KR20020033101A - 일주기 리듬 단백질을 변화시키기 위한 스크리닝 방법 - Google Patents

일주기 리듬 단백질을 변화시키기 위한 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유동물의 일주기 리듬을 변화시키는 시험 화합물을 확인하는 방법 및 보다 구체적으로, 사람 피리어드 단백질의 hCKIδ 및/또는 ε 인산화를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상이한 사람 피리어드 단백질의 인산화, 상호작용 또는 대안으로 분해를 변화시키는 시험 화합물의 능력과 비교하여, 하나 이상의 사람 피리어드 단백질의 인산화, 상호작용 또는 대안으로 분해를 선택적으로 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다.

Description

일주기 리듬 단백질을 변화시키기 위한 스크리닝 방법 {Screening methods for altering circadian rhythm proteins}
내인성 생물학적 리듬조율기(pacemaker)에 의해 생성되는 일주기 리듬은 사람, 진균, 곤충 및 세균을 포함하는 수 많은 다양한 유기체내에 존재한다[Dunlap, J.C. (1999) Cell, 96, 271-290; Hastings, J.W., et al., (1991) in Neural and Integrative Animal Physiology, ed. Prosser, C.L. (New York: Wiley-Liss), pp. 435-546; Allada, R., et al., (1998) Cell, 93, 791-804; Kondo, T., et al., (1994) Science, 266, 1233-1236; Crosthwaite, S.K., et al., (1997) Science, 276, 763-769]. 일주기 시계는 생물학적 리듬을 유지하는데 필수적이다. 이들은 자가 유지되며 완전히 어두운 조건하에서도 지속되지만, 빛 및 온도 변화 같은 환경적 신호에 의해서 유입될 수 있다. 내인성 시계는 행동, 음식 섭취 및 수면/기상 주기 뿐만 아니라 호르몬 분비 같은 생리학적 변화에서의 일상의 변동, 및 체온의 변동을 포함하는 활동 패턴을 조절한다[Hastings, M., (1997) Trends Neurosci. 20, 459-464; Kondo, T., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5672-5676; Reppert, S.M., & Weaver, D.R. (1997) Cell, 89, 487-490].
드로소필라에서의 유전학적 및 분자학적 연구는 일주기 리듬성과 관련된 유전자의 일부에 대한 해명을 가능하게 하였다. 이러한 연구로부터 밝혀진 것은 긴밀하게 자가 조절되며 전사/해독-기초 네가티브 피드백 루프로 이루어지는 경로이다[Dunlap, J.C. (1999) Cell, 96, 271-290; Dunlap, J.C. (1996) Annu. Rev. Genet. 30, 579-601; Hall, J.C. (1996) Neuron, 17, 799-802]. 중추 시계의 두 가지 중요한 성분은 피리어드 또는 PER, 및 타임리스 또는 TIM으로 불리는 분자들이다.
드로소필라에서 처음으로 발견된 per 좌위는 성체 탈피(adult eclosion) 행동 및 운동 활동에서 일주기 리듬을 조절하는 필수적인 인자이다[Konopka, R.J., & Benzer, S. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2112-2116]. PER의 미스센스 돌연변이는 일주기 리듬의 주기를 단축(perS)시키거나 연장(perL)시킬 수 있지만, 넌센스 돌연변이(perO)는 이들의 행동에서 리듬이상(arrhythmicity)을 야기한다 [Hall, J.C. (1995) Trends Neurosci. 18, 230-240]. 포유동물의 교차상핵(suprachiasmatic nuclei, SCN)에서, 세 개의 PER 동족체, per1, per2 및per3이 확인되었다. 이러한 포유동물 유전자의 단백질 생성물은 서로 상동성인 수 개의 영역을 공유한다[Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 20, 1103-1110; Albrecht, U., et al., (1997) Cell 91, 1055-1064]. Per mRNA 및 단백질 수준은 일주기(daily cycle) 동안 변동하지만, PER1 및 PER2 만이 빛에 반응해서 변동한다[Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 20, 1103-1110., Shearman, L.P., et al., (1997) Neuron 19, 1261-1269].
모든 PER 단백질은 이량체화에 필요한 PAS 도메인으로 불리는 단백질/단백질 상호작용 영역을 함유한다[Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 20, 1103-1110]. 또 다른 PAS 함유 단백질인 TIM은 PER를 탐색 수단(bait)으로 사용하여 효모 2-하이브리드 유전자 스크리닝으로 분리하였다[Gekakis, N., et al., (1995) Science 270, 811-815]. PER 단백질 수준이 증가하면, PER는 TIM과 이종이량체를 형성한다. TIM/PER 이종이량체 형성은 PER 조절을 위해서 필요하며, 이는 tim에서의 돌연변이가 per mRNA 변동의 손실 및 핵 전위를 수행하는 PER의 능력의 상실을 수반하는, 일주기 리듬의 손실을 야기하기 때문이다[Sangoram, A.M., et al., (1998) Neuron 21, 1101-1113; Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 21, 1115-1122].
최근에, 클락(CLOCK) 및 BMAL/MOP3를 포함하는 일주기 리듬성의 몇몇 부가적인 분자 성분들이 유전학적 스크리닝 및 생화학적 특성화를 사용하여 발견되었다[Gekakis, N., et al., (1998) Science 280, 1564-1569; King, D.P., et al., (1997) Cell 89, 641-653; Allada, R., et al., (1998) Cell 93, 791-804].
후속적인 연구들은 PER이 전사적 수준에서 조절되는 방법을 밝혀냈다.CLOCK 및 BMAL/MOP3은 모두 PAS 도메인인 염기성-헬릭스-루프-헬릭스 도메인을 함유하며, 서로 이종이량체를 형성한다. PER이 전사, 해독 및 축적되면, PER은 핵으로 전위하여 이의 공통적인 PAS 도메인을 통하여 CLOCK에 결합하여 자체 전사를 억제 조절하여 네가티브 피드백 루프를 형성한다[Allada, R., et al., (1998) Cell 93, 791-804; Darlington, T.K., et al., (1998) Science 280, 1599-1603; Hao, H., et al., (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 3687-3693; Jin, X., et al., (1999) Cell 96, 57-68].
또한, PER는 해독후 수준에서 변화 및 조절된다. PER 및 TIM 모두는 일주기 변동에 의해서 초래되는 인산화를 수행하는 것으로 보인다[Edery, I., et a., (1994) Proc. Natl. Sci. USA 91, 2260-2264; Lee, C., et al., (1998) Neuron 21, 857-867]. 더블 타임(DBT)으로 불리는 드로소필라 키나제가 최근에 클로닝되었다[Price, J.L., et al., (1998) Cell 94, 83-95, Kloss, B., et al., (1998) Cell 94, 97-107]. DBT에서의 돌연변이는 행동 리듬의 주기를 단축시키거나 연장시킨다. DBT에 대한 P-인자 삽입 돌연변이는 유충 뇌에서 PER의 일주기 변동을 파괴하며, 이는 DBT가 드로소필라 시계에서 필수적인 성분임을 나타낸다. PER는 이러한 돌연변이체에서 높은 수준으로 축적되며 인산화된다. DBT은 직접적으로 PER을 인산화시키는 것으로 보이진 않는다. CKIε은 포유동물에서 DBT의 밀관된 동족체이다[Kloss, B., et al., (1998) Cell 94, 97-107]. CKIε 및 DBT는 상기 키나제 도메인에서 아미노산 수준에서 86% 상동성이다. 피쉬(Fish) 등에 의해 처음으로 동정된 hCKIε은 세린/트레오닌 단백질 키나제 활성을 갖는 몇몇 CKI동형체(α, β, γ, δ) 중 하나이다[Fish, K.J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14875-14883; Rowles, J., et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9548-9552]. CKI들은 세포성 DNA 대사의 조절에 관여한다. 포유동물 CKI의 동족체인 HRR25 유전자에 결함이 있는 사카로마이세스 돌연변이체는 이중쇄 DNA 분해에 감수성을 나타낸다[Hoekstra, M.F., et al., (1991) Science 253, 1031-1034]. hCKI에 대한 몇몇 시험관내 기질들은 RNA 폴리머라제 I 및 II, p53, IκBα, 및 원숭이 바이러스 40 거대 T 항원을 포함하는 것으로 동정되었다. 그러나, hCKI 인산화가 기질 기능 변화에 연관된다는 증거는 거의 존재하지 않으며, 최근까지, 어떠한 시계 유전자들도 hCKIδ 및 ε 기질인 것으로 확인되지 않았다.
일주기 리듬은 일주기 경로상의 특정 주요 단백질들의 연속적인 인산화 및 단백질 수준의 변화에 의해서 조절된다. 일주기 시계 경로의 중심 성분인 피리어드(PER)는 많은 일주기 변동 및 인산화 상태를 진행하게 된다. PER 유전자는 드로소필라 PER에서 동정되어 dPER로 명명되고, 마우스 PER에서 동정되어 mPER로 명명되고, 사람 PER에서 동정되어 hPER로 명명되었다. 드로소필라에서는, 단지 하나의 PER 만이 존재하며, 이는 PER1 단백질과 가장 높은 상동성을 갖는다. 사람 및 마우스 모두는 세 개의 PER를 가지며, PER1, 2 및 3으로 명명되었다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 hCKIδ 및 ε이 사람 피리어드 단백질을 인산화시켜 인산화된 사람 피리어드 단백질은 분해된다는 발견에 관한 것이다. 결과로서, 본 발명은 포유동물의 일주기 리듬을 변화시키는 시험 화합물을 동정하는 방법, 및 보다 구체적으로는 사람 피리어드 단백질의 hCKIδ 및 ε 인산화를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인산화된 사람 피리어드 단백질의 분해를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상이한 사람 피리어드 단백질의 인산화 또는 대안으로 분해를 변화시키는 능력과 비교해서 하나 이상의 사람 피리어드 단백질의 인산화 또는 대안으로 분해를 선택적으로 변화시키고, 결과적으로 포유동물의 일주기 리듬을 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 포유동물의 일주기 리듬을 변화시키는, 보다 구체적으로는 사람 시계 단백질(Clock protein)인, 사람 피리어드(Period) 1, 사람 피리어드 2 및 사람 피리어드 3을 인산화시키는 사람 카제인 키나제 Iδ 및/또는 ε의 능력을 변화시키는 시험 단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다.
도 1.재조합 hCKIε에 의한 카제인, IκBα 및 hPER1의 시험관내 인산화
재조합 카제인 키나제의 정제 및 키나제 분석 조건은 하기 재료 및 방법에서 기술된다. (A) hCKIε(레인 1 내지 3), hCKIε-K38Rε(레인 4 내지 6), 또는 완충액 대조군(레인 7 및 8)은 단독으로(레인 1 및 4), 카제인과 함께(레인 2 및 5), 또는 IκBα와 함께(레인 3 및 6) 항온 배양하며, 키나제 분석은 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 수행한다. 분자량 마커는 좌측에 나타낸다. (B) 벡터(레인 1, 4 및 8), 루시퍼라제(레인 2, 5 및 9) 또는 hPER1(레인 3, 6 및 10)으로 형질감염시킨 293T 세포의 용해액을 제조하고 M2 항-Flag mAb를 사용하여 면역침전시키고 키나제 분석을 hCKIε(레인 1 내지 6), hCKIδε-K38Rε(레인 7) 또는 완충액 대조군(레인 8 내지 10)을 사용하여 수행한다. 면역침전물을 65℃에서 30분 동안가열-불활성화시킨 후 키나제 분석한다(레인 4 내지 6). 샘플을 12% SDS-PAGE로 분리시킨다. 겔을 쿠마시 R-250으로 염색하고 건조시키고 방사선사진 촬영한다.
도 2. (A 및 B)hPER1 및 hCKIε의 웨스턴 블롯 분석
293T 세포를 hPER1 및 벡터(레인 1), hPER1 및 hCKIε(레인 2), hPER1 및 hCKIε-K38R(레인 3), 벡터 및 hCKIε(레인 4), 또는 벡터 및 hCKIε-K38R(레인 5)로 형질감염시킨다. 형질감염 24시간 후, 세포를 수거하고 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 용해액을 제조한다. 전체 293T 세포 용해액 중 40㎍을 3 내지 8% 구배 NU-PAGE에 로딩한다. 단백질을 PVDF 막에 전이시키고 M2 항-Flag mAb(1:1000) 또는 항-hCKIε mAb(1:750)를 사용하여 웨스턴 블롯팅한다. (C) hPER1의 람다 포스파타제 처리. 293T 세포를 hPER1 및 벡터(레인 1 및 4), hPER1 및 hCKIε(레인 2 및 5), 또는 hPER1 및 hCKIε-K38R(레인 3 및 6)으로 형질감염시키고, [35S]메티오닌(250μCi/㎖)으로 표지한다. 용해액을 M2 항-Flag mAb를 사용하여 면역침전시키고 재조합 람다 포스파타제 처리(레인 4, 5 및 6) 또는 모의 처리(레인 1, 2 및 3)한다.
도 3.hCKIε과 공-형질감염된 hPER1의 펄스 추적 표지화
293T 세포를 hPER1 및 벡터(패널 A) 또는 hPER1 및 hCKIε(패널 B)로 공-형질감염시킨다. 형질감염 3시간 후, 293T 세포를 [35S]메티오닌 및시스테인(1000μCi/㎖)으로 30분 동안 펄스 표지시키고 각각의 겔 상부에 나타낸 시간 동안 추적한다. 세포를 용해시키고 M2 항-Flag mAb로 면역침전시키고 hPER1을 8% SDS-PAGE 상에서 분리시킨다. 분자량 마커를 좌측에 나타낸다. (C) 바(bar) 그래프는 주변 영역의 인산영상화(phosphoimaging) 스캔을 나타내며 각각의 레인으로부터의 hPER1 밴드를 포함한다. 바(2 내지 30 시간)는 0 시간 시점의 계수와 비교하여 전체 분당 계수(cpm)의 백분율에 기초한다. 검은 바는 벡터와 공-형질감염된 hPER1을 나타낸다. 빗금친 바는 hCKIε과 공-형질감염된 hPER1을 나타낸다.
도 4.hPER1 및 hCKIε 사이의 단백질 상호작용(A, B, C 및 D)
293T 세포를 벡터 및 hCKIε(레인 1), 벡터 및 hPER1(레인 2) 및 hCKIε 및 hPER1(레인 3)로 형질감염시킨다. 형질감염 24시간 후, 세포를 수거하고 용해액을 제조한다. 용해액을 M2 항-Flag mAb(패널 A 및 C), HA mAb(패널 B), 또는 항-hCKIε mAb(패널 D)를 사용하여 면역침전시키고, 항-HA mAb(패널 A), M2 항-Flag mAb(패널 B 및 D), 또는 항-hCKIε mAb(패널 C)로 웨스턴 블롯팅한다. 레인 4에서, 웨스턴 블롯 분석은 지시된 mAb를 사용한 면역침전 전에 조 용해액 상에서 수행한다. 모든 단백질은 10% SDS-PAGE 상에서 분리시킨다.
도 5.hCKIε 인산화 부위의 맵핑
(A) 재조합 말단 절단된 hPER1 돌연변이체. 말단 절단된 돌연변이체는 하기재료 및 방법에 기술된 바와 같이 작제한다. ORF는 아미노산 잔기 1 내지 1289의 hPER1의 완전한 개방 판독 프레임을 나타낸다. N1, N2, N3, N4 및 C5의 생성을 위해서 사용된 제한 부위는 표 1에 나타낸다. 흰색 바는 분자량 변화를 나타내지 않는 돌연변이체를 나타낸다. 검은 바는 분자량 변화를 나타내는 돌연변이체를 나타낸다. ORF, N2, N3 및 N4의 빗금친 영역은 hCKIε에 의한 hPER1의 잠재적인 인산화 영역을 나타낸다. (B) 293T 용해액으로부터의 공-형질감염된 hPER1 말단 절단된 돌연변이체의 웨스턴 블롯 분석. 293T 세포는 hPER1 및 벡터(레인 1), hPER1 및 hCKIε(레인 2), 또는 hPER1 및 hCKIε-K38R(레인 3)로 공-형질감염시키고 hPER1은 M2 항-Flag mAb를 사용하여 웨스턴 블롯 분석한다. 분자량 마커를 좌측에 나타낸다. 화살표는 각각의 말단 절단된 돌연변이체의 이동 위치를 나타낸다. hPER1 ORF, 및 돌연변이체 N1 및 N2는 10% SDS-PAGE에서 통상적으로 분리시키는 반면, hPER1 돌연변이체 N3, N4, C1, C2, C5 및 C6은 12% SDS-PAGE에서 통상적으로 분리시킨다.
도 6.피리어드 mRNA 농도
시간은 하단 축에서 시간 단위로 제시되며, 다른 축은 시간에 대한 활성, 체온 및 Per mRNA 수준이다. Per mRNA 수준은 24시간 주기 동안 변동하며, 드로소필라에서 피리어드 길이와 역 상관 관계이다. 유사한 변동이 정상적인 Per 마우스에서 관찰되지만, Per 녹아웃 마우스는 변형된 일주기 리듬을 갖는다.
도 7.시계 단백질 경로
이는 시계 단백질 경로의 도시이다. hCKIδ 및/또는 ε은 PO4로 대표되는 바와 같이, 피리어드를 인산화시켜 이의 분해를 초래한다. Clock 및 BMal은 PAS 도메인에서 상호작용하며, 피리어드 mRNA의 전사를 개시시켜 피리어드 단백질의 수준을 증가시킨다.
도 8.시간 경과에 따른 피리어드 단백질 및 포스페이트 수준
하단 축은 24시간 주기 동안 시간 단위의 경과 시간이다. 다른 축은 피리어드 단백질(백색으로 표시) 및 인산화 수준(채색됨)이다. 일주기 개시 때, 피리어드 단백질 수준은 낮으며, 상대적으로 비인산화되어져 있다. 피리어드 단백질 수준이 증가하여 8pm 정도에서 정점에 도달하며, 피리어드 단백질의 상대적인 인산화 또한 증가하며, 피리어드 단백질 수준이 감소될 때까지 계속된다.
도 9.CKIε/사람 피리어드 1 공-형질감염
상부 우측 패널은 hPer1 인산화를 나타낸다. 제1 컬럼은 시험 화합물 1μM을 나타내고, 제2 컬럼은 시험 화합물 10μM를 나타내며, 제3 컬럼은 시험 화합물 30μM를 나타내며, 제4 컬럼은 Per 단독을 나타내고, 제5 컬럼 및 마지막 컬럼은 Per 및 hCKIε을 나타낸다. 상부 우측 패널은 대조군 시험 화합물을 나타낸다. 중간 패널은 CKIε 억제 시험 화합물 S943166을 나타내며 하단 우측 패널은 CKIε억제 시험 화합물 W0236을 나타낸다. 이러한 결과들은 Per 인산화의 억제는 단백질 안정성 및 수준의 증가를 초래한다는 것을 입증한다.
도 10.사람 피리어드 mRNA 수준
상단 그래프는 하단 그래프에서 나타낸 데이터의 도시이다. 하단 축은 시간 단위의 경과 시간이고, 다른 축은 RT-PCR로 측정된 바와 같은 Rat1 섬유아세포 또는 Rat SCN(교차상핵)의 상대적인 실시간 내인성 hPER1 mRNA 수준이다. 두 개의 시험 화합물이 제시되며, 박스로 나타낸 시험 화합물은 세포에 10μM로 부가되는 "C"이며, 삼각형으로 제시되는 제2 시험 화합물은 세포에 10μM로 부가되는 "F"(플루옥시틴)이다. 배양된 세포의 일주기 리듬은 시간 경과에 따라서 감소되며, 따라서, 반응에 대한 증폭도 시간 경과에 따라서 감소된다. 이러한 결과는 대조군 화합물은 CKI 활성을 변화시키지 않으며 또한 세포의 일주기 리듬을 변화시키지 않는다는 것을 나타낸다.
도 11.사람 피리어드 mRNA 수준
상단 그래프는 하단 그래프에 제시된 데이터의 도시이다. 하단 축은 시간 단위의 경과 시간이고, 다른 축은 RT-PCR로 측정된 바와 같은 Rat1 섬유아세포 또는 Rat SCN 세포의 상대적인 실시간 hPER1 mRNA 수준이다. 두 개의 시험 화합물이 제시되며, 박스로 표시된 시험 화합물은 10μM로 세포에 부가되는 "C"이며, 삼각형으로 제시되는 제2 시험 화합물은 10μM로 세포에 부가되는 S943166이다. 이러한결과는 시험 화합물을 S943166이 hPER의 mRNA 변동을 변화시켜 세포의 일주기 리듬을 변화시키며, 일주기 리듬을 약 20시간으로 단축시킨다는 것을 나타낸다.
본 발명은 포유동물의 일주기 리듬을 변화시키는 시험 화합물을 동정하는 방법, 및 보다 구체적으로는 사람 피리어드 단백질, 바람직하게는 사람 피리어드 1, 사람 피리어드 2 및/또는 사람 피리어드 3의 hCKIδ 및/또는 ε 인산화를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인산화된 사람 피리어드 단백질의 분해를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상이한 사람 피리어드 단백질의 인산화 또는 대안으로 분해를 변화시키는 능력과 비교해서 하나 이상의 사람 피리어드 단백질의 인산화 또는 대안으로 분해를 선택적으로 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 hCKIδ 및/또는 ε 인산화를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법, 및 세포에서 hCKIδ 및/또는 ε 인산화된 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 분해를 변화시키는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 안정성을 변화시키고 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 단백질 분해를 증가시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 포유동물의 일주기 리듬을 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 가지 양태는 hCKIδ 및/또는 ε에 의한 hPER1, hPER2 및 hPER3의 인산화를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 사람 피리어드 단백질의 인산화를 가능하게 하는 조건하에서 hPER1, hPER2 및 hPER3, 및 hCKIδ 및/또는 ε으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 사람 피리어드 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, 사람 피리어드 단백질의 인산화 수준을 측정함을 포함하여, hCKIδ 및/또는 ε에 의한 hPER1, hPER2 및 hPER3의 인산화를 억제하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것이다. 한 가지 바람직한 양태에서, 스크리닝 시스템은 포스페이트의 공급원을 포함한다. 바람직한 포스페이트의 공급원은 ATP이다.
용어 "아미노산"은 천연 및 비천연 아미노산의 광학 이성체, 즉 L-이성체 및 D-이성체 중 하나를 포함함을 의미한다. 따라서, 용어 "펩타이드"는 L-아미노산 단독으로 구성되는 펩타이드 뿐만 아니라 부분적으로 또는 전적으로 D-아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함함을 의미한다.
추가로, 용어 "아미노산"은 천연 단백질을 구성하는 20개 천연 아미노산 잔기 뿐만 아니라 다른 알파-아미노산, 베타-, 감마-, 및 델타-아미노산, 및 비천연 아미노산 등을 포함한다. 따라서, 단백질인 사람 피리어드 및 사람 hCKIδ 및/또는 ε은 아미노산 잔기 보존적인 아미노산 잔기로 변형될 수 있으며, 예를 들면 천연 단백질을 구성하는 알파-아미노산 잔기 뿐만 아니라 다른 알파-아미노산 잔기, 및 베타-, 감마-, 및 델타-아미노산 잔기, 비천연 아미노산 중 하나의 유사한 전하, 극성 또는 다른 특성을 갖는 것 등으로 변형될 수 있다. 적합한 베타-, 감마-및 델타-아미노산의 예는 베타-알라닌, 감마-아미노부티르산 및 오르니틴을 포함한다. 천연 단백질 이외의 다른 아미노산 잔기 또는 비천연 아미노산의 예는 3,4-디하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실글리신, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산 또는 니페코틴산을 포함한다.
용어 "hPER1", "hPER2", "hPER3", "hCKIδ" 및 "hCKIε"은 각각, 사람 피리어드 1, 사람 피리어드 2, 사람 피리어드 3, 사람 카제인 키나제 Iδ 및 사람 카제인 키나제 Iε의 전장 단백질 및 hPER1, hPER2, hPER3 및 hCKIδ 및/또는 ε 단백질의 대립형질 및 유도체를 포함한다. 유도체는 하나 이상의 상이한 아미노산에 의한 이들 단백질의 천연 형태의 변형, 말단 절단된 단백질 및 3' 또는 5'-'태그'를 함유하는 전장 또는 말단 절단된 단백질의 융합 단백질, 뿐만 아니라 상기 인용된 문헌에서 제공되는 천연 및 비천연 돌연변이체 서열, 및 진뱅크(Gene Bank) 같은 공지된 데이터베이스에 제출된 서열들을 포함한다. 이러한 단백질의 유도체는 MycTM-태그된, his-태그된, 또는 FlagTM에피토프 태그 서열 같은 리더, 에피토프, 또는 다른 단백질 서열을 함유하는 단백질을 포함한다. 사람 피리어드 1 서열은 진뱅크 승인 번호 AB002107, NID g2506044[1997년 3월 24일자로 H. Tei에 의해 제출됨]하에서 이용이 가능하다. 사람 피리어드 1 서열은 또한 문헌[Tei, H., et al., Nature 389:512-516 (1997)]에 공지되어져 있다. 사람 피리어드 2 서열은 진뱅크 승인 번호 NM003894, NID g4505710[T. Nagase 등에 의해 제출됨]하에서 이용이 가능하다. 사람 피리어드 2 서열은 또한 문헌[Nagase, T., et al., DNA Res.4(2):141-150 (1997) and Shearman, L.P., et al., Neuron 19(6):1261-1269 (1997)]에 공지되어져 있다. 사람 피리어드 3 게놈 서열은 진뱅크 승인 번호 Z98884하에서 이용이 가능하다. 사람 카제인 키나제 Iδ 서열은 진뱅크 승인 번호 U29171하에서 이용이 가능하다. 사람 카제인 키나제 Iδ는 또한 문헌[Kusda, J., et al., Genomics 32:140-143 (1996)]에 공지되어져 있다. 사람 카제인 키나제 Iε 서열은 진뱅크 승인 번호 L37043하에서 이용 가능하다. 사람 카제인 키나제 Iε은 또한 문헌[Fish, K.J., et al., J. Biol. Chem. 270:14875-14883 (1995)]에 공지되어져 있다. c-MYC 태그된 CKIδ는 데이비드 비셥 박사가 제공하였다.
용어 "염기 서열"은 이의 유도체를 포함하여 hPER1, hPER2, hPER3 또는 hCKIε을 암호화하는 RNA 서열 뿐만 아니라 DNA 서열을 의미한다.
본 발명에 따른 단백질 "hCKIδ 및/또는 ε"은 본원에 기술된 바와 같이 사람 Per 단백질 상에서 실질적으로 유사한 인산화 활성을 갖는 단백질 또는 이의 유도체이다. 단백질 hCKIδ 및/또는 ε은 천연 hCKIδ 및/또는 ε, 이의 대립형질 및 유도체의 실질적으로 유사한 활성을 갖는 단백질이다. hCKIδ 및/또는 ε은 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3에 대한 이의 키나제 활성을 보유하거나, hPER1, hPER2 및/또는 hPER3를 인산화시키는 이의 능력이 필수적으로 변화되지 않는 방식으로 변형된 다른 포유동물 카제인 키나제 I 단백질을 포함한다. hCKIδ 및/또는 ε의 사람 형태가 바람직하다. 그러나, hCKIδ 및/또는 ε의 다른 포유동물 형태의 사용도 허용되며, 이는 예를 들면, 사람 hCKIδ 및 랫트 hCKIδ는 97% 상동성이며, 키나제 도메인(284개 아미노산 잔기)내의 서열은 완전히 동일하기 때문이다. 변형된단백질은 hCKIδ 및/또는 ε의 말단 절단된 형태, 아미노산 치환, 결실, 부가 등을 함유하는 hCKIδ 및/또는 ε의 유도체를 포함하며, 이는 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3을 인산화시키는 능력을 보유한다. 카제인 키나제 I의 유도체는 MycTM-태그된, his-태그된, 또는 FlagTM에피토프 태그 서열 같은 리더, 에피토프, 또는 다른 단백질 서열을 함유하며, hPER1 인산화 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 상기 유도체는 정제를 촉진시키거나 세파로오스 비드에 부착될 수 있거나 용이한 검출을 가능하게 한다.
hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 유도체는 MycTM-태그된, his-태그된, 또는 FlagTM에피토프 태그 서열 같은 리더, 에피토프 또는 다른 단백질 서열을 함유하는 단백질을 포함하며, 이는 hCKIε에 의해 인산화되는 능력을 보유한다. 상기 유도체는 정제를 촉진시키고, 세파로오스 비드에 대한 부착을 가능하게 하거나 용이한 검출을 가능하게 한다. 바람직한 사람 피리어드 단백질은 하나 이상의 hCKIε 컨센서스 인산화 서열 "DXXS"(이때, D는 글루탐산 잔기이고, X는 모든 아미노산 잔기이며, S는 세린 잔기이다)를 갖는 단백질을 포함한다. 인산화는 S-Xn-S 모티프(이때, n은 1, 2, 3 또는 4이다)에 적합한 세린에서 일어나며 과인산화를 초래한다. 카제인 키나제 I에 대한 인산화 참조는 문헌[Flotow, H. and Roach, P.J., J. Biol. Chem. 266(6): 3724-3727 (1991)]에 특성화되어 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 사람 피리어드 단백질은 과인산화시킬 수 있다. hPER1에서 인산화 부위는 hPER1의 아미노산 743 내지 889번 사이에서 일어나며, 바람직하게는 hPER1의 아미노산 800 내지 820 사이에서 내지 가장 바람직하게는 hPER1의 아미노산 808 내지 815 사이에서 일어나거나, 대안으로 잠재적인 CKI 상호작용 도메인의 파괴를 위해서는 사람 PER1의 경우 아미노산 486 내지 503인 IQELSEQIHRLLLQPVH에서, 사람 PER2의 경우 아미노산 460 내지 477인 IQELTEQIHRLLLQPVH에서, 및/또는 사람 PER3의 경우 ITELQEQIYKLLLQPVH에서 일어난다. 본 발명의 한 가지 양태에서, hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 바람직한 유도체는 hPER1 아미노산 743 내지 889으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인산화 부위를 포함하거나, 잠재적인 CKI 상호작용 도메인의 파괴를 위해서는, hPER1의 경우 아미노산 486-503(IQELSEQIHRLLLQPVH)에서, 사람 PER2의 경우 아미노산 460-477(IQELTEQIHRLLLQPVH)에서, 및 사람 PER3의 경우 ITELQEQIYKLLLQPVH에서 선택되는 인산화 부위를 포함한다.
용어 "단백질 키나제 활성을 갖는 단백질"은 당해 분야의 숙련자에 의해서 단백질 키나제 활성을 갖는 것으로 평가된 단백질을 의미하며, 예를 들면, 스크리닝 시스템에서 사람 피리어드 단백질 하나 이상을 인산화시킬 수 있는 단백질이다. 스크리닝 시스템은 하기 실시예 중 하나에서 설정된 바와 같이 동일하거나 실질적으로 유사한 조건일 수 있다. 그러나, 인산화, 분해 또는 일주기 리듬 분석을 설정하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어져 있으며, 본 발명을 본원에서 제공된 특정 양태로 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 단백질은 예를 들면, 사람 조직으로부터 수득하고, 표준 재조합 기술로 재조합적으로 발현시키고/시키거나 임의로 화학적으로 변형시킬 수있다. 단백질의 재조합 발현이 바람직하다.
단백질의 "유도체"는 아미노산의 아미노 말단(N-말단) 또는 아미노산의 측쇄의 아미노 그룹 중 일부 또는 전부에서 아미노 그룹, 및/또는 아미노산의 카복실 말단(C-말단) 또는 아미노산의 측쇄의 카복실 그룹 중 일부 또는 전부에서 카복실 그룹, 및/또는 아미노산의 측쇄의 아미노 그룹 및 카복실 그룹 이외의 작용 그룹, 예를 들면, 수소, 티올 그룹 또는 아미도 그룹이 적합한 다른 치환체로 변형된 단백질을 포함한다. 적합한 다른 치환체에 의한 변형은 예를 들면, 단백질내 작용 그룹을 보호하고, 안전성을 개선시키거나 분석을 촉진시키기 위해서 수행되며, 예로서 세파로오스 비드에 단백질을 부착시키기 위한 작용 그룹의 부가를 들 수 있다. 한 가지 예는 5' 말단 또는 his-태그된 부위에서 프라이머에 부착된 FlagTM에피토프 태그 서열의 부가이다.
본 발명의 유도체는,
(1) 아미노산의 아미노 말단(N-말단)의 아미노 그룹 또는 아미노산의 측쇄의 아미노 그룹 중 일부 또는 전부의 수소 원자 하나 이상이 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹(이는 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 쇄일 수 있다, 예를 들면, 메틸 그룹, 에틸 그룹, 프로필 그룹, 이소프로필 그룹, 이소부틸 그룹, 부틸 그룹, t-부틸 그룹, 사이클로프로필 그룹, 사이클로헥실 그룹 또는 벤질 그룹), 치환되거나 치환되지 않은 아실 그룹(예를 들면, 포르밀 그룹, 아세틸 그룹, 카프로일 그룹, 사이클로헥실카보닐 그룹, 벤조일 그룹, 프탈로일 그룹, 토실 그룹, 니코티노일 그룹또는 피페리딘카보닐 그룹), 우레탄-유형 보호 그룹(예를 들면, p-니트로벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, p-비페닐이소프로필-옥시카보닐 그룹 또는 t-부톡시카보닐 그룹), 또는 유레아-유형 치환체(예를 들면, 메틸아미노카보닐 그룹, 페닐카보닐 그룹 또는 사이클로헥실아미노카보닐 그룹)으로 교체된 단백질;
(2) 아미노산의 카복실 말단(C-말단) 또는 아미노산의 측쇄의 일부 또는 전부에서 카복실 그룹이 에스테르화(예를 들면, 수소 원자(들)이 메틸, 에틸, 이소프로필, 사이클로헥실, 페닐, 벤질, t-부틸 또는 4-피콜릴로 교체된다), 또는 아미드화(예를 들면, 치환되지 않은 아미드, 또는 메틸렌아미드, 에틸렌아미드 또는 이소프로필아미드 같은 C1-C6알킬아미드가 형성된다)되는 단백질; 또는
(3) 아미노산의 측쇄의 아미노 그룹 및 카복실 그룹 이외의 작용 그룹, 예를 들면, 수소, 티올 그룹 또는 아미도 그룹의 일부 또는 전부가 (1)에서 기술된 치환체들 또는 트리틸 그룹으로 교체되는 단백질을 포함한다.
용어 "변화시키는"이란 시험 화합물의 부재하에서의 인산화와 비교하여 hCKIδ 및/또는 ε에 의한 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 인산화를 억제 또는 증강시키는 시험 화합물의 능력을 의미한다. 대안으로, "변화시키는"이란 또한 표준(standard) 같은 상이한 화합물의 인산화와 비교하여 hCKIδ 및/또는 ε에 의한 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 인산화를 억제 또는 증강시키는 시험 화합물의 능력을 의미한다. hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 인산화를 억제 또는 증강시키는 화합물의 능력을 hCKIδ 및/또는 ε 단백질의 천연 형태에 대해서 측정하는 것이바람직하다.
용어 "스크리닝 시스템"은 hCKIδ 및/또는 ε에 의한 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 인산화를 가능하게 하는 적합한 조건의 세트를 의미한다. 일반적으로, 스크리닝 시스템은 포스페이트의 준비된 공급원을 함유한다. 포스페이트의 바람직한 공급원은 ATP의 준비된 공급원이다. 스크리닝 시스템은 세포-기초이거나 시험관내 시스템일 수 있다. 세포-기초 스크리닝 시스템은 hPER1, hPER2, hPER3 및/또는 hCKIδ 및/또는 ε 중 하나 또는 각각을 발현하는 세포를 사용하는 것을 포함한다. 스크리닝 방법은 세포 또는 세포-비함유 시스템일 수 있다. 적합한 세포 시스템은 효모 세포(예를 들면, 에스. 세레비지애), 세균 세포(예를 들면, 이. 콜라이), 곤충 세포(예를 들면, 배큘로바이러스성 발현 시스템에서 사용되는 것), 선충 세포, 포유동물 세포[예를 들면, COS 세포, 임파구, 섬유아세포(예를 들면, 3Y1 세포, NIH/3T3 세포, Rat1 세포, Balb/3T3 세포 등), 사람 배아 신장 세포(예를 들면, 293T 세포), CHO 세포, 혈액 세포, 종양 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 뇌 세포]를 포함한다. 바람직한 세포 시스템은 교차상핵 세포, 신경 세포, 골수 세포, 신경교 세포 및 성상 세포이다. 세포 기초 시스템에서, 세포 시스템이 사람 피리어드 단백질 및/또는 hCKIε을 발현하지 않는 경우, 세포는 사람 피리어드 단백질 및/또는 hCKIε 중 하나 또는 모두를 발현시키도록 형질감염 또는 형질전환되어야 한다. 대안으로, 세포 -비함유 시스템을 사용할 수 있다. 부분적으로 정제된 또는 정제된 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3, 및 hCKIδ 및/또는 ε은 각각 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3, 및 hCKIδ 및/또는 ε을 발현하는 재조합 공급원으로부터 수득할 수 있으며, 이로써 상기 단백질을 암호화하는 원래 mRNA의 내재하는 염기 서열은 변형된다.
세포에서 사람 피리어드 단백질 및/또는 hCKIδ 및/또는 ε의 재조합 발현은 예를 들면, 프로모터 및 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3, 및 hCKIδ 및/또는 ε을 암호화하는 cDNA를 함유하는 적합한 발현 벡터 하나 이상으로 형질감염시킨 결과일 수 있다. 세포-기초 스크리닝 시스템은 또한, 사람 피리어드 단백질 및/또는 hCKIδ 및/또는 ε을, Antennepedia 형질도입 단편인 HIV로부터 수득된 TAT 단백질 같은 형질도입 또는 형질도입성 서열을 갖는 융합단백질로서 또는 외인성 단백질을 세포내로 도입하는 임의의 다른 방법으로, 세포내로 삼출시키거나 형질도입시키는 세포의 사용을 포함한다.
바람직한 시험관내 스크리닝 시스템은 포스페이트의 준비된 공급원을 포함하는 수성 조성물을 포함한다. 바람직한 시험관내 스크리닝 시스템은 ATP를 포함한다.
사람 피리어드 단백질의 인산화 수준을 측정하기 위한 방법의 예는 방사능 표지된 인 및 자동 방사선사진술의 사용, 또는 부가된 방사선 표지된 인과 결합되지 않은 인의 수득량을 간접적으로 비교함으로써, 단백질 인산화의 양을 검출하는 표준 방법들을 포함한다. 대안으로, 비색계 또는 다른 검출 방법을 사용하여 인산화 수준을 측정할 수 있다. 사람 피리어드 단백질의 인산화 수준을 측정하는 또 다른 적합한 방법은 글루타티온 세파로오스 비드를 사용하는 세포-비함유 시스템을 포함하며, 여기서, 사람 피리어드 단백질 또는 hCKIε중 하나는 세파로오스 비드같은 고체 지지체에 고정시키고 hCKIε 또는 사람 피리어드 단백질 중 하나를 부가한다. 또한, 수 많은 사람 피리어드 단백질의 양을 검출하는 대안적인 방법들이 이용 가능하며,35S-표지된 사람 피리어드 단백질 분해, 비색계 분석, 결합된 사람 피리어드 단백질의 용출 등의 사용을 포함한다.
본원에 기술된 스크리닝 방법은 특히 이들이 자동화될 수 있는 것이 유용하며, 이는 임의로 디자인된 시험 화합물 또는 합리적으로 디자인된 시험 화합물 중 어느 하나의 대량의 시험 화합물을 고효율 스크리닝하여, 사람 피리어드 단백질의 인산화 및/또는 분해 수준을 효과적으로 조절하거나 변화시켜 포유동물의 일주기 리듬을 변화시키는 시험 화합물을 동정하는 것을 가능하게 한다.
용어 "포유동물"은 사람, 영장류, 개, 돼지, 소 및 다른 고등 유기체를 의미한다. 사람 및 영장류가 보다 바람직한 포유동물이다. 사람이 가장 바람직하다.
본 발명에 사용하기 위한 시험 화합물은 모든 생물학적 또는 소분자 화학적 화합물, 예를 들면, 단순 또는 복합 유기 분자, 펩타이드, 펩타이드의 유사체, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 미생물 배양으로부터 수득된 화합물, 천연 또는 합성 유기 화합물, 및/또는 천연 또는 합성 무기 화합물을 포함한다. 스크리닝하고자 하는 시험 화합물의 선택은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있다.
본 발명은 또한, (1) hCKIδ 및/또는 ε 단백질, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 사람 피리어드 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (2) 사람 피리어드 단백질의 인산화 수준을 측정함을 포함하여, 하나 이상의 사람 피리어드 단백질의 인산화를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) hCKIδ 및/또는 ε 단백질, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 두 개 이상의 상이한 hPER 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (2) 사람 피리어드 단백질의 인산화 수준을 측정함을 포함하여, 사람 피리어드 단백질의 인산화를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
대안으로, 본 발명은 (1) hCKIδ 및/또는 ε 단백질, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 hPER 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (2) hCKIδ 및/또는 ε 단백질, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 hPER 단백질(이때, (2)에서 선택된 hPER 단백질은 (1)에서 선택된 hPER 단백질이 아니다)을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (3) (1) 및 (2)에서 사람 피리어드 단백질의 인산화 수준을 측정하며, (4) 시험 화합물이 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 인산화를 변화시키는데 선택적인지를 측정하기 위해서 각각의 사람 피리어드 단백질에 대해 (3)에서 수득된 결과를 비교함을 포함하여, 사람 피리어드 단백질의 인산화를 선택적으로 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법을 포함한다.
대안으로, 본 발명은 (1) hCKIδ 및/또는 ε 단백질, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 hPER 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (2) 시험 화합물의 부가 후 사람 피리어드 단백질의양을 측정하며, (3) 단계 (2)에서 수득된 사람 피리어드 단백질의 양을 스크리닝 시스템내 사람 피리어드 단백질의 양과 비교함을 포함하여, 사람 피리어드 단백질의 분해를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법을 포함한다.
대안으로, 본 발명은 (1) hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 hPER 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물 및 hCKIδ 및/또는 ε 단백질을 부가하고, (2) 시험 화합물 및 hCKIδ 및/또는 ε 단백질을 부가 한 후 사람 피리어드 단백질의 양을 측정하며, (3) 단계 (2)에서 수득된 사람 피리어드 단백질의 양을 스크리닝 시스템내 사람 피리어드 단백질의 양과 비교함을 포함하여, 사람 피리어드 단백질의 분해를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법을 포함한다.
대안으로, 본 발명은 (1) 시험 화합물, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 hPER 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 hCKIδ 및/또는 ε 단백질을 부가하고, (2) hCKIδ 및/또는 ε 단백질의 부가 후 사람 피리어드 단백질의 양을 측정하며, (3) 단계 (2)에서 수득된 사람 피리어드 단백질의 양과 스크리닝 시스템내 사람 피리어드 단백질의 양을 비교함을 포함하여, 사람 피리어드 단백질의 분해를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법을 포함한다.
본 발명은 hPER1의 아미노산 743 및 889 사이에서, 바람직하게는 hPER1의 아미노산 800 및 820 사이에서, 및 가장 바람직하게는 hPER1의 아미노산 808 및 815 사이에서 hPER1을, 또는 대안으로 사람 PER1의 잠재적인 CKI 상호작용 도메인의 파괴를 위해서는 아미노산 486 내지 503인 IQELSEQIHRLLLQPVH에서, 사람 PER2에 있어서는 아미노산 460 내지 477인 IQELTEQIHRLLLQPVH에서, 및/또는 사람 PER3에 있어서는 ITELQEQIYKLLLQPVH에서 인산화시키는 hCKIδ 및/또는 ε의 능력을 변화시키는 화합물에 의해 hPER1의 분해를 변화시키는 방법을 포함한다.
하기되는 바와 같이, 인산화된 hPER1 단백질은 신속하게 분해되기 때문에, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 hPER1의 분해를 선택적으로 활성화시키거나 억제하는 시험 화합물을 동정하는데 사용할 수 있다. 인산화된 hPER2 및 hPER3 단백질은 신속하게 분해되기 때문에, 본 방법은 각각, hPER2 또는 hPER3의 분해를 선택적으로 활성화시키거나 억제하는 시험 화합물을 동정하는데 사용할 수 있다. 본 발명은 또한, hPER1, hPER2 및/또는 hPER3 중 어느 하나의 인산화를 활성화 또는 억제시키는데 대한 화합물의 효과를 측정하고, 동일하거나 상이한 시험 화합물로 수득한 결과를 비교함으로써, hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 인산화를 선택적으로 활성화하거나 억제하는 화합물을 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 인산화된 hPER1 단백질은 신속하게 분해되기 때문에, 본 발명의 방법은 시험 화합물의 부재하에서의 동일하거나 상이한 사람 피리어드 단백질의 수준과 비교하여 세포내에서 사람 피리어드 단백질의 수준을 선택적으로 증가시키거나 감소시키는 시험 화합물을 동정하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 한 가지 바람직한 양태에서, 본 방법은 시험 화합물의 부재하에서의 hPER1의 수준과 비교하여 세포내에서 hPER1의 수준을 선택적으로 증가시키거나 감소시키는 시험 화합물을 동정하는데 사용된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 본 방법은 시험 화합물의 부재하에서의 hPER2의 수준과 비교하여 세포내에서 hPER2의 수준을 선택적으로 증가시키거나 감소시키는 시험 화합물을 동정하는데 사용한다.
또한, 본 발명은 시험 화합물의 존재하에서 hPER2의 분해 양과 비교하여 세포내에서 hPER1의 분해 양을 선택적으로 억제하는 시험 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 방법은 시험 화합물의 존재하에서의 hPER1의 분해 양과 비교해서 세포내에서 hPER2의 분해 양을 선택적으로 억제하는 시험 화합물을 동정하는데 사용한다.
대안으로, 본 발명은 시험 화합물의 부재하에서의 hPER2 및/또는 hPER3 각각의 수준에 비해서, 또는 대안으로 상이한 사람 피리어드 단백질의 수준에 비해서, 세포내에서 hPER2 및/또는 hPER3의 수준을 선택적으로 증가시키거나 감소시키는 시험 화합물을 동정하는데 사용할 수 있다. 본 발명은 이의 천연 수준에 비해서 세포내에서 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 수준을 선택적으로 증가시키거나 감소시키는 화합물을 동정하는데 사용할 수 있다. 생물학적 또는 화학적 처리, 예를 들면, 내인성 및/또는 외인성 자극(예를 들면, 빛, 성장 인자, 전사 인자 등)의 부가, 억제 또는 변화 이후, 사람 피리어드 단백질의 수준에 대한 상이한 시험 화합물의 결과를 비교할 수 있다.
인산화된 hPER 단백질은 포유동물의 일주기의 조절에 밀접하게 관여하는 것으로 공지되어져 있다. 따라서, 본 발명은 시험 화합물 또는 자극의 부재하에서 포유동물의 일주기의 생리학적 반응에 영향을 미치거나 조절하거나 그밖에 변화를 야기하는 시험 화합물을 동정하는데 사용할 수 있다. 포유동물의 일주기 조절은시험 화합물의 부재하에서 자극에 반응하는 포유동물의 정상적인 일주기의 변화를 예방하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 정상적으로 포유동물의 일주기 리듬을 변화시키는 자극에 반응하는 포유동물의 일주기 리듬의 변화를 예방할 수 있는 시험 화합물을 동정하는 방법을 포함한다.
사람 피리어드 1의 인산화에 대한 사람 카제인 키나제 Iε의 효과를 입증하는 하기 실시예는 사람 피리어드 2 및/또는 사람 피리어드 3으로 대체하여 변형시킬 수 있다. 유사한 결과를 사람 카제인 키나제 I hCKIδ를 사용하여 수득한다.
정제된 재조합 hCKIε은 시험관내에서 hPER1을 인산화시키지만, hCKIε의 키나제 네가티브 돌연변이체(hCKIε-K38R)은 인산화시키지 못한다. 293T 세포에서 야생형을 사용한 공-형질감염의 경우, hPER1은 분자량 변화에 의해 입증되는 바와 같이, 인산화에서 유의한 증가를 나타낸다. hPER1 단백질은 또한, 형질감염된 hCKIε 뿐만 아니라 내인성 hCKIε과 함께 공-면역침전될 수 있으며, 이는 hPER1 및 hCKIε 사이의 물리적인 연결을 나타낸다. 또한, hCKIε에 의한 hPER1의 인산화는 hPER1내에서의 단백질 안정성을 감소시킨다. 인산화되지 않은 hPER1은 24시간 일주기 동안 세포내에서 안정하게 유지되는 반면, 인산화된 hPER1은 약 12시간의 반감기를 갖는다. 다양한 hPER1 말단 절단된 돌연변이체를 사용한 결과, hPER1 내의 잠재적인 인산화 부위는 아미노산 743 내지 889이며, 이는 CKI 컨센서스 인산화 부위를 함유한다.
드로소필라 DBT의 포유동물 동족체인 hCKIε이 hPER1을 인산화시킬 수 있는지를 조사하기 위해서, 재조합 his-태그된 야생형-hCKIε을 이. 콜라이에서 발현시키고, 정제하고 hPER1 뿐만 아니라 공지된 한 쌍의 기질인 카제인 및 GST-IκBα를 인산화시키는 이의 능력에 대해서 분석한다. 재조합 hCKIε은 카제인 및 IκBα 기질 모두를 인산화시킨다(도 1A, 레인 2 및 3). 정제된 야생형 hCKIε은 자가 인산화된다. 자가 인산화하는 능력은 hCKIε활성을 나타낸다(도 1A, 레인 1 및 2). 인산화는 재조합 hCKIε이 부재하는 경우에는 관찰되지 않는다(도 1A, 레인 7 및 8).
ATP 결합 도메인내의 라이신 38이 아르기닌으로 돌연변이되는, hCKIε-K38R의 키나제 네가티브 돌연변이체는 카제인 및 IκBα 기질 모두의 인산화에 대해서 분석된다. hCKIε-K38R은 자가 인산화 활성을 갖지 않으며 카제인 또는 GST-IκBα 기질을 인산화시키지 못한다(도 1A, 레인 4 내지 6). 이는 이전의 인산화 활성이 야생형 hCKIε에 대해서 특이적임을 입증한다.
재조합 hCKIε은 또한 시험관내에서 hPER1을 인산화시키는 것으로 보인다. 도 1B에서 나타낸 바와 같이, 재조합 hCKIε의 부재하에서는 어떠한 인산화도 관찰되지 않는다(레인 8 내지 10). hCKIε의 존재는 시험관내에서 hPER1의 인산화를 초래하지만, Flag-태그된 루시퍼라제를 인산화시키지는 못한다(레인 2 및 3). hPER1의 인산화는 hPER1 관련된 키나제 활성에 기인하는 것이 아니며, 이는 hCKIε이 또한, 열 불활성화된 hPER1 면역침전물을 인산화시키기 때문이다(레인 6). 또한, hCKIε-K38R은 hPER1에 대한 어떠한 키나제 활성도 갖지 않는다(레인 7). 따라서, hCKIε은 시험관내에서 직접적으로 hPER1을 인산화시킨다.
hCKIε은 flag-태그된 hPER1, 및 벡터 대조군, 야생형 hCKIε 또는 hCKIε-K38R과 함께 공-형질감염된 293T 세포에서 hPER1을 특이적으로 인산화시킨다. 세포는 형질감염시킨 24시간 후 용해시키고, 용해물을 3 내지 8% SDS NU-PAGE 상에서 분리하고 웨스턴 블롯 분석한다. 도 2A는 야생형 hCKIε 및 hPER1으로 공-형질감염시킨 세포내에서, 벡터 대조군 또는 hCKIε-K38R로 공-형질감염시킨 세포와 비교하여 hPER1 단백질의 분자량에서 유의한 변화가 관찰됨을 나타낸다(레인 1 내지 3). hPER1 분자량에서 유사한 변화가 상이한 퍼센트의 SDS-PAGE를 사용하는 수 차례의 공-형질감염 실험에서 항상 관찰된다. 웨스턴 블롯 분석은 야생형 hCKIε 및 hCKIε-K38R 단백질 모두가 동일한 수준으로 발현됨을 나타낸다(도 2B, 레인 2 내지 5).
Flag-태그된 hPER1, 및 벡터 대조군, hCKIε 또는 hCKIε-K38R의 키나제-네가티브 돌연변이체로 293T 세포를 공-형질감염시키고 [35S]메티오닌 및 시스테인으로 방사능 표지한 결과, 인산화 이후에 hPER1 분자량에서 변화가 야기되었다.35S-표지된 hPER1은 면역침전되며 정제된 재조합 람다 포스파타제로 처리하거나 처리하지 않는다. 도 2C에 나타낸 바와 같이, 면역침전된35S-방사능 표지된 hPER1은 세포를 야생형 hCKIε으로 공-형질감염시키는 경우 분자량의 변화를 나타내지만, 벡터 또는 hCKIε-K38R의 키나제-네가티브 대조군으로 공-형질감염시키는 경우에는 분자량의 변화를 나타내지 않는다(레인 1, 2 및 3). 공-형질감염된 hPER1 및 야생형 hCKIε 세포로부터의 단백질의 분자량 변화는 람다 포스파타제로 처리한 1시간 후에는 현저하게 감소된다. 이는 hPER1의 이동성의 변화는 인산화에 기인한다는것을 입증한다(도 2C, 레인 2 및 5). 람다 포스파타제로 처리한 1시간 후, hCKIε 공-형질감염된 세포 대 벡터 대조군 및 키나제 네가티브 공-형질감염된 세포로부터의 모든 hPER1의 이동성이 서로 본질적으로 구별되지 않는다(도 2C, 레인 4, 5 및 6).
람다 포스파타제 이동성 변화는 오염된 프로테아제에 기인하는 것이 아니다. 람다 포스파타제 반응에 50mM 나트륨 플루오라이드(포스파타제 억제제)를 부가하면 hPER1의 이동성 변화의 감소가 차단된다. 면역침전물내에는 어떠한 다른 고분자량 형태의 hPER1도 존재하지 않으며, 이는 hPER1의 해독후 이동성 변화는 인산화에 기인하는 것임을 나타낸다.
일주기 동안, PER 단백질은 축적되며 이러한 축적은 이의 후속적인 분해를 초래한다[Edery, I., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2260-2264, Dembinska, M.E., et al. (1997) J. Biol. Rhythms 12, 157-172]. PER 단백질이 축적되는 단계 동안, 상기 단백질의 인산화에 기인할 수 있는 분자량의 현저한 변화가 생긴다. 이동성 변화는 PER이 사라지기 직전에 최대치에 도달한다[Edery, I., et al. (1994) 상기]. hPER1 및 야생형 hCKIε , 또는 벡터 대조군 모두를 암호화하는 발현 플라스미드를 사용하여 공-형질감염된 293T 세포를 사용하여, hPER1의 인산화가 이의 세포내 불안정성을 초래한다는 것을 입증한다. 형질감염 약 20시간 후, 세포를 [35S]메티오닌/시스테인을 사용하여 30분 동안 펄스 표지한 후 0 내지 30시간 동안 추적한다. 적당한 시간 후, hPER1을 수거하고, 면역침전시키고SDS-PAGE로 분석한다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, hPER1 및 벡터 단독으로 공-형질감염시킨 세포는 시간 경과에 따라서 이동성이 거의 변화하지 않는다(레인 1 내지 7). 30시간 시점에서 미약하게 증가된 단백질의 손상으로 지시되는 바와 같이, 12시간 후, 분자량에서 미약한 변화가 나타난다. 대조군 세포내에 존재하는 hPER1의 양은 시간 경과에 따라서 상대적으로 일정하게 유지된다. 방사능 표지 2시간 후, 대략 50% hPER1 단백질이 여전히 세포내에 존재하며 이러한 수준은 시간 경과에 따라서도 일정하게 유지된다(도 3C, 검은 바). 대조군 벡터와는 다르게, hPER1 및 야생형 hCKIε으로 공-형질감염시킨 세포는 방사능 표지 2시간 후에 이동성 변화를 나타낸다(도 3B, 레인 1 및 2). 이러한 분자량의 변화는 시간 경과에 따라서 지속되고 보다 더 심화되어 24 및 30시간 사이에서 최대 변화에 도달하게 된다(도 3B, 레인 2 내지 7). 벡터 대조군과는 다르게, hCKIε로 공-형질감염시킨 293T 세포로부터의 hPER1은 단백질 안정성의 감소를 나타낸다. 벡터 대조군과 유사하게, 2시간 시점에서, hCKIε 공-형질감염된 세포로부터의 전체 hPER1의 50%가 세포내에 존재한다(도 3B, 레인 2, 및 도 3C, 빗금친 바). 벡터 대조군과는 다르게, 인산화된 hPER1의 단지 1/2 만이 12시간 후에 세포에 잔류한다. 24시간 후에는, 인산화된 hPER1의 대략 14%만이 존재한다(도 3B, 레인 5 및 6, 및 도 3C, 빗금친 바). 본 실험은 3회 반복하며 유사한 결과를 야기한다. 야생형 hCKIε에 의한 hPER1의 인산화는 단백질 안정성 감소 및 결과적으로 이의 분해를 초래한다.
hPER1 및 hCKIε은 293T 세포내에서 물리적으로 상호작용한다. 293T 세포는 Flag-태그된 hPER1 및 벡터 단독 또는 HA-태그된 hCKIε로 공-형질감염시킨다. 형질감염된 293T 세포를 용해시키고 hPER1을 항-Flag mAb로 면역침전시킨 후 항-HA mAb로 면역블롯팅한다. 대안으로, hCKIε을 항-HA mAb로 면역침전시킨 후 항-Flag-태그된 mAb로 면역블롯팅한다. 도 4A 및 4B는 재조합 hCKIε이 hPER1과 함께 공-침전됨을 나타내며, 이는 hCKIε이 직접적으로 hPER1과 결합한다는 것을 나타낸다. 293T 세포를 hPER1 단독으로 형질감염시켜 바로 hPER1임을 입증한다. 세포를 용해시키고 hPER1을 항-Flag mAb로 면역침전시킨 후 항-hCKIε mAb로 면역블롯팅한다. 대안으로, 내인성 hCKIε을 항-hCKIε mAb로 면역침전시킨 후 항-Flag mAb로 면역블롯팅한다. 내인성 hCKIε은 hPER1과 공-침전되며 이는 두 단백질 사이에 물리적 결합을 나타낸다(도 4C및 4D).
hCKIε는 아미노산 621 및 889 사이에서 hPER1을 인산화시킨다. 도 2A는 hPER1의 분자량 변화가 hCKIε에 의한 인산화에 기인한다는 것을 나타낸다. hCKIε에 의해 인산화된 hPER1의 인산화 부위(들)를 확인하기 위해서, hPER1의 말단 절단된 형태를 도 5A 및 하기 재료 및 방법에서 기술된 바와 같이 제조한다. 이러한 작제물들을 벡터, hCKIε 또는 hCKIε-K38R과 함께 293T 세포에 형질감염시키고, 분자량의 변화에 대해서 분석한다. 도 5B, 레인 2에 나타낸 바와 같이, hCKIε 및 전장 개방 판독 프레임 hPER1(ORF), N2, N3 또는 N4를 사용하여 공-형질감염시킨 세포는 상기 단백질의 분자량 변화를 나타낸다. 말단 절단된 hPER1 단백질의 람파 포스파타제 처리는 상기 변화를 사라지게 하며, 이는 hCKIε에 의한 인산화에 기인한다. N1 또는 C-말단 작제물 C1, C2, C5 또는 C6으로 공-형질감염시킨 hCKIε는 상기 단백질의 분자량 변화를 나타내지 않는다(도 5B 및 5C, 레인 2). 분자량 변화를 나타내는 말단 절단된 작제물(ORF, N2, N3 및 N4)는 아미노산 621 내지 889의 상동성 영역을 공유한다(도 5A 참조). 아미노산 584 내지 743을 함유하는 C1은 변화를 나타내지 않기 때문에, hCKIε는 아미노산 743 및 889 사이에서 hPER1을 인산화시킨다. 몇몇 CKI 인산화 컨센서스 서열이 hPER1 도처에 위치하며, hCKIε에 의해 인산화되는 것으로 보이는 hPER1의 영역 중 하나를 포함하며, 특히 아미노산 808 내지 815를 포함하는 서열: DSSSTAPS을 포함한다. 모든 세린 및 트레오닌은 hCKIε에 대한 기질로서 작용하며, 이는 관찰되는 극적인 이동성 변화를 설명할 수 있다.
재료 및 방법
실시예 1
플라스미드 작제, 발현 및 단백질의 정제
야생형 hCKIε를 암호화하는 cDNA를 사람 태반 cDNA 라이브러리로부터 이전에 기술된 방법[Fish, K.J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14875-14883]을 사용하여 분리한다. hCKIε의 세균 벡터(pRST-CKIε) 및 포유동물 발현 벡터(pCEP4-CKIε)로의 클로닝은 문헌[Cegielska, A., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 1357-1364, Rivers, A., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 15980-15984]에 기술된 바와 같다. 헤마글루티닌(HA) 에피토프 태그(YPDYDVPDYA)를 pCEP4-CKIε내의 hCKIε의 5' 말단에 부가한다. 전장 hPER1[Tel, H., et al., (1997) Nature 389, 512-516]를 EcoRI 및 SalI으로 절단하고 플라스미드 벡터pCMV-TagTM(제조원: Stratagene)에 결합시켜 프레임내에 Flag 태그를 갖는 융합체를 생성시킨다. 말단 절단된 N-말단 돌연변이체(N1, N2, N3, N4, C5)를 PER1을 각각 EcoRI/EcoRV, EcoRI/XhoI, EcoRV/XhoI, PvuII/XhoI, 또는 BamHI/SalI로 절단시켜 생성시키고, 동일한 벡터내로 결합시킨다. 돌연변이체 C1, C2 및 C6를 작제하기 위해서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 PCR 반응에서 사용하여 아미노산 584 내지 743, 998 내지 1160, 또는 1161 내지 1289를 각각 암호화하는 DNA 단편을 주형으로써 hPER1 cDNA를 사용하여 증폭시킨다. 수득되는 단편은 표 1에서 요약한다.
hPER1의 전장 및 말단 절단된 형태
명칭 제1 아미노산 마지막 아미노산
RF 1 1289
N1 1 485
N2 1 889
N3 486 889
N4 621 889
C1 584 743
C2 998 1160
C5 1127 1289
C6 1161 1289
FlagTM에피토프 태그 서열을 5' 말단에서 프라이머에 부가한다. PCR 생성물을 포유동물 발현 벡터 pcDNA3 Topo vectorTM(제조원: Invitrogen)내로 클로닝한다. 문헌[Cegielska, A., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 1357-1364]에 기술된 바와 같이 세균 발현된 히스티딘-태그된 hCKIε 및 hCKIε-K38R을 발현시키고 정제한다. c-MYC 태그된 CKIε은 데이비드 비셥 박사로부터 제공받았다. 90% 이상 균질하고 분자량이 대략 54 kDa인 단백질이 정제된다.
실시예 2
293T 세포의 형질감염 및 방사능 표지화
사람 배아 신장 세포 293T 세포를 10% 소 태아 혈청(제조원: Hyclone)으로 보충된 DMEM 중 6웰 플레이트에서 성장시킨다. 대략 80%의 밀도에서 세포를 제조업자의 지침에 따라서 lipofectAMINETM시약(제조원: Life Technologies)를 사용하여 DNA 2㎍으로 형질감염시킨다. 293T 세포의 일시적인 형질감염 효율은 GFP 대조군 플라스미드 형질감염으로 모니터링되는 바와 같이, 전형적으로 30 내지 50%이다.
형질감염 16시간 후, 293T 세포를 메티오닌 및 시스테인 결핍 배지 중에서 30분 동안 [35S]메티오닌/시스테인 0.5μCi/㎖로 방사능 표지시킨다. 이후, 세포를 디쉬에 넣고 지정된 시간 동안 정상적인 DMEM 중에서 배양한다. 세포를 용해 완충액(20mM 트리스, 1% 트리톤 X-100TM, 0.5% IgepalTM, 150mM NaCl, 20mM NaF, 0.2mM Na2VO4, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 완전한 프로테아제 억제제 칵테일[제조원: Boeriger Mannheim], pH 7.5)으로 용해시킨다. 용해액을 12,000rpm에서 원심분리시켜 세포 분쇄물을 제거하여 투명하게 만든다. 상등액을 수거하고 사용할 때까지 -70℃에서 저장한다.
실시예 3
면역침전 및 웨스턴 블롯 분석
동일한 양의 단백질(전체 100㎍)을 함유하는 용해액을 항-Flag, 항-HA 또는 항-hCKIε mAb 중 하나의 1:500 희석액 5㎕와 혼합하고 밤새 4℃에서 항온처리한다. 항체와의 항온처리 후, G-단백질 세파로오스 비드의 1:1 슬러리 30㎕를 부가하고 2 내지 4시간 동안 추가로 항온처리한다. 비드를 용해 완충액으로 5회 세척하고 후속적으로 5mM DTT와 함께 SDS 샘플 완충액 30㎕에 재현탁시키고, 가열하고 SDS-PAGE로 분석한다. 단백질의 웨스턴 블롯팅은 문헌[Yao, Z., et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 32378-32383]에 기술된 바와 같이, 형질감염된 293T 세포로부터의 상등액 또는 면역침전된 단백질 상에서 1:1000 희석액의 항-FlagTM(제조원: Sigma), 1:1000 희석액의 항-HA(제조원: Invitrogen), 또는 1:750 희석액의 항-hCKIε(제조원: Transduction Laboratories)를 사용하여 수행한다.
실시예 4
키나제 및 포스파타제 분석
hCKIε는 카제인 또는 GST-IκBα를 기질로 사용하여 활성을 분석한다. 카제인 또는 GST-IκBα(0.5㎍)를 200nM ATP, 10mM MgCl2, 0.6mM EGTA, 및 0.25mM DTT를 함유하는 PBS 중 hCKIε(0.1㎍) 및 [γ-32P]ATP(제조원: Amersham) 5μCi와 혼합한다. 반응물은 실온에서 30분 동안 항온처리하고, SDS 샘플 완충액을 부가하여종결시킨 후 SDS-PAGE로 분석한다. GST-IκBα는 SDS-PAGE에서 hCKIε과 유사한 위치에서 이동하기 때문에, 약간 변형된 프로토콜을 수행한다. 30분 항온처리 후, GST-IκBα를 글루타티온-세파로오스 비드를 부가하여 키나제 반응로부터 제거한다. 비드를 용해액에서 5회 세척하여 모든 오염성 hCKIε를 제거한 후 SDS 샘플 완충액을 부가한다. 겔을 쿠마시 블루 R-250으로 염색하고, 건조시키고 방사능사진을 촬영한다.
35S-표지된 hPER1의 면역침전은 상기 기술된 바와 같다. hPER1을 함유하는 비드를 포스파타제 완충액(100mM MES, 0.5mM 디티오트레이톨 DTT, 0.2mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 아프로티닌 20㎍/㎖, 류펩틴 10㎍/㎖, 펩스타틴 A 10㎍/㎖, pH 6.0) 중에서 추가로 3회 세척하고 포스파타제 완충액 20㎕에 재현탁시킨다. 포스파타제 처리는 10x 반응 용액(50mM 트리스-HCl, 0.1mM EDTA, 5mM DTT 0.01% Brij 35, 2mM MnCl2, pH 7.0), 및 정제된 람다 포스파타제 40단위를 부가하여 개시시킨다. 반응은 37℃에서 1시간 동안 진행시킨다. 포스파타제 활성의 억제는 50mM 나트륨 플루오라이드를 부가하여 달성한다. 적당한 항온처리 후, 반응은 SDS 샘플 완충액을 부가하여 종결시킨다. 단백질을 SDS-PAGE를 사용하여 분리시키고, 겔을 건조시키고 방사능사진을 촬영한다. 이미지를 Molecular Dynamics PhosphoImagerTM을 사용하여 가시화시킨다.
실시예 5
사람 PER1의 hCKIε과의 상호작용 및 인산화
하기 실시예들은 hCKIε이 사람 PER2와 상호작용하고 인산화시킨다는 것을 입증하기 위해 사용된 재료 및 방법을 예시한다. 이러한 결과를 요약하기 위해서, 293T 세포에, hCKIε와 공-형질감염되는 경우, hPER2는 분자량 변화 뿐만 아니라32P 통합에 의해 입증되는 바와 같이, 인산화 상태에서 유의한 증가를 나타낸다. 추가로, hCKIε 및 hPER1과 마찬가지로, hCKIε은 형질감염된 hPER2와 공-면역침전된다. hCKIε 억제제인 CKI-7을 사용한 형질감염된 세포의 처리는 hPER1 및 hPER2 인산화의 감소를 초래한다. 펄스/추적 연구 결과, 형질감염된 hCKIε에 의한 hPER2의 증가된 인산화는 hPER2가 분해되도록 만든다는 것을 밝혀냈다. 이러한 데이터는 생체내에서 hCKIε 및 사람 피리어드 단백질들 사이, 즉 아미노산 486 내지 503에서 IQELSEQIHRLLLQPVH에서 CKI 및 사람 PER1 사이에서, 사람 PER2의 경우 아미노산 460 내지 477에서 IQELTEQIHRLLLQPVH에서, 및/또는 PER3의 경우 ITELQEQIYKLLLQPVH에서의 물리적 결합, 및 hPER1 및 hPER2 인산화를 통한 피리어드 안정성의 조절을 나타낸다.
hPER2에 대한 재료 및 방법
실시예 6
플라스미드 작제, 발현 및 단백질의 정제
전장 개방 판독 프레임(ORF) 사람 피리어드 2를 정방향 프라이머ATCTAGATCTAGAATGAATGGATACGCGGAATTTCCG 및 역방향 프라이머 TCTGCTCGAGTCAAGGGGGATCCATTTTCGTCTT를 사용하여 제조원(Clontech)으로부터의 사람뇌 cDNA 라이브러리로부터 PCR에 의해 클로닝한다. ORF는 1246개 아미노산 단백질을 암호화한다. 상기 DNA를 hPER2-C-말단 YGFP 단백질을 생성하는 pYGFP living color 벡터(제조원:Clontech)내로 서브클로닝한다. 세균 발현된 히스티딘-태그된 hCKIε을 상기와 같이 발현시키고 정제한다. 90% 이상의 균질성 및 대략 54 kDa의 분자량을 갖는 단백질이 정제된다.
실시예 7
293T 세포의 형질감염
사람 배아 신장 세포 293T 세포의 형질감염은 상기된 재료 및 방법을 사용하여, 사람 피리어드 1 DNA 대신 사람 피리어드 2 DNA로 대체하여 수행한다. 상기와 같이 용해액 및 상등액을 수거하고 저장한다.
실시예 8
면역침전 및 웨스턴 블롯 분석
용해액은 상기 기술된 재료 및 방법을 사용하여, hPER1 용해액을 hPER2 용해액으로 대체하여 면역침전 및 웨스턴 블롯 분석에 사용한다. 결과를 하기 표 2에 나타낸다. 293T 세포에 hPER2 및 hCKIε를 공-형질감염시킨 후, 세포를 형질감염 24시간 후 용해시키고, 면역침전시키고, 용해액을 8% SDS-PAGE 상에서 분리시킨 후웨스턴 블롯 분석한다. 표 2에서 나타낸 바와 같이, HA-hCKIε의 면역침전 및 이후 웨스턴 블롯 분석은 hCKIε이 hPER1 뿐만 아니라 hPER2와 상호작용한다는 것을 나타낸다. 포지티브는 상호작용을 나타내고, 네가티브는 상호작용하지 않음을 나타낸다.
실시예 9
hCKIε은 hPER2와 결합하여 인산화시킨다
PER1 인산화의 결과는 단백질의 불안정성 및 단백질의 분해이다. 따라서, hCKIε이 PER2를 인산화시키는지를 측정하기 위해서, 293 세포를 CKIε 및 hPER2, 또는 대조군으로서 hPER1과 공-형질감염시키고 단백질을 웨스턴 블롯 분석으로 가시화시킨다. 표 2에서 hCKIε 및 hPER2로 공-형질감염시킨 세포에서 나타낸 바와 같이, 단백질의 분자량 변화가 관찰되며, 이는 hCKIε및 hPER1을 사용한 결과와 유사하다.
hCKIε 단독 hPER2 단독 hCKIε및 hPER2 hCKIε(K38A) 및 hPER2
CKIε과의 상호작용 - - + +
hPER2 이동의 변화 검출되지않음 - + -
이동성 변화가 hPER2의 인산화에 기인하는 것인지를 측정하기 위해서, 본 발명자들은 p32 표지화 실험을 수행하고 p32 표지의 hPER2내로의 통합에 대해서 분석하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, hPER2 또는 hPER1 및 CKIε의 공-형질감염은 p32를 PER 단백질 둘 모두에 통합시킨다. p32 통합 양은 hPER2 보다 hPER1에서 보다 더 많은 것으로 보인다. hPER1 인산화 대 hPER2 인산화에서 이러한 차이점은 CKI에 의한 hPER1의 인산화 대 hPER2의 인산화의 증강된 역학적 비율에 기인할 수 있다. 또 다른 설명은 hPER1이 hPER2 보다 보다 많은 수의 CKI 컨센서스 인산화 부위를 갖는다는 것이다(hPER1 상에 9개 대 hPER2 상에 7개).
hCKIε 단독 hPER2 단독 hCKIε및 hPER2 hCKIε(K38A) 및 hPER2
hPER2내로의 P32 통합(단위 cpm) 1000 750 5000 3000
hPER2의 인산화는 단백질 불안정성을 초래한다: hPER1의 인산화는 단백질 불안정성 및 분해를 초래한다. hPER2는 hCKIε에 의해 유사하게 인산화되기 때문에, hPER2 단백질 안정성에 대한 인산화 효과를 측정하기 위해서, HEK 293 세포를 PER2 단독 또는 PER1 단독을 암호화하는 cDNA로 형질감염시키거나, hCKIε 및 PER2, 또는 hCKIε 및 PER1 모두를 암호화하는 cDNA를 사용하여 공-형질감염시킨다. 세포를 35-S 메티오닌으로 펄스하고 표 4에 요약된 시간에서 32시간 동안 면역침전시킨다. 표 4에 나타낸 바와 같이, hPER2 및 hPER1 중 하나로의 단독 형질감염은 hPER1 또는 hPER2가 내인성 키나제에 의해 인산화되어 분해되게 한다. 각각의 단백질의 반감기는 약 hPER1의 경우 14시간이고 hPER2의 경우 4시간이다. 그러나, hCKIε를 사용한 hPER1 또는 hPER2의 공-형질감염은 상기 단백질 둘 모두의과인산화를 초래한다. 추가로, 이러한 과인산화는 약간의 변화 및 약 2 내지 4시간의 단백질 반감기의 단축을 초래한다. hPER2는 hPER1 보다 더 낮은 수준으로 인산화된다고 할지라도, hCKIε를 사용한 인산화 후 hPER1 보다 더 안정한 것 같지는 않다.
시간(hr) hPER1 단독* hPER2 단독* hCKIε 및 hPER1* hCKIε 및 hPER2*
0 100 100 100 100
4 59 69 33 44
6 41 37 24 28
8 48 29 28 26
14 43 19 22 10
18 32 11 15 10
24 16 7 8 6
32 13 7 2 7
* 단백질의 반감기를 측정하기 위한 시간에 대한 S-35 표지된 hPER1또는 hPER2(단위 cpm)
실시예 10
hCKIδ 및 ε 억제제에 대한 분석
하기 분석을 사용하여 hPER1의 인산화를 변화시켜, 공-형질감염된 세포내에서 hPER1의 수준을 증가시키며, 랫트 PER1 세포성 mRNA 변동을 변화시키는 능력에 대해서 시험 화합물을 분석한다. hCKIε-Per1 공-형질감염(일시적인) 분석을 사용하여, HEK293T 세포를 약 80% 컨플루언스까지 6웰 플레이트에서 성장시킨 후, Lipofectamine plus 시약(제조원: Gibco BRL)을 사용하여 hCKIε 및 Per1 또는 Per2로 공-형질감염시킨다. 16시간 후, 형질감염 배지를 제거하고 세포에 CKI 억제성 및 비활성 동족체 화합물 1, 10 또는 30μM를 16시간 동안 투여한다. 추가로16시간 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2회 세척하고 용해시키고 원심분리시킨 후 상등액을 8 내지 16% 또는 8% 트리스 글리신 겔 상에서 러닝한다. 웨스턴 블롯을 Flag-태그된 hPER1 또는 GFP-태그된 hPER2에 대해서 수행한다. hCKIε의 존재는 항-HA 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 각각의 샘플에서 검출한다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 세포를 hCKIε 및 hPER1과 공-형질감염시키고 대조군 시험 화합물의 증가되는 농도에 노출시키면, hCKIε는 억제되지 않으며, hPER1 수준의 어떠한 증가도 관찰되지 않는다. 그러나, 공-형질감염된 세포를 hCKIε 억제제로 처리하면 투여량 의존적인 방식으로 hPER1 수준의 상대적인 증가가 나타난다. hPER1 수준의 이러한 증가는 CKI 인산화 활성의 억제 및 hPER1 인산화 감소 이후 단백질 안정성의 증가에 기인한다. CKI 억제제가 PER1 단백질 안정성 및 반감기를 변화시키는 경우, 세포내 PER1 수준의 증가가 일주기 변동 또는 세포내 주기에 특정 영향을 미칠 것이라는 것은 이해될 수 있다.
TaqMan RT-PCR(제조원: Perkin Elmer Biosystems)를 사용한 정량적인 PCR로 랫트 PER1 변동을 변화시키는데 대한 CKI 억제제의 효과를 시험하기 위해서, rat-1 섬유아세포를 5% 소 태아 혈청 및 페니실린-스트렙토마이신-글루타민의 혼합물으로 보충된 둘베코 변형된 이글스 배지에서 성장시킨다. SCN 세포를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 및 2% 글루코오스로 보충된 둘베코 최소 이글스 배지에서 성장시킨다. 대략 5x105세포를 실험에 앞서 3 내지 5일 동안 10㎝ 페트리 디쉬에 플레이팅한다. 플레이트가 컨플루언스해 지면, 이를 시간 = 0으로지정하고, 배지를 혈청 풍부 배지, 즉 50% 말 혈청을 함유하는 혈청 풍부 배지로 교체한다. 50% 말 혈청에서 혈청 쇼크 2시간 후, 상기 배지를 혈청 비함유 배지로 교체한다. 지시된 시점에서, 디쉬를 PBS로 세척하고 전체 세포 mRNA를 추출할 때까지 -80℃에서 동결시킨다. hCKIε 억제제 또는 대조군을 혈청-비함유 배지가 부가되는 시점에서 부가한다.
전체 세포 mRNA를 RNeasy Midi kit 또는 Rneasy 96 kit(제조원: Qiagen)로 추출하고 Dnase로 처리한다(Ambion DNA-비함유). 정량적인 PCR을 real-time Taq-Man 기술(제조원: PE Biosystems)을 사용하여 수행하고[C.A. Heid et al., Genomes Res. 6, M (1996)], ABI PRISM 7700 상에서 분석한다[T. Takumi et al., Genes Cells 4, 67: 1999]. rPer1에 대한 프라이머는 다음과 같다: 정방향 5'-TCTGGTTAAGGCTGCTGACAAG-3'; 역방향 5'-GTGTAGCCCCAACCCTGTGA-3', 및 TaqMan, 프로브 5'-TCCAAATCCCAGCTGAGCCCGA-3'. RNA에 대한 내부 대조군으로써, r액틴의 발현을 동일 조건하에서 시험한다. rPer1 대 r액틴의 비율을 산출하고 표준화시킨다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 세포를 화합물 미처리하거나, 불활성 hCKIε 소분자 동족체인 시험 화합물로 처리한 세포는 PER1 mRNA 변동에 의해 지시되는 바와 같이 대략 24시간의 정상적인 일주기를 나타낸다. 그러나, CKI 억제제인 시험 화합물로 처리된 세포는 도 11의 변화된 1일 변동성 일주기를 나타낸다. 이러한 세포내에서 PER1 mRNA 수준은 정상적인 24시간 주기 대신 약 18 내지 20시간의 단축된 리듬을 나타낸다. 단축된 주기는 CKI 인산화 억제에 기인하며, PER 인산화의 수준 감소를 초래한다. 보다 덜 인산화된 PER은 증가된 PER 단백질 안정성 및 증가된 PER의 세포내 수준을 초래하며, 이는 포유동물의 일주기 리듬을 변화시킨다.
상기 인용된 모든 참조 문헌들은 이로써 본 명세서에 참조로 혼입된다.
상기 실시예들은 본 발명의 특정 양태를 제한하고자 하는 것은 아니며 단지 예시하고자 하는 것이다.

Claims (57)

  1. (1) hCKIδ 및/또는 ε 단백질, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 사람 피리어드 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (2) 사람 피리어드 단백질의 인산화 수준을 측정함을 포함하여, 하나 이상의 사람 피리어드 단백질의 인산화를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 화합물이 hCKIε에 의해 사람 피리어드 단백질의 인산화를 변화시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 화합물이 hCKIδ에 의해 사람 피리어드 단백질의 인산화를 증강시키는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 스크리닝 시스템이 세포 시스템 또는 세포-비함유 시스템인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 스크리닝 시스템인 세포-비함유 시스템인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 세포-비함유 시스템이 부분적으로 정제된 또는 정제된 사람피리어드 단백질, hCKIδ 또는 hCKIε을 사용하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 사람 피리어드 단백질 및 hCKIε을 재조합 공급원으로부터 수득하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 스크리닝 시스템이 세포-기초 시스템인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 세포-기초 시스템이 원핵 세포인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 원핵 세포가 세균 세포인 방법.
  11. 제4항에 있어서, 세포-기초 시스템이 진핵 세포인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 진핵 세포가 효모 세포인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 효모 세포가 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 세포-기초 시스템이 곤충 세포인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 세포-기초 시스템이 포유동물 세포인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 포유동물 세포가 사람 세포인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 포유동물 세포가 임파구 세포, 섬유아세포, 종양 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 배아 신장 세포, 뇌 세포, 신경 세포, 골수 세포, 신경교 세포 또는 성상 세포인 방법.
  18. (1) hCKIδ 및/또는 ε 단백질, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 두 개 이상의 상이한 hPER 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (2) 사람 피리어드 단백질의 인산화 수준을 측정함을 포함하여, 사람 피리어드 단백질의 인산화를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 화합물이 hCKIε에 의해 사람 피리어드 단백질의 인산화를 변화시키는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 화합물이 hCKIδ에 의해 사람 피리어드 단백질의 인산화를 변화시키는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 스크리닝 시스템이 세포-비함유 시스템인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 세포-비함유 시스템이 부분적으로 정제된 또는 정제된 사람 피리어드 단백질, hCKIδ 또는 hCKIε을 사용하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 사람 피리어드 단백질, hCKIδ 또는 hCKIε이 재조합 공급원으로부터 수득되는 방법.
  24. 제18항에 있어서, 스크리닝 시스템이 세포-기초 시스템인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 세포-기초 시스템이 원핵 세포인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 원핵 세포가 세균 세포인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 세포-기초 시스템이 진핵 세포인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 진핵 세포가 효모 세포인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 효모 세포가 에스. 세레비지애인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 진핵 세포가 곤충 세포인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 포유동물 세포가 사람 세포인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 포유동물 세포가 임파구 세포, 섬유아세포, 종양 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 배아 신장 세포, 뇌 세포, 신경 세포, 골수 세포, 신경교 세포 또는 성상 세포인 방법.
  34. (1) hCKIδ 및/또는 ε 단백질, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 hPER 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (2) hCKIδ 및/또는 ε 단백질 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 hPER 단백질(이때, (2)에서 선택된 hPer 단백질은 (1)에서 선택된 hPer 단백질이 아니다)을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (3) (1) 및 (2)에서 사람 피리어드 단백질의 인산화 수준을 측정하며, (4) 시험 화합물이 hPER1, hPER2 및/또는 hPER3의 인산화를 변화시키는데 선택적인지를 측정하기 위해서 각각의 사람 피리어드 단백질에 대해 (3)에서 수득된 결과를 비교함을 포함하여, 사람 피리어드 단백질의 인산화를 선택적으로 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 화합물이 hCKIε에 의해 사람 피리어드 단백질의 인산화를 변화시키는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 화합물이 hCKIδ에 의해 사람 피리어드 단백질의 인산화를 증강시키는 방법.
  37. 제34항에 있어서, 스크리닝 시스템이 세포-기초 시스템 또는 세포-비함유 시스템인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 스크리닝 시스템이 세포-비함유 시스템인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 세포-비함유 시스템이 부분적으로 정제된 또는 정제된 사람 피리어드 단백질, hCKIδ 및/또는 ε을 사용하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 사람 피리어드 단백질 및 hCKIε이 재조합 공급원으로부터 수득되는 방법.
  41. 제37항에 있어서, 스크리닝 시스템이 세포-기초 시스템인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 세포-기초 시스템이 원핵 세포인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 원핵 세포가 세균 세포인 방법.
  44. 제37항에 있어서, 세포-기초 시스템이 진핵 세포인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 진핵 세포가 효모 세포인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 효모 세포가 에스. 세레비지애인 방법.
  47. 제37항에 있어서, 세포-기초 시스템이 곤충 세포인 방법.
  48. 제37항에 있어서, 세포-기초 시스템이 포유동물 세포인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 포유동물 세포가 사람 세포인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 포유동물 세포가 임파구 세포, 섬유아세포, 종양 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 배아 신장 세포, 뇌 세포, 신경 세포, 골수 세포, 신경교 세포 또는 성상 세포인 방법.
  51. (1) hCKIδ 및/또는 ε 단백질, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 hPER 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (2) 시험 화합물의 부가 후 사람 피리어드 단백질의 양을 측정하고, (3) 단계 (2)에서 수득된 사람 피리어드 단백질의 양을 스크리닝 시스템내 사람 피리어드 단백질의 양과 비교함을 포함하여, 사람 피리어드 단백질의 분해를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법.
  52. (1) hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 hPER 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물 및 hCKIδ 및/또는 ε 단백질을 부가하고, (2) 시험 화합물 및 hCKIδ 및/또는 ε 단백질을 부가한 후 사람 피리어드 단백질의 양을 측정하고, (3) 단계 (2)에서 수득된 사람 피리어드 단백질의 양을 스크리닝 시스템내 사람 피리어드 단백질의 양과 비교함을 포함하여, 사람 피리어드 단백질의 분해를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법.
  53. (1) 시험 화합물 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 hPER 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 hCKIδ 및/또는 ε 단백질을 부가하고, (2) hCKIδ 및/또는 ε 단백질을 부가한 후 사람 피리어드 단백질의 양을 측정하고, (3) 단계 (2)에서 수득된 사람 피리어드 단백질의 양을 스크리닝 시스템내 사람 피리어드 단백질의 양과 비교함을 포함하여, 사람 피리어드 단백질의 분해를 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법.
  54. 제1항에 있어서, 사람 피리어드 단백질이 사람 피리어드 1인 방법.
  55. 제1항에 있어서, 사람 피리어드 단백질이 사람 피리어드 2인 방법.
  56. 제1항에 있어서, 사람 피리어드 단백질이 사람 피리어드 3인 방법.
  57. (1) hCKIδ 및/또는 ε 단백질, 및 hPER1, hPER2 및 hPER3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 사람 피리어드 단백질을 포함하는 스크리닝 시스템에 시험 화합물을 부가하고, (2) 시험 화합물의 부재하에서의 포유동물의 일주기 리듬과 비교하여 포유동물의 일주기 리듬에 대한 효과를 측정함을 포함하여, 포유동물의 일주기 리듬을 변화시키는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법.
KR1020017015764A 1999-06-08 2000-06-07 일주기 리듬 단백질을 변화시키기 위한 스크리닝 방법 KR100722176B1 (ko)

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