CN105744948B - 进食节律提前综合征的识别方法及其应用 - Google Patents

进食节律提前综合征的识别方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种哺乳动物受试者出现或倾向于出现与改变的进食周期相关的病情的筛选方法，包括检测PER1蛋白的磷酸化状态。另外，本发明提供了一种治疗和预防哺乳动物受试者改变的进食周期相关的病情的方法，以及一种能够用于治疗和预防与改变的进食周期相关的病情的试剂的筛选方法。

Description

进食节律提前综合征的识别方法及其应用
技术领域
本发明涉及蛋白质PER1(周期节律蛋白1)，其参与到哺乳动物的进食周期。具体而言，本发明包括与改变的进食周期有关的病情的PER1蛋白磷酸化。
背景技术
生物钟允许有机体预测环境的周期性变化，如光暗周期和进食周期，从而提供了适应的优势。目前哺乳动物生物钟模型由一个转录、翻译的反馈网络构成，包括含有PAS(Per-Arnt-Sim)结构域的螺旋-环-螺旋转录因子CLOCK和BMAL1、周期(Period)基因(Per1、Per2、和Per3)、和隐花色素(Cryptochrome)基因(Cry1和Cry2)。CLOCK：BMAL1复合物通过结合到启动子的E-boxes区域激活周期基因和隐花色素基因的转录，PER:CRY复合物通过抑制CLOCK:BMAL1的活性来形成负反馈回路。这些复合物一起作用引起内源性生物节律振荡(P.L.Lowrey,et al.,Annu Rev Genomic Hum Genet 2004,5:407；S.M.Reppert,et al.,Nature 2002,418:935；U.Schibler,et al.,Curr Opin Cell Biol 2005,17:223)。
越来越多的证据显示了生物钟和代谢之间的密切关系。在主要的代谢器官肝脏中，许多转录出现昼夜振荡(Panda et al.,Nature 2002,417:329；Oishi et al.,J BiolChem 2003,278:41519-27)。许多代谢的参数也表现出昼夜节律，如体温、血糖、胰岛素和瘦素水平等(Sinha et al.,J Clin Invest 1996,97:1344-7；Van Cauter et al.,EndocrRev 1997,18:716-38)。
在了解生物钟和代谢的分子联系上已经进行了很多的努力。在几个主要的代谢器官，如肝脏，白色或褐色脂肪组织和肌肉中，发现核受体存在振荡；并且由于核受体与代谢有着紧密的联系，核受体被认为是生物钟和代谢之间的中介体(Yang et al.,Cell 2006,12,6,801-10)。最近发现，参与到多种代谢过程的NDA+依赖的脱乙酰基酶SIRT1可以通过PER2和BMAL1调节生物钟，使得SIRT1成为另一个备选的中介体。除了这些中介体，在一些生物节律小鼠模型中发现了代谢的表型。Clock突变鼠表现出贪食和肥胖，并发展为高瘦素、高血脂、脂肪肝、高血糖和低胰岛素的代谢综合征(Turek et al.,Science 2005,308,1043-5)。Bmal1基因被发现能够调节脂肪细胞并影响机体寿命(Shimba et al.,PNAS2005,102:12071-6；Kondratov et al.,Genes Dev 2006,20:1868-73)。Rev-erbα与HDAC3共定位并调节脂质代谢，在Rev-erbα缺失的情况下，产生脂肪肝(Feng et al.,Science2011,331:1315-19)。
另一方面，代谢也可以调节生物钟，食物可以作为一个强信号在代谢器官中牵引生物钟而不影响核心钟(Damiola et al.,Genes Dev 2000,14:2950-2961)。进一步的研究指出，糖皮质激素信号和ADP核糖基化也参与到食品的牵引作用中(Asher et al.,Cell2010,142:943-953；Le Minh et al.,Embo J 2001,20:7128-7136)。不仅是进食的时间，摄入食物的种类也可以影响生物钟。高脂饮食能够强烈的影响生物钟，延长周期节律并且减弱节律的强度(Kohsaka et al.,Cell Metab 2007,6:414-421)。越来越多的证据支持这样的观点，在不适当的时候进食可能导致代谢综合征。相比在正常活跃期喂食等量饲料的小鼠，在正常的休息时间喂食高脂饲料的小鼠，体重增长的速率增加(Salgado-Delgado etal.,PLoS One 2009,8:e60052；Arble et al.,Obesity(Silver Spring)2009,17:2100-2102)。将进食时间限制在正常的活动期可以完全挽救代谢紊乱(Hatori et al.,CellMetab 2012)，再次验证了生物节律与代谢的相关性。更重要的是，临床的数据也支持从小鼠研究中获得的结论；对比那些在正常时间工作的人群，轮班工作的人更可能产生肥胖(Tasali et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2008,105:1044-49)。
生物节律的时间线索是如何传递给进食仍然是未知的。目前对进食控制的理解主要是基于神经肽和循环激素的研究。现认为，下丘脑是主要的进食控制中枢，通过平衡神经肽的作用来调控。慢慢的，人们开始建立生物钟和这些神经肽的联系。一些神经肽表现出昼夜节律的振荡，虽然可能并不是生物钟的直接靶点(Lu et al.,Endocrinology 2002,143:3905-15；Obesity(Silver Spring)2007,15:607-15；Xu et al.,Endocrinology 1999,140:2868-75)。另一个重要的进食调节因子是循环激素。其中一种循环激素瘦素，就是在生物钟调控下，由白色脂肪组织分泌的(Kalsbeek et al.,Endocrinology 2001,142:2677-85)。
目前存在着一种称为夜间进食综合征(NES)生物节律疾病，它的特点是夜间的贪食。NES的患者表现出延迟的进食节律的昼夜节律模式，但睡眠-觉醒周期正常，体现了进食节律与睡眠控制的分离(O’Reardon et al.,Obes Res 2004,12:1789-96)。隐藏在这种现象背后的机制仍然未知。
虽然分子生物钟的基本功能很大程度上是保守的，但是哺乳动物使用了多个同源的生物钟基因。这些生物钟组成部分在哺乳动物的生物节律系统中出现并扩张，导致高度的生理功能的功能分化。定位每个同源基因的特定功能能够帮助理解在生物钟组成成分进化中生物钟系统和生理稳态之间是如何建立平衡的。然而，由于遗传学上的冗余性，敲除这些基因经常只表现出轻微的表型变化。
在低等的无脊椎动物，如果蝇中，只存在一个dPer。在进化中，dPer在脊椎动物中分化成三个同源基因：PER1、PER2和PER3。基因复制经常伴随着功能分化，这样的情况也发生在PER家族中。自本世纪以来，在区分三个PER家族成员的功能上已经进行了很多的工作。已经建立了过表达或者缺失PER1，PER2和PER3中的一个或多个的多个小鼠模型。简单来说，单独的基因敲除产生了轻微的生物节律的表型，造成周期长度变化并轻微的影响分子生物钟。Per1和Per2双敲造成节律丧失，说明Per1和Per2在维持生节律中起着重要功能，而Per3似乎在核心生物钟的下游起作用(Bae et al.,Neuron 2001,30:525-36)。但是，由于基因的冗余，没有一个模型可以告诉我们，是否这些基因产生了生物节律系统外的特殊功能。一些发表的数据表明，PER1、PER2、和PER3与细胞周期、代谢、睡眠等相关(Goel et al.,PLoSOne 2009,4:e5874；Dallmann and Weaver,Chronobiol Int 2010,27:1317-28；Grimaldiet al.,Cell Metab 2010,12:509-20；Gu et al.,Cell Death Differ 2012,19:397-405)。
对PER2功能阐述的一项重要工作是由徐璎等人完成的，其在小鼠模型中引入在FASPS(Hper2S662G,Toh et al.,Science 2001,291:1040-43)中发现的突变，清楚地将hPer2的功能联系到对于睡眠的控制(Xu et al.,Cell 2007,128:59-71)。对这一突变位点的进一步研究显示了一个序列性的磷酸化位点，由5个丝氨酸组成的SXXS序列(富含丝氨酸的基序，SR基序)，这个位点被酪蛋白激酶亚型ε(CKIε)和酪蛋白激酶亚型δ(CKIδ)靶向。第一个丝氨酸位点(S662)的磷酸化被CKIε和CKIδ所识别，然后PER2后序的丝氨酸被磷酸化。序列比对结果显示这个基序是高度保守的；只有在脊椎动物的PERs中存在。类似的基序也出现在PER1和PER3中，在进化中是保守的。对mPER1中相同位点(S714位点，与S662位点同源)的研究显示这个位点可能影响到核心生物钟(Abraham et al.,J Neurosci 2005,25:8620-26)。
发明内容
本发明涉及一种哺乳动物受试者与改变的进食周期相关的病情或是潜在发展为此病情的筛选方法，包括检测受试者PER1的磷酸化状态。在一些实例中，所述磷酸化状态是通过检测SEQ ID NO:1的S714的磷酸化状态而决定，S714低磷酸化的检测是对上述病情的正面诊断。在一些具体的实施例中，SEQ ID NO:1中S714磷酸化状态的检测包括检测714位的丝氨酸是否突变为甘氨酸。在某些的实施例中，上述所述病情是夜间进食综合征。
本发明的另一方面与治疗或预防哺乳动物体改变的进食节律相关的病情的方法，包括受试者PER1的磷酸化状态调控。在某些实施例中，所述SEQ ID NO:1中的PER1磷酸化状态的调控节是通过使PER1磷酸化的激酶进行。在一个实施例中，该激酶是酪蛋白激酶亚型ε。在某些实施例中，所述病情为夜间进食综合征。在某些实施例中，所述磷酸化状态的调控为SEQ ID NO:1中S714的磷酸化的调控。
本发明的又一个方面涉及一种能够治疗或预防与哺乳动物受试者改变的进食周期相关的病情的试剂的筛选方法。该方法包括：a)由哺乳动物提供测试细胞或组织；b)提供多个候选试剂；c)在对PER1磷酸化有效调控的情况下，用候选试剂接触测试的细胞或组织，并且识别的候选试剂能够改变PER1的磷酸化状态，并且结果，这些识别的试剂在治疗或预防与哺乳动物受试者改变的进食周期有关的病情的潜在能力。在某些实施例中，所述磷酸化的调控包括SEQ ID NO:1氨基酸序列中的S714的磷酸化的调控。在某些实施例中，所述病情为夜间进食综合征。
本发明的另一个方面提供了一种能够调控PER1磷酸化状态的试剂在用于治疗或预防哺乳动物的与改变的进食周期相关的病情的药物制造中的应用。在特定的实例中，所述磷酸化的调控包括SEQ ID NO:1氨基酸序列中S714的磷酸化的调控。这种试剂可能是一种激酶，或具体地为激酶亚型ε。在特定的实例中，所述状态为夜间进食综合征。
本发明提供了一种新的筛选、治疗或预防哺乳动物的与改变的进食周期有关的病情的方法，并且进一步提供能够治疗或预防哺乳动物的与改变的进食周期有关的病情的试剂和其筛选的方法。
附图说明
图1.hPER1S714G突变破坏生物钟振荡。(a)所示的基因型小鼠的生物周期节律定量。使用clocklab计算完全黑暗状态下8-21天的周期，柱形图表示为平均值±标准偏差(SD)。所示的p值由GraphPad Prism5判定。(b)来自hPER1S714(绿色)、hPER1S714G(红色)、hPER2S662G(蓝色)小鼠离体组织的代表性的PER2：：Luc生物素荧光曲线。离体组织在关灯前一小时采样，使用显示的时间窗口测定连续三天的数据的周期。(c)所示组织和所示基因型的周期如图所示，平均周期±SD由Self-step算法得到。展示的样本(节律的组织数)来自与每一基因型的三只小鼠。单因素ANOVA示出hPER1S714、hPER1S714G或hPER2S662G小鼠之间的显著性差异。紫色的星代表hPER1S714和hPER2S662G鼠间的显著差异(一颗星＝p<0.05，两颗星＝p<0.01，三颗星＝p<0.001)。(d)示出的组织中mPer1和mPer2mRNA的富集。所有的mRNA水平通过Gapdh归一化，平均值±SD由来自三只独立小鼠的三次独立实验得到。
图2.hPER1S714G突变改变了代谢内稳态。(a)hPER1S714和hPER1S714G突变小鼠在12小时光照/12小时黑暗周期下的食物摄入及VO2曲线，绘制超过72小时大体时间的节律。数据进行了归一化处理并绘制为平均值±SEM(每个基因型N＝16)。整体的能量消耗通过CLAMS笼中O2消耗的体积计算得到。Δ1表示hPER1S714和hPER1S714G小鼠进食峰值的相位差。Δ2表示hPER1S714G小鼠中，进食和氧气消耗峰值的相位差。(b)所示的进食及氧气消耗的峰值相位，和对应小鼠的运动周期。数量(N)代表每种基因型检测的小鼠。(c)示出进食的日节律。数据包括在三天连续的记录周期内，白天和黑夜相的平均进食量±SD(每种基因型中N＝16)。(d)hPER1S714和hPER1S714G小鼠在六个月NC中的BW(10％kcal/脂肪，每一种基因型中N＝16，p＝0.96)。通过双因素ANOVA用来分析数据差异，此后。(e)hPER1S714和hPER1S714G小鼠在HFD饮食下8周实验的BW(60％kcal/脂肪，每一种基因型中N＝15，p＝0.033)。(f)hPER1S714和hPER1S714G小鼠在8周夜间限制性饮食获得下的BW，该饮食获得的前两周为夹带NC并之后为HFD。该实验方案采用的所有小鼠为6周龄(每一种基因型中N＝10，p＝0.59)。(g)hPER1S714和hPER1S714G小鼠在夜间限制性HFD饮食下食物摄入和VO2的变化曲线，绘制超过72小时大体时间的节律。数据归一化处理并然后绘制为为平均值±SEM(每一种基因型中N＝8)。
图3.hPER1S714G突变加速了分子反馈环。(a)hPER1S714和hPER1S714G肝脏及肺(图5)提取物的细胞核中hPER1的丰度和磷酸化水平。蛋白相对丰度通过ACTIN归一化处理得到从每一个实验获得表示为最大值的百分含量。用来自两次独立实验展示误差线范围。(b)S714G突变造成hPER1蛋白的不稳定。来自hPER1S714和hPER1S714G转基因胚胎的MEFs(第三代)通过蛋白翻译抑制剂放线菌酮(CHX)处理，在图示的时间点收集。细胞核中hPER1蛋白的量通过WB使用MYC抗体检测并用ACTIN归一化处理。hPER1蛋白定量结果来自三次独立实验，用平均值±SD表示。对细胞的溶剂处理不会造成hPER1降解(数据没有显示)。(c)同步化的MEFs中，细胞核中hPER1以及细胞核和胞浆中mCRY1的蛋白印记结果。(d)在使用CHX处理MEFs16小时后，检测一次生物周期内细胞核中hPER1，以及细胞核和胞浆中mCRY1的含量。用来自两次独立实验展示误差线范围。(e)Per2和Dbp启动子区域BMAL1：CRY1：E-box率有改变。hPER1S714和hPER1S714G肝脏组织用于CHIP实验，使用Bmal1和CRY1的抗体用于免疫共沉淀，IgG作为对照。ChIP结果使用定量PCR分析。原始的CRY1和BMAL1的ChIP结果在图11中显示。数据用每一次实验中最高值的百分含量和平均值±SD表示。BMAL1：CRY1：E-box中率±SD是用三次独立实验中每个时间点BMAL1的富集度除以CRY1的富集度得到。(f)我们发现RNAPII在Per2及Dbp启动子上E-box处的富集有改变，结果如上所示，双因素ANOVA证明hPER1S714和hPER1S714G中存在显著性差异(p<0.001)。(g)肝脏中Per2和Dbp mRNA的表达曲线如图所示。所有的mRNA水平通过Gapdh归一化处理，平均值±SD通过三次独立的实验得到。图13中显示了其它的生物钟基因在肝脏及脂肪组织中的表达。
图4.进食节律及生物钟的相互关系。(a)限制性饮食下，在hPER1S714G小鼠中生物钟基因的相位移动得到了改善。转录水平通过qRT-PCR定量，用GapdhmRNA水平归一化处理，如上述描述的平均值±SD通过三次独立的实验得到。(b-c)hPER1S714和hPER1S714G小鼠肝脏(b)及脂肪(c)组织中ZT1和ZT13时反相转录谱的聚类分析。高表达量通过红色表示，低表达量的用绿色表示，WT表示hPER1S714，SG表示hPER1S714G。(d)维恩图描绘了肝脏组织中在改变的基因与PER1结合位点(38)直接的普通基因。(e)逆转录与tRF调控转录之间的普通基因。
图5.hPER1S714突变小鼠的构建。(a)hPER1中S662位点的的hPEROID同源序列比较。丝氨酸通过方框标注。(b)BAC转基因小鼠的构建。在基因表达的终止位点前加入MYC-tag位点。S714G的突变在包含hPER1的BAC中导入85kb的包含ATG起始位点的5’侧翼顺序和50kb包含终止位点的下游序列。不包含突变的BAC载体用于产生野生型的hPER1S714对照鼠。测序确认位点突变成功。(c)Southern blot用于分析突变及野生型鼠的拷贝数。DNA电泳图用于控制上样量。
图6.小鼠自发活动的代表性动作记录图。小鼠在12小时光/12小时暗的周期中调节7到10天，然后保持在持续黑暗的状态下。红色线代表了持续黑暗中活动开始的相位。周期由持续黑暗的8-21天计算而得。
图7.Per1-/-、hPER1S714、hPER1S714G和hPER2S662G小鼠的脂肪外植体在第一天和七天的PER2：：luc生物发光痕迹的示意图。
图8.Per1-/-和hPER2S662G小鼠在8周的高脂诱导下的体重(60％kcal/脂肪，N＝10)。双因素ANOVA计算显示高脂诱导下的Per1-/-和hPER2S662G或野生型小鼠没有显著的差异。
图9.代谢参数的测定。(a)2个月龄时，DEXA测定正常饮食下身体的组成。P值在相应的位置标记，N＝16。(b)高脂诱导5周后，DEXA测定身体组成，每个基因型N＝14。(c，d)通过代谢笼中的红外光线阻断测定正常饮食(c)和高脂饮食(d)小鼠在水平面上的总活动量。(e)小鼠高脂诱导5周后，测定小鼠在12小时光/12小时暗的周期下六天的进食量。结果显示为平均摄食量(克)±SD(N＝8)。
图10.hPER1S714和hPER1S714G小鼠肺提取物的细胞核内hPER1的丰度和磷酸化。
图11.BMAL1和CRY1在Per2和Dbp启动子区域E-box区的结合在肝组织中的改变。IgG作为内参。来自hPER1S714(蓝色)和hPER1S714G(红色)小鼠肝脏的染色体样品用抗BMAL1(c)和抗CRY1(b)抗体通过ChIP检测。ChIP样本用定量PCR分析。每次实验中，数据表示为最高值的百分比。平均值±SD由三次独立的实验获得。双因素ANOVA计算显示hPER1S714(蓝色)和hPER1S714G(红色)肝脏组织之间，BMAL1(p<0.001)和CRY1(p<0.001)在Per2和Dbp启动子区域的结合存在显著性差异。
图12.如上图3的Per1-/-小鼠肝脏组织的ChIP实验结果。使用抗BMAL1和抗CRY1进行免疫沉淀，IgG作为对照。ChIP样本用定量PCR分析。每次实验中，数据表示为最高值的百分比以及平均值±SD。BMAL1：CRY1：E-box的比率±SD通过三次独立实验的每个时间点上BMAL1的富集度除以CRY1的富集度而获得。
图13.脂肪(上)及肝脏(下)组织中，生物钟组分Bmal1、Cry1、Per2和Dbp在不同时间点的mRNA水平。转录水平通过qRT-PCR定量，以Gapdh mRNA归一化。每次实验中，结果表示为最高值的百分比。标准差±SD由三次独立实验获得。
具体实施方式
在本说明书及附随的权利要求中使用时，单数形式“一”、“一个(a)”以及“一个(the)”包括复数的引用，除非有其他明确的表述。
在说明书通篇中，除非上下文明确指示，词语“包括(comprise)”，或其变形“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应理解为表示包括所述元件或整体或包括元件或整体的组，而不排除任意其他元件或整体或排除任意元件或整体的组。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养及转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶反应和纯化技术可根据产品规格、或像在本领域中通常完成的或像在本文中描述的一样地执行。这些及相关的技术和过程一般可按本领域众所周知的常规方法或按照本说明书中引用或讨论的各种通常或更具体的的参考而执行。除非有具体的定义，否则结合使用的术语，和分子生物学、分析化学、有机合成化学、及在本文描述的医用材料-化学和药物化学的实验程序和技术，都是那些众所周知的并常用于本领域中的。标准技术可能被用于重组技术、分子生物、微生物、化学合成、化学分析、药物制备、配方、给药及患者的治疗。
如上所用，且贯通本发明的说明，除非另有说明，下列术语应被理解为具有以下含义。如果本文中的其他地方没有定义，所有本文使用的技术和科学术语均与本发明所述的本领域技术人员通常理解的具有相同的意思。
用于本文的术语“生物钟”是一种生化机制，这种生化机制在24小时的周期中波动，与昼夜循环协调，是驱动昼夜节律的中心机制，驱动昼夜节律的意思是指在约24小时的过程中发生的生理和行为参数的规律变化。这样的活动包括睡眠循环、营养循环和其它循环。
用于本文的术语“氨基酸”的意思包括光学异构体中的每一个，即天然和非天然氨基酸的L-异构体和D-异构体。而且，术语“氨基酸”包括组成天然蛋白质的仅20种天然氨基酸残基；也包括其他α-氨基酸、β-、γ-、和δ-氨基酸、非天然氨基酸、及类似的氨基酸。因此，蛋白PER1可能由保守氨基酸残基中的一个以上氨基酸残基进行修饰，例如，与组成天然蛋白的一种α-氨基酸残基具有相似的电荷、极性或其它特性的保守氨基酸残基；及其他α-氨基酸残基、β-、γ-、和δ-氨基酸、非天然氨基酸，、及类似的氨基酸。合适的β-、γ-、和δ-氨基酸的实例包括β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和鸟氨酸。组成天然蛋白或是非天然氨基酸之外的其它氨基酸残基的实例包括3,4-二羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基甘氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸或哌啶-3-羧酸(nipecotinic acid)。
用于本文的术语“PER1”包括哺乳动物周期1蛋白的全长蛋白、等位基因、衍生物和其任意长度片段。特别是，此处的衍生物包括由天然蛋白通过一个以上不同的氨基酸替换获得的蛋白、截短蛋白、和含有3’或5’“标签”的全长或截短蛋白的融合蛋白、以及上述文献中引用的或提交到诸如Gene Bank的公共数据库的天然或非天然突变序列。衍生物还包括这些蛋白，它们含有前导(LEADER)、表位或其它蛋白质序列，如Myc-tag、His-tag、或FLAG表位标记序列。
本发明与所有哺乳动物PER1蛋白有关。优选地，本发明涉及人PER1蛋白，其序列可在GANGBANK ACCESSION NP_002607找到，如SEQ ID NO:1所示。
用于本文的术语“SEQ ID NO:1的S714”指的是位于全长hPERE1蛋白位点714的丝氨酸，如SEQ ID NO:1所示。该丝氨酸位点是在所谓的富有丝氨酸基序(SR基序，含有形成类似SXXS序列的五个丝氨酸的一系列磷酸化位点)的第一个磷酸化位点，这个磷酸化位点已经在PERs中找到，其由酪蛋白激酶亚型ε(CKIε)和酪蛋白激酶亚型δ(CKIδ)靶向。序列比较显示在这个基序高度保守；它只在脊椎动物的PERs中被发现。这是可理解的，即：在SR基序中，第一个丝氨酸位点磷酸化将导致随后的丝氨酸位点的磷酸化，甚至使在蛋白中的其它潜在的磷酸化位点磷酸化。
用于本文的术语“磷酸化状态”指的是有关的蛋白质或其片段的磷酸化水平。全长蛋白或其片段可能包含许多潜在的磷酸化位点，这些位点可能在不同的时间不同的状态下被不同的激酶磷酸化。根据本发明，检测PER1蛋白磷酸化状态是指了解存在于PER1中的一个以上潜在的磷酸化位点的磷酸化状态，一个以上潜在的磷酸化位点例如从由磷酸化的氨基酸位点组成的组中选择的一个、两个或多个的位点。
根据本发明，改变SEQ ID NO.1的S714的磷酸化状态可能直接或间接的与受试者的食物摄取行为有关，特别是与受试者的摄食循环有关。如已经提到的，这样的包含丝氨酸磷酸化位点的SR基序在脊椎动物的PERs中高度保守；因此，存在于任意同源PER1蛋白的保守SR基序的第一个丝氨酸具有相似的功能，即，与受试者的食物摄取行为和摄食循环的改变有关。这样的一个丝氨酸能在如小鼠PER1的S714、或大鼠PER1的S713等中发现。
进一步的理解是，根据本发明，“磷酸化状态”也指被磷酸化的潜在的变化。例如，PER1基因的遗传突变可能改变被PER1磷酸化的可能性，并且如果是这样的话，这种突变可能被认为引起“磷酸化状态”改变的原因。如在实例中所示，hPER1中的突变，即把SEQ IDNO:1的S714改为甘氨酸，会永久的改变蛋白质的磷酸化图谱。这种突变因此可能被认为是蛋白质“磷酸化状态“的改变。
用于本文的术语“激酶”指的是一种蛋白质，这种蛋白质被本领域技术人员评估具有蛋白质激酶活性，例如，在筛选过程中能够使蛋白质磷酸化的一种蛋白质。这种筛选可使用如下面所示的任何一种实例相同或大致相似的状态。但是，设定磷酸化测定的方法在本领域中也是公知的。
用于本文的术语“筛选”指的是适合于使PER1磷酸化的病情或试剂。通常，筛选系统包含一种现成的磷酸基团来源。磷酸基团的优选来源是现成的ATP源。筛选系统可以基于细胞，或是体外。基于细胞的筛选系统包括使用表达任何PER1的细胞。筛选方法可以是细胞系统或无细胞系统。合适的细胞系统包括诸如S.cerevisia的酵母细胞、诸如E.coli的细菌细胞、诸如用于杆状病毒的表达系统的昆虫细胞、线虫细胞、诸如COS细胞的哺乳动物细胞、淋巴细胞、成纤维细胞(3Y1细胞、NIH/3T3细胞、Ratl细胞、Balb/3T3细胞等)、诸如239T细胞的人胚肾细胞、CHO细胞、血细胞、肿瘤细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、脑细胞。优选的细胞系统包括视交叉上核的细胞、神经细胞、骨髓细胞、神经胶质细胞和星形胶质细胞。基于细胞的系统中，如果细胞系统不表达PER1，则这些细胞必须被转染或转化来表达PER1。另外，可以使用无细胞系统。部分纯化或纯化的PER1可能通过重组表达PER1的来源而获得，或因此，原mRNA编码的蛋白质的基本碱基序列被修改。
在细胞中的PRE1的重组表达可能是转染的结果，所述转染利用包含例如编码PER1的cDNA和启动子的一个以上适宜表达载体。基于细胞的筛选系统也包括细胞的使用，PRE1被渗出或转染到该细胞中以作为含有转导或被转导序列的融合蛋白，诸如从HIV中获得的TAT蛋白、触足(Antennepedia)转导片段、或将外源蛋白转导到细胞的其它任何方法。优选的体外筛选系统包括含有一个现成的磷酸来源的水性复合物。优选的体外筛选系统包括ATP。
确定PER1蛋白磷酸化水平的方法的实例包括检测大量蛋白磷酸化的标准方法，例如放射性标记磷和放射自显影的使用，或间接的通过比较添加的放射性标记磷的量和获得的游离磷的量的方法。
另外，色度法或其它检测方法可用于确定磷酸化水平。用于确定周期蛋白的磷酸化水平的其它合适的方法包括使用谷胱甘肽琼脂糖珠的无细胞系统，其中PER1结合到诸如琼脂糖珠的固态支撑物上，并且添加PER1。另外，确定PER1蛋白量的其它替代方法也可是可行的，并且包括使用35S标记的PER1蛋白降解法、色度分析法、结合PER1蛋白的洗脱法等。
在这里描述的筛选方法特别有用，是因为它们可以自动化，允许高通量筛选大量试剂，包括随机或合理设计的试剂，以识别那些有效调节或改变PER1蛋白的磷酸化水平和/或降解水平的试剂，从而改变哺乳动物的生物节律。
用于本文的术语“哺乳动物”指的是人类、灵长类、犬、大鼠及其它高等生物，这些高等生物有覆盖在皮肤上的毛发，对于雌性而言，有哺育幼儿的乳腺。根据本发明，人类是最优选的。另外，用于全文的“受试者”是用来描述利用本发明提供的方法和试剂进行治疗，包括预防治疗的哺乳动物和以及优选地，人类。
在本发明中使用的“试剂和试剂等”包括任何生物制品或小分子的化学物，例如简单或复杂的有机分子、多肽、肽类似物、蛋白质、寡核苷酸、来源于微生物培养的化合物、天然或人工合成的有机化合物、或/和天然或人工合成的无机化合物。用于筛选的测试化学物或生物制品的选择在本领域中已经完善。
用于本文的术语“与改变的进食周期有关的病情”指的是与受试者的改变的、非正常的进食周期有关的疾病或环境。这种状态特别显著地在于其产生食物摄入行为与能量消耗周期的非偶联。这样的病情可能导致肥胖和其它代谢紊乱。这样状态的一个实例是“夜间进食综合征”。用于本文的术语“潜在发展为此状态”指的是受试者具有一个以上表示具有或将会具有相关状态的症状或特征。例如，在PER1的SEQ ID NO:1中具有S714G的人类受试者应当至少被认为患有夜间进食综合征。
用于本文的术语“进食周期”指的是与动物或人类是食物摄入行为有关的的生物节律。这样的周期可以在许多方面改变，例如进食时间、每个进食行为的持续时间、每次进食行为之间的间隔、进食周期的初始阶段等等。本发明涉及一种哺乳动物受试者，例如人类进食周期的调控方法。了解进食周期的调控可以影响进食周期的各个方面是非常重要的。
用于本文的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指的是获得有益或期望的结果的方法，包括并优选临床结果。治疗可包括选择性地改善疾病的症状或病情，或延缓疾病或病情发展。
除非上下文另外有说明，用于本文的术语“预防(prevention)”和类似词语诸如“预防(prevented)”和“预防(preventing)”等指的是一种用于预防、抑制、或降低疾病或病情的发病或复发的可能性的方法。也可指预防、抑制、或降低疾病或病情的症状出现或再次出现；或选择性地一种推迟疾病或病情的发病或复发或推迟疾病或病情的症状出现或再次出现的方法。用于本文的术语“预防”及类似词语也包括在一种疾病或病情的发病或复发之前减轻疾病或病情的强度、效果、症状、和/或负担。
本发明提到的方法涉及筛选或检测PER1的磷酸化状态，进一步涉及诊断与改变的进食周期相关的病情或潜在发展为此状态。基于该方法，本发明进一步提供了一种试剂的筛选方法，该试剂可有效地治疗或预防与改变进食周期相关的病情。值得强调的是通过上述方法筛选的这些试剂可进一步用于制造治疗和预防改变的进食周期相关疾病，例如夜间进食综合征，的有效药物。
实例
hPER1突变小鼠的构建及特性化
为了研究PER1特异的功能，构建了在终止密码子前具有Myc-tag(图1b)的携带S714G突变的BAC转基因小鼠(hPER1S714G)和野生型(hPER1S714)。因为与小鼠基因的高度同源性并转入基因能够与内源性的表达进行区分，所以使用了人转基因。获得的BAC载体包含启动子区域和大段的侧翼区(向上游延伸了85kb，向下游延伸了50kb)并且预期具有很大可能性包含调控元件和座控制区(G.A.Maston,et al.,Annu Rev Genomics Hum Genet 2006,7,29)。所有品系的拷贝数通过southern blot进行分析(图5c)。所有的小鼠使用C57BL/6J背景。
对每种基因型选择低拷贝(L)和高拷贝(H)的转基因品系，并分析了它们的自主活动。对比在持续黑暗下体现出剂量依赖的周期增长的hPER2的转基因(X.Gu et al.,CellDeath Differ,2011)，具有低剂量和高剂量hPER1的转基因小鼠在跑轮活动中都没有差异(L：τ＝23.73±0.16，H：τ＝23.72±0.14)(图1a、图6)。hPER1S714G小鼠显示出其使跑轮周期缩短的轻微的剂量依赖性(L：hPER1S714Gτ＝23.36±0.26，H：hPER1S714Gτ＝22.67±0.16)(图1a、图6)。hPER1S714G；Per1-/-表现出比Per1-/-小鼠更短的周期(图1a)，显示出这个突变的显性作用。这些数据表明，hPER1的突变造成了运动试验中生物钟的加速，但是这种效果相对弱于hPER2S662G鼠的效果。
由于Per1在维持组织自主性振荡的稳定节律中有决定性的作用(A.C.Liu etal.,Cell 2007,129,605)，将hPER1S714、hPER1S714G、或hPER2S662G小鼠与mPER2：：LUC敲入报告基因小鼠交配后观察外周组织的生物节律振荡(S.H.Yoo et al.,Proc Natl Acad Sci US A2004,101,5339)。出乎意料的是，hPER1S714G小鼠离体的SCN、肺、肝脏、脂肪、和脾脏组织显示出显著的周期缩短(红色曲线)(图1b、c)。尽管敲除Per1会造成外周组织振荡维持的减弱，但第一周期与第二周期的平均周期比hPER1S714G和hPER2S662G长，再次表明hPER1S714G小鼠的表型并非是因为缺失Per1功能造成的(图7)。还分析了与组织特异性行为相关的潜在不同作用的mPer1和mPer2的相对表达量。在肝脏、肺、脂肪、和脾脏组织中的mPer1和mPer2相对富集度不同(图1d)，显示出其在不同组织中功能有差异。另外，在脂肪和肺中，hPER1S714和hPER1S714G在第一周期中形成几乎倒相位的各自的生物钟(图1b)，说明hPER1S714G小鼠中可能存在内在紊乱。我们的体外数据显示，尽管其在不同组织中的功能存在差异，hPER1S714G对组织自主性的振荡具有总体的损害。hPER1S714G小鼠表现出进食节律的提前并且将食物摄入和能量消耗解耦联。
hPER1S714G组织中各个生物钟的相位关系的错位促使我们用综合实验室动物监测系统(CLAMS，Columbus Instruments)去测定在12小时光暗周期下觅食行为和能量代谢参数。非线性多元回归余弦拟合显示hPER1S714野生型和hPER1S714G突变小鼠的进食节律都满足24小时的节律(P<0.05，所有检测的小鼠)。hPER1S714和hPER1S714G小鼠食物摄入的生物节律峰值(acrophases)通过连续的三天的数据计算得到。对hPER1S714小鼠的低拷贝和高拷贝组的进食峰值的相位分别为ZT17.88±0.42和15.44±0.29。对于hPER1S714G小鼠的低拷贝和高拷贝组的峰值分别前移到ZT13.48±0.61和10.00±0.54(P<0.0001，单因素方差分析(One-wayanalysis of variance)(ANOVA))(图2a、b)。
为了分析在调控进食相位上的旁系同源特异性作用，比较了hPER2S662G和hPER1S714G小鼠的进食行为。相比于hPER2S662G小鼠(14.68±0.20)，hPER1S714G小鼠(10.00±0.54)的进食峰值显著提前(P<0.0001，单因素ANOVA)(图2b)。hPER2S662G小鼠的活动周期要比hPER1S714G小鼠短2小时，证实hPER1S714G进食相位中提前的进食相位是特异性的，并非是缩短的活动周期的结果(图2b左vs.右)。另外，Per1敲除的小鼠显示出轻微的进食相位前移(ZT14.71±0.40)，证实hPER1S714G在这种功能上的决定性作用(图2b)。另外，相位差(进食相位-氧气消耗相位)在hPER1S714G小鼠中为-3.35±0.45，而在低拷贝和高拷贝的hPER1S714小鼠中分别为0.11±0.35和-1.02±0.38(图2b)，说明氧气消耗与进食节律存在着显著的错位(P<0.0001，单因素ANOVA)。在hPER2S662G小鼠中也能观测到进食节律与氧气消耗之间轻微的错位(相位差)(-1.37±0.2，p＝0.06，与野生型小鼠对照)。该作用要比在hPER1S714G中弱，显示hPER1使进食相位和氧气消耗相位之间错位的同源基因特异性作用。与这样的表型相符的是，S714G转基因鼠会在光周期内比hPER1S714对照摄入更多的食物(56.9％±9.3％对比36.3％±5.7％，P<0.0001，单因素ANOVA)(图2c)。
为了研究摄食行为与能量消耗间错位的生理意义，分析了hPER1S714和hPER1S714G小鼠在正常饮食(NC)和高脂饮食(HFD)下的生长曲线。在9个月内，使用双因素ANOVA(基因型×时刻)比较体重(BW)，NC情况下，两种小鼠没有体现出基因型特异性差异(图2d)(p＝0.96)。然而，在HFD情况下，hPER1S714G小鼠体重增长的速度要比hPER1S714对照显著增加(图2e)(p＝0.033，基因型x时间，双因素ANOVA)。在Per1敲除和hPER2S662G小鼠中没有观察到类似的效果(P>0.05，图7)，证实短期高脂饮食诱导肥胖的变化是hPER1S714G小鼠特有的。另外，通过双能X射线吸收(DEXA)分析显示，在对8周龄小鼠进行HFD之前，各种基因型的身体组成是相同的(图9a)。然而，在保持HFD5周后，hPER1S714G小鼠的总脂肪含量比hPER1S714小鼠增加，而两个基因型的总瘦体重部分保持一致(图9b)，说明增加的BW与身体成分的改变相关(脂肪积累)。通过CLAMS测定的总体活动(图9c、d)和总食物摄入(图2c和图9e)在正常饮食和高脂饮食下没有差异，说明增加的BW并非是由于活动减弱或进食增加造成的。
为了分析在hPER1S714G小鼠中提前的进食行为是否加速高脂诱导肥胖，使食用NC的八周龄公鼠hPER1S714和hPER1S714G处于固定夜晚周期两周，并随后仅在夜晚周期变为HFD。hPER1S714和hPER1S714G小鼠表现出相当的BW增加(图2f，p＝0.59)，并且与整日喂食HFD，仅在夜晚喂食HFD的BW增加较小，说明不规则的进食时间是hPER1S714G小鼠的肥胖的主因。此外，为了测试在HFD的情况下改变的进食规则是否能够修正进食节律与氧气消耗之间的错位(相位差)，在仅在夜间喂食HFD的情况下，通过CLAMS记录觅食行为与能量消耗参数。hPER1S714和hPER1S714G小鼠都显示出相当的食物摄入和氧气消耗的类似模式(图2g)，说明提前的进食是hPER1S714G小鼠增加的BW的原因。
hPER1S714突变加速反馈环速度
改变的个体生物钟和因此改变的进食行为可能显示生物节律负反馈环的破坏功能。首先，研究了S714G突变对于hPER1蛋白磷酸化的影响。每隔4个小时牺牲hPER1S714和hPER1S714G小鼠，因为胞质中的hPER1无法检测到，所以制备肝脏及肺的核内提取物进行Western blot。使用MYC抗体，野生型的hPER1(hPER1S714)显示出丰度及迁移率变动都随着生理周期显著地短暂变化。对比之下，突变的hPER1在夜间显示出低丰度和低迁移率，但是不像hPER2S662G一样在白天也低(Y.Xu et al.,Cell,2007 128,59)(图3a和图10)。在过去几年内，通过PER2中SXXS位点的序列磷酸化遭到破坏造成的更快的降解和细胞核/胞质分布的改变已被用来解释PER2小鼠的昼夜节律表型(K.Vanselow et al.,Genes&development2006,20,2660)。选择性的在夜间使PER1被CKItau影响，加速PER1降解，用于解释短周期和相位变化(J.Dey et al.,Journal of biological rhythms 2005,20,99；M.Gallego,etal.,Proceedings of National Academy of Science of the United States ofAmerica 2006,103,10618；Q.J.Meng et al.,Neuron 2008,58,78)。因此，使用来自于hPER1S714和hPER1S714G小鼠的培养小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)来进一步分析核内hPER1的稳定性，通过环乙酰亚胺(CHX)-追踪分析发现带有S714G突变的核内hPER1加速hPER1蛋白的降解(图3b)。这也与在夜晚阶段hPER1S714G蛋白明显少于hPER1S714的观察一致(图3a)。将这一结果拓展到对生物节律周期的改变，在hPER1S714和hPER1S714G小鼠同步化的MEF细胞中，检测了生物钟的两个抑制蛋白，PER1和CRY1的表达动力学水平。在hPER1S714GMEF中，核内hPER1S714G蛋白显示出短暂变化。然而，相比于hPER1S714蛋白，核内hPER1S714G蛋白的峰值出现的时间要早很多，并且在16-20小时后几乎检测不到。相应的，以PER1依赖的方式，相比于野生型，CRY1蛋白也同样在核内和胞质内表现出提早的峰值(图3c)，说明hPER1S714GMEF有缩短的周期。为了检测核穿梭的S714位点，MEF用CHX处理14小时来从细胞去除所有的生物钟蛋白，然后移除CHX，用地塞米松(DEX)进行同步化。有趣的是，在CHX移除4小时后检测到可评估的hPER1S714G蛋白，随后在hPER1S714GMEF中，核内CRY1的积累也在4-8小时出现。与之相反，PER1S714蛋白在CHX移除8小时后才能检测到，在hPER1S714MEF中，核内CRY1的峰值出现在12小时(图3d)。重要的是，核内PER1和CRY1在0点时都无法检测到，说明两者的起点相同(图3d)。PER1和CRY1蛋白在hPER1S714GMEF核中的提早积累，反映了分子水平上，向核内运输速度的加快。因为内源性的mPER1存在于MEF中，情况是，突变hPER1和它的伴侣CRY1的提前入核更像是周期缩短的结果而不是由于降解机制的改变。
随后，研究了PER1S714位点的状态对于生物节律振荡的反馈环的时间依赖作用。检测了BMAL1和CRY1在Per2和白蛋白D位点结合蛋白(Dbp)基因，一个重要的生物节律输出基因(M.stratman,et al.,Genes&development 2010,24,1317)，的E-box区域的结合(图11)。BMAL1:CRY1在E-box上的比率变化显示出昼夜的振荡图形，其与hPER1S714G小鼠的PER1蛋白的节律图形相位一致(图3e、图11，BMAL1和CRY1在E-box上的结合)。由于PER1在先被报道能够与CRY1互相作用去以抑制BMAL1：CLOCK对E-box的激活，PER1周期性的积累很可能代表调节E-box活性相位的部分机制。有趣的是，与hPER1S714小鼠相比，在hPER1S714G小鼠中，BMAL1：CRY的比率提前了8-10个小时，表明PER1中S714G的突变改变了E-box活性的相位，与S714G突变造成入核提前的观点相符。S714G突变对于入核及蛋白稳定性的作用可能造成相位移动和短周期。为了区分hPER1S714G和PER1null的差异，也在Per1-/-的肝脏组织中检测了BMAL1和CRY1蛋白在Per2和Dbp基因的E-box区域上的结合。
最终，为了确定BMAL1：CRY1比率是否能够代表转录的活性，检测了RNA聚合酶II(RNAPII)在Per2和Dbp启动子区域的结合(J.P.Etchegaray,et al.,Nature 2003,421,177)。在hPER1S714和hPER1S714G小鼠肝脏中,RNAPII结合信号与BMAL1：CRY1比率的变化是几乎一致的(图3f)。随后，分析了生物钟基因mRNA在肝脏和脂肪组织中的图谱。在两种组织中，相比于在hPER1S714，在hPER1S714G中表达谱相位显示出反相或接近反相的图样(图3g，图13)，说明hPER1中S714G的突变改变了BMAL1：CLOCK和PER：CRY间的平衡，在负反馈环中的相位改变中起着重要的作用。
改变的进食节律和生物钟的缺陷交互地加剧了内部错位
各种组织转录的相位是内源性周期与体内输入的综合。食物对于小鼠的多种组织，如肝脏、肾、心脏等都是生物节律振荡的主要授时因子。需要讨论进食行为的提前是否加剧了肝脏和脂肪组织中靶向基因表达相位的移动。为了解决这个问题，hPER1S714和hPER1S714G小鼠从ZT16至ZT20用NC喂食2周。和先前对夜行性动物的报道(F.Damiola etal.,Genes&development 2000,14,2950),对hPER1S714小鼠，进食时间限制到夜间并没有显著的改变周期性基因表达的相位角(图4a和图3g对比，图13)。与之相反，在hPER1S714G小鼠中观察到相位前移的改善，Per2和Dbp的mRNA从ZT0-4移动到ZT4-8，说明提前的进食对于增加hPER1S714G小鼠生物钟基因转录的相位移动是主要的因素。
为了系统性的分析S714G突变影响的转录，使用Capitalbio提供的Agilent RNA芯片服务比较了肝脏和脂肪在时点(Zeitgeber time,ZT)1和ZT13的转录组(ZT0开灯，ZT12关灯)。设定2倍的改变阈值标准，并且结果在5％水平时认为统计上显著(P<0.05)。层次聚类分析鉴定了肝脏组织中有119个转录本(图4b)，脂肪组织中有28个转录本(图4c)，其在ZT1和ZT13存在显著的相位颠倒，说明进食提前是造成节律性转录相位移动增加的主要原因。然后，肝脏组织中119个逆转录本与由来自Panda组数据的tRF改变的240个转录本进行比较(M.Hatori et al.,Cell metabolism 2012,15,848)，发现在两组中有44个共同变化的基因，再次显示了进食的巩固作用(图4d)。最后，119个逆转录本中的60个活性转录本与数据库中报道的PER1结合位点(N.Koike et al.,Science 2012,338,349)共定位，或者与Ueda组发现的RRE、D-box、E-box驱动的节律性基因(http://www.dbsb.org/)，包含Bmal1、Nrld2、Nfil3、Dbp、Hmgcr、和PPAR(图4e)。这些数据表明，大部分变化的基因是由PER1直接调控或者依赖于生物钟系统。因此，生物钟和代谢的协同互作通过节律性的转录得到证实。
尽管很多的生物钟基因敲除的小鼠已经被应用在生物钟基因作用的研究上，但是同源基因在进化中整合并促进哺乳动物生物节律系统多样化的方式还不清楚。先前的研究发现，SXXS基序在脊椎动物的PERIOD同源物中高度保守，预示这个基序对于PERIOD的固有功能有关键作用。这个基序的重要性已经通过hPER2中的S662残基对引发磷酸化级联反应及信号放大机制是必要的这一事实而证实(Y.Xu et al.,Cell 2007,128,59)。其它蛋白，包含活化T细胞核因子(NFAT)家族和APC(H.Okamura et al.,Molecular and cellularbiology2004,24,4184；M.A.price,Genes&development 2006,20,399)也在进化中产生了SXXS基序。这样的发现说明SXXS的基序经过进化的物种形成而出现，可能使这些蛋白适应了环境的变化。推测改变这些基序可能是解析这些同源蛋白常被忽视的特异性功能的重要工具。在此项研究中，发现了PER1中S714位点在调节进食相位上的关键作用，这在Per1-/-小鼠，hPER2S662G或Per2-/-小鼠中都不曾发现。这项发现表明复制的基因随时间不断分化而经历功能上的特化，但是与前体基因依然存在着部分重叠。
确实，休息、进食、适应自然环境的日常变化可能导致了生物钟、代谢和休息-活动周期的共进化和相互关联，特别是在高等动物中。总体上说，环境的昼夜循环对SCN提供了主要的诱导信号，来调节行为，包括休息-活动周期和进食周期(U.Albrecht,Neuron 2012,74,246)。但是，进食周期能够作为同步器并且在某些节律性的过程中产生相位移动。hPER2S662G的小鼠已经证实是一个睡眠相位前移综合症的模型，表现出在昼夜周期中4小时的活动相位提前(Y.Xu et al.,Cell2007,128,59)。如果休息-活动的周期和进食节律是紧密联系的，那么在hPER2S662G小鼠中进食节律的相位会和休息-活动的相位一样提前。但是，发现相比于hPER2S662G小鼠，在hPER1S714G小鼠中会有更显著的进食行为的相位前移，与其休息-活动周期没有相关性，说明PER1和PER2功能的不同，休息-活动和进食的周期至少部分是分开的。发现hPER1S714G突变小鼠因进食时间的改变而在高脂诱导下更快的产生肥胖，并hPER2S662G小鼠不会这样中，进一步支持其存在特异性功能。在人类中，夜间进食综合征(NES)的特征在于夜间摄入大量食物(在早上和傍晚时段的缺乏食欲或夜晚饮食过量)(A.J.Stunkard et al.,Am J Med 1955,19,78)，影响到约1-2％的人群。大部分患有NES的患者也肥胖(K.C.Allison et al.,Obesity 2006,14Suppl 2,77s)。目前NES患者的尚没有可行的突变筛选，但在全基因组的层次上分析人类疾病遗传中发现，因为同源基因的蛋白序列功能相近，序列突变更倾向于发生在排列的氨基酸对上(M.Yandell et al.,PloSComput Biol2008,4,e1000218)。先前的研究在FASPS中鉴定了PER2S662G，并且很可能在NES病人中存在PER1的S714G突变。
对于PER1，PER2分别控制进食-禁食周期及活动-休息周期的相位提前的机制还不清楚。近期的研究表明，PER2而不是PER1能够与多种的核受体结合，可能能够用来解释两种PER蛋白功能上的差异(I.Schmutz,et al.,Genes&development 2010,24,345)。这里同样地，在肝脏和脂肪组织中PER1S714G诱导的靶向转录本不一致，并且Per1和Per2富集度的不同，证实了PER1对靶向基因表达存在组织特异性效果。越来越多的证据表明生物钟和大多数的生理过程的连接是双向的。将来的研究将从PER1的结合蛋白入手，利用组织特异性的敲除技术分析它们在代谢中的具体作用。
下面列出的实例仅用于证明的目的，而不用于以任何方式限制本发明的范围。
实例1
构建PER1BAC转基因小鼠
RP11-1D5是一个从人类基因组文库中挑选出的细菌人工染色体克隆，包含完整的PER1，位于含有85kb的基因上游区域的163kb基因插入位点(奥克兰儿童医院研究所)。这个BAC克隆通过先前描述的同源重组的方法进行了改造(H.Y.Lee et al.,The Journal ofclinical investigation 2012,122,507)。在hPER1基因的TAG终止密码子前的区域引入了编码C-Myc tag的序列以进行蛋白检测。然后，突变(S714G)通过重组插入上述BAC克隆中形成hPER1S714G突变形式，并且将未引入突变的载体作为对照。转基因的小鼠通过显微注射改造BAC克隆而得到。首建鼠用C57BL/6J回交5代以上。我们通过southern blot基于其拷贝数分析了上述小鼠，分别对每种基因型选择了高拷贝和低拷贝两个转基因品系。
实例2
动物管理和行为分析
自发转轮周期的测定按照X.Wang et al.,The EMBO journal 2010,29,1389中在先描述地进行。小鼠被单独放置在装配有转轮的独立的笼内，放置在避光通风的箱体中，通过定时器控制光照。跑轮的活动在12小时光暗周期监测7天，随后进入4周的黑暗期。用Clocklab系统分析生物节律的参数，通过在持续黑暗期后8-21天计算周期(Actimetrics，IL)。所有的动物实验在AAALAC国际(国际实验动物评估认证管理委员会)认证的SPF级动物房内进行，所有的动物实验流程都在中国南京大学经模式动物研究所国家遗传工程小鼠资源库的动物管理及使用委员会审核通过。
实例3
生物荧光记录
实时记录离体组织生物荧光的具体方法遵循Shin Yamazaki的方法，并与Yamazaki和Sergey A.Savelyer当面交流SCN的培养(S.Yamazaki,et al.,MethodsEnzymol 2005,393,288；S.A.Savelyev,et al.,J Vis Exp,2010)。离体组织在关灯之前一小时采样，并在添加10mM HEPES、4.5mM NaHCO3、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的Hank's平衡盐溶液中冷却。离体组织随后转移到添加B27添加剂(产品编号17504-044，Gibco)、10mM HEPES(pH7.2)、抗生素(100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)、0.1mM荧光素(Promega)、4.5g/l葡萄糖、4.2mM NaHCO3的DMEM培养液中(产品编号D2902，Sigma)。使用Millicell(0.4um，30mm直径，Millipore)培养SCN。培养皿使用光学粘附膜(Applied Biosystems)封口。所有的实验在32道的自动荧光记录仪lumiCycle(Actimatrics Inc，IL)中进行，放置在37℃环境下培养，以10分钟的间隔进行监测。
使用Mariko Lzumo研发的self-step算法(M.Izumo et al.,Plos Comput Biol2006,2,e136)获得荧光素酶的节律：
(1)从第一个数据点起，线性回归法以24小时的长度应用于子序列数据序列以计算趋势线。此后，将子序列的趋势线临时储存在储存器中。从第二原始数据点起，重复上述步骤，随后是第三原始数据点，以此类推。直至子序列数据超过最后一个原始数据点时停止处理；
(2)每个时间点储存的所有值取平均得到最终的趋势线；
(3)通过从原始数据去除所述趋势线而提取节律组成部分；
(4)为了减低衰减的影响，每个去除趋势线的数据用子序列数据序列(24小时)的标准差除，并且临时储存在存储器中；
(5)步骤(4)中得到的数据平均化以得到去除趋势、恒定单位方差的时间序列。
在节律恢复后，计算相位和周期。此处，生物钟的振荡被认为是余弦波形。用非线性非线性最小二乘法评估余弦波形的参数。周期、相位、快速傅里叶变换中的最强光谱峰的振幅初始化非线性最小二乘法。
实例4
组织采集
在组织采样前不同基因型的小鼠在12小时光暗周期下进行诱导至少7天。以4小时的给时时间(ZT)0，4，8，12，16，20，和24间隔地采集组织，其中，ZT12对应夜晚来临的时间。在每个时间点，每种基因型平均有三到四只鼠。
实例5
RNA提取、RT-PCR和mRNA表达分析
RNA提取和RT-PCR(包括mRNA图谱的引物)基本按照先前的描述进行(X.Wang etal.,The EMBO journal 2010,29,1389)。各个RNA的相对量使用对应的Gapdh或36B4RNA水平进行校正。用于这些计算的每个ZT值为至少两次相同反应的重复实验的平均值，相对的RNA水平表示为每次实验中最高值的百分比。每个均值±s.d.来自三次独立实验(并且下文所有均值±s.d.均是如此)。
实例6
芯片检测
芯片标记和杂交由博奥公司(Capitalbio and China)代表性地使用Agilent小鼠全基因组Oligo芯片(4X44K)进行。杂交的基因芯片使用AgilentG2565CA芯片扫描仪读取数据。特征提取用于转化为基因芯片探针结果文件。GeneSpring GX软件用于分析探针水平数据。
所有芯片中信号强度的原始数据使用log转换(底数为2)并且用R进行归一化(B.M.Bolstad,et al.,Bioinformatics 2003,19,185)。对于芯片的显著性(SAM)分析(V.G.Tusher,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 2010,98,5116)，肝脏与脂肪中hPERS714G和hPERS714之间的转录本在特定的时间点(ZT1和ZT13)显示2倍的差异或5％错误发现率，是统计学显著的。聚类分析使用平均连锁利用MeV进行(A.I.Saeed et al.,BioTechniques 2003,34,374)。
实例7
抗体，western blot(WB)，染色质免疫沉淀(ChIP)
新鲜的肝脏提取物按照设定的给时时间点使用核提取试剂盒制备(ActiveMotif，100505)。简言之，100mg新鲜肝脏使用5ml冰冷(icecold)的PBS/磷酸酶抑制剂清洗，随后转移到添加了2ul 1M DTT、2ul洗涤剂的1ml冰冷的1x低张缓冲液中匀浆。在850Xg转速下离心10分钟，细胞使用150ul1x低张缓冲液轻柔地重悬15分钟并且在14000g离心1分钟收集细胞核沉淀。细胞核沉淀使用添加蛋白酶抑制剂cocktail的100ul完全裂解缓冲液重悬，随后提取核蛋白。细胞质及核部分使用Bradford法进行定量后分装保存在液氮中。小鼠的胚胎成纤维细胞由13.5天的胚胎制作。第三代的细胞在100mm的培养皿中长满。细胞核及胞质的蛋白在用100ug/ml蛋白合成抑制剂CHX处理后，在设定的时间点采集。核和胞质部分使用western blot进行分析。蛋白样品使用十二烷基硫酸钠(SDS)-6％聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺29.6g；双丙烯酰胺0.4g)电泳进行分离后转移到PVDF膜上。按制造商说明，在PBS使用5％脱脂奶粉进行封闭膜后用MYC抗体(Sigma)进行培养，所述MYC抗体以1:500在包含0.05％Tween20的PBS中稀释。使用羊抗兔IgG-HRP(santa Cruz.sc-2030)和ECL(Amersham)检测免疫反应的条带。ACTIN染色作为上样对照。
染色体免疫沉淀(ChIP)实验按照先前的描述进行修改(M.Yandell et al.,PloSComput Biol 2008,4,e1000218)。低张缓冲液(Active Motif,100505)用于获得核提取物。来自非免疫兔的兔IgG作为阴性对照。对E-box位点的ChIP(Cry1和Per2启动子区域)，Cry1的第一个内含子作为对照区域；对RRE位点的ChIP(Bmal1和Cry1的启动子/增强子区域)，Cry1的启动子作为如前所述的对照位点(G.Shi et al.,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 2013)。q-PCR的引物在附表中列出。
实例8
代谢节律测定及分析
小鼠在正常的光暗周期下诱导一周(8点开灯，20点关灯)。经过三天的适应期后，使用综合实验室动物监测系统(Oxymax，Columbus Instruments)以30分钟的间隔连续记录小鼠3天的进食、氧气消耗(VO2)数据。采样时间点使用下列公式进行转换：x＝((小时*3600+分*60+秒)/3600-8)*2，其中，第一天的8：00设为0，并且第二天的8：00记录为48。72小时周期累积进食和VO2导入matlab中。随后，进食及VO2值使用参数为5的移动平均法进行平滑化。数据使用公式(y＝a*cos(2*pi/48*x-b)+c)进行拟合。参数b代表每只小鼠进食及VO2的相位，随后相位使用公式ZT＝24*b/2*pi转换到ZT时间。相位差由进食相位减去VO2相位得到。每个数据表示为平均值±SEM。
实例9
进食流程和生长曲线
年龄配对的野生型及突变小鼠使用正常饲料(NC)共同饲养(每笼5只)至8周龄，然后分别给予NC或是HFD(研究饲料，D12492，60％脂肪kcal％饲料)至9个月。对限制性饮食的流程，年龄匹配的野生型和突变小鼠用正常饲料养至6周然后用NC在ZT0到ZT12间限制食物获取两周，然后转换到HFD。体重在每天的ZT0进行记录。在实验起始和结束时，在麻醉状态下使用双能X射线吸收仪测定身体组成(脂肪含量和瘦体重)(DEXA,PIXImus,GE LunarCorporation,Madison,WI,USA)。
实例10
统计
使用单因素ANOVA进行进食相位、氧气消耗相位、组织周期和身体组成的统计分析。NC和HFD下自由饮食及限制性饮食的生长曲线使用双因素ANOVA进行分析。P＜0.05视为显著性差异。
尽管本文已经详尽地描绘并描述了具体实施方案，但是显然在相关领域技术人员能够在不背离本发明的精神的情况下进行各种修改、增加、替换等，并且这些都应被认定为在下述权利要求所限定的本发明的的范围内。
Figure IDA0000994234080000011
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Claims (5)

1.一种识别PER1磷酸化状态的试剂在制备用于筛选哺乳动物中与进食节律提前相关的病情或潜在发展为所述病情的产品中的用途，所述试剂用于检测所述哺乳动物中PER1磷酸化状态，所述磷酸化状态通过检测SEQ ID NO：1中714位的丝氨酸的磷酸化状态确定，并且检测到所述714位的丝氨酸的脱磷酸化表示所述病情的阳性诊断。
2.根据权利要求1的用途，其中所述试剂用于检测714位点的丝氨酸是否突变为甘氨酸。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述病情是夜间进食综合症。
4.根据权利要求1或2的用途，其中所述哺乳动物选自灵长类动物、犬、大鼠、小鼠。
5.根据权利要求4的用途，其中所述灵长类动物选自人类。
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