CN101165192A - 应激评价方法 - Google Patents
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Abstract
基于以下发现阐明了联系时钟基因与应激的分子反应机制:应激伴随外周组织中Per1基因表达水平的增加,应激反应不改变外周组织的昼夜节律,以及Per1基因依赖存在于其启动子区域内的糖皮质激素反应性元件而增加其表达水平。这个发现被用于应激评价。即,通过检测和确定外周组织中Per1基因转录物(mRNA)的增加(Per1基因编码的蛋白的增加),可评价应激的存在或缺乏或程度。
Description
相关申请的交叉参考
本发明包含涉及2005年10月18日在日本特许厅提交的日本专利申请JP2005-302589的主题,其全文在此并入作为参考。
技术领域
本发明涉及用于应激评估的方法,该方法目的是检测外周组织中Per1基因表达水平、Per1基因、由Per1基因编码的蛋白质PER1的任何增加,以及Per1基因的转录物或PER1作为应激检测的标记物的用途。
背景技术
包括从单细胞生物体到人的所有有生命的生物体普遍地具有昼夜节律,该昼夜节律是基于24小时周期的活体现象或生物学节律。它们还具有控制该昼夜节律的基因。
在哺乳动物中,昼夜节律控制基因主要在下丘脑的视交叉上核(SCN)中表达并在个体昼夜节律的控制中起着重要作用。在有生命的生物体中它也在其它组织中表达,从而以与中枢相同的方式控制细胞和组织的昼夜节律。
已知昼夜节律控制基因包含Per基因(Per1、Per2和Per3)、时钟基因(Clock gene)、Bmal基因(Bmal1、Bmal2和Bmal3)、Cry基因、Dec基因(Dec1和Dec2)、Dbp基因、E4Bp4基因、和Rev-erb基因(Rev-erbα和Rev-erbβ)。
日本专利公开第2000-275248号先于本发明,其披露了通过测量唾液中的皮质醇用于确定慢性应激的方法。顺便提及,本发明采用SokoloveP.G.和Bushell W.N.(1978)J Theor Biol.72,131-160作为后面提到的其非专利文献举例的参考。
发明内容
发明概述
由于将时钟基因和应激相联系的分子反应机制还不明确,所述机制不同于确信存在于哺乳动物中的涉及应激反应性的昼夜节律控制机制,因此有必要阐明该机制。
本发明人基于他们的以下发现完成这项发明:应激伴随外周组织内Per1基因表达水平的增加,应激反应不改变外周组织中的昼夜节律,以及Per1基因依赖存在于其启动子区域内的糖皮质激素反应性元件而增加其表达水平。
前述发现提示了下述应激反应机制的存在。施加到个体生物体的任何应激导致肾上腺皮质分泌糖皮质激素以循环进入身体的每一部分。并且Per1基因的表达水平依赖存在于其启动子区域内的糖皮质激素反应性元件而增加。也就是说,应激通过与例如时钟基因表达和昼夜节律不同的机制来增加Per1基因的表达水平。
上述发现对于应激评价是有用的。也就是说,将有可能通过检测mRNA和PER1的增加或确定其量来检测应激的存在或缺乏,或评价应激的程度,mRNA是外周组织中Per1基因的转录物,PER1是由Per1基因编码的蛋白质。
检测Per1基因的转录物可通过合成总RNA或从外周组织中提取总RNA,以及将具有Per1碱基序列(或其部分)的多核苷酸(作为检测探针)与提取或合成的核酸杂交来完成。并且,PER1(蛋白质)的检测也可通过涉及特异性结合PER1的抗-PER1抗体的抗原-抗体反应来完成。
可从NCBI(国家生物技术信息中心)的基因数据库得到Per1基因的碱基序列和归因于Per1基因的氨基酸序列的信息。例如,序列No.1显示人Per1基因同源物的碱基序列,而序列No.2显示小鼠Per1基因的碱基序列。依据本发明实施方案的Per1基因不仅包含各种动物中Per1基因的同源物的序列,还包含那些部分具有替代、缺陷、插入和添加的序列。
本发明的实施方案提供了对应激的客观和精确评价。
附图说明
图1A是显示实施例1中小鼠在应激下在一天内如何改变其活动的活动变化记录图;
图1B是图表,用图表表示实施例1中图1A的活动变化记录图中观察到的小鼠的昼夜节律的平均值;
图1C是显示实施例1中施加应激前后观察到的活动性比率的变化的图;
图1D是显示实施例1中施加应激后直到再同步的天数的图;
图2A是显示实施例2的昼夜节律周期中肝脏内时钟基因表达量如何改变的图;
图2B是显示实施例2的昼夜节律周期中心脏内时钟基因表达量如何改变的图;
图2C是显示实施例2的昼夜节律周期中肾脏内时钟基因表达量如何改变的图;
图3A是显示实施例3中肝脏内时钟基因表达量的图;
图3B是显示实施例3中心脏内时钟基因表达量的图;
图3C是显示实施例3中肺内时钟基因表达量的图;
图3D是显示实施例3中肾脏内时钟基因表达量的图;
图4A是显示实施例4中GRE类似序列及其邻近的序列的图;
图4B是显示实施例4中的序列上每个启动子的位置的示意图;
图4C是显示实施例4中荧光素酶分析的结果的图;
图4D是显示当GRE类似序列改变时荧光素酶分析的结果的图;
图5A是描述实施例5中Per1基因的序列的示意图;
图5B是显示用于通过半定量RT-PCR检测所需序列的电泳的照片,所述半定量RT-PCR在通过实施例5中的ChIP方法得到的免疫沉淀物上进行;
图5C是显示在通过实施例5中ChIP方法进行免疫沉淀之后通过定量实时RT-PCR来检测所需序列的实验结果的图;
图6A是显示用于通过半定量RT-PCR检测所需序列的电泳的照片,所述半定量RT-PCR在通过实施例6中的ChIP方法得到的免疫沉淀物上进行;
图6B是显示在通过实施例6中ChIP方法进行免疫沉淀之后通过定量实时RT-PCR来检测所需序列的实验结果的图;
图7A是显示实施例7中皮质酮剂量和Per1基因表达量之间的相关性的图;
图7B是显示实施例7中通过施用皮质酮(10mg/kg)诱导的每个时钟基因表达量的图;和
图8是显示与本发明的实施方式相关的应激反应的机制的示意图。
具体实施方式
实施例1
这个实施例的目的是通过分析由红外线活动记录装置(Biotex制造)记录的小鼠活动的数据,来研究小鼠在应激下一天内如何改变其活动。
通过使BALB/c系小鼠在配备有红外线活动记录装置的笼内在黑暗中自由活动24小时,将小鼠的活动记录在活动变化记录图上,此前该小鼠已对12小时间隔的明亮和黑暗环境(前者从8点持续到20点)的昼夜节律适应2周。在连续的两天内,在它的自由奔跑过程中,小鼠在指定时间被给予1小时的应激。顺便提及,活动变化记录图是显示小鼠的连续活动的记录。所得到的活动变化记录图通过“卡方周期图(periodgram)”方法进行分析(见非专利文献)。
图1A是显示小鼠在应激下在一天内如何改变其活动的活动变化记录图。图1顶部的数字显示测量时间。顶部下方的黑色和灰色线分别显示小鼠在开始自由奔跑之前经历的明亮和黑暗环境的时间。图1中第二行和随后的行显示两天的活动变化记录,每一点代表检测到的活动的数量。
图1中,“CT2”、“CT5”、和“CT15”分别表示昼夜节律时间的2点、5点、和15点。昼夜节律时间意味着小鼠的主观时间。由于小鼠是夜间活动的,如果它交替经历以12小时为间隔的明亮和黑暗环境,明亮环境开始于昼夜节律时间的0点。可替换地,如果明亮和黑暗环境以24小时的间隔转换,小鼠由于昼夜节律而开始减少其活动(或开始睡觉)的时间被看作0点。
每一活动变化记录有两个黑色遮盖的部分。它们代表施加应激的时间区。即,“CT2”、“CT5”、和“CT15”的活动变化记录分别显示,在小鼠被置于每天24小时的黑暗中后,在第20天和第21天的1-2点、4-5点、和14-15点(昼夜节律时间)施加应激。
由图1A表明,应激下的小鼠不改变它的昼夜节律。
图1B是图表,其用图表表示从图1A的活动变化记录图中观察到的小鼠的昼夜节律周期的平均值。纵轴上的“时间(小时)”表示小鼠的昼夜节律周期(或小鼠主观的一天的长度)”。横轴上的“PrS”和“Pos”分别表示施加应激前的昼夜节律周期和施加应激后的昼夜节律周期。“应激”表示施加或没有施加应激。“CT2”、“CT5”、和“CT15”的定义如上。
图1B表明,施加应激前后昼夜节律周期改变非常少。
图1C是显示施加应激前后观察到的活动性比率的变化的图。纵轴上的“活动性比率(%)”表示施加应激后3天的活动性值被施加应激前10天的活动性值除所获得的值(%)。“应激”表示施加或没有施加应激。“CT2”、“CT5”、和“CT15”定义如上。
图1C表明,未施加应激组(对照)和施加应激组之间活动性比率差异很小。
图1D是显示施加应激后直到再同步的天数的图。该图是基于这样的实验,该实验的目的为研究当把小鼠交替置于以12小时为间隔(从8到20点为明亮环境)的明亮环境和黑暗环境中、然后给予应激并最终提前6小时置于明亮环境中(从2到14点为明亮环境)时,需多少天使其昼夜节律再次同步(resynchronize)。
纵轴上“直到再同步的天数”表示当小鼠置于明亮环境中的时间改变后为了再同步所需的天数。“ZT2”表示在1-2点(授时因子时间)(Zeitgebertime)给予应激的组。同样地,“ZT15”表示在14-15点给予应激的组。“ctrl”表示未给予应激的组(对照)。此处,“授时因子时间”表示定时系统的时间,其中当明亮环境和黑暗环境以12小时为间隔重复时,明亮环境开始于0点。
由图1D表明,ZT15和对照之间直到再同步的天数差异非常小,尽管ZT2缺乏一致性。
实施例1的结果提示,施加应激对受试个体小鼠的昼夜节律改变很少。
实施例2
这个实施例是为了研究在昼夜节律周期中当施加应激时,时钟基因的表达量如何变化。
每个小鼠在指定时间给予一小时的应激,然后从施予应激后12小时开始以4小时的间隔采集其器官(肝脏、心脏和肾脏)。所采集的器官被均质化以使用Promega总SV RNA分离试剂盒(来自Promega)提取总RNA。提取的总RNA用于通过定量实时RT-PCR来确定mPer1、mPer2、和Bmal1基因的表达量。
将这样获得的显示表达量随时间的改变的数据绘图,用于通过基于以下公式的“余弦拟合曲线”方法而拟合。
该结果在图2A到2C中显示。
图2A是显示肝脏内时钟基因表达量在昼夜节律周期中如何改变的图。图2B是显示心脏内时钟基因表达量在昼夜节律周期中如何改变的图。图2C是显示肾脏内时钟基因表达量在昼夜节律周期中如何改变的图。
在图2A到2C中,“mPer1”、“mPer2”、和“mBmal1”分别表示在昼夜节律周期中,mPer1、mPer2、和mBmal1的表达量如何改变。顺便提及,附加于每一基因名称的前缀“m”代表小鼠(Mus musculus)。并且,在图2A至2C中,“ctrl”表示未给予应激的组(对照),“ZT2”表示以授时因子时间在1-2点给予应激的组,和“ZT15”表示以授时因子时间在14-15点给予应激的组。横轴上的数字代表器官被采集的时间。
图2A到2C表明,每个时钟基因表达量有变化,但给予应激的组(“ZT2”和“ZT15”)和未给予应激的组(“ctrl”)之间在昼夜节律相移上差异很小。
因此,实施例2的结果表明,就时钟基因表达水平而言,施加应激导致昼夜节律相位的极小改变。
实施例3
这个实施例是为了研究当施加应激时每一器官内时钟基因表达量如何改变。
每个小鼠在指定时间给予一小时的应激,然后从施予应激后12小时开始以4小时的间隔采集其器官(肝脏、心脏、肺和肾脏)。所采集的器官被均质化以使用Promega总SV RNA分离试剂盒(来自Promega)提取总RNA。提取的总RNA用于通过定量实时RT-PCR来确定每一时钟基因的表达量。
该结果在图3A到3D中显示。
图3A是显示肝脏内时钟基因表达量的图。图3B是显示心脏内时钟基因表达量的图。图3C是显示肺内时钟基因表达量的图。图3D是显示肾脏内时钟基因表达量的图。
在图3A到3D中,“Per1”、“Per2”、“Per3”、“Bmal1”“Npas2”、“Cry1”、“Cry2”、“Dec1”、“Dec2”、“Dbp”和“E4bp4”分别表示每个时钟基因的表达量。并且,黑条表示未给予应激的对照组中时钟基因的表达量,以及白条表示给予应激的组中时钟基因的表达量。横轴上的数字代表采集器官的时间,纵轴上的数字表示表达量(相对值)。
由图3A到3D表明,施加应激引起每个器官内Per1基因表达量的增加,但不引起每个器官内其它时钟基因表达量的增加。
从上述实施例1到实施例3总结出,就个体的活动性节律或时钟基因表达水平而言,不管是否施加应激,昼夜节律保持稳定,而Per1基因在外周组织内的表达水平在施加应激后立即增加。
前述结论提示了通过使用作为指标的Per1基因在外周组织中的表达水平来客观评估应激的可能性。
并且,前述实施例中实验的结果提示,一旦施加应激,Per1的表达水平通过新的转录控制机制增加,该机制与通过已知启动子(例如E-box和CRE)的途径、例如Bmal/时钟-E-box途径和CRE-CREB途径不同。
实施例4
这个实施例是为了研究与应激反应相关的Per1基因的启动子。
第一步是基于基因组信息,对Per1基因启动子区域进行计算机上的(insilico)序列分析。其结果表明,在所有人、大鼠和小鼠的启动子区域的序列中都有四组E-box和两组DBPE(Dbp-结合元件),并且有两个GRE(糖皮质激素反应性元件)类似序列(以下将称作“GRE类似序列”)。
顺便提及,E-box不仅存在于Per1基因的启动子区域,还存在于Per2和Dbp基因的启动子区域。此外,DBPE还存在于Per3基因的启动子区域。
图4A是显示GRE类似序列和它的邻近序列的图。图4B是显示序列上每个启动子的位置的示意图。
图4A和4B中,“远侧GRE”和“近侧GRE”分别表示两组GRE类似序列的上游序列和下游序列。而且,“H”、“R”和“M”分别表示人、大鼠和小鼠的序列。加下划线的序列是类似GRE的序列。“Ex1”和“Ex2”分别表示外显子1和外显子2。
图4B中,“E-box”、“GRE”、和“CRE”分别表示E-box、GRE类似序列、和CRE在Per1基因的启动子区域中存在的位置。
第二步是萤光素酶分析,以研究Per1启动子区域的什么部分与应激反应相关。
萤光素酶是一种催化生物发光的酶蛋白。它可用于通过以下方式估计特定基因的表达被诱导的水平。首先,制备重组基因,该重组基因中特定基因的启动子区域与编码荧光素酶的基因连接。第二,将重组的基因掺入培养的细胞。第三,允许该基因进行表达,这样使荧光素酶能够表达。第四,测定由荧光素酶引起的生物发光的强度以获得荧光素酶表达的水平。
以前述原理为基础进行了实验。它包括制备数种DNA,所述DNA在Per1启动子区域长度上有所不同,以及当存在地塞米松时测定Per1的表达水平。这样获得的结果揭示了Per1基因启动子区域的什么部分与应激反应相关。顺便提及,地塞米松是合成的糖皮质激素。已知当有生命的生物体经历应激时,血液中糖皮质激素的量增加。
实验的步骤概述如下。(1)第一步是制备DNA(P1F、P1K、和P1S),第一个具有Per1基因启动子区域的全长,第二个和第三个具有Per1基因启动子区域的部分长度,上游侧被切掉。如图4B所示,P1F的截断位置在距离Per1基因转录起始区域上游6301个碱基处,P1K的截断位置在上游3806个碱基处,以及P1S的截断位置在上游2369个碱基处。
(2)第二步是通过将前述DNA导入荧光素酶发光载体pGL3basic(来自Promega)而制备重组载体。所得到的重组载体具有特定长度的启动子区域和编码荧光素酶基因的区域。
(3)第三步是将重组载体(第二步(2)中制备)转染到培养的NIH3T3细胞中并加入地塞米松(0.1μM)。已经转染的培养细胞被分离和次代培养以表达荧光素酶。次代培养的细胞在转染后36小时被采集和溶解。
(4)第四步是从溶解的细胞来制备溶液和通过二重荧光素酶分析系统(来自Promega)测量发光强度。从而能够得知地塞米松诱导Per1基因表达的程度。
该结果如图4C所示。
图4C是显示荧光素酶分析结果的图。横坐标(相对荧光素酶活性)用与指定为100的、掺入Per1基因启动子全长的培养细胞的发光强度相比的相对值(%)来代表发光强度。
“P1F”表示源自掺入Per1基因启动子区域全长的培养细胞的发光强度。“P1K”表示源自掺入Per1基因转录起始区域上游3806个碱基的部分长度的培养细胞的发光强度。“P1S”表示掺入Per1基因转录起始区域上游2369个碱基的部分长度的培养细胞的发光强度。“载体”表示掺入空白载体的培养细胞(对照)的发光强度。图4C的右侧部分为描述已掺入的DNA的示意图。“Dex”和“EtOH”分别表示包含地塞米松的样本和包含乙醇的样本(对照)的发光强度。
图4C表明,地塞米松导致“P1K”样本的高发光强度和“P1S”样本一定的发光强度。
考虑到“P1K”样本中使用的启动子序列具有两个GRE类似序列,以及“P1S”样本中使用的启动子序列具有一个GRE类似序列的事实,该实验的结果提示,计算机分析中发现的GRE类似序列可能与Per1基因的应激反应有关。
进行后续的实验来研究当在计算机分析中发现的两个GRE类似序列中的两个或任一个上实施突变时,是否以与图4C所示相同的方式诱导表达。
首先,如下制备四个DNA样本:
Per1基因启动子区域在其全长上保持完好的DNA(P1F);P1F的GRE类似序列在其上游发生突变的DNA(P1FdM);P1F的GRE类似序列在其下游发生突变的DNA(P1FpM);和两个GRE类似序列都发生突变的DNA(P1Fd/pM)。每个DNA样本以与如上所述相同的方式掺入荧光素酶发光载体。将该载体转染至培养的NIH3T3细胞内,随后给予该培养细胞0.1μM的地塞米松。转染后36小时,将传代培养的细胞采集和溶解。用二重荧光素酶分析系统(来自Promega)检测所得溶液的发光强度。该实验揭示了地塞米松诱导Per1基因表达的程度。
该结果如图4D所示。
“P1F”表示掺入Per1基因启动子区域全长的培养细胞的发光强度。“P1FdM”表示掺入P1F的培养细胞的发光强度,所述P1F具有在其上游发生突变的GRE类似序列。“P1FpM”表示掺入P1F的培养细胞的发光强度,所述P1F具有在其下游发生突变的GRE类似序列。“P1Fd/pM”表示掺入P1F的培养细胞的发光强度,所述P1F具有其上游和其下游都发生突变的GRE类似序列。
图4D表明,包含地塞米松的P1FpM样本产生高发光强度,而P1FdM样本产生较低的发光强度。这个结果提示,存在于Per1基因启动子区域内的GRE类似序列,特别是存在于其下游的GRE类似序列,与应激反应密切相关。
实施例5
这个实施例的目的是使用ChIP(染色质免疫沉淀)方法研究Per1基因的GRE类似序列在NIH3T3细胞内是否结合至糖皮质激素受体(以下简称GR)。
首先,用地塞米松处理NIH3T3细胞以诱导mPer1基因的表达。细胞被给予甲醛以固定蛋白质和染色质DNA的结合。使用超声波处理使染色质DNA成为碎片,将得到的碎片与抗GR抗体进行免疫沉淀。回收得到的沉淀(作为抗GR抗体、GR、和与GR结合的染色质DNA的复合物)。加热回收的沉淀以去除DNA-蛋白的交联。通过PCR扩增所需序列,并用电泳鉴别PCR产物。
图5A是描述Per1基因序列的示意图。
图5A中置于“dGRE”和“pGRE”上方的三角标记代表对应于用于PCR的引物的序列区域。换言之,引物被如此设计以特异性扩增两个GRE类似序列附近的区域。
图5B是显示通过半定量RT-PCR检测所需序列的电泳的照片,该半定量RT-PCR在由ChIP方法得到的免疫沉淀物上进行。
图5B中,“IP:α-GR”表示用抗-GR抗体免疫沉淀后通过半定量RT-PCR检测到的所需序列。“IP:α-正常兔IgG”表示用兔IgG从免疫沉淀反应中检测到的序列(对照)。此外,“输入”表示不经免疫沉淀反应通过半定量RT-PCR检测到的所需序列(对照)。最下行中的“ChIP引物”表示用于半定量RT-PCR的引物序列或已被扩增的所需序列。“dGRE”和“pGRE”分别表示扩增的来自存在于Per1基因启动子区域内两个GRE类似序列的上游序列和下游序列。“mPer2”表示作为对照的扩增的mPer2基因。“0hr”表示当未用地塞米松处理时立即加入甲醛获得的结果。“1hr(Dex)”表示当用地塞米松处理1小时后加入甲醛获得的结果。“1hr(EtOH)”表示当用乙醇(用作对照)处理1小时后加入甲醛获得的结果。
图5C是显示在通过ChIP方法进行免疫沉淀之后通过定量实时RT-PCR检测所需序列的实验结果的图。
纵座标上的“%输入”代表PCR产物中扩增的所需DNA的量。其它符号与图5B中的那些相同。
由图5B显示,在地塞米松处理和随后借助抗α-GR抗体进行免疫沉淀反应后,当表示为“dGRE”和“pGRE”的序列通过PCR扩增时,检测到所需区带(见图5B上部的电泳照片)。
由图5C显示如果在地塞米松处理和随后借助抗α-GR抗体进行免疫沉淀反应后进行PCR,PCR极大地扩增了包含表示为“dGRE”和“pGRE”的序列的DNA。
这个结果提示,糖皮质激素受体(GR)结合至来自Per1基因的启动子区域的两个GRE类似序列。
实施例6
除了用从经历过应激的小鼠采集的肝脏代替NIH3T3细胞外,重复与实施例5相同的步骤。
从已经历1小时应激然后休息1小时的小鼠采集肝脏。采集的肝脏通过与实施例5中相同的方式处理以产生具有所需基因序列的PCR产物。
图6A是显示通过半定量RT-PCR检测所需序列的电泳的照片,该半定量RT-PCR在通过ChIP方法得到的免疫沉淀物上进行。图6A中的符号与图5B中的那些相同。
图6B是显示在通过ChIP方法进行免疫沉淀之后通过定量实时RT-PCR检测所需序列的实验结果的图。图6B中的符号与图5C中的那些相同。
由图6A和6B显示即使在小鼠实际上经历应激的情况下,糖皮质激素受体(GR)也与来自Per1基因的启动子区域的两个GRE类似序列结合。
从图6A和6B所示的结果发现,GR更多地与存在于Per1启动子区域内的两个GRE类似序列的上游部分结合。
实施例7
这个实施例目的是研究给予了皮质酮的小鼠中Per1的表达量。
给予小鼠指定量的皮质酮,1小时后其肝脏被取出。所采集的肝脏被均质化以通过与实施例2相同的方法进行定量实时RT-PCR,并测定时钟基因的表达量。
图7A是显示皮质酮剂量和Per1基因表达量之间的相关性的图。
横坐标代表每1kg小鼠重量的皮质酮剂量(mg/kg)。“PBS”表示对照,其被给予磷酸盐缓冲溶液以代替皮质酮。纵座标上的“诱导倍数”代表Per1基因的表达量(用相对值表示,以PBS的值为1)。
由图7A显示,Per1基因的表达量随皮质酮剂量的增加而增加。
图7B是显示通过施予皮质酮(10mg/kg)诱导的每个时钟基因表达量的图。
横坐标代表每个时钟基因。纵坐标上的“诱导倍数”代表用相对值表示的每个时钟基因的表达量,以PBS的值为1。
由图7B显示,施予皮质酮在时钟基因中仅增加Per1基因的表达量。换言之,这个实验的结果提示,施加应激所引起的Per1基因的表达受与昼夜节律调节完全不同的机制诱导。
上述实施例1到实施例7中实验结果提示了如图8中所示的应激反应性机制的存在。
由图8显示,在Per1基因的启动子区域中不仅存在E-box和CRE,还存在GRE类似序列。
一旦施加应激,糖皮质激素就从肾上腺皮质分泌并输送至整个身体。然后,糖皮质激素结合至存在于外周组织中的GR。所得到的产物结合至Per1基因启动子区域中存在的GRE类似序列。这是诱导Per1基因表达的机制。
顺便提及,E-box和CRE的序列与应激反应性机制无关。因此,它们不诱导具有其它序列的其它时钟基因的表达。因此,即使施加应激,昼夜节律(或内部身体钟(internal body clock))改变极小。
依据本发明实施方案用于评价应激的方法可通过使用与已知的应激反应性机制完全不同的新机制来检测应激。关于本发明实施方案的基因转录物和蛋白质可用作应激检测的标记物。此外,关于本发明实施方案的多核苷酸和抗体可应用于DNA芯片、蛋白质芯片、以及应激评价试剂盒。
本领域技术人员应当理解,根据设计要求和其它因素,可以进行各种改良、组合、再组合和改变,只要它们在所附权利要求或其等效物的范围内。
Claims (10)
1.一种应激评价方法,其被设计为检测Per1基因表达水平的任何增加。
2.如权利要求1中所限定的应激评价方法,其被设计为检测外周组织中表达水平的任何增加。
3.在施加应激时表达水平增加的Per1基因。
4.如权利要求3中所限定的Per1基因,其在外周组织中表达水平增加。
5.如权利要求3中所限定的Per1基因,其依赖于糖皮质激素反应性元件而增加。
6.具有权利要求3中所限定的Per1基因的碱基序列或其部分的多核苷酸。
7.权利要求3中所限定的Per1基因的转录产物作为应激检测标记物的用途。
8.PER1,其为由权利要求3中所限定的Per1基因编码的蛋白质。
9.特异性结合权利要求8中所限定的PER1的抗-PER1抗体。
10.权利要求8中所限定的PER1作为应激检测标记物的用途。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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