers periode; den andre aksen er periodeprotein (antydet i hvitt) og fosforyleirngsnivåer (antydet i farger). På begynnelsen av den cirkadiske syklus er periodeprotein-nivået lavt, og relativt ufosforylert. Etter hvert som periodeprotein-nivåene øker til maksimum rundt klokken 20, øker også den relative fosforylering av periodeproteinet, og fortsetter idet periodeprotein-nivåene synker.
FIGUR 9 CKIe/HUMAN PERIODE 1 KOTRANSFEKSJON
Det øvre, høyre panelviser hPERl-fosforylering. Den første kolonne viser 1 uM av testforbindelsen; den andre kolonne viser 10 um av testforbindelsen; den tredje kolonne viser 30 um av testforbindelsen; den fjerde kolonne viser Per alene; den femte og siste kolonne viser Per og hCKIe. Det øvre, høyre panel viser en kontrolltestforbindelse. Det midterste panel viser at CKIe inhiberer testforbindelsen S943166 og det nedre, høyre panel viser at CKIe inhiberer testforbindelsen W0236. Disse resultater viser at inhibisjon av Per-fosforylering resulterer i øket proteinstabilitet og -nivå.
FIGUR 10 HUMANE PERIODEmRNA-NIVÅER
Den øvre figur gir en billedlig presentasjon av data vist i den nedre figur. Den nedre akse er tid i timer; den andre akse er relative endogene mRNA-nivåer av hPERl enten rotte 1-fibroblast eller rotte SCN (suprachiasmatisk kjerne) bestemt ved RT-PCR i virkelig tid. To testforbindelser er representert: Testforbindelsen representert ved bokser er "C" som er tilsatt cellene ved 10 uM, den andre er representert ved triangler er "F"
(Fluoxitin) som er tilsatt cellene ved 10 uM. Den cirkadiske rytme til dyrkede celler reduseres over tid, dvs. amplituden på responsen reduseres over tid. Disse resultater
viser at kontrollforbindelsen ikke endrer CKI-aktiviteten og heller ikke endrer den cirkadiske rytme til celler.
FIGUR 11 HUMANE PERIODE-mRNA-NIVÅER
Den øvre grafen viser en billedlig presentasjon av dataene vist i den nedre grafen. Den nedre aksen er tid i timer; den andre aksen er de relative mRNA-nivåer av hPERl rotte 1-fibroblaster eller rotte SCN-celler bestemt ved RT-PCR i virkelig tid. To testforbindelser er representert: Testforbindelsen representert ved bokser er "C" som er tilsatt cellene ved 10 uM, den andre er representert ved triangler er S943166 som er tilsatt cellene ved 10 uM. Disse resultater viser at testforbindelsen S943166 endrer den cirkadiske rytme til cellene ved å forskyve mRNA-oscilleringen til hPERl, og forkorter den cirkadiske rytme til ca. 20 timer.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot fremgangsmåter for å identifisere testforbindelser som endrer fosforyleringen av hPERl, mer spesielt, rettet mot fremgangsmåter for en testforbindelses evne til å endre hCKI8- og/eller -e-fosforylering av et humant periodeprotein, fortrinnsvis human Periode 1. Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot en fremgangsmåte for en testforbindelses evne til selektivt å endre fosforylering.
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å bestemme en testforbindelses evne til å endre hCKIe- og/eller -e-fosforylering av hPERl i en celle. Foreliggende oppfinnelse kan også benyttes for å bestemme en testforbindelses evne til å endre stabiliteten avhPERl, hPER2 og/eller hPER3, og/eller øke proteindegradering av hPERl, hPER2 og/eller hPER3.
Betegnelsen "aminosyre" henviser til betydningen inkludert begge optiske isomerer, dvs. en L-isomer og en D-isomer av naturlig forekommende og ikke-naturlige forekommende aminosyrer. Betegnelsen "peptid" henviser følgelig til betydningen inkludert ikke bare peptider bestående av L-aminosyrer utelukkende, men også peptider omfattende delvis eller utelukkende D-aminosyrer.
Videre inkluderer "aminosyre" bare tjue naturlig forekommende aminosyrerester som utgjør naturlige proteiner, så vel som andre alfa-aminosyrer, beta-, gamma- og delta-aminosyrer, og ikke-naturlig forekommende aminosyrer og liknende. Følgelig kan proteinene human periode og human hCKI5 og/eller -e modifiseres med en eller flere aminosyrerester konservative aminosyrer, for eksempel en med en tilsvarende ladning, polaritet eller annen egenskap som en av alfa-aminosyrerestene som utgjør naturlige proteiner, så vel som andre alfa-aminosyrerester, og beta-, gamma- og deltaaminosyrerester, ikke-naturlige aminosyrerester og liknende. Eksempler på egnede beta-, gamma- og delta -aminosyrer inkluderer beta-alanin, garnrna-aminosrnørsyre og ornitin. Eksempler på andre aminosyrerester enn de som utgjør naturlige proteiner eller ikke-naturlige aminosyrer inkluderer 3,4-dihydroksyfenylalanin, fenylglysin, sykloheksylglysin, l,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-karboksylsyre eller nipecotinsyre.
Betegnelsene "hPERl", "hPER2", "hPER3", "hCKtø" og "hCKIe" inkluderer full-lengde-proteiner av humant Periode 1, humant Periode2, humant Periode3, humant kasein kinase I 5 og humant kasein kinase I e, alleler og derivater av hPERl, hPER2 og hPER3 og hCKI5 og/eller -e-proteiner. Derivater inkluderer variasjoner fra naturlig forekommende former av disse proteiner med en eller flere ulike aminosyrer, avkortede proteiner og fusjonsproteiner av full-lengde eller avkortet protein inneholdende enten 3' eller 5'-"tags", så vel som naturlig forekommende eller ikke naturlig forekommende mutante sekvenser gitt i litteraturen referert ovenfor og tilført offentlige databaser, slik som genbank. Derivater av disse proteiner inkluderer proteiner som inneholder en leder-, epitop- eller annen proteinsekvens, slik som "Myc-tagged", "his-tagged", eller en "Flag-epitoptag"-sekvens. Human Periode 1-sekvens er tilgjengelig under Gene Bank Accession AB002107, NID g2506044, inngitt av H. Tei on March 24,1997. Human Periode 1-sekvens ble også publisert i Tei, H., et al., Nature 389: 512-516 (1997). Human Periode2-sekvensen er tilgjengelig under Gene Bank Accession NM003894, NID g4505710, inngitt av T. Nagase et al. Human Periode2-sekvensen ble også publisert i Nagase, T., et al, DNA Res. 4(2): 141-150 (1997) og i Shearman, L. P., et al, Neuron 19(6): 1261-1269 (1997). Human Periode3-genomsekvensen er tilgjengelig under Gene Bank Accession Z98884. Human kasein kinase 15-sekvensen er tilgjengelig under Gene Bank Accession U29171. Human kasein kinase I-delta ble også publisert i Kusda, J., et al, Genomics 32: 140-143
(1996). Human kasein kinase I e-sekvensen er tilgjengelig under Human kasein kinase I-epsilon ble også publisert i Fish, K. J., et al, J. Biol. Chem. 270: 14875-14883 (1995). Den c-MYC-merkede CKI 5 var en gave fra dr. David Virshup.
Betegnelsen "base sekvens" henviser til RNA-sekvenser så vel som DNA-sekvenser som koder for hPERl, hPER2, hPER3 eller hCKIe, inkludert derivater av disse.
Proteinene "hCKI5" og "hCKIe" er et protein eller et derivat med hovedsakelig tilsvarende fosforyleringsaktivitet mot et Per-protein som beskrevet her i dokumentet. Proteinene hCKI5 og/eller hCKIe er proteiner med hovedsakelig tilsvarende aktivitet som naturlig forekommende hCKI8 og/eller -e, alleler og derivater av disse. hCKK og/eller -e inkluderer andre pattedyr kasein kinase I-proteiner som opprettholder sin kinaseaktivitet med hensyn til hPERl, hPER2 og/eller hPER3, eller er modifisert på en slik måte at dens evne til å fosforylere hPERl, hPER2 og/eller hPER3 ikke er vesentlig endret. Humane former av hCKI8 og/eller -e er foretrukket. Imidlertid vil anvendelse av andre pattedyrformer av hCKI5 og/eller -e være akseptable fordi for eksempel human hCKI5 og rotte-hCKI8 er 97 % homologe, og deres sekvenser i kinasedomenet (284 aminosyrerester) var fullstendig identiske. Modifiserte proteiner inkluderer avkortede former av hCKI5 og/eller - e, derivater av hCKI8 og/eller -e inneholdende aminosyresubstitusjoner, delesjoner, addisjoner og liknende, som opprettholder evnen til å fosforylere hPERl, hPER2 og/eller hPER3. Derivater av kasein kinase I inkluderer proteiner som inneholder en leder-, epitop- eller annen proteinsekvens, slik som en "Myc-tagged", "his-tagged" eller en "Flag-epitop tag"-sekvens og har hPERl-fosforyleringsaktivitet. Slike derivater letter rensing og muliggjør festing til sefarosekuler og tillater enkel påvisning.
Derivater av hPERl, hPER2 og/eller hPER3 inkluderer proteiner inneholdende en leder-, epitop- eller annen proteinsekvens, slik som et "Myc-tagged", "his-tagged" eller en "Flag-epitop tag"-sekvens, som opprettholder evnen til å bli fosforylert av hCKIe. Slike derivater letter rensing og muliggjør festing til sefarosekuler og tillater enkel påvisning. Foretrukne humane periodeproteiner omfatter proteiner med eller flere hCKIe-konsensus fosforyleringssekvenser 'DXXS', der D er en glutaminsyre, X er en hvilken som helst aminosyrerest og S er en serinrest. Fosforylering oppstår ved seriner tilpasset S-Xn-S-motivet, der n er 1,2, 3 eller 4 og kan resultere i hyperfosforylering. Fosforyleringsfordeler for kasein kinase I erkarakteriserti Flotow, H. og Roach, P. J., L Biol. Chem. 266(6): 3724-3727 (1991). Et humant periodeprotein er i stand til hyperfosforylering. Fosforyleringsseter i hPERl oppstår mellom aminosyrene 743 og
889 av hPERl, fortrinnsvis mellom aminosyrene 800 og 820 av hPERl og helst mellom aminosyrene 808 og 815 av hPERl, eller alternativt for ødeleggelse av det antatte CKI-interaksjonsdomenet for humant PER1 ved IQELSEQIHRLLLQPVH, ved aminosyrene 486-503, for humant PER2 ved IQELTEQIHRLLLQPVH, aminosyrene 460-477, og/eller for humant PER3 ved ITELQEQIYKLLLQPVH. I en utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter foretrukne derivater av hPERl, hPER2 og/eller hPER3 et fosforyleringssete utvalgt fra gruppen bestående av hPERl aminosyrene 743 og 889, eller for ødeleggelse av det antatte CKI-interaksjonsdomenet mot hPERl ved aminosyrene
486-503 (IQELSEQIHRLLLQPVH), for humant PER2 ved aminosyrene 460-477 (IQELTEQIHRLLLQPVH), og for humant PER3 ved ITELQEQIYKLLLQPVH. Betegnelsen "protein med proteinkinase aktivitet" henviser til et protein som er evaluert av fagperson innen teknikken til å ha proteinkinase aktivitet, for eksempel et protein som er i stand til å fosforylere en eller flere humane periodeproteiner i et screeningsystem.
Screeningsystemet kan være det samme, eller hovedsakelig lik, betingelsene beskrevet i et hvilket som helst av eksemplene nedenfor. Imidlertid er fremgangsmåter for opprettelse av fosforylering, degradering eller cirkadiske rytmeanalyser vel kjent innen teknikken og foreliggende oppfinnelse har ikke til hensikt å bli begrenset til spesielle utførelsesformer angitt her i dokumentet.
Proteiner som skal anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse kan oppnås for eksempel fra humant vev, rekombinant uttrykt ved standard rekombinante teknikker, og/eller eventuelt kjemisk modifiserte. Rekombinant ekspresjon av proteiner er foretrukket.
"Derivater" av proteiner inkluderer proteiner der en aminogruppe ved en aminoterminal ende (N-terminal) eller hele eller en del av aminogruppen i sidekjeder av aminosyrer, og/eller en karboksylgruppe ved en karboksylterminal ende (C-terminal) eller hele eller deler av karboksylgruppen i sidekjeder av aminosyrer, og/eller funksjonelle grupper forskjellige fra aminogruppene og karboksylgruppene i sidekjedene av aminosyrene, slik som hydrogen, en tiolgruppe eller en aminogruppe er modifisert ved andre hensiktsmessige substituenter. Modifiseringen ved andre hensiktsmessige substituenter utføres for eksempel i den hensikt å beskytte funksjonelle grupper i proteinet, forbedre sikkerhet eller lette analysering, slik som tilsetting av funksjonelle grupper for å feste et protein til en sefarosekule. Et eksempel er tilsetting av en "Flag-epitoptag"-sekvens tilsatt primerne ved den 5' ende eller "his-tagged".
Derivatene av proteinene inkluderer:
(1) proteiner der en eller flere hydrogenatomer i aminogruppen ved den aminoterminale ende (N-terminal) eller en del eller hele aminogruppene i sidekjedene til aminosyrene er erstattet av substituerte eller usubstituerte alkylgrupper (som kan være rettkjedet eller forgrenet eller syklisk), slik som en metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, isobutyl-, butyl-, t-butyl-, syklopropyl-, sykloheksyl- eller en benzylgruppe, substituert eller usubstituert acylgruppe slik som en formyl-, acetyl-, caproyl-, sykloheksylkarbonyl-, benzoyl-, ftaloyl-, tosylgruppe, en nicotinoylgruppe eller en piperidinkarbonylgruppe, beskyttende uretan-typegrupper, slik som a p-nitrobenzyloksykarbonylgruppe, en p-metoksybenzyloksykarbonylgruppe, a p-bifenylisopropyloksykarbonylgruppe eller en t- butoksykarbonylgruppe eller urea-type substituenter, slik som em metylaminokarbonylgruppe, en fenylkarbonylgruppe eller en sykloheksylaminokarbonylgruppe; (2) proteiner der karboksylgruppene ved den karboksylterminale ende (C-terminal) eller en del eller hele sidekjeden til aminosyrene er foresteret (for eksempel hydrogenatomene erstattet med metyl, etyl, isopropyl, sykloheksyl, fenyl benzyl, t-butyl eller 4-picolyl), eller amidert (for eksempel usubstituerte amider eller Ci-C6-alkylamid, slik som et metylamid, et etylamid eller et isopropylamid dannes); eller (3) proteiner der en del eller alle de funksjonelle grupper, forskjellige fra aminogruppene og karboksylgruppene i sidekjedene til aminosyrene, slik som hydrogen , en tiolgruppe eller en aminogruppe er erstattet av substituentene beskrevet i (1) eller en tritylgruppe.
Betegnelsen "endre" henviser til en testforbindelses evne til å inhibere eller øke fosforylering av hPERl, hPER2 og/eller hPER3 ved hCKI8 og/eller -e i forhold til fosforyleringen i fravær av denne testforbindelse. Alternativt betegner "endre" også en testforbindelses evne til å inhibere eller øke fosforyleringen av hPERl, hPER2 og/eller hPER3 ved hCKI8 og/eller -e i forhold til fosforyleringen av en ulik forbindelse, slik som en standard, det er foretrukket at en testforbindelses evne til å inhibere eller øke fosforylering av hPERl, hPER2 og/eller hPER3 bestemmes med hensyn til en naturlig forekommende form av hCKI5 og/eller -e-protein.
Betegnelsen "screeningsystem" henviser til et sett betingelser egnet til å tillate fosforylering av hPERl, hPER2 og/eller hPER3 ved hCKI5 og/eller -e. Et screeningsystem inneholder vanligvis enkel fosfatkilde. En foretrukket fosfatkilde er en klar ATP-kilde. Screeningsystemet kan være cellebasert eller in vitro. Cellebaserte screeningsystemer inkluderer anvendelse av celler som uttrykker en hvilken som helst, eller enhver av hPERl, hPER2 og/eller hPER3 og/eller hCKI5 og/eller -e. En fremgangsmåte for screening kan være en celle eller et cellefritt system. Egnede cellesystemer inkluderer gjærceller slik som S. cerevisia, bakterieceller slik som E. coil, insektceller slik som de anvendt i baculovirus ekspresjonssystemer, nematodeceller, pattedyrceller slik som COS-celler, lymfocytter, fibroblaster (3Y1-celler, NIH/3T3-celler, rotte 1-celler, Balb/3T3-celler, osv.), humane embryonale nyreceller, slik som 293T-celler, CHO-celler, blodceller, tumorceller, glatte muskelceller, hjertemuskelceller, hjerneceller. Foretrukne cellesystemer er suprachiasmatiske nukleus celler, nerveceller, melocytter, gliacytter og astrocytter. I et cellebasert system, dersom cellesystemet ikke uttrykker det humane periodeprotein og/eller hCKIe, da må cellene transfekteres eller transformeres for å uttrykke en eller begge human periodeprotein og/eller hCKIe. Alternativt kan et cellefritt system anvendes. Delvis renset eller renset hPERl, hPER2 og/eller hPER3, og hCKI8 og/eller -e kan skaffes fra rekombinante kilder som uttrykker henholdsvis hPERl, hPER2 og/eller hPER3, og hCKKog/eller -e, eller hvorved den underliggende basesekvens til det opprinnelige mRNA, som koder for proteinet, modifiseres.
Rekombinant ekspresjon av et humant periodeprotein og/eller hCKI8og/eller - e i en celle kan være resultat av transfeksjon med en eller flere egnede ekspresjonsvektorer, inneholdende for eksempel en promoter og cDNA som koder for hPERl, hPER2 og/eller hPER3 og/eller hCKI5og/eller -e. Cellebaserte screeningsystemer inkluderer også anvendelse av celler der det humane periodeprotein og/eller hCKI8og/eller -e overført eller omformet til cellen som et fusjonsprotein med en transduksjon eller transduksjonssekvens slik som TAT-protein oppnådd fra HIV, antennepedia-transduksjonsfragment, eller en hvilken som helst måte for å introdusere exogene proteiner i en celle.
Foretrukne in vitro screeningsystemer inkluderer vandige blandinger omfattende en klar fosfatkilde. Foretrukne in vitro screeningsystemer omfatter ATP.
Eksempler og fremgangsmåter for å bestemme nivået av fosforylering til et humant periodeprotein inkluderer standard fremgangsmåter for å påvise mengden proteinfosforylering, slik som anvendelse av radiomerket fosfor og autoradiografi, eller indirekte ved sammenlikning av mengden radiomerket fosfor tilsatt og den resulterende mengde ubundet fosfor. Alternativt kan colorimetriske eller andre påvisningsmetoder anvendes for å bestemme fosforyleringsnivået. En annen egnet fremgangsmåte for bestemmelse av fosforyleringsnivået til et humant periodeprotein inkluderer et cellefritt system som anvender glutation sefarosekuler der enten det humane periodeprotein eller hCKIe er bundet til et støttemateriale, slik som sefarosekuler, og enten hCKIe eller det humane periodeprotein tilsettes. I tillegg er flere alternative fremgangsmåter for å påvise mengden humant periodeprotein tilgjengelige, og inkluderer anvendelse av<35>S-merket humant periodeprotein degradering, colorimetriske analyser, eluering av bundet humant periodeprotein og liknende.
Screeningsfremgangsmåtene beskrevet her i dokumentet er spesielt nyttige ved at de kan automatiseres, hvilket tillater høyhastighets-screening av store antall av testforbindelser, enten vilkårlig utformete testforbindelser eller rasjonelt utformete testforbindelser for identifisering av de testforbindelser som effektivt modulerer eller endrer fosforyleringsnivået og/eller degradering av det humane periodeprotein, og følgelig endrer den cirkadiske rytme hos et pattedyr.
Betegnelsen "pattedyr" henviser til menneske, primat, hund, gris, kveg og andre høyere organismer. Mennesker og primater er de foretrukne pattedyr. Menneske er mest foretrukket. Testforbindelser for anvendelse ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer enhver biologisk forbindelse eller små kjemiske molekyler, slik som et enkelt eller kompleks organisk molekyl, peptider, analoger av peptider, proteiner, oligonukleotider, forbindelser oppnådd fra mikroorganismekulturer, naturlig forekommende eller syntetiske organiske forbindelser, og/eller naturlig forekommende eller syntetiske uorganiske forbindelser. Valget av testforbindelse som skal screenes er godt innenfor fagområdet.
Som beskrevet nedenfor degraderes fosforylerte hPERl-proteiner raskt, derfor kan screeningsmetoden ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendes for å identifisere testforbindelser som selektivt aktiverer eller inhiberer degradering av hPERl. Siden fosforylert hPER2- og hPER3-protein degraderes raskt kan foreliggende fremgangsmåte anvendes for å identifisere testforbindelser som selektivt aktiverer eller inhiberer degradering av henholdsvis hPER2 eller hPER3. Foreliggende oppfinnelse kan derfor frembringe forbindelser som selektivt aktiverer eller inhiberer fosforylering av hPERl, hPER2 og/eller hPER3, ved å bestemme forbindelsens virkning på aktivering eller inhibering av fosforylering av hvilke som helst av hPERl, hPER2 og/eller hPER3, og å sammenlikne resultatene oppnådd med den samme, eller en ulik testforbindelse.
Slik som fosforylerte hPERl-protein degraderes raskt, kan også fremgangsmåte anvendes til å identifisere testforbindelser som selektivt øker eller reduserer nivået av et humant periodeprotein i en celle i forhold til nivået av den samme eller et ulikt humant periodeprotein i fravær av testforbindelsen. Fremgangsmåten kan anvendes for å identifisere testforbindelser som selektivt øker eller reduserer nivået av et hPERl i en celle i forhold til nivået av hPERl i fravær av testforbindelsen. I en alternativ foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen anvendes fremgangsmåten for å identifisere testforbindelser som selektivt øker eller reduserer nivået av et hPER2 i en celle i forhold til nivået av hPER2 i fravær av testforbindelsen.
Alternativt kan foreliggende oppfinnelse anvendes for å identifisere testforbindelser som selektivt øker eller reduserer nivået av hPER2 og/eller hPER3 i en celle i forhold til nivået av henholdsvis hPER2 og/eller hPER3 i fravær av testforbindelsen, i fravær av testforbindelsen, eller alternativt, i forhold til nivået av et forskjellig humant periodeprotein. Foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å identifisere testforbindelser som selektivt øker eller reduserer nivåene av hPERl, hPER2 og/eller hPER3 i en celle i forhold til dens native nivå. sammenlikning av resultater fra ulike testforbindelser på nivået av humant periodeprotein kan også være etter en biologisk eller kjemisk behandling, slik som tilsetning, inhibisjon eller endring av endogene og/eller eksogene stimuli, slik som lys, vekstfaktorer, transkripsjonsfaktorer og liknende.
Fosforylerte hPER-proteiner er kjent å være nært involvert i regulering av den cirkadiske syklus hos pattedyr. Foreliggende oppfinnelse kan derfor anvendes til å identifisere testforbindelser som påvirker, modulerer eller på annet vis endrer den fysiologiske respons av den cirkadiske syklus hos et pattedyr i fravær av en testforbindelse eller et stimuli. Modulering av cirkadisk syklus hos et pattedyr inkluderer forebygging av en endring av den normale cirkadiske syklus hos et pattedyr som respons på et stimuli i fra vær av testforbindelsen.
De følgende eksempler som demonstrerer effekten av humant kasein kinase I e (hCKIe) på fosforylering av humant Periode 1 kan modifiseres til å erstatte humant Periode2 og/eller humant Periode3 med humant Periode 1. Tilsvarende resultater er oppnådd med human kasein kinase 15 (hCKI5).
Renset rekombinant hCKIe, men ikke en negativ kinasemutant av hCKIe (hCKIe-K38R), fosforylerer hPERl in vitro. Når den kotransfekteres med villtype hCKIe i 239T-celler, viser hPERl en betydelig økning i fosforylering som bevis på en forflytning i molekylmasse. hPERl -protein kan også immunpresipiteres samtidig med transfektert hCKIe så vel som endogent hCKIe, hvilket indikerer fysisk assosiering mellom hPERl-og hCKIe-proteiner in vivo. Videre medfører fosforylering av hPERl ved hCKIe en reduksjon i proteinstabiliteten til hPERl. Ufosforylert hPERl forblir stabil i cellen gjennom en 24 timers syklus, mens fosforylert hPERl har en halveringstid på omtrent 12 timer. Ved anvendelse av ulike avkortede hPERl-mutanter er potensielle fosforyleringsseter i hPERl aminosyrene 743 til 889, som inneholder et CKI-konsensus fosforyleringssete.
For å undersøke om hCKIe, pattedyrhomologen til Drosophila DBT, kan fosforylere hPERl, uttrykkes rekombinant "his-tagged" villtype hCKIe i E. coli., renses og analyseres for dens evne til å fosforylere et par kjente substrater, kasein og GST-IkBa, så vel som hPERl. Rekombinant hCKIe fosforylerer både kasein- og IkBa-substrater (figur IA, felt 2 og 3). Renset villtype hCKIe autofosforyleres. Evnen til å autofosforylere indikerer hCKIe -aktivitet (figur IA, felt 1 og 2). Fosforylering observeres ikke når rekombinant hCKIe er fraværende (figur IA, felt 7 og 8).
En kinasenegativ mutant av hCKIe-K38R, der lysin 38 i det ATP-bindende domene muteres til en arginin, analyseres for fosforylering av både kasein- og IkBa-substrat. hCKIe-K38R har ikke autofosforyleringsaktivitet og fosforylerer verken kasein- eller GST-IkBa-substrater (figur IA, felt 4-6) Dette viser at den foregående fosforyleringsaktivitet er spesifikk for villtype hCKIe.
Rekombinant hCKIe er også vist å fosforylere hPERl in vitro. Som vist i figur IB observeres ingen fosforylering i fravær av rekombinant hCKIe (felt 8-10). Nærvær av hCKIe resulterer i fosforylering av hPERl, men ikke "FLag-tagged" luciferase in vitro (felt 2 og 3). Fosforylering av hPERl er ikke forårsaket av hPERl-assosiert kinaseaktivitet da hCKIe også fosforylerer varmeinaktiverte hPERl-immunpresipitater (felt 6). Videre har hCKIe-K38R ingen kinaseaktivitet mot hPERl (felt 7). Følgelig fosforylerer hCKIe direkte hPERl in vitro.
hCKIe fosforylerer spesifikt hPERl i 293T-celler kotransfektert med "Flag-tagged" hPERl og enten vektorkontroll, villtype hCKIe eller hCKIe-K38R. Celler lyseres 24 timer etter transfeksjon og lysatene separeres på 3-8 % SDS NU-PAGE etterfulgt av western blot analyse. Figur 2A viser at det i celler kotransfektert med villtype hCKIe og hPERl observeres et betydelig skifte i molekylmasse til hPERl-proteinet, sammenliknet med celler kotransfektert med enten vektorkontroll eller hCKIe-K38R (felt 1-3).
Kotransfekterte 293T-celler med "Flag-tagged" hPERl og enten vektorkontroll, hCKIe eller den kinasenegative mutant av hCKIe-K38R og radiomerket med [ S]metionin og cystein, viser årsaken til endringen i hPERl-molekylmassen etter fosforylering. [<35>S]-merket hPERl immunpresipiteres og enten behandles eller ikke behandles med renset, rekombinant lambda fosfatase. Som vist i figur 2C viser immunoresipiterte [<35>S]-radiomerket hPERl et skifte i molekylmasse når celler kotransfekteres med villtype hCKIe, men ikke med vektor eller kinasenegative hCKIe-K38R-kontroller (feltene 1,2 og 3). Endringen i molekylmasse av proteinet fra kotransfektert hPERl- og villtype hCKIe-celler er betydelig redusert etter 1 times behandling med lambda-fosfatase. Dette viser at endringen i mobilitet til hPERl er forårsaket av fosforylering (figur 2C, felt 2 og 5). Etter 1 times behandling med lambda fosfatase er mobiliteten til alle hPERl fra hCKIe kotransfekterte celler versus vektorkontroll og kinasenegative kotransfekterte celler i alt vesentlig ikke til å skjelne fra hverandre (figur 2C, feltene 4, 5 og 6).
Lambda fosfatase mobilitetsskiftet er forårsaket av kontaminerende proteaser. Tilsetting av 50 mM natriumfluorid (en fosfataseinhibitor) til lambda fosfatasereaksjonen blokkerte reduksjonen av mobilitetsskiftet til hPERl. Ingen andre høyere molekylmasseformer av hPERl er tilstede i immunpresipitatene; hvilket indikerer at det posttranslasjonelle mobilitetsskiftet i hPERl er forårsaket av fosforylering.
I løpet av døgnsyklusen akkumulerer PER-protein og denne akkumulering fører til dens påfølgende degradering (Edery, I., et al, (1994) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91, 2260-2264, Dembinska, M. E., et al. (1997) J. Biol. Rhytms 12, 157-172). Under den fasen der PER-protein akkumulerer er det et betydelig skifte i molekylmasse som kan være forårsaket av fosforylering av proteinet. Mobilitetsskiftet når sitt maksimum rett før PER forsvinner (Edery, I., et al., (1994) supra). Kotransfekterte 293T-celler med ekspresjonsplasmider, som koder for både hPERl og villtype hCKIe eller vektorkontroll, anvendes for å demonstrere at fosforylering av hPERl resulterer i dens ustabilitet i celler. Omtrent 20 timer etter transfeksjon pulsmerkes cellene i 30 minutter med [<35>S]metionin/systein og fordrives deretter i 0 til 30 timer. Etter den passende tidsperiode høstes hPERl, immunpresipiteres og analyseres ved SDS-PAGE. Som vist i figur 3A viste celler kontransfektert med hPERl og vektor alene bare svært liten endring i mobilitet i løpet av tidsforløpet (feltene 1-7). Etter 12 timer synes det å være et svakt skifte i molekylmasse slik antydet ved en utsmøring av proteinet som økte svakt ved 30 timers tidspunktet (feltene 1, 5 og 7). Mengden hPERl tilstede i kontrollceller forble relativt konstant gjennom tidsforløpet. To timer etter radiomerking var fortsatt omtrent 50 % hPERl -protein tilstede i cellen og dette nivået forble konstant gjennom tidsforløpet (figur 3C, fylte stolper). I kontrast til vektorkontrollen viste celler kotransfektert med hPERl og villtype hCKIe en endring i mobilitet så snart som 2 timer etter radiomerking (figur 3B, felt 1 og 2). Denne endring i molekylmasse fortsatte å bli mer uttalt gjennom tidsforløpet med maksimal endring mellom 24 og 30 timer (figur 3B, felt 2-7). I motsetning til vektorkontrollen viste hPERl fra 293T-celler kontransfektert med hCKIe en reduksjon i proteinstabilitet. I likhet med vektorkontrollen ved 2 timers tidspunktet er 50 % av totalt hPERl fra CKIe-kotransfekterte celler tilstede i cellen. (Figur 3B, felt 2 og figur 3C, tverrstripete stolper). Til forskjell fra vektorkontrollen forble bare halvparten av det fosforylerte hPERl i cellen etter 12 timer. Ved 24 timer er omtrent 14 % av fosforylert hPERl tilstede (figur 3B, felt 5 og 6 og figur 3C, tverrstripete stolper). Dette eksperiment er gjentatt tre ganger med tilsvarende resultater. Fosforylering av hPERl med villtype hCKIe resulterer i nedsatt proteinstabilitet og deretter i dens degradering.
hPERl og hCKIe interagerer fysisk i 293T-celler. 293T-celler kotransfekteres med "Flag-tagged" hPERl og enten vektor alene eller "HA-tagged" hCKIe. Transfekterte 293T-celler lyseres og hPERl immunpresipiteres med anti-Flag-mAb og immunblottes deretter med anti-HA-mAb. Alternativt immunpresipiteres hCKIe med anti-HA-mAb og deretter immunblottes med anti-Flag-mAb. Figurene 4A og 4B viser at rekombinant hCKIe kopresipiterte med hPERl, hvilket antyder at hCKIe direkte assosieres med hPERl. 293T-celler transfekteres med hPERl bare for å vise at hPERl. Celler lyseres og hPERl immunpresipiteres med anti-Flag-mAb og immunblottes deretter med anti-hCKIe-mAb. Alternativt immunpresipiteres endogent hCKIe med anti-hCKIe-mAb og immunblottes deretter med anti-Flag-mAb. Endogent hCKIe kopresipiterte med hPERl hvilket indikerer en fysisk assosiering mellom de to proteiner (figur 4C og 4 D).
hCKIe fosforylerer hPERl mellom aminosyrene 621 og 889. Figur 2A viser at endringen i molekylmasse til hPERl er forårsaket av fosforylering ved hCKIe. For å identifisere fosforyleringsseter i hPERl fosforylert ved hCKIe, tilberedes avkortede versjoner av hPERl som beskrevet i figur 5A og materialer og metoder nedenfor. Disse konstruksjoner transfekteres i 293T-celler sammen med enten vektor, hCKIe eller hCKIe-K38R, og analyseres for en endring i molekylmasse. Som vist i figur 5B, felt 2, viste celler kotransfektert med både hCKIe og enten full-lengde åpen leseramme hPERl (ORF), N2, N3 eller N4 en endring i molekylmasse av proteinet. Lambda-fosfatasebehandling av avkortet hPERl -protein resulterer i en forsvinning av endringen som er forårsaket av fosforylering av hCKIe. hCKIe kotransfektert med NI eller C-terminale konstruksjoner Cl, C2, C5 eller C6 viste ikke endring i proteinenes molekylmasse (figur 5B og 5C, felt 2). Avkortede konstruksjoner viste en endring i molekylmasse (ORF, N2, N3 og N4) deler en homologiregion fra aminosyrene 621 til 889 (se figur 5A). Siden Cl som inneholder aminosyrene 584-743 ikke viste noen endring, fosforylerer hCKIe hPERl mellom aminosyrene 743 og 889.
Flere CKI-fosforyleringskonsensussekvenser er lokalisert gjennom hPERl, inkludert en innenfor hPERl-regionen, vist ovenfor å bli fosforylert av hCKIe, spesielt en sekvens som utgjør aminosyren 808-815: DSSSTAPS. Alle serinene og treoninene kan fungere som substrat for hCKIe, som kan stå for det dramatiske mobilitetsskiftet som observeres.
MATERIALER OG METODER
Eksempel 1 Plasmidkonstruksjon, ekspresjon og rensing av proteiner.
cDNA som koder for villtype hCKIe isoleres fra et humant placenta-cDNA-bibliotek ved anvendelse av tidligere beskrevne fremgangsmåter Fish, K. J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14875-14883. Kloning av hCKIe inn i bakterievektor (pRST-B-CKIe) og pattedyrekspresjonsvektor (pCEP4-CKIe) er tidligere beskrevet (Cegielska, A., et al,
(1998) J. Biol. Chem. 273,1357-1364, Rivers, A., et al, (1998) J. Biol. Chem. 273, 15980-15984). Et hemagglutenin (HA)-epitop merkelapp (YPDYDVPDYA) tilsettes ved den 5' ende av hCKIe i pCEP4-CKIe. Full-lengde hPERl (tel, H., et al, (1997) Nature 389, 512-516) spaltet med EcoRI og Sali og ligeres inn i plasmidvektoren "pCMV-TAG" (Stratagene) for å danne en "in-frame" fusjon med Flag-merkelappen. Avkortede N-terminale mutanter (NI, N2, N3, N4; C5) dannes ved spalting av PER1 med henholdsvis EcoRI/ EcoRV, EcoRI/ XhoI, EcoRV/ XhoI, PvuII/ XhoIeller Bamffl/ Sall, og legering inn i den samme vektoren. For konstruksjon av mutantene Cl, C2 og C6 anvendes oligonukleotidprimere i PCR-reaksjoner for amplifisering av DNA-fragmenter som koder for aminosyrene henholdsvis 584 til 743, 998 til 1160, eller 1161 til 1289, ved anvendelse av hPERl-cDNA som templat. De resulterende fragmenter er oppsummert i tabell 1.
En "Flag"-epitop tag-sekvens tilsettes primeren ved den 5' ende. PCR-produktene klones inn i pattedyrekspresjonsvektoren "pcDNA3 Topo vektor" (Invitrogen). Bakterieuttrykt histidin-merket hCKIe og hCKIe-K38R uttrykkes og renses som beskrevet i (Cegielska, A., et al, (1998) J. Biol. Chem. 273, 1357-1364. c-MYC-merket CKI5 var en gave fra dr. David Virshup. Et protein med høyere enn 90 % homogenitet, og med molekylvekt på omtrent 54 kDa, renses.
Eksempel 2 Transfeksjon og radiomerking av 293T-celler.
Humane, embryonale nyreceller 293T dyrkes i 6-brønnsplater i DMEM tilsatt 10 % fetalt kalveserum (Hyclone). Celler transfekteres ved en tetthet på omtrent 80 % med 2 ug DNA ved anvendelse av "lipofectAMINE"-reagenset (Life Technologies) ifølge produsentens anvisning. Forbigående transfeksjonseffektivitet av 293T-celler er typisk 30-50 % kontrollert ved GFP-kontrollplasmidtransfeksjon.
293T-celler radiomerkes 16 timer etter transfeksjon med 0,5 uCi/ml [<35>S]metionin/cystein i 30 minutter i metionin og systeinmanglende medium. Deretter blir cellene "ished" og dyrket i normalt DMEM i den antydede tidsperiode. Celler lyseres ved anvendelse av lyseringsbuffer (20 mM tris, 1 % "Triton X-100", 0,5 % "Igepal", 150 mM NaCl, 20 mM NaF, 0,2 mM Na2V04, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, fullstendig proteaseinhibitor cocktail [Boeringer Mannheim], pH 7,5). Lysatene klargjøres for cellerester ved sentrifugering ved 12 000 rpm. Supernatantene samles og lagres ved -70 °C fram til anvendelse.
Eksempel 3 Immunpresipitering og Western Blot analyser.
Lysater inneholdende like mengder protein (100 u.g) blandes med 5 ul av en 1:500 fortynning, enten av anti-Flag-, anti-HA eller anti-hCKIe-mAb og inkuberes over natten ved 4 °C. Etter inkubering med antistoffet tilsettes 30 ul av en oppslemming av 1:1 G-protein-sefarosekuler og inkuberes i ytterligere 2-4 timer. Kulene vaskes 5 ganger i lyseringsbuffer og resuspenderes deretter i 30 ul SDS-prøvebuffer med 5 mM DTT, kokes og analyseres ved SDS-PAGE. Western blot av proteinet utføres på enten supernatanter eller immunpresipiterte proteiner fra transfekterte 293T-celler ved anvendelse av enten "anti-Flag" (Sigma) ved en 1:1000 fortynning, anti-HA (Invitrogen) ved 1:1000 fortynning eller anti-hCKIe (Transduction Laboratories) ved en 1:750 fortynning som beskrevet tidligere (Yao, Z., et al, (1997) J. Biol. Chem. 272, 32378-32383).
Eksempel 4 Kinase og fosfataseanalyser.
hCKIe analyseres for aktivitet ved anvendelse av enten kasein eller GST-IkBa som substrat. Kasein eller GST-IkBa (0,5 u.g) kombineres med hCKIe (0,1 u.g) og 5 uCi [y-<32>P]ATP (Amersham) i PBS inneholdende 200nM ATP, 10 mM MgCl2, 0,6 mM EGTA
og 0,25 mM DTT. Reaksjonene inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur, stoppes ved tilsetting av SDS-prøvebuffer og analyseres deretter ved SDS-PAGE. Fordi GST-IkBa vandrer til en tilsvarende posisjon i SDS-PAGE som hCKIe ble en liten modifisering av protokollen foretatt. Etter 30 minutters inkubering fjernes GST-IkBa fra kinasereaksjonen ved å tilsette glutation-sefarosekuler. Kulene vaskes 5 ganger i lysetingsbuffer for å fjerne ethvert kontaminerende hCKIe før tilsetting av SDS-prøvebuffer. Gelene farges med Coomassiblå R-250, tørkes og autoradiografi utføres.
Immunpresipitering av [<35>S]-merket hPERl er beskrevet ovenfor. Kuler inneholdende hPERl vaskes ytterligere tre ganger i fosfatasebuffer (100 mM MES, 0,5 mM ditioltreitol DTT, 0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 20 u.g/ml aprotinin, 10 u.g/ml leupeptin, 10 ug(ml pepstatin A, pH 6,0) og resuspenderes i 20 ul fosfatasebuffer. Fosfatasebehandlingen starter ved tilsetting av en 10x løsning av reaksjon (50 mM Tris-HC1, 0,1 mM EDTA, 5mM Dtt 0,01 % Brij 35, 2 mM MnCl2pH 7,0), og 40 enheter av renset lambda-fosfatase- Reaksjonen pågår i 1 time ved 37 °C. Inkubering av fosfataseaktivitet oppnås ved tilsetting av 50 mM natriumfluorid. Etter passende inkuberinger stoppes reaksjonen ved tilsetting av SDS-prøvebuffer. Proteinene separeres ved anvendelse av SDS-PAGE; gelen tørkes og autoradiografi utføres. Avbildningen visualiseres ved anvendelse av "Molecular Dynamics Phospholmager".
Eksempel 5 hCKIe-interaksjon med og fosforylering av humant PER1.
De følgende eksempler demonstrerer materialer og metoder anvendt for å vise at hCKIe interagerer med og fosforylerer humant PER2. For å oppsummere disse resultater; hPER2 viser, når det kotransfekteres med hCKIe i 293T-celler, en betydelig økning i fosforyleringstilstand slik det er vist ved<32>P-inkorporering, så vel som et skifte i molekylmasse. Videre koimmunpresipiteres hCKIe med transfektert hPER2 på samme måte som hCKIe og hPERl. Behandling av transfekterte celler med hCKIe-inhibitoren CKI-7, resulterer i en reduksjon i hPERl- og hPER2-fosforylering. Puls/chase studier viser at øket fosforylering av hPER2 forårsaket av transfektert hCKIe medfører at hPER2 degraderes. Disse data antyder en fysikalsk assosiering mellom hCKIe og de humane periodeproteiner in vivo mellom CKI og humant PER1 ved IQELSEQIHRLLLQPVH, ved aminosyrene 486-503, for humant PER2 ved IQELTEQIHRLLLQPVH, aminosyrene 460-477, og/eller antakelig for humant PER3 ved ITELQEQIYKLLLQPVH, og en regulering av periodestabilitet ved hPERl- og hPER2-fosforylering.
Materialer og metoder for hPer2
Eksempel 6 Plasmidkonstruksjon, ekspresjon og rensing av proteiner.
Full-lengde åpen leseramme (ORF) humant Periode2 klones ved PCR fra et humant hjerne cDNA-bibliotek fra Clonetech ved anvendelse av foroverprimeren. ATCTAGATCTAGAATGAATGGATACGCCGGAATTTCCG og reversprimeren TCTGCTCGAGTCAAGGGGGATCCATTTTCGTTCTT. ORF koder for et 1246 aminosyrers protein. DNA subklones inn i pYGFP-levende fargevektor (Clonetech) som danner et hPER2-C-terminalt YGFP-protein. Bakterieuttrykket histidin-merket hCKIe uttrykkes og renses som beskrevet ovenfor. Et protein med høyere en 90 % homogenitet og med en omtrentlig molekylvekt på 54 kDa ble renset.
Eksempel 7 Transfeksjon av 293T-celler.
Transfeksjon av humane, embryonale nyreceller 293T utføres ved anvendelse av metodene og materialene beskrevet ovenfor, der humant Periode2 DNA erstatter humant Periode 1 DNA. Lysater og supernatanter innsamles og lagres som beskrevet ovenfor.
Eksempel 8 Immunpresipiteringer og Western Blot analyser.
Lysater anvendes for immunpresipitering og western blot analyser ved anvendelse av fremgangsmåter og materialer beskrevet ovenfor, der hPER2-lysat erstatter hPERl-lysat. Resultatene vises nedenfor i tabell 2. Etter kotransfeksjon av hPER2 og hCKIe i 293T-celler, lyseres cellene 24 timer etter transfeksjon, immunpresipiteres og lysatene separeres på 8 % SDS-PAGE etterfulgt av western blot analyse. Som vist i tabell 2 viste immunpresipitering av HA-hCKIe etterfulgt av western blot analyse at hCKIe interagerer med hPER2 så vel som hPERl. Pluss-tegn betegner interaksjon, minus-tegn betegner ingen interaksjon.
Eksempel 9 hCKIe assosierer med og fosforylerer hPER2.
Konsekvensen av PER 1-fosforylering er ustabilitet og degradering av proteinet. For derfor å bestemme om hCKIe fosforylerer PER2 ble 293-celler kotransfektert med CKIe og hPER2 eller hPERl som kontroll, og proteinene ble visualisert ved western blot analyser. Som vist i tabell 2 observeres i celler kotransfektert med hCKIe og hPER2 et skifte i molekylmasse av proteinet som er tilsvarende til resultatene observert med hCKIe oghPERl.
For å bestemme om endringen i mobilitet var forårsaket av fosforylering av hPER2, ble det utført p32-merkeforsøk og analyser for inkorporering av p32-merking i hPER2. Som vist i tabell 3 resulterte kotransfeksjon av hPER2 eller hPERl med CKIe i inkorporering av p32 i begge PER-proteiner. Mengden av p32 inkorporert synes å være større i hPERl enn hPER2. Denne forskjell i hPERl-fosforylering versus hPER2 kan være forårsaket av en øket kinetikkhastighet på fosforylering av hPERl av CKI versus hPER2. En annen forklaring er at hPERl har et større antall CKI-konsensusfosforyleringsseter enn hPER2 (9 hos hPERl versus 7 hos hPER2).
Fosforylering av hPER2 fører til protein ustabilitet: Fosforylering av hPERl resulterer i protein-ustabilitet og degradering. Siden hPER2 fosforyleres tilsvarende av hCKIe, ble, for å bestemme effekten av fosforylering på hPER2-proteinstabiliteten, HEK293-celler transfektert med cDNA som koder for enten PER2 alene eller PER1 alene, eller kotransfektert med cDNA som koder for både hCKIe og PER2, eller hCKIe og PER1. Celler pulses med 35-S-metionin og immunpresipiteres på tidspunktene oppsummert i tabell 4 i 32 timer. Som vist i tabell 4 resulterte enkel transfeksjon av enten hPER2 og hPERl i at enten hPERl eller hPER2 ble fosforylert av endogent kinase og degradert. Halveringstiden for hver an proteinene er omtrent 14 timer for hPERl og 4 timer for hPER2. Kotransfeksjon av enten hPERl eller hPER2 med hCKIe resulterer imidlertid i en hyperfosforylering av begge proteiner. Denne hyperfosforylering resulterer videre i en svak endring og forkorting av proteinets halveringstid med omtrent 2-4 timer. hPER2 synes ikke å være mer stabilt enn hPERl etter fosforylering med hCKIe selv om det synes å være fosforylert i mindre grad enn hPERl.
Eksempel 10 Analyse av hCKI5- og -e -inhibitorer.
Den følgende analyse anvendes for testforbindelse for deres evne til å endre fosforylering av hPERl, dermed øker hPERl-nivået i kotransfekterte celler og PER1-cellulært mRNA-variasjoner endres. Ved anvendelse av en hCKIe-Perl-kotrasfeksjon (forbigående) analyse ble HEK293T-celler dyrket i 6-brønns plater til omtrent 80 % konfluens og deretter kotransfektert med hCKIe og Perl eller Per2 ved anvendelse av lipofectamin plussreagens (Gibco BRL). Etter 16 timer ble transfeksjonsmediet fjernet og cellene behandlet med 1,10 eller 30 uM CKI-inhibisjonsforbindelse og ikke-aktiv analogforbindelse i 16 timer. Etter ytterligere 16 timer ble mediet fjernet og cellene vasket to ganger med PBS, lysert, sentrifugert og supernatanten analyseres på 8-16 % eller 8 % tris glysingeler. Western blot utføres for Flag-merket hPERl eller GFP-merket hPER2. Tilstedeværelse av hCKIe påvises i hver prøve ved western blot med anti-HA-antistoffer.
Som vist i figur 9 viser celler kotransfektert med hCKIeog hPERl og eksponert for økende konsentrasjoner av en kontrolltestforbindelse, for eksempel en som ikke inhiberer hCKIe, ingen økning i hPERl-nivåene. Kotransfekterte celler behandlet med hCKIe-inhibitorer viste imidlertid en relativ økning i hPERl-nivåer på en doseavhengig måte. Denne økning i hPERl-nivåer er forårsaket av en inhibisjon av CKI-fosforyleringsaktiviteten og en relativ reduksjon i hPERl-fosforylering etterfulgt av en økning i proteinstabilitet. Dersom CKI-inhibitorer endrer PER 1-proteinstabiliteten og halveringstiden, kan det forklares at økende cellulære PER 1-nivåer vil ha noe effekt på døgnrytmevariasjoner eller cellulær syklus.
For å teste effekten av CKI-inhibitorer til å endre rotte PER 1-variasjoner ved kvantitativ PCR ved anvendelse av TaqMan RT-PCR (Perkin Eimer Biosystems), ble rotte-1-fibroblaster dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagle medium, tilsatt 5 % fetalt kalveserum og en blanding av penicillin-streptomycin-glutamin. SCN-celler dyrkes i Dulbecco's Minimum Eagle medium, tilsatt 10 % fetalt kalveserum, penicillin-streptomycin-glutamin og 2 % glukose. Omtrent 5 x 10<5>celler såes ut 10 cm petriskåler 3-5 dager før eksperimentet. Når skålene er konfluente, hvilket betegnes tid = 0, skiftes mediet med serumrikt medium, dvs. serum inneholdende 50 % hesteserum. 2 timer etter serumsjokket på 50 % hesteserum, erstattes dette medium med serumfritt medium. På antydede tidspunkter ble skålene vasket med PBS og oppbevart nedfrosset ved -80 °C inntil ekstraksjon av totalcelle mRNA. hCKIe-inhibitor eller -kontroll tilsettes på det tidspunktet når serumfritt medium tilsettes.
Totalcelle mRNA ekstraheres ved hjelp av RNeasy Midi sett eller RNeasy 96 sett (Qiagen) og Dnase behandlet (Ambio DNA-fritt). Kvantitativ PCR utføres med "real-time Taq-Man technology" (PE Biosystems) [C. A. Heid et al, Genomes Res. 6, M
(1996)] og analyseres på en ABI PRISM 7700 (T. Takumi et al, Genes Cells 4, 67: 1999). Primerene for rPerl er som følger: Forover 5'-TCTGGTTAAGGCTGCTGACAAG-3'; revers 5'-GTGTAGCCCCAACCCTGTGA-3', og Taq-Man probe 5'-TCCAAATCCCAGCTGAGCCCGA-3'. Som en indre kontroll for RNA undersøkes ekspresjon av rActin under de samme betingelser. Forhold mellom rPerl og rActin ble beregnet og normalisert.
Som vist i figur 10 viser celler som ikke er behandlet med forbindelse eller behandlet med en testforbindelse som er en inaktiv hCKIe-småmolekylanalog, en normal døgnsyklus på omtrent 24 timer som antydet ved PER 1-mRNA-variasjoner. Celler behandlet med en testforbindelse som er en CKI-inhibitor viste imidlertid en endret daglig varierende døgnrytme, figur 11. PERl-mRNA-nivåene i disse celler viser en forkortet rytme på ca. 18 til 20 timer i stedet for den normale 24 timers syklus. Den forkortede syklus er forårsaket av CKI-inhibisjon av fosforylering, hvilket resulterer i reduserte nivåer av PER-fosforylering. Mindre fosforylert PER fører til øket PER-proteinstabilitet og økede cellenivåer av PER, vilket endrer den cirkadiske rytme hos pattedyret.
Claims (15)
1.
Fremgangsmåte for å identifisere forbindelser som endrer fosforylering av det humane klokkeproteinethPERIODEl (hPERl),karakterisertved at den omfatter
(1) plassering av forbindelsen som skal screenes i et screeningsystem inneholdende humant kasein kinase hCKIe-protein og hPERl-protein, og
(2) måle graden av fosforylering av hPERl-protein eller måle graden av degradering av hPERl-protein.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat forbindelsen inhiberer fosforylering av hPERl ved hCKIe.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat forbindelsen øker fosforylering av hPERl ved hCKIe.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat screeningsystemet er et cellesystem eller et cellefritt system.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat screeningsystemet er et cellefritt system med delvis renset eller renset hPERl eller hCKIe, eller hPERl eller hCKIe oppnådd fra rekombinante kilder.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat screeningsystemet er et cellesystem.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat cellesystemet er en prokaryot celle.
8.
Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat den prokaryote celle er en bakteriecelle.
9.
Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat cellesystemet er en eukaryot celle.
10.
Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat den eukaryote celle er en gjærcelle.
11.
Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat gjærcellen er S. cerevisia.
12.
Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat cellesystemet er en insektcelle.
13.
Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat cellesystemet er en pattedyrcelle.
14.
Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat pattedyrcellen er en human celle.
15.
Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat pattedyrcellen er en lymfecelle, fibroblastcelle, tumorcelle, glatt muskelcelle, hjertemuskelcelle, embryonal nyrecelle, hjernecelle, nervecelle, myelocytt, gliacelle eller astrocyttcelle.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US32774599A | 1999-06-08 | 1999-06-08 | |
| PCT/US2000/015633 WO2000075669A1 (en) | 1999-06-08 | 2000-06-07 | Screening methods for altering circadian rhythm proteins |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20015972D0 NO20015972D0 (no) | 2001-12-06 |
| NO20015972L NO20015972L (no) | 2002-02-05 |
| NO330241B1 true NO330241B1 (no) | 2011-03-14 |
Family
ID=23277866
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20015972A NO330241B1 (no) | 1999-06-08 | 2001-12-06 | Fremgangsmate for a identifisere forbindelser som endrer fosforylering av det humane klokkeproteinet hPERIODE1 (hPER1) |
| NO20100431A NO20100431L (no) | 1999-06-08 | 2010-03-23 | Fremgangsmate for a endre degradering av det humane klokkeproteinet hPeriode1 (hPER1) |
| NO20100430A NO20100430L (no) | 1999-06-08 | 2010-03-23 | Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for a endre den cirkadiske rytme hos et pattedyr |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20100431A NO20100431L (no) | 1999-06-08 | 2010-03-23 | Fremgangsmate for a endre degradering av det humane klokkeproteinet hPeriode1 (hPER1) |
| NO20100430A NO20100430L (no) | 1999-06-08 | 2010-03-23 | Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for a endre den cirkadiske rytme hos et pattedyr |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6555328B1 (no) |
| EP (1) | EP1183541B1 (no) |
| JP (1) | JP4583682B2 (no) |
| KR (1) | KR100722176B1 (no) |
| AT (1) | ATE322016T1 (no) |
| AU (1) | AU767800B2 (no) |
| BR (1) | BR0011437A (no) |
| CA (1) | CA2375450C (no) |
| DE (1) | DE60026998T2 (no) |
| IL (2) | IL146729A0 (no) |
| MX (1) | MXPA01011417A (no) |
| NO (3) | NO330241B1 (no) |
| NZ (1) | NZ514603A (no) |
| WO (1) | WO2000075669A1 (no) |
| ZA (1) | ZA200108962B (no) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6476188B1 (en) | 1998-06-19 | 2002-11-05 | The Rockefeller University | Clock gene and methods of use thereof |
| US6436628B1 (en) | 1998-06-19 | 2002-08-20 | The Rockefeller University | Methods of identifying an agent which modulates period and doubletime protein interaction |
| KR100722176B1 (ko) * | 1999-06-08 | 2007-05-29 | 아벤티스 파마슈티칼스 인크. | 일주기 리듬 단백질을 변화시키기 위한 스크리닝 방법 |
| US7659387B1 (en) * | 1999-11-18 | 2010-02-09 | University Of Virginia | Transgenic mammals introduced a Period 1 promoter that confers rhythmical expression |
| GB0103110D0 (en) * | 2000-08-25 | 2001-03-28 | Aventis Pharma Inc | A membrane penetrating peptide encoded by a nuclear localization sequence from human period 1 |
| AU2002248338A1 (en) * | 2001-01-11 | 2002-07-24 | University Of Utah Research Foundation | Identification of an advanced sleep phase syndrome gene in humans |
| AU2003278333A1 (en) * | 2002-10-25 | 2004-05-13 | University Of Surrey | Polymorphism in the per3 gene as a indicator in the diagnosis and treatment of circadian rhythm sleep disorders |
| AU2003293150A1 (en) * | 2002-11-27 | 2004-06-23 | University Of Utah Research Foundation | Casein kinase i epsilon and casein kinase i delta and sleep in humans |
| AU2005277460A1 (en) * | 2004-08-19 | 2006-03-02 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | 3-arylthioindole-2-carboxamide derivatives and analogs thereof as inhibitors of casein kinase I epsilon |
| JO2629B1 (en) * | 2004-08-19 | 2012-06-24 | افينتيس فارما سوتيكالز انك | Branched carboxylic acid amides containing thienobirol, carboxylic acid amides containing pyrolithiazole, and the like as kinase inhibitors casein epsilon |
| JO2724B1 (en) | 2004-08-19 | 2013-09-15 | افينتس فارماسوتيكالز انك | 3-Alternative-5 -6-Amino Alkyl Indole-2-Carboxyl Acid Amide and Related Isotopes as Casein Kinase Inhibitors |
| US20100028871A1 (en) * | 2006-05-31 | 2010-02-04 | National Institute Of Radiological Sciences | Light-inducible and rhythmically expressed genes and method for screening substances that affect an internal clock system |
| JP5518479B2 (ja) * | 2006-10-25 | 2014-06-11 | ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ | Ａβ関連障害の処置のための方法およびその組成物 |
| FR2918986B1 (fr) | 2007-07-19 | 2009-09-04 | Sanofi Aventis Sa | Derives de 6-cycloamino-3-(pyridazin-4-yl)imidazo[1,2-b]- pyridazine, leur preparation et leur application en therapeutique |
| WO2015054819A1 (en) * | 2013-10-14 | 2015-04-23 | Nanjing University | Method for identifying advanced feeding rhythm syndrome and application thereof |
| KR101600144B1 (ko) * | 2013-12-20 | 2016-03-04 | 서울대학교산학협력단 | 일주기 리듬 수면장애 및 시차 부적응에 대한 예방 또는 치료제 스크리닝 방법 |
| RU2016132574A (ru) | 2014-01-09 | 2018-02-12 | Интра-Селлулар Терапиз, Инк. | Органические соединения |
| WO2017083835A1 (en) * | 2015-11-13 | 2017-05-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Inhibition of tor complex 2 increases immunity against bacterial infection |
| WO2023129377A1 (en) * | 2022-01-03 | 2023-07-06 | The Johns Hopkins University | Methods and materials for treating heart attack |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1157137A (ja) * | 1997-08-28 | 1999-03-02 | Sanyo Bussan Kk | 遊技機用特別図柄表示装置 |
| KR100246893B1 (ko) * | 1997-12-29 | 2000-05-01 | 윤종용 | 전자렌지용 도어 |
| AU3976099A (en) * | 1998-05-07 | 1999-11-23 | President & Fellows Of Harvard College, The | Compositions and methods involving regulation of mammalian circadian rhythms |
| KR100722176B1 (ko) * | 1999-06-08 | 2007-05-29 | 아벤티스 파마슈티칼스 인크. | 일주기 리듬 단백질을 변화시키기 위한 스크리닝 방법 |
-
2000
- 2000-06-07 KR KR1020017015764A patent/KR100722176B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-06-07 BR BR0011437-5A patent/BR0011437A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-06-07 MX MXPA01011417A patent/MXPA01011417A/es active IP Right Grant
- 2000-06-07 CA CA002375450A patent/CA2375450C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-07 EP EP00939629A patent/EP1183541B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-07 DE DE60026998T patent/DE60026998T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-07 IL IL14672900A patent/IL146729A0/xx active IP Right Grant
- 2000-06-07 JP JP2001501893A patent/JP4583682B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-07 AU AU54689/00A patent/AU767800B2/en not_active Ceased
- 2000-06-07 NZ NZ514603A patent/NZ514603A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-06-07 US US09/589,462 patent/US6555328B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-07 WO PCT/US2000/015633 patent/WO2000075669A1/en active IP Right Grant
- 2000-06-07 AT AT00939629T patent/ATE322016T1/de active
-
2001
- 2001-10-30 ZA ZA200108962A patent/ZA200108962B/en unknown
- 2001-11-25 IL IL146729A patent/IL146729A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 NO NO20015972A patent/NO330241B1/no not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-03-23 NO NO20100431A patent/NO20100431L/no not_active Application Discontinuation
- 2010-03-23 NO NO20100430A patent/NO20100430L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60026998T2 (de) | 2007-04-05 |
| NO20015972L (no) | 2002-02-05 |
| NO20100430L (no) | 2002-02-05 |
| CA2375450A1 (en) | 2000-12-14 |
| NO20015972D0 (no) | 2001-12-06 |
| KR20020033101A (ko) | 2002-05-04 |
| ZA200108962B (en) | 2003-01-30 |
| EP1183541B1 (en) | 2006-03-29 |
| MXPA01011417A (es) | 2002-06-04 |
| EP1183541A1 (en) | 2002-03-06 |
| CA2375450C (en) | 2009-04-28 |
| AU5468900A (en) | 2000-12-28 |
| JP4583682B2 (ja) | 2010-11-17 |
| KR100722176B1 (ko) | 2007-05-29 |
| NO20100431L (no) | 2002-02-05 |
| BR0011437A (pt) | 2002-03-05 |
| IL146729A (en) | 2007-06-17 |
| US6555328B1 (en) | 2003-04-29 |
| WO2000075669A1 (en) | 2000-12-14 |
| DE60026998D1 (de) | 2006-05-18 |
| ATE322016T1 (de) | 2006-04-15 |
| JP2003501074A (ja) | 2003-01-14 |
| AU767800B2 (en) | 2003-11-27 |
| NZ514603A (en) | 2003-10-31 |
| IL146729A0 (en) | 2002-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO330241B1 (no) | Fremgangsmate for a identifisere forbindelser som endrer fosforylering av det humane klokkeproteinet hPERIODE1 (hPER1) | |
| Chung et al. | PAKa, a putative PAK family member, is required for cytokinesis and the regulation of the cytoskeleton in Dictyostelium discoideum cells during chemotaxis | |
| Livingstone et al. | ATF‐2 contains a phosphorylation‐dependent transcriptional activation domain. | |
| Fiol et al. | A secondary phosphorylation of CREB341 at Ser129 is required for the cAMP-mediated control of gene expression. A role for glycogen synthase kinase-3 in the control of gene expression. | |
| Brandeis et al. | The proteolysis of mitotic cyclins in mammalian cells persists from the end of mitosis until the onset of S phase. | |
| Llorian et al. | SIPP1, a novel pre-mRNA splicing factor and interactor of protein phosphatase-1 | |
| Anderson et al. | Ca 2+/calmodulin-dependent protein kinase IV and calcium signaling | |
| Garcia-Gonzalo et al. | Interaction between HERC1 and M2-type pyruvate kinase | |
| US8389207B2 (en) | Methods for identifying candidate fat-mobilizing agents | |
| Boratkó et al. | Elongation factor-1A1 is a novel substrate of the protein phosphatase 1-TIMAP complex | |
| Masson et al. | In vitro phosphorylation studies of a conserved region of the transcription factor ATF1 | |
| Kalmes et al. | Interaction between the protein kinase B-Raf and the α-subunit of the 11S proteasome regulator | |
| Schiller et al. | Induction of lamellipodia by Kalirin does not require its guanine nucleotide exchange factor activity | |
| Fukumoto et al. | The polyanionic C-terminal tail of human Rad17 regulates interaction with the 9–1–1 complex | |
| US20020106690A1 (en) | The g-protein b subunit interaction domain of ste20p/pak family of protein kinases and uses thereof in bioassays | |
| Rutherford et al. | Phosphorylation-independent internalisation and desensitisation of the human sphingosine-1-phosphate receptor S1P3 | |
| Alex | Mechanistic insights into the mitotic checkpoint through biochemical characterisation and in vivo method development | |
| US20050181360A1 (en) | Assay for cell cycle modulators based on the modulation of cyclin d1 degradation in response to ionising radiation | |
| McCollami et al. | Pleckstrin and Dbl Homology Regions in the Ras Exchange | |
| Delpire et al. | Ste20 kinases and cation-chloride cotransporters | |
| CA2286073A1 (en) | Screening for compounds that inhibit phosphorylation of i?b.alpha. | |
| Lee | Mechanism of inhibitory action of nitric oxide on hepatic stellate cell migration and motility | |
| Palazzo | The regulation of microtubule organization by small Rho GTPases and integrin signals | |
| Remy et al. | Regulation of Apoptosis by the Ft1 Protein | |
| Tomar | Tyrosine phosphorylation of villin: Effects on actin dynamics, cell morphology and cell migration |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |