JP4583682B2 - 概日リズムタンパク質の変化に関するスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術的分野】
本発明は哺乳類の概日リズムを変える試験化合物、および更に具体的にはヒトClockタンパク質、ヒトPeriod1、ヒトPeriod2およびヒトPeriod3をリン酸化するヒトカゼインキナーゼIδおよび/またはεの能力を変える試験化合物を同定する方法に関する。
【0002】
【発明の背景】
内因性の生物学的なペースメーカーにより生じる概日リズムは、ヒト、真菌、昆虫および細菌を含む多くの様々な生物に存在する(Dunlap, J.C. (1999) Cell, 96, 271-290;Hastings, J.W., et al., (1991) in Neural and Integrative Animal Physiology, ed. Prosser, C.L. (New York: Wiley-Liss), pp.435-546; Allada, R., et al., (1998) Cell, 93, 791-804; Kondo, T., et al., (1994) Science, 266, 1233-1236; Crosthwaite, S.K., et al., (1997) Science, 276, 763-769)。概日時計は生物学的リズムの維持に不可欠である。概日時計は自動的に継続し、完全に暗い条件下ですら一定であるが、光および温度変化のような環境シグナルにより別の細胞周期に同調する。
【0003】
内因性時計は行動、食事の摂取および睡眠/覚醒サイクルにおける日変動およびホルモン分泌のような生理学的変化、および体温の変動を含む活動のパターンを制御する(Hastings, M., (1997) Trends Neurosci. 20, 459-464; Kondo, T., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5672-5676; Reppert, S.M., & Weaver, D.R. (1997) Cell, 89, 487-490)。
【0004】
概日リズムに関するいくつかの遺伝子の説明のためにショウジョウバエにおける遺伝学的および分子的研究が考慮されてきた。これらの研究から分かったことは、厳密に自動制御され、転写/翻訳に基づく負のフィードバックループから構成される1つの経路である(Dunlap, J.C. (1999) Cell, 96, 271-290; Dunlap, J.C. (1996) Annu. Rev. Genet. 30, 579-601; Hall, J.C. (1996) Neuron, 17, 799-802)。中央時計の2つの重要な構成要素はPeriodまたはPERおよびTimelessまたはTIMと称される分子である。
【0005】
ショウジョウバエで最初に発見されたper遺伝子座は、成虫の脱蛹行動および運動行動における概日リズム制御に必要な要素である(Konopka, R.J., & Benzer, S. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2112-2116)。PERのミスセンス突然変異は概日リズムの周期を短縮(pers)または長くする(perL)ことができ、一方ナンセンス突然変異(pero)はそれらの活動上の非周期性の原因となる(Hall, J.C. (1995) Trends Neurosci. 18, 230-240)。哺乳類の視交叉上核(SCN)においては、3つのPERホモログであるper1、per2、およびper3が同定されている。これら哺乳類遺伝子のタンパク質産物はいくつかの互いに相同な領域を共有する(zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 20, 1103-1110; Albrecht, U., et al., (1997) Cell 91, 1055-1064.)。PerのmRNAおよびタンパク質のレベルは日周期で変動するが、PER1およびPER2のみは光に応答して変動する(Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 20, 1103-1110., Shearman, L.P., et al., (1997) Neuron 19, 1261-1269)。
【0006】
PERタンパク質は全て、ダイマー形成に必要なPASドメインと称するタンパク質/タンパク質相互作用領域を含有する(Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 20, 1103-1110)。PASを含有する他のタンパク質であるTIMはベイトとしてPERを用いた酵母2−ハイブリット遺伝学的スクリーニングにより単離された(Gekakis, N., et al., (1995) Science 270, 811-815)。PERタンパク質レベルが増加するに従い、PERはTIMと共にヘテロダイマーを形成する。TIM/PERヘテロダイマー形成はPERの調節に必要である。その理由は、tim変異がper mRNA変動喪失およびPERの核移行不能に伴って生じる概日リズム喪失の原因となるからである(Sangoram, A.M., et al., (1998) Neuron 21, 1101-1113; Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 21, 1115-1122)。
【0007】
最近、CLOCKおよびBMAL/MOP3を含む概日リズムの構成要素であるいくつかの別の分子が、遺伝学的スクリーニングおよび生化学的特徴づけの手法を用いて発見された(Gekakis, N., et al., (1998) Science 280, 1564-1569; King, D.P., et al., (1997) Cell 89, 641-653; Allada, R., et al., (1998) Cell 93, 791-804)。
【0008】
その後の研究で、PERが転写レベルでどのように調節されるのか明らかになった。CLOCKおよびBMAL/MOP3は、どちらもベーシック−へリックス−ループ−へリックス ドメインであるPASドメインを含有し、そして互いにヘテロダイマーを形成する。PERが転写され、翻訳され、そして蓄積すると、PERは核移行し、それらの共通のPASドメインを介してCLOCKに結合し、負のフィードバックループ形成して、それ自身の転写をダウンレギュレーションする(Allada, R., et al., (1998) Cell 93, 791-804; Darlington, T.K., et al., (1998) Science 280, 1599-1603; Hao, H., et al., (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 3687-3693; Jin, X., et al., (1999) Cell 96, 57-68)。
【0009】
さらに、PERは調節され、転写後レベルで制御される。PERおよびTIMのどちらも概日変動に影響されるリン酸化を受けるようである(Edery, I., et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2260-2264; Lee, C., et al., (1998) Neuron 21, 857-867)。ダブルタイム(DBT)と称されるショウジョウバエのキナーゼが最近クローン化された(Price, J.L., et al., (1998) Cell 94, 83-95, Kloss, B., et al., (1998) Cell 94, 97-107)。DBTにおける変異は行動リズムの周期を短くするかまたは長くするかのいずれかの原因となる。DBTにおけるP因子挿入突然変異により、幼虫の脳におけるPERの概日変動をなくす。これはDBTがショウジョウバエ時計の不可欠な構成要素であることを指し示している。PERはこれらの変異体に高レベルで蓄積し、低リン酸化される。DBTはPERを直接リン酸化することが示されなかった。CKIεは哺乳類における密接な関係があるDBTのホモログである(Kloss, B., et al., (1998) Cell 94, 97-107)。CKIεおよびDBTはキナーゼドメインのアミノ酸レベルが86%相同である。Fishらにより最初に同定されたhCKIεはセリン/スレオニンプロテインキナーゼ活性を有するCKIのアイソフオーム(α,β,γ,δ)のひとつである(Fish, K.J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14875-14883; Rowles, J., et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9548-9552)。CKIは細胞のDNA代謝制御に関連がある。HRR25遺伝子(哺乳類のCKIのホモログ)欠損型サッカロミセス突然変異体は二本鎖DNA切断に感受性を示す(Hoekstra, M.F., et al., (1991) Science 253, 1031-1034)。hCKIに対するインビトロの基質のいくつかが同定されており、それにはRNAポリメラーゼIおよびII、p53、IκBα、およびシミアンウイルス40ラージT抗原が含まれる。しかし、基質の機能を変化させるhCKIのリン酸化に関係するという証拠はほとんど無く、そして現在まで、どのclock遺伝子もhCKIδおよびε基質であると示されていない。
【0010】
概日リズムは概日経路において鍵となる特定のタンパク質の連続的なリン酸化、およびそのタンパク質レベルの変化により制御される。概日時計経路の中心の構成要素であるPeriod(PER)は、その量およびリン酸化状態における日変動を受ける。PER遺伝子はショウジョウバエPER(dPERと示す)、マウスPER(mPERと示す)、およびヒトPER(hPERと示す)が同定されている。ショウジョウバエではPERが一種だけであり、PER1タンパク質と最も相同性がある。ヒトおよびマウスの両方は3種のPER(PER1、2および3と示す)を有する。
【0011】
【発明の概要】
本発明は、hCKIδおよびεがヒトPeriodタンパク質をリン酸化し、リン酸化されたヒトPeriodタンパク質が分解するという発見に関する。その結果、本発明は、哺乳類の概日リズムを変える試験化合物を同定する方法、およびさらに具体的には、hCKIδおよびεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。また本発明は、リン酸化されたヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。また本発明は1種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化あるいは分解を選択的に変える試験化合物の能力を、異なるPeriodタンパク質のリン酸化あるいはまた分解を変え、引き続き哺乳類の概日リズムを変えるその能力に比較して測定する方法に関する。
【0012】
添付図面において:
図1.組換えhCKIεによるカゼイン、IκBα、およびhPER1のインビトロのリン酸化
組換えカゼインキナーゼ(複数可)の精製およびキナーゼアッセイ条件は、後記の“実験材料および実験方法”に記載する。(A)hCKIε(レーン1〜3)、hCKIε−K38Rε(レーン4〜6)、またはコントロールとしての緩衝液(レーン7および8)は、単独で(レーン1および4)、カゼインと共に(レーン2および5)、またはIκBαと共に(レーン3および6)インキュベートし、そして“実験材料および実験方法”に記載のとおりにキナーゼアッセイを実施する。分子量マーカーを左に示す。(B)ベクター(レーン1、4および8)、ルシフェラーゼ(レーン2、5および9)またはhPER1(レーン3、6および10)をトランスフェクションした293T細胞溶解物を調製し、M2抗−フラッグモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、次いでキナーゼアッセイをhCKIε(レーン1〜6)、hCKIε−K38Rε(レーン7)またはコントロールとしての緩衝液(レーン8〜10)を用いて実施する。キナーゼアッセイ前に免疫沈降物を65℃、30分間の熱処理により不活化する(レーン4〜6)。試料を12%SDS−PAGEで分離する。ゲルをクマシーR−250で染色し、乾燥してオートラジオグラフィーに付す。
【0013】
図2.(AおよびB)hPER1およびhCKIεのウエスタンブロット分析
293T細胞にhPER1およびベクター(レーン1)、hPER1およびhCKIε(レーン2)、hPER1およびhCKIε−K38R(レーン3)、ベクターおよびhCKIε(レーン4)、またはベクターおよびhCKIε−K38R(レーン5)をトランスフェクションする。トランスフェクション後24時間で、細胞を採集し溶解物を“実験材料および実験方法”に記載のように調製する。40μgの293T細胞溶解物総量を3〜8%勾配NU−PAGEにロードする。タンパク質をPVDF膜に転写してM2抗−フラッグモノクローナル抗体(1:1000)または抗−hCKIεモノクローナル抗体(1:750)を用いてウエスタンブロットする。(C)hPER1のラムダホスファターゼ処理。293T細胞にhPER1およびベクター(レーン1および4)、hPER1およびhCKIε(レーン2および5)、またはhPER1およびhCKIε−K38R(レーン3および6)をトランスフェクションし、[35S]メチオニン(250μCi/ml)で標識する。溶解物をM2抗−フラッグモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、次に組換えラムダフォスファターゼで処理(レーン4、5および6)または偽処理(レーン1、2および3)のいずれかを行う。
【0014】
図3.hCKIεを同時にトランスフェクションしたhPER1のパルス−チェイス標識
293T細胞にhPER1およびベクター(パネルA)またはhPER1およびhCKIε(パネルB)のいずれかを同時にトランスフェクションする。トランスフェクション後3時間で、293T細胞を[35S]メチオニンおよびシステイン(1000μCi/ml)を用いて30分間パルス標識し、次いで各ゲルの上に示した時間でチェイスする。細胞を溶解し、M2抗−フラッグモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、hPER1を8%SDS−PAGEで分離する。分子量マーカーを左に示す。(C)各レーンからのhPER1バンドを取り囲みかつ含有する領域のホスホイメージングスキャンを表した棒グラフ。バー(2〜30時間)はゼロ時点のカウントと比較した1分当りの総カウント(cpm)の百分率に基づく。黒いバーはベクターと同時にトランスフェクションしたhPER1を示す。縞のバーは、hCKIεと同時にトランスフェクションしたhPER1を示す。
【0015】
図4.hPER1およびhCKIε間のタンパク質相互作用(A、B、CおよびD)
293T細胞にベクターおよびhCKIε(レーン1)、ベクターおよびhPER1(レーン2)、およびhCKIεおよびhPER1(レーン3)をトランスフェクションする。トランスフェクション後24時間で、細胞を採集し、溶解物を調製する。溶解物をM2抗−フラッグモノクローナル抗体(パネルAおよびC)、HAモノクローナル抗体(パネルB)、または抗−hCKIεモノクローナル抗体(パネルD)を用いて免疫沈降し、抗−HAモノクローナル抗体(パネルA)、M2抗−フラッグモノクローナル抗体(パネルBおよびD)、または抗−hCKIεモノクローナル抗体(パネルC)を用いてウエスタンブロットする。レーン4では、ウエスタンブロット分析を上記のモノクローナル抗体を用いた免疫沈降前の粗溶解物について実施する。全てのタンパク質を10%SDS−PAGEで分離する。
【0016】
図5.hCKIεのリン酸化部位のマッピング
(A)トランケーションして組換えたhPER1変異体の略図。トランケーション変異体を後記の“実験材料および実験方法”に記載のとおりに構築する。ORFはhPER1の完全なオープン・リーデイング・フレームであるアミノ酸残基1〜1289を示す。N1、N2、N3、N4、およびC5作製のために使用した制限酵素部位を表1に示す。白抜きのバーは分子量の移動を示さなかった変異体を表す。黒いバーは分子量の移動を示した変異体を表す。ORF、N2、N3、およびN4の縞の領域は、hCKIεによるhPER1の推定リン酸化領域を表す。(B)同時にトランスフェクションした293T細胞溶解物由来のhPER1トランケーション変異体をのウエスタンブロット分析。hPER1およびベクター(レーン1)、hPER1およびhCKIε(レーン2)、またはhPER1およびhCKIε−K38R(レーン3)を293T細胞に同時にトランスフェクションして、hPER1をM2抗−Flagモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析により分析する。分子量マーカーを左に示す。矢印は各トランケート変異体タンパク質の移動位置を示す。hPER1ORFおよび変異体N1およびN2を規定通りに10%SDS−PAGEで分離し、一方hPER1変異体であるN3、N4、C1、C2、C5、およびC6を規定通りに12%SDS−PAGEで分離する。
【0017】
図6.Period mRNA濃度
横軸に時間単位で時間を示す;縦軸は時間経過における活性、体温およびPer mRNAレベルである。Per mRNAレベルは24時間周期で変動し、ショウジョウバエでは周期長と逆相関している。同様な変動が正常Perマウスにて観察される;ところが、Perノックアウトマウスは異常な概日リズムを有する。
【0018】
図7.Clockタンパク質経路
これはClockタンパク質経路の略図である。hCKIδおよび/またはεはPeriodを、PO4で表されるように、リン酸化し、次いでその分解に至る。ClockおよびBMalはPASドメインで相互作用し、そしてPeriodのmRNAの転写を開始し、Periodタンパク質レベルを増加する結果になる。
【0019】
図8.時間経過におけるPeriodタンパク質およびリン酸化のレベル
横軸は24時間周期に対する時間表示の時間であり;もう一方の軸はPeriodタンパク質(白で示される)およびリン酸化レベル(色で示される)である。概日周期の最初に、Periodタンパク質のレベルは低く、相対的にリン酸化されていない。Periodタンパク質のレベルが増加して午後8時ごろにピークを迎えるに従い、Periodタンパク質の相対的なリン酸化もまた増加し、Periodタンパク質のレベルが減少するにつれてそのリン酸化はなおも続く。
【0020】
図9.CKIε/ヒトPeriod1の同時トランスフェクション
右上のパネルはhPer1のリン酸化を示す。最初のカラムは試験化合物1μMを示す;第2カラムは試験化合物10μMを示す; 第3カラムは試験化合物30μMを示す;第4カラムはPerのみを示す;第5カラムおよび最終カラムはPerおよびhCKIεを示す。右上のパネルはコントロールの試験化合物を示す。中央のパネルはCKIε阻害剤試験化合物S943166を示し、右下のパネルはCKIε阻害剤試験化合物W0236を示す。これらの結果はPerリン酸化の阻害がタンパク質の安定性およびレベルの増加という結果になることを証明する。
【0021】
図10.ヒトPeriod mRNAレベル
上のグラフは下のグラフで示したデータを絵で表現したものを提供する。横軸は時間で表された時間である;もう片方の軸はRT−PCRにより測定したRat1繊維芽細胞またはラットSCN(視交叉上核)のいずれかの相対的なリアル−タイムの内因性hPER1 mRNAレベルである。2つの試験化合物の説明をする;ボックスで示される試験化合物は“C”であり、10μMで細胞に添加する。三角で示される第2の試験化合物は“F”(フルオキシチン)であり、10μMで細胞に添加する。培養細胞の概日リズムは時間が経過するにつれ減少し、従って応答の振幅が時間が経過するにつれ減少する。これらの結果はコントロールの化合物がCKI活性を変えないということ、また細胞の概日リズムも変えないということを示す。
【0022】
図11.ヒトPeriod mRNAレベル
上のグラフは下のグラフで示したデータを絵で表現したものを提供している。横軸は時間表示の時間である;他方の軸はRT−PCRにより測定したRat1繊維芽細胞またはラットSCN細胞のhPER1の相対的なリアル−タイムのmRNAのレベルである。2つの試験化合物を説明する;ボックスで示される試験化合物は“C”であり、10μMで細胞に添加し、三角で示される第2の試験化合物はS943166であり、10μMで細胞に添加する。これらの結果は、試験化合物S943166がhPER1のmRNAの変動をシフトすることにより細胞の概日リズムを変化させ、そして概日リズムを約20時間に短縮するという結果を示す。
【0023】
【発明の詳述】
本発明は哺乳類の概日リズムを変える試験化合物を同定する方法に関し、さらに具体的には、hCKIδおよび/またはεによるヒトPeriodタンパク質、好ましくはヒトPeriod1、ヒトPeriod2および/またはヒトPeriod3に対するリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。さらに、本発明はリン酸化されたヒトPeriodタンパク質の分解を変化させる試験化合物の能力を測定する方法に関する。また本発明は異なるヒトPeriodタンパク質のリン酸化(または分解)を変化させる試験化合物の能力に関する1種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化(または分解)を選択的に変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。
【0024】
本発明はhCKIδおよび/またはεによるhPER1、hPER2および/またはhPER3のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法、および細胞におけるhCKIδおよび/またはεによりリン酸化されたhPER1、hPER2および/またはhPER3の分解を変える化合物を同定する方法に関する。また本発明はhPER1、hPER2および/またはhPER3の安定性を変える、またはhPER1、hPER2および/またはhPER3のタンパク質分解を増加する試験化合物の能力を測定する方法に関する。本発明は哺乳類の概日リズムを変える試験化合物の能力を測定する方法を提供する。
【0025】
本発明の特徴の1つは、hCKIδおよび/またはεによるhPER1、hPER2およびhPER3のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定することである。本発明の他の特徴はリン酸化が可能な条件下でhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より1種選択されるヒトPeriodタンパク質、およびhCKIδおよび/またはεからなるスクリーニング系に試験化合物を添加し、そしてヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定することからなるhCKIδおよび/またはεによるhPER1、hPER2およびhPER3のリン酸化を阻害する試験化合物の能力を測定することである。一つの好ましい実施態様で、スクリーニング系はホスフェート源を含む。好ましいホスフェート源の1つはATPである。
【0026】
「アミノ酸」という用語は光学異性体、すなわち天然型および非天然型アミノ酸のL型異性体およびD型異性体をどちらも含む意味である。従って、「ペプチド」という用語は、L−アミノ酸のみにより構成されるペプチドだけでなく、部分的または完全にD−アミノ酸により構成されるペプチドを含む意味である。
【0027】
さらに、「アミノ酸」という用語は、天然のタンパク質を構成する20のみの天然型アミノ酸残基、並びに他のα−アミノ酸、β−、γ−およびδ−アミノ酸、および非天然型アミノ酸等を含む。従って、該タンパク質、ヒトPeriodおよびヒトhCKIδおよび/またはεは、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基すなわち保存的アミノ酸残基、例えば天然タンパク質を構成するα−アミノ酸残基、並びに他のα−アミノ酸残基、β−、γ−およびδ−アミノ酸残基、非天然型アミノ酸残基等のうちの1つと同様の電荷、極性または他の性質を有するもので修飾され得る。適当なβ−、γ−およびδ−アミノ酸の例には、β−アラニン、γ−アミノブタン酸およびオルニチンが含まれる。天然型タンパク質を構成するもの以外の他のアミノ酸残基または非天然型アミノ酸の例には、3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、シクロへキシルグリシン、1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボキシル酸またはニペコチン酸が含まれる。
【0028】
「hPER1」、「hPER2」、「hPER3」、「hCKIδ」および「hCKIε」という用語は、それぞれヒトPeriod1、ヒトPeriod2、ヒトPeriod3、ヒトカゼインキナーゼIδおよびヒトカゼインキナーゼIεの全長タンパク質、hPER1、hPER2、hPER3、およびhCKIδおよび/またはεタンパク質のアレルおよび誘導体を含む。誘導体はこれらのタンパク質の天然型からの(1種またはそれ以上の異なるアミノ酸、トランケートタンパク質、および3′または5′−のいずれかに‘タグ’を含む全長またはトランケートしたタンパク質との融合タンパク質、並びに前記引用文献にて提供されそしてGeneBank等の公共のデータベースに提示された天然型および非天然型変異体の配列による)交互変化を含む。これらのタンパク質誘導体にはリーダー、エピトープまたは他のタンパク質の配列、例えばMycTM−タグ付き、ヒスチジンのタグ付き、またはFlagTMエピトープタグ付き配列を含有するタンパク質が含まれる。ヒトPeriod1配列はH. Teiにより1997年3月24日に提示されたGene Bank Accession AB002107、NID g2506044で得られる。また、ヒトPeriod1配列はTei, H., et al., Nature 389: 512−516 (1997)に公開されている。ヒトPeriod2配列はT. Nagaseらにより提示されたGene Bank Accession NM003894、NID g4505710にて利用できる。また、ヒトPeriod2配列はNagase, T., et al., DNA Res. 4(2): 141−150 (1997)およびShearman, L.P., et al., Neuron 19(6): 1261−1269 (1997)に公開されている。ヒトPeriod3のゲノム配列はGene Bank Accession Z98884で得られる。ヒトカゼインキナーゼIδ配列はGene Bank Accession U29171で得られる。またヒトカゼインキナーゼIδはKusda, J., et al, Genomics 32: 140−143 (1996)に公開された。ヒトカゼインキナーゼIε配列はGeneBank Accession L37043にて得られる。またヒトカゼインキナーゼIεはFish, K.J. et al., J. Biol. Chem. 270: 14875-14883 (1995)に公開された。c−MYCタグ付きCKIδはDavid Virshup博士からの寄付であった。
【0029】
「塩基配列」という用語は、hPER1、hPER2、hPER3、またはhCKIεをコードするRNA配列並びにDNA配列、およびその誘導体を意味する。
【0030】
本発明に関する「hCKIδ」および「hCKIε」タンパク質はここに記載されたようなヒトPerタンパク質に対して実質的に同様なリン酸化活性を有する、タンパク質またはその誘導体である。hCKIδおよび/またはεタンパク質は天然に存在するhCKIδおよび/またはε、アレルおよびその誘導体と実質的に同様な活性を有するタンパク質である。hCKIδおよび/またはεは、hPER1、hPER2、および/またはhPER3に対してそのキナーゼ活性を保持するか、またはhPER1、hPER2、および/またはhPER3をリン酸化するそれの能力が本質的には変わらない方法で修飾された他の哺乳類のカゼインキナーゼIタンパク質を含む。ヒト型hCKIδおよび/またはεが好ましい。しかし、他の哺乳類型hCKIδおよび/またはεを用いてもよい。その理由は、例えば、ヒトhCKIδおよびラットhCKIδは97%の相同性であり、そのキナーゼドメイン(284アミノ酸残基)の配列は完全に相同だからである。修飾されたタンパク質にはhCKIδおよび/またはεのトランケート型、アミノ酸の置換、欠失、付加等を含有するhCKIδおよび/またはεの誘導体が含まれ、それらはhPER1、hPER2および/またはhPER3をリン酸化する能力を保持している。カゼインキナーゼI誘導体はリーダー、エピトープまたは他のタンパク質配列、例えばMycTMタグ付き、ヒスチジンタグ付き、またはFlagTMエピトープタグ配列を含有するタンパク質を含み、かつhPER1リン酸化活性を有する。このような誘導体は精製を容易にするか、セファロースビーズへの吸着または簡単な検出を可能にする。
【0031】
hPER1、hPER2および/またはhPER3の誘導体にはリーダー、エピトープまたは他のタンパク質配列、例えばMycTMタグ付き、ヒスチジンタグ付き、またはFlagTMエピトープタグ配列を含有するタンパク質が含まれており、hCKIεによりリン酸化される能力を保持する。このような誘導体は精製を容易にするか、セファロースビーズへの吸着または簡単な検出を可能にする。
【0032】
好ましいヒトPeriodタンパク質は1またはそれ以上のhCKIεリン酸化共通配列‘DXXS’を有するタンパク質からなり、ここでDはグルタミン酸残基、Xはいずれかのアミノ酸残基、そしてSはセリン残基である。S−Xn−Sモチーフ(ここでnは1、2、3または4である)に適合するセリンでリン酸化は起こり、過リン酸化を生ずることもある。カゼインキナーゼIのリン酸化優先はFlotow, H. and Roach, P.J., J. Biol. Chem. 266(6): 3724-3727 (1991)に特徴付けられている。本発明の好ましい実施態様において、ヒトPeriodタンパク質は過リン酸化できる。推定CKI相互作用ドメインの遺伝子破壊の場合にはヒトPER1では486〜503アミノ酸であるIQELSEQIHRLLLQPVH、ヒトPER2では460〜477アミノ酸であるIQELTEQIHRLLLQPVH、および/またはヒトPER3ではITELQEQIYKLLLQPVHにある。hPER1のリン酸化部位はhPER1の743〜889アミノ酸、好ましくはhPER1の800〜820アミノ酸および最も好ましくはhPER1の808〜815アミノ酸の間にあるか、あるいはまた本発明の実施態様の一つにおいて、hPER1、hPER2および/またはhPER3の好ましい誘導体は、hPER1の743〜889アミノ酸からなる群から選択されるリン酸化部位を含有し、または推定CKI相互作用ドメインの遺伝子破壊の場合にはhPER1では486〜503アミノ酸(IQELSEQIHRLLLQPVH)、ヒトPER2では460〜477アミノ酸(IQELTEQIHRLLLQPVH)、およびヒトPER3ではITELQEQIYKLLLQPVHを含有する。
【0033】
“プロテインキナーゼ活性を有するタンパク質”という用語は、当業者ならばプロテインキナーゼ活性を有すると評価されるタンパク質、例えば、スクリーニング系で1種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質をリン酸化できるタンパク質を意味する。スクリーニング系は後記実施例のいずれかに記載のように、同じ(または実質的に同様な)条件であってよい。しかし、リン酸化、分解、または概日周期アッセイのセットアップ方法は、当業者によく知られており、本発明はここで提供する具体的な実施例に限定されるものではない。
【0034】
本発明で用いるタンパク質は、例えば標準的遺伝子組換え技術により組換え体として発現させ、および/または場合により化学的修飾されたヒト組織から得ることができる。タンパク質の組換え発現体が好ましい。
【0035】
タンパク質の「誘導体」としてはアミノ末端(N−末端)のアミノ基またはアミノ酸側鎖のアミノ基の全てまたは一部、および/またはカルボキシル末端(C−末端)のカルボキシル基またはアミノ酸側鎖のカルボキシル基の全てまたは一部、および/またはアミノ酸側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基、例えば水素、チオール基またはアミド基が他の適当な置換基により修飾されたタンパク質を挙げることができる。他の適当な置換基による修飾は、例えばタンパク質の官能基の保護、安全性の改良またはアッセイの促進、例えばタンパク質をセファロースビーズに付着させる官能基の付加という目的で実施される。一例として5′末端タグ付きプライマーまたはヒスチジンタグ付プライマーに付いたFlagTMエピトープタグ配列の付加である。
【0036】
そのタンパク質の誘導体には以下のものが含まれる;
(1) アミノ末端(N−末端)にあるアミノ基またはアミノ酸側鎖のアミノ基の一部または全てのうちの置換または非置換のアルキル基(直鎖または分枝鎖または環状鎖であることができる)例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ブチル基、t−ブチル基、シクロプロピル基、シクロへキシル基またはベンジル基、置換または非置換のアシル基、例えばホルミル基、アセチル基、カプロイル基、シクロへキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フタロイル基、トシル基、ニコチノイル基またはピペリジンカルボニル基、ウレタン型保護基、例えばp−ニトロベンジルオキシカルボニル基、p−メトキシベンジルオキシカルボニル基、p−ビフェニルイソプロピル−オキシカルボニル基またはt−ブトキシカルボニル基、または尿素型置換基、例えばメチルアミノカルボニル基、フェニルカルボニル基またはシクロへキシルアミノカルボニル基で置換されているタンパク質;
(2) カルボキシル末端(C−末端)またはアミノ酸側鎖の一部または全てにおけるカルボキシル基がエステル化されている(例えば、水素原子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロへキシル、フェニル、ベンジル、t−ブチルまたは4−ピコリルにより置換される)またはアミド化されている(例えば、未置換のアミドまたは例えばメチルアミド、エチルアミドまたはイソプロピルアミドのようなC1〜C6アルキルアミドが形成される)タンパク質;または
(3) アミノ酸側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基の一部または全て、例えば水素、チオール基またはアミノ基が、(1)に記載の置換基またはトリチル基により置換されているタンパク質。
【0037】
「変える」という用語は、試験化合物のない場合のリン酸化に対してhCKIδおよび/またはεによるhPER1、hPER2、および/またはhPER3のリン酸化を阻害または促進する試験化合物の能力を意味する。あるいは、「変える」はまた例えば標準物質のような異なる化合物のリン酸化に対してhCKIδおよび/またはεによるhPER1、hPER2、および/またはhPER3のリン酸化を阻害または促進する試験化合物の能力を意味する。hPER1、hPER2、および/またはhPER3のリン酸化を阻害または促進する化合物の能力は天然型hCKIδおよび/またはεタンパク質に対して測定されることが好ましい。
【0038】
「スクリーニング系」という用語はhCKIδおよび/またはεによるhPER1、hPER2、および/またはhPER3のリン酸化をするのに適した条件セットの意味である。一般的に、スクリーニング系にはいつでも利用可能なホスフェート源が含まれる。好ましいホスフェート源はいつでも利用可能なATP源である。スクリーニング系は細胞をベースとしたものか、インビトロが可能である。細胞をベースとしたスクリーニング系はhPER1、hPER2、hPER3および/またはhCKIδおよび/またはεのいずれかまたは各々を発現する細胞の使用を含む。スクリーニング方法は細胞系または無細胞系のいずれかであり得る。適した細胞系はS. cerevisiaeのような酵母細胞、E. coliのような細菌細胞、バキュロウイルス発現系で使用されるような昆虫細胞、線虫細胞、COS細胞のような哺乳類細胞、リンパ球、繊維芽細胞(3Y1細胞、NIH/3T3細胞、Rat1細胞、Balb/3T3細胞等)、293T細胞のようなヒト胎児腎臓細胞、CHO細胞、血球、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、脳細胞を含む。好ましい細胞系は視交叉上核細胞、神経細胞、骨髄球、膠細胞および星状膠細胞である。細胞をベースとした系では、細胞系がヒトPeriodタンパク質および/またはhCKIεを発現しない場合、一方または両方のヒトPeriodタンパク質および/またはhCKIεを発現する目的で細胞にトランスフェクションあるいは形質転換させなければならない。あるいは、無細胞系を利用してもよい。部分精製または精製したhPER1、hPER2、および/またはhPER3、およびhCKIδおよび/またはεは、hPER1、hPER2、および/またはhPER3のそれぞれ、およびhCKIδおよび/またはεを発現する組換え体源から得ることができ、またはそのために該タンパク質をコードする元来のmRNAの内在する塩基配列が修飾される。
【0039】
細胞内でのヒトPeriodタンパク質および/またはhCKIδおよび/またはεの組換え発現は例えば、プロモーターおよびhPER1、hPER2、hPER3および/またはhCKIδおよび/またはεをコードするcDNAを含む1つまたはそれ以上の適当な発現ベクターを用いたトランスフェクションの結果であり得る。また細胞をベースとしたスクリーニング系にはヒトPeriodタンパク質および/またはhCKIδおよび/またはεが、例えばHIVから得られるTATタンパク質、アンテナペディア形質導入フラグメント、または細胞に外因性タンパク質を導入する何か他の方法のような形質導入または形質導入配列を有する融合タンパク質として細胞に導入または形質導入される細胞の使用がある。
【0040】
好ましいインビトロのスクリーニング系は、すぐ利用可能なホスフェート源含有水溶性組成物を含む。好ましいインビトロのスクリーニング系はATPを含む。
【0041】
ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定する方法の例は、タンパク質のリン酸化の量を検出する標準方法、例えば放射性標識されたリンおよびオートラジオグラフィーの使用、または放射性標識されたリンの添加量と得られた非結合リンの量を比較することにより間接的に検出する方法を含む。あるいは、カラーメトリックまたは他の検出方法がリン酸化のレベルを測定するのに使用されることもある。ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定するのに適した他の方法は、ヒトPeriodタンパク質またはhCKIεのいずれかがセファロースビーズのような固形支持体に結合し、かつhCKIεまたはヒトPeriodタンパク質のいずれかが添加されるグルタチオンセファロースビーズを用いた無細胞系を含む。さらに、後でヒトPeriodタンパク質の量を測定する多数の別法が利用でき、35Sで標識されたヒトPeriodタンパク質の分解、カラーメトリック検定、結合したヒトPeriodタンパク質の溶出などの使用が含まれる。
【0042】
ここで開示されたスクリーニング方法は、ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルおよび/または分解を効果的に調節しまたは変え、従って哺乳類の概日リズムを変える試験化合物を同定する目的で、無作為にデザインされた試験化合物または合理的にデザインされた試験化合物のいずれかの多数の試験化合物のスルー−プットの高いスクリーニングを可能にし、それらが自動化できるという点で特に有用である。
【0043】
「哺乳類」という用語はヒト、霊長類、イヌ、ブタ、牛および他の高等生物を意味する。ヒトおよび霊長類はさらに好ましくは哺乳類である。ヒトは最も好ましい。
【0044】
本発明に使用される試験化合物は任意の生物学的または低分子化合物、例えば簡単なまたは複雑な有機分子、ペプチド、ペプチド類似物、タンパク質、オリゴヌクレオチド、微生物培養物由来化合物、天然型または合成有機化合物、および/または天然型または合成無機化合物を含む。選別されるべき試験化合物の選択は当業者に既知である。
【0045】
また本発明は一種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法を提供する。この方法は以下の工程:
(1) 試験化合物をhCKIδおよび/またはεタンパク質およびhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される1種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、および
(2) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること
からなる。
【0046】
また本発明はヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法を包含することも理解される。その方法は以下の工程:
(1) 試験化合物をhCKIδおよび/またはεタンパク質およびhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される2種またはそれ以上の異なるhPERタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、および
(2) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること
からなる。
【0047】
別法として、本発明はヒトPeriodタンパク質のリン酸化を選択的に変える試験化合物の能力を測定する方法を含む。その方法は以下の工程:
(1) 試験化合物をhCKIδおよび/またはεタンパク質並びにhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される1種のhPERタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、および
(2) 試験化合物をhCKIδおよび/またはεタンパク質およびhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される1種のhPERタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、但し(2)で選択されたhPERタンパク質は(1)で選択されたhPERタンパク質ではない;
(3) (1)および(2)におけるヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること;および
(4) hPER1、hPER2、および/またはhPER3のリン酸化を変えるのに試験化合物が選択的であるかどうかを測定するために、(3)で得られた各ヒトPeriodタンパク質について得られた結果を比較すること
からなる。
【0048】
別法として、本発明はヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法を含む。それは以下の工程:
(1) 試験化合物をhCKIδおよび/またはεタンパク質並びにhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される1種のhPERタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、
(2) 試験化合物の添加後ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(3) 工程(2)で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる。
【0049】
別法として、本発明は試験化合物がヒトPeriodタンパク質の分解を変える能力を測定する方法を含む。それは以下の工程:
(1) 試験化合物およびhCKIδおよび/またはεタンパク質をhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される1種のhPERタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、
(2) 試験化合物およびhCKIδおよび/またはεタンパク質の添加後、ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(3) 工程(2)で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる。
【0050】
別法として、本発明はヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法を含む。その方法は以下の工程:
(1) hCKIδおよび/またはεタンパク質を試験化合物並びにhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される1種のhPERタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、
(2) hCKIδおよび/またはεタンパク質の添加後ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(3) 工程(2)で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系のヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる。
【0051】
本発明はhCKIδおよび/またはεタンパク質hPER1の743〜889アミノ酸、好ましくはhPER1の800〜820アミノ酸、および最も好ましくはhPER1の808〜815アミノ酸の部位で、または推定CKI相互作用ドメインの遺伝子破壊の場合にはヒトPER1では486〜503アミノ酸であるIQELSEQIHRLLLQPVH、ヒトPER2では460〜477アミノ酸であるIQELTEQIHRLLLQPVH、および/またはヒトPER3ではITELQEQIYKLLLQPVHでhPER1をリン酸化する能力を変える化合物によりhPER1の分解を変える方法を含む。
【0052】
以下に記載のように、リン酸化されたhPER1タンパク質は急速に分解し、それ故に本発明によるスクリーニング方法はhPER1の分解を選択的に活性化または阻害する試験化合物の同定のために使用され得る。リン酸化されたhPER2およびhPER3タンパク質は急速に分解するので、本発明方法はhPER2またはhPER3それぞれの分解を選択的に活性化または阻害する試験化合物を同定するのに用いることができる。また本発明方法は、hPER1、hPER2および/またはhPER3のいずれかのリン酸化の活性化または阻害に及ぼすその化合物の効果を測定し、そして同一または異なる試験化合物を用いて得られた結果を比較することにより、hPER1、hPER2および/またはhPER3のリン酸化を選択的に活性化または阻害する化合物を測定する方法も提供する。
【0053】
また、リン酸化されたhPER1タンパク質は急速に分解するので、本発明の方法は、試験化合物の不在下での同じまたは異なるヒトPeriodタンパク質のレベルと比較して、細胞中のヒトPeriodタンパク質のレベルを選択的に増加または減少する試験化合物の同定に用いることができる。本発明の一つの好ましい実施態様において、その方法は試験化合物の不在下のhPER1レベルと比較して細胞内hPER1のレベルを選択的に増加または減少させる試験化合物の同定に用いられる。本発明の好ましい他の実施態様において、その方法は試験化合物の不在下のhPER2レベルと比較して細胞内のhPER2のレベルを選択的に増加または減少させる試験化合物の同定に用いられる。
【0054】
さらに、本発明は試験化合物の存在下のhPER2の分解量と比較して細胞中のhPER1の分解量を選択的に阻害する試験化合物を同定する方法を含む。本発明の他の実施態様において、その方法は試験化合物の存在下のhPER1の分解量と比較して細胞内hPER2の分解量を選択的に阻害する試験化合物の同定に用いられる。
【0055】
あるいは、本発明は試験化合物の不在下のhPER2および/またはhPER3それぞれのレベルと比較して、または異なるヒトPeriodタンパク質のレベルと比較して、細胞内のhPER2および/またはhPER3のレベルを選択的に増加または減少させる試験化合物を同定することに用いることができる。本発明方法は細胞内のhPER1、hPER2および/またはhPER3のレベルをその本来のレベルと比較して選択的に増加または減少させる化合物を同定するのに使用できる。またヒトPeriodタンパク質のレベルに関する種々の試験化合物の結果の比較は、生物学的処理または化学的処理、例えば光、成長因子、転写因子等の内因性および/または外因性刺激の添加、阻害または変質の後であってもよい。
【0056】
リン酸化されたhPERタンパク質は哺乳類の概日周期の調節に密接に関係していることが知られている。それ故に、本発明は試験化合物または刺激の不在下で哺乳類の概日周期の生理的反応に影響を与え、調節を行い、または変化を与える試験化合物を同定するのに用いることができる。哺乳類の概日周期の調節は、試験化合物の不在下で刺激に応答する哺乳類の正常の概日周期の変化の防止を含む。従って、本発明は哺乳類の概日リズムを正常に変える刺激に応答する哺乳類の概日リズムの変化を妨げることができる試験化合物を同定する方法を含む。
【0057】
ヒトカゼインキナーゼIε(hCKIε)がヒトPeriod1のリン酸化に与える効果を証明する後記実施例を変形させてヒトPeriod2および/またはヒトPeriod3に置き換えることができる。同様な結果がヒトカゼインキナーゼIhCKIδで得られる。
【0058】
hCKIε(hCKIε−K38R)のキナーゼネガティブ変異体ではなく、精製した組換えhCKIεは、インビトロでhPER1をリン酸化する。293T細胞において野生型hCKIεを同時にトランスフェクションすると、hPER1は分子量での1つのシフトにより証明されるように、リン酸化の著しい増加を示す。また、hPER1タンパク質はトランスフェクションされたhCKIε並びに内因性hCKIεと共に免疫沈降することができ、それはインビボでhPER1およびhCKIεタンパク質間の物理的会合を示している。さらに、hCKIεによるhPER1のリン酸化はhPER1でのタンパク質の安定性を減少させる。リン酸化されないhPER1は、24時間周期を通して細胞が安定なままであり、一方リン酸化されたhPER1は半減期が約12時間である。多様なhPER1トランケート変異体を用いて、hPER1のリン酸化可能な部位は743〜889アミノ酸であり、これはCKI共通リン酸化部位を1つ含有する。
【0059】
ショウジョウバエDBTの哺乳類のホモログであるhCKIεがhPER1をリン酸化できるかどうか調べるために、組換えhisタグ付き野生型hCKIεをE. coli.で発現させ、精製し、カゼインおよびGST−IκBαのような一組の既知の基質、並びにhPER1をリン酸化するその能力をアッセイした。組換えhCKIεはカゼインおよびIκBα基質の両方をリン酸化する(図1Aのレーン2および3)。精製した野生型hCKIεは自己リン酸化する。自己リン酸化の能力はhCKIε活性を示す(図1Aのレーン1および2)。組換えhCKIε不存在下ではリン酸化は観察されない(図1Aのレーン7および8)。
【0060】
キナーゼネガティブ変異体hCKIε−K38R(ここではATP結合ドメインのリジン38をアルギニンに変異させる)をカゼインおよびIκBα両基質のリン酸化についてアッセイする。hCKIε−K38Rは自己リン酸化活性を有さず、カゼインまたはGST−IκBα両基質をリン酸化しない(図1Aのレーン4〜6)。これは前のリン酸化活性が野生型hCKIεに特異的であることを証明している。
【0061】
また組換えhCKIεはインビトロでhPER1をリン酸化することを示す。図1Bに示すように、組換えhCKIεの不在下ではリン酸化は全く観察されない(レーン8〜10)。インビトロでhCKIεの存在によりhPER1がリン酸化されるが、Flagタグ付ルシフェラーゼはリン酸化されない結果になる(レーン2および3)。hCKIεはまた熱処理で不活化したhPER1免疫沈降物をリン酸化したように、hPER1のリン酸化はhPER1関連キナーゼ活性が原因ではない(レーン6)。さらに、hCKIε−K38RはhPER1に対するキナーゼ活性がない(レーン7)。それ故に、hCKIεはインビトロでhPER1を直接リン酸化する。
【0062】
hCKIεはフラッグタグ付hPER1およびベクターコントロール、野生型hCKIεまたはhCKIε−K38Rのいずれかを同時にトランスフェクションした293T細胞においてhPER1を特異的にリン酸化する。トランスフェクションの後24時間後に溶解し、溶解物を3〜8%のSDS NU−PAGEで分離し、続いてウエスタンブロット解析を行う。図2Aは野生型hCKIεおよびhPER1を同時にトランスフェクションした細胞内では、コントロールのベクターまたはhCKIε−K38Rのいずれかと同時にトランスフェクションした細胞と比較して、hPER1タンパク質の分子量の著しいシフトが観察されることを示す(レーン1〜3)。hPER1分子量の同様なシフトは、異なる百分率のSDS−PAGEを用いたいくつかの同時トランスフェクション実験で常に観察される。ウエスタンブロット解析は野生型hCKIεおよびhCKIε−K38Rタンパク質の両方が等量で発現することを示す(図2Bのレーン2〜5)。
【0063】
Flagタグ付hPER1およびコントロールのベクター、hCKIεまたはhCKIε−K38Rキナーゼネガティブ変異体のいずれかを同時にトランスフェクションし、[35S]メチオニンおよびシステインで放射性同位体標識した293T細胞では、リン酸化後にhPER1の分子量に変化が生じることが証明される。35Sで標識したhPER1を免疫沈降し、精製した組換えラムダフォスファターゼで処理または未処理する。図2Cに示すように、細胞にコントロールのベクターまたはキナーゼネガテイブhCKIε−K38Rとではなく、野生型hCKIεと同時にトランスフェクションすると、35S−放射性同位体標識された免疫沈降したhPER1は分子量に一つのシフトを示す(レーン1、2、および3)。hPER1および野生型hCKIεを同時にトランスフェクションした細胞からのタンパク質の分子量変化は、ラムダフォスファターゼ処理の1時間後著しく減少する。これはhPER1の移動性変化はリン酸化が原因であることを証明する(図2Cのレーン2および5)。ラムダフォスファターゼの処理後1時間後に、コントロールのベクターおよびキナーゼネガティブを同時にトランスフェクションした細胞に対する、hCKIεを同時にトランスフェクションした細胞由来の全hPER1の移動性は互いに本質的に見分けがつかない(図2Cのレーン4、5および6)。
【0064】
ラムダフォスファターゼの移動性変化は汚染プロテアーゼが原因ではない。ラムダフォスファターゼ反応に50mMフッ化ナトリウム(ホスファターゼ阻害剤)を添加することにより、hPER1の移動性の変化減少がブロックされた。免疫沈降物中には分子量のより高い形態のその他のhPER1は全く存在しない;これはhPER1翻訳後の移動性シフトはリン酸化が原因ということを示している。
【0065】
概日周期の間、PERタンパク質が蓄積し、この蓄積に続いてPERは分解する(Edery, I., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2260-2264, Dembinska, M.E., et al.(1997) J. Biol. Rhythms 12, 157−172)。PERタンパク質が蓄積するフェイズの間に、そのタンパク質のリン酸化が原因と思われる分子量の著しいシフトがある。PERが消える直前に該移動性シフトはその最大値に達する(Edery, I., et al. (1994) supra)。hPER1および野生型hCKIεの両方をコードする発現プラスミド、またはコントロールのベクターを同時にトランスフェクションした293T細胞は、hPER1のリン酸化が細胞内でhPER1が不安定になる結果であることを証明するのに用いられる。トランスフェクション後約20時間経過してから、細胞を30分間[35S]メチオニン/システインを用いてパルス標識し、次に0〜30時間チェイスする。適切な時間経過の後、hPER1を採集し、免疫沈降してSDS−PAGEで分析する。図3Aで示すように、hPER1およびベクターのみを同時にトランスフェクションした細胞は、タイムコースの間の移動性についてはほとんどシフトを示さなかった(レーン1〜7)。12時間後そのタンパク質のスミアで示されるが、30時間の時点で僅かに増加した(レーン1、5、および7)分子量の僅かなシフトが現れた。コントロールの細胞に存在するhPER1量はそのタイムコースの間相対的に一定である。放射性同位体標識後2時間経過後に、約50%のhPER1タンパク質が依然として細胞内に存在し、このレベルはタイムコースの間一定である(図3Cの黒い棒)。コントロールのベクターとは対照的に、hPER1および野生型hCKIεを同時にトランスフェクションした細胞は放射性同位体標識後2時間ですぐに、移動性のシフトを示した(図3Bのレーン1および2)。この分子量シフトはタイムコースの間ますます顕著になり続け、24〜30時間の間に移動値が最大になった(図3Bのレーン2〜7)。コントロールのベクターとは対照的に、hCKIεを同時にトランスフェクションした293T細胞由来hPER1はタンパク質安定性の減少を示した。コントロールのベクターと同様に、2時間の時点でCKIδを同時にトランスフェクションした細胞由来のhPER1総量の50%が細胞に存在する(図3Bのレーン2、および図3Cの縞の棒)。コントロールのベクターとは異なり、リン酸化されたhPER1の2分の1のみは12時間後細胞に残存していた。24時間ではリン酸化されたhPER1の約14%が存在する(図3Bのレーン5および6並びに図3Cの縞の棒)。この実験は3回繰り返して同様な結果である。野生型hCKIεによるhPER1のリン酸化により、タンパク質の安定性が減少し、続いて、hPER1が分解するという結果になる。
【0066】
hPER1およびhCKIεは293T細胞内で物理的に相互作用する。293T細胞にFlagタグ付hPER1およびベクターのみまたはHAタグ付hCKIεのいずれかを同時にトランスフェクションする。トランスフェクションした293T細胞を溶解し、hPER1を抗FlagmAbを用いて免疫沈降し、次に抗HAmAbを用いてイムノブロットする。あるいは、hCKIεを抗HAmAbで免疫沈降し、次に抗FlagmAbでイムノブロットする。図4Aおよび図4Bには組換えhCKIεはhPER1と共沈するということが証明されているが、これはhCKIεがhPER1と直接会合することを示している。293T細胞にhPER1のみをトランスフェクションしてそのようなhPER1を証明する。細胞を溶解し、hPER1を抗FlagmAbを用いて免疫沈降し、次に抗hCKIεmAbを用いてイムノブロットする。あるいは、内因性hCKIεを抗hCKIεmAbを用いて免疫沈降し、次いで抗FlagmAbを用いてイムノブロットする。内因性hCKIεがhPER1と共に免疫沈降したが、これはこの2つのタンパク質間の物理的な会合を示している(図4Cおよび図4D)。
【0067】
hCKIεはhPER1の621〜889アミノ酸をリン酸化する。図2AはhPER1の分子量シフトがhCKIεによるリン酸化の結果であることを示す。hCKIεによりリン酸化されたhPER1のリン酸化部位を同定するために、トランケート型のhPER1を図5Aおよび後記の実験材料および実験方法に記載のように調製する。これらの構築物をベクター、hCKIε、またはhCKIε−K38Rのいずれかと共に293T細胞にトランスフェクションし、分子量シフトを検定する。図5Bのレーン2に示すように、hCKIεおよび全長オープンリーデイングフレームhPER1(ORF)、N2、N3またはN4のいずれかを同時にトランスフェクションした細胞は、タンパク質の分子量シフトを示す。トランケートhPER1タンパク質をラムダフォスファターゼ処理するとhCKIεによるリン酸化が原因でシフトが消失するという結果になり、N1またはC−末端構築物C1、C2、C5またはC6を同時にトランスフェクションしたhCKIεは該タンパク質の分子量シフトを示さなかった(図5Bおよび図5Cのレーン2)。分子量シフトを示したトランケート構築物(ORF、N2、N3、およびN4)は、621〜889アミノ酸の相同性のある領域を共有する(図5A参照)。584〜743アミノ酸を含有するC1は、シフトを示さなかったので、hPER1はhCKIεにより743〜889アミノ酸の間でリン酸化される。いくつかのCKIリン酸化共通配列はhPER1内に位置しており、hCKIεによりリン酸化される上記hPER1領域内の一つ、具体的には808〜815アミノ酸:DSSSTAPSを含む配列を包含する。セリンおよびスレオニンの全てがhCKIεの基質として供され、そのことは観察された劇的な移動性シフトを説明しているかもしれない。
【0068】
実験材料および実験方法
実施例1 プラスミドの構築、発現、およびタンパク質の精製
野生型hCKIεをコードするcDNAはヒト胎盤cDNAライブラリーから前記方法(Fish, K.J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14875-14883)を用いて単離する。細菌用ベクターにhCKIεをクローニングしたもの(pRST−B−CKIε)および哺乳類用発現ベクターにhCKIεをクローニングしたもの(pCEP4−CKIε)は前述の通りである(Cegielska, A., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 1357-1364, Rivers, A., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 15980-15984)。ヘマグルチニン(HA)エピトープタグ(YPDYDVPDYA)はpCEP4−CKIεにおいてhCKIεの5′末端に付加する。全長hPER1(Tel, H., et al, (1997) Nature 389, 512-516)をEcoRIおよびSalIで切断し、プラスミドベクターpCMV−TagTM(Stratagene)にライゲーションしてイン−フレームでFlagタグのついた融合タンパク質を作製する。トランケートされたN末端変異体(N1、N2、N3、N4、C5)はPER1をEcoRI/EcoRV、EcoRI/XhoI、EcoRV/XhoI、Pvu II/XhoI、またはBamHI/SalIそれぞれで切断し、同じベクターにライゲーションすることにより生成される。変異体C1、C2およびC6を構築するために、鋳型としてhPER1cDNAを用い、584〜743、998〜1160、または1161〜1289アミノ酸それぞれをコードするDNAフラグメントを増幅するためのPCR反応でオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。得られたフラグメントを表1に要約する。
【0069】
【表1】
【0070】
FlagTMエピトープタグ配列をプライマーの5′末端に付加する。PCR産物を哺乳類用発現ベクターpcDNA3 Topo vectorTM(Invitrogen)にクローン化する。細菌で発現させたヒスチジンタグ付hCKIεおよびhCKIε−K38Rを、Cegielska, A., et al, (1998) J. Biol. Chem. 273, 1357-1364に記載のように精製する。c−MYCタグ付CKIδはDavid Virshup博士の寄贈であった。90%以上の相同性を有する分子量約54kDaのタンパク質が精製される。
【0071】
実施例2 293T細胞のトランスフェクションおよび放射性同位体標識
ヒト胎児腎臓293T細胞を10%ウシ胎児血清(Hyclone)を補充したDMEM入り6ウェルプレートで培養する。約80%密度になった時点でlipofectAMINETM reagent(Life Technologies)を用い、メーカーの使用説明書に従い、2μgのDNAを細胞にトランスフェクションする。293T細胞の一過性トランスフェクション効率は、コントロールのGFPプラスミドのトランスフェクションによりモニターされるように典型的には30〜50%である。
【0072】
トランスフェクションの16時間後に293T細胞をメチオニンおよびシステイン欠乏培地で0.5μCi/ml[35S]メチオニン/システインを用いて30分間放射性標識する。その後、細胞を洗い、指定された時間まで通常のDMEMで培養する。細胞を溶解緩衝液(20mM Tris, 1% Triton X-100TM, 0.5% IgepalTM, 150mM NaCl, 20mM NaF, 0.2mM Na2VO4, 1mM EDTA, 1mM EGTA, Complete protease inhibitor cocktail [Boeringer Mannheim], pH 7.5)を用いて溶解する。溶解物を12,000rpmで遠心分離することにより、細胞の残骸を取り除く。上澄みを回収し、使用するまで−70℃で保存する。
【0073】
実施例3 免疫沈降およびウエスタンブロット分析
等量のタンパク質を含有する溶解物(全100μg)を抗−Flag、抗−HA、または抗−hCKIεmAbいずれかを1:500で希釈した5μlと混合し、4℃で一晩インキュベートする。抗体とのインキュベーション後、30μlのGタンパク質セファロースビーズの1:1スラリーを添加し、更に2〜4時間インキュベーションする。ビーズを溶解緩衝液中で5回洗浄し、その後30μLの5mM DTT入りSDSサンプルバッファーに再懸濁し、煮沸し、SDS−PAGEにより分析する。タンパク質のウエスタンブロットは前述のように抗−FlagTM(Sigma)(1:1000希釈)、抗−HA(Invitrogen)(1:1000希釈)、または抗−hCKIε(Transduction Laboratories)(1:750希釈)のいずれかを用いてトランスフェクションされた293T細胞由来の上澄みまたは免疫沈降したタンパク質のいずれかについて実施する(Yao, Z., et al, (1997) J. Biol. Chem. 272, 32378-32383)。
【0074】
実施例4 キナーゼおよびフォスファターゼの検定
基質としてカゼインまたはGST−IκBαのいずれかを用い、hCKIεの活性について検定する。カゼインまたはGST−IκBα(0.5μg)は、200nM ATP、10mM MgCl2、0.6mM EGTAおよび0.25mM DTTを含有するPBS中でhCKIε(0.1μg)および5μCi[γ−32P]ATP(Amersham)と結合する。反応混合物を室温で30分間インキュベートし、SDSサンプルバッファーの添加により反応を停止させ、それからSDS−PAGEにより分析する。GST−IκBαはSDS−PAGEでhCKIεと同じような位置まで泳動されたので、プロトコールを少し改変して実施した。30分間インキュベーションした後、グルタチオン−セファロースビーズの添加によりGST−IκBαをキナーゼ反応から除去する。SDSサンプルバッファーの添加前にhCKIεの汚染を除去するため、ビーズを溶解緩衝液中で5回洗浄する。ゲルをCoomassie blue R-250で染色し、乾燥し、次いでオートラジオグラフィーに付す。
【0075】
35Sで標識されたhPER1の免疫沈降は上記のとおりである。hPER1含有のビーズをフォスファターゼ緩衝液(100mM MES、0.5mMジチオスレイトール(DTT)、0.2mMフェニルメチルスルホニルフロリド、20μg/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチン、10μg/mlペプスタチンA、pH6.0)で更に3回洗浄し、20μlのフォスファターゼ緩衝液に再懸濁する。10×反応溶液(50mM Tris−HCL、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.01% Brij 35、2mM MnCl2、pH7.0)、および精製したラムダフォスファターゼ40単位を添加することにより、フォスファターゼ処理を開始する。その反応を37℃で1時間続行させる。フォスファターゼ活性の阻害は50mMフッ化ナトリウムの添加により達成される。適切なインキュベーションの後、SDSサンプルバッファーの添加により反応を停止する。タンパク質をSDS−PAGEを用いて分離し;ゲルを乾燥し、次いでオートラジオグラフィーに付す。画像はMolecular Dynamics PhospholmagerTMを用いて視覚化される。
【0076】
実施例5 hCKIεのヒトPER1との相互作用およびリン酸化
以下の例により、hCKIεがヒトPER2と相互作用してリン酸化することの証明に用いる実験材料および実験方法を示す。これらの結果を要約すると、hCKIεを293T細胞に同時にトランスフェクションすると、32Pの取り込み並びに分子量シフトでも分かるようにhPER2はリン酸化状態の著しい増加を示す。さらにhCKIεおよびhPER1のように、hCKIεはトランスフェクションされたhPER2と共に免疫沈降する。トランスフェクションされた細胞をhCKIε阻害剤であるCKI−7で処理すると、hPER1およびhPER2のリン酸化が減少する。パルス/チェイスの調査により、トランスフェクションされたhCKIεによるhPER2のリン酸化の増加がhPER2を分解させたことが明らかである。これらのデータには、CKIおよびヒトPER1ではIQELSEQIHRLLLQPVHの486〜503アミノ酸、ヒトPER2ではIQELTEQIHRLLLQPVHの460〜477アミノ酸、および/またはおそらくヒトPER3ではITELQEQIYKLLLQPVHの間でインビボでのhCKIεおよびヒトperiodタンパク質との間の物理的会合並びにhPER1およびhPER2のリン酸化によるperiodの安定性の調節が示されている。
【0077】
hPER2に関する実験材料および実験方法
実施例6 プラスミドの構築、発現、およびタンパク質の精製
ヒトperiod2オープンリーディングフレーム(ORF)全長は、Clonetech社製ヒト脳cDNAライブラリーからフォワードプライマーATCTAGATCTAGAATGAATGGATACGCGGAATTTCCGおよびリバースプライマーTCTGCTCGAGTCAAGGGGGATCCATTTTCGTCTTを用いたPCRによりクローン化する。ORFは1246アミノ酸のタンパク質をコードする。DNAをpYGFPリビングカラーベクター(living color vector)(Clonetech社)にサブクローン化して、hPER2−C末端YGFPタンパク質を作製する。細菌で発現させたヒスチジンタグ付hCKIεを前記のように精製する。90%以上の相同性を有する分子量約54kDaのタンパク質が精製された。
【0078】
実施例7 293T細胞へのトランスフェクション
ヒトPeriod1DNAの代わりにヒトPeriod2DNAを用いて、前記実験材料および実験方法でヒト胎児腎臓293T細胞にトランスフェクションした。溶解物および上澄みを前述のように回収して保存した。
【0079】
実施例8 免疫沈降およびウエスタンブロット分析
hPER1溶解物の代わりにhPER2溶解物を用いて、前記実験材料および実験方法で、溶解物は免疫沈降およびウエスタンブロット分析に使用する。その結果を後記の表2に示す。293T細胞にhPER2およびhCKIεを同時トランスフェクションした後、細胞をトランスフェクションの24時間後に溶解し、免疫沈降して溶解物を8%SDS−PAGEで分離し、次いでウエスタンブロット分析をする。表2に示すように、HA−hCKIεの免疫沈降、それに続くウエスタンブロット分析により、hCKIεがhPER1と同様にhPER2と相互作用することが明らかである。プラスは相互作用することを意味し、マイナスは相互作用しないことを意味する。
【0080】
実施例9 hCKIεはhPER2と会合してhPER2をリン酸化する
PER1のリン酸化の結果、そのタンパク質が不安定になり分解する。それ故に、hCKIεはPER2をリン酸化するかどうか測定する目的で、293T細胞にCKIεおよびhPER2またはコントロールとしてのhPER1を同時にトランスフェクションしてタンパク質をウエスタンブロット分析により視覚化した。hCKIεおよびhPER2を同時にトランスフェクションした細胞では、表2に示すように、タンパク質分子量において1つのシフトが観察され、それはhCKIεおよびhPER1で見られた結果と同様である。
【0081】
【表2】
【0082】
移動性シフトがhPER2のリン酸化に依存するのかどうかを測定するため、p32で標識実験を実施してp32標識のhPER2への取り込みを検定した。表3に示すように、hPER2またはhPER1をCKIεと同時にトランスフェクションすると、両方のPERタンパク質へp32が取り込まれる結果になった。p32の取り込み量はhPER2よりもhPER1の方がより多いようであった。hPER2に対するhPER1のこのリン酸化の違いは、hPER2に対してCKIによるhPER1のリン酸化の増強した反応速度に起因している。他の解釈は、hPER1はhPER2よりも多数のCKIリン酸化共通部位(hPER1で9個に対してhPER2では7個)を有するということである。
【0083】
【表3】
【0084】
hPER2のリン酸化がタンパク質を不安定にさせる:hPER1のリン酸化によりタンパク質が不安定になり分解するという結果になる。hPER2はhCKIεにより同様にリン酸化されるので、hPER2タンパク質の安定性におけるリン酸化の影響を測定する目的で、HEK293細胞にPER2単独またはPER1単独のいずれかをコードするcDNAをトランスフェクションするか、またはhCKIεおよびPER2、またはhCKIεおよびPER1の両方をコードするcDNAを同時にトランスフェクションする。細胞を35−Sメチオニンでパルスし、次いで32時間、表4に要約した時間に免疫沈降する。表4に記載のように、hPER2またはhPER1のシングルトランスフェクションは、hPER1またはhPER2のいずれかが内因性のキナーゼによりリン酸化されて分解するという結果になる。各タンパク質の半減期はhPER1では約14時間でありhPER2では4時間である。けれども、hPER1またはhPER2のいずれかをhCKIεと共に同時トランスフェクションすると、両方のタンパク質の過リン酸化という結果になる。さらに、この過リン酸化は約2〜4時間のタンパク質半減期の変動ないし短縮を生じる。hPER2はhPER1より低い程度でリン酸化されるようであるけれども、それはhCKIεによるリン酸化後ではもはやhPER1よりも安定ではないようである。
【0085】
【表4】
【0086】
実施例10 hCKIδおよびε阻害剤の検定
以下のアッセイを用いて、hPER1のリン酸化を変え、その結果、同時にトランスフェクションされた細胞のhPER1レベルを増加させる化合物の能力およびラットPER1細胞内mRNA変動を変える化合物の能力について該化合物を試験する。hCKIε−PER1の同時トランスフェクション(一過性)検定を用いて、HEK293T細胞を6ウェルプレートで約80%コンフルエントになるまで培養し、次にLipofectamine plus reagent(GibcoBRL)を用いてhCKIεおよびPER1またはPER2を同時にトランスフェクションする。16時間後、トランスフェクション培地を除去し、それらの細胞に1、10、または30μMのCKI阻害剤および不活性の類似化合物を16時間投与する。さらに16時間後、培地を除去し、細胞を2回PBSで洗浄し、溶解させ、遠心分離し、上澄みを8〜16%または8%トリスグリシンゲルに流す。ウエスタンブロットをフラッグ−タグ付きhPER1またはGFP−タグの付いたhPER2で実施する。hCKIεの存在は、抗−HA抗体を用いたウエスタンブロットにより各サンプルで検出される。
【0087】
図9に示すように、細胞にhCKIεおよびhPER1を同時にトランスフェクションし、増加する濃度のコントロール試験化合物(例えば、hCKIεを阻害しないもの)に曝しても、hPER1のレベルには何の増加も観察されない。しかし、hCKIε阻害剤で処理した同時トランスフェクションされた細胞は、投与量に依存したhPER1のレベルの相対的な増加を示す。このhPER1レベルの増加は、CKIリン酸化活性の阻害およびhPER1リン酸化の相対的減少それに続くタンパク質の安定性の増加による。CKI阻害剤がPER1タンパク質の安定性および半減期を変える場合には、細胞のPER1レベルの増加が概日変動または細胞周期に何らかの効果を与えるということが論考できる。
【0088】
TaqMan RT−PCR(Perkin Elmer Biosystems)を用いた定量的PCRによりラットPER1の変動を変えるCKI阻害剤の効果を試験するために、rat−1繊維芽細胞を5%ウシ胎児血清およびペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンの混合物を補充したDulbecco's modified Eagle mediumで培養する。SCN細胞を10%ウシ胎児血清、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、および2%グルコースを補充したDulbecco's Minimum Eagle mediumで培養する。本実験の3〜5日前に約5×105個の細胞を10cmぺトリ皿に播種する。プレートがコンフルエントになったらすぐに、それを時刻=0と設定して、富血清培地、即ち50%ウマ血清含有血清に交換する。50%ウマ血清中での血清ショックの2時間後、この培地を無血清培地に置き換える。指示された時間に、デイッシュをPBSで洗って、全細胞mRNAの抽出まで−80℃で凍結保存する。hCKIε阻害剤またはコントロールを無血清培地が添加される時に添加する。
【0089】
全ての細胞mRNAをRNeasy MidiキットまたはRneasy 96キット(Qiagen)を用いて抽出し、次いでDnase処理をする(Ambion DNA-free)。定量的PCRをリアルタイムTaq-Man technology(PE Biosystems)を用いて実施し[C.A. Heid et al., Genomes Res. 6, M (1996) 参照]、ABI PRISM 7700で分析する(T. Takumi et al., Genes Cells 4, 67: 1999参照)。rPERI用プライマーは以下の通りである:フォワード5′-TCTGGTTAAGGCTGCTGACAAG-3′;リバース、5′-GTGTAGCCCCAACCCTGTGA-3′、およびTaqMan、プローブ5′-TCCAAATCCCAGCTGAGCCCGA-3′。RNAの内部コントロールとして、同じ条件でrActinの発現を調べる。rPER1対rActinの比を計算して標準化した。図10に示すように、PER1のmRNA変動により示されたように、化合物なしで、または不活性なhCKIε低分子類似物である試験化合物で処理した細胞は約24時間の正常な概日周期を示す。しかし、CKI阻害剤である試験化合物で処理した細胞は、図11の変化した日内振動の概日周期を示す。これらの細胞におけるPER1のmRNAレベルは、正常な24時間周期の代わりに約18〜20時間の短縮したリズムを明らかに示す。短縮された周期は、即ち、CKIのリン酸化の阻害が原因であり、PERのリン酸化レベルが低いという結果になる。より少ないリン酸化を受けたPERは、PERタンパク質の安定性の増加およびPERの細胞内レベルの増加をもたらし、それは哺乳類の概日リズムを変える。
【0090】
全ての上記引用文献は、参照によりこの明細書に組み込まれる。上記実施例は、本発明の特定の実施態様を限定するものではなく、単に説明のためだけのものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 組換えhCKIεによるカゼイン、IκBα、およびhPER1のインビトロのリン酸化を示す。
【図2】 hPER1およびhCKIεのウエスタンブロット分析(AおよびB)およびhPER1のラムダホスファターゼ処理(C)を示す。
【図3】 hCKIεを同時にトランスフェクションしたhPER1のパルス−チェイス標識を示す。
【図4】 hPER1およびhCKIε間のタンパク質相互作用を示す。
【図5】 hCKIεのリン酸化部位のマッピングを示す。
【図6】 Period mRNA濃度を示す。
【図7】 Clockタンパク質経路を示す。
【図8】 時間経過におけるPeriodタンパク質およびリン酸化のレベルを示す。
【図9】 CKIε/ヒトPeriod1の同時トランスフェクションを示す。
【図10】 ヒトPeriod mRNAレベルを示す。
【図11】 ヒトPeriod mRNAレベルを示す。
Claims (57)
- (1) hCKIδおよび/またはhCKIεタンパク質、並びにhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される一またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質からなるスクリーニング系に試験化合物を添加すること、および
(2) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること
からなる、一またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法。 - 該化合物がhCKIεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変えるものである、請求項1に記載の方法。
- 該化合物がhCKIδによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を促進するものである、請求項1に記載の方法。
- スクリーニング系が細胞系または無細胞系である、請求項1に記載の方法。
- スクリーニング系が無細胞系である、請求項4に記載の方法。
- 部分精製または精製したヒトPeriodタンパク質、hCKIδまたはhCKIεを無細胞系で使用する、請求項5に記載の方法。
- ヒトPeriodタンパク質およびhCKIεが組換え体源から得られる、請求項6に記載の方法。
- スクリーニング系が細胞をベースとした系である、請求項4に記載の方法。
- 細胞をベースとした系が原核細胞である、請求項8に記載の方法。
- 原核細胞が細菌細胞である、請求項9に記載の方法。
- 細胞をベースとした系が真核細胞である、請求項4に記載の方法。
- 真核細胞が酵母細胞である、請求項11に記載の方法。
- 酵母細胞が S. cerevisiaeである、請求項12に記載の方法。
- 細胞をベースとした系が昆虫細胞である、請求項11に記載の方法。
- 細胞をベースとした系が哺乳類細胞である、請求項11に記載の方法。
- 哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項15に記載の方法。
- 哺乳類細胞がリンパ球細胞、繊維芽細胞、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胎芽腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、骨髄球細胞、グリア細胞および星状膠細胞である、請求項15に記載の方法。
- (1) 試験化合物をhCKIδおよび/またはhCKIεタンパク質、並びにhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される二またはそれ以上の異なるhPERタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、および
(2) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること
からなる、ヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法。 - 該化合物がhCKIεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変えるものである、請求項18に記載の方法。
- 該化合物がhCKIδによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変えるものである、請求項18に記載の方法。
- スクリーニング系が無細胞系である、請求項18に記載の方法。
- 無細胞系で部分精製または精製したヒトPeriodタンパク質、hCKIδまたはhCKIεを使用する、請求項21に記載の方法。
- ヒトPeriodタンパク質、hCKIδまたはhCKIεが組換え体源から得られる、請求項22に記載の方法。
- スクリーニング系が細胞をベースとした系である、請求項18に記載の方法。
- 細胞をベースとした系が原核細胞である、請求項24に記載の方法。
- 原核細胞が細菌細胞である、請求項25に記載の方法。
- 細胞をベースとした系が真核細胞である、請求項24に記載の方法。
- 真核細胞が酵母細胞である、請求項27に記載の方法。
- 酵母細胞が S. cerevisiaeである、請求項28に記載の方法。
- 真核細胞が昆虫細胞である、請求項27に記載の方法。
- 真核細胞が哺乳類細胞である、請求項27に記載の方法。
- 哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項31に記載の方法。
- 哺乳類細胞がリンパ球細胞、繊維芽細胞、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胎芽腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、骨髄球細胞、グリア細胞および星状膠細胞である、請求項32に記載の方法。
- (1) hCKIδおよび/またはhCKIεタンパク質、並びにhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択されるhPERタンパク質からなるスクリーニング系に試験化合物を添加すること、および
(2) hCKIδおよび/またはhCKIεタンパク質、並びにhPER1、hPER2およびhPER3からなる群から選択される一つのhPERタンパク質からなるスクリーニング系に試験化合物を添加すること、ただしここで(2)で選択されたhPERタンパク質は(1)で選択されたhPERタンパク質ではない;
(3) (1)および(2)のヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること;並びに
(4) hPER1、hPER2および/またはhPER3のリン酸化を変える上記試験化合物が選択的であるかどうかを調べる目的で、各ヒトPeriodタンパク質について(3)で得られた結果を比較すること
からなる、ヒトPeriodタンパク質のリン酸化を選択的に変える試験化合物の能力を測定する方法。 - 該化合物がhCKIεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変えるものである、請求項34に記載の方法。
- 該化合物がhCKIδによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を促進するものである、請求項34に記載の方法。
- スクリーニング系が細胞をベースとした系または無細胞系である、請求項34に記載の方法。
- スクリーニング系が無細胞系である、請求項37に記載の方法。
- 無細胞系で部分精製または精製したヒトPeriodタンパク質、hCKIδまたはhCKIεを使用するものである、請求項38に記載の方法。
- ヒトPeriodタンパク質およびhCKIεが組換え体源から得られるものである、請求項39に記載の方法。
- スクリーニング系が細胞をベースとした系である、請求項37に記載の方法。
- 細胞をベースとした系が原核細胞である、請求項41に記載の方法。
- 原核細胞が細菌細胞である、請求項42に記載の方法。
- 細胞をベースとした系が真核細胞である、請求項37に記載の方法。
- 真核細胞が酵母細胞である、請求項44に記載の方法。
- 酵母細胞が S. cerevisiaeである、請求項45に記載の方法。
- 細胞をベースとした系が昆虫細胞である、請求項37に記載の方法。
- 細胞をベースとした系が哺乳類細胞である、請求項37に記載の方法。
- 哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項48に記載の方法。
- 哺乳類細胞がリンパ球細胞、繊維芽細胞、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胎芽腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、骨髄球細胞、グリア細胞、星状膠細胞である、請求項48に記載の方法。
- (1) 試験化合物をhCKIδおよび/またはhCKIεタンパク質、並びにhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される一つのhPERタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、
(2) 試験化合物の添加後、ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(3) 工程(2)で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる、ヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法。 - (1) 試験化合物およびhCKIδおよび/またはhCKIεタンパク質を、hPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される一つのhPERタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、
(2) 試験化合物およびhCKIδおよび/またはhCKIεタンパク質の添加後、ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(3) 工程(2)で得られたヒトPeriodタンパク質の量と、スクリーニング系におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる、ヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法。 - (1) hCKIδおよび/またはhCKIεタンパク質を、試験化合物並びにhPER1、hPER2およびhPER3からなる群から選択される一つのhPERタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、
(2) hCKIδおよび/またはhCKIεタンパク質の添加後、ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(3) 工程(2)で得られたヒトPeriodタンパク質の量と、スクリーニング系におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる、ヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法。 - ヒトPeriodタンパク質がヒトPeriod1である、請求項1に記載の方法。
- ヒトPeriodタンパク質がヒトPeriod2である、請求項1に記載の方法。
- ヒトPeriodタンパク質がヒトPeriod3である、請求項1に記載の方法。
- (1) 試験化合物をhCKIδおよび/またはhCKIεタンパク質、並びにhPER1、hPER2およびhPER3からなる群より選択される一またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、および
(2) 試験化合物が存在しない場合の哺乳類の概日リズムを基準にして哺乳類の概日リズムに与える効果を測定すること
からなる、哺乳類の概日リズムを変える試験化合物の能力を測定する方法。
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