KR101538787B1 - 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ANGPTL-4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물, 상기 조성물을 포함하는 췌장염 진단 키트, 췌장염 진단용 마커를 이용한 췌장염의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명의 ANGPTL-4 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 바이오 마커는 췌장염 환자에서 정상인에 비해 현저하게 발현이 증가하기 때문에, 췌장염의 발병 유무를 정확하고 빠르게 진단하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

췌장염 진단용 바이오 마커 조성물{Biomarker composition for diagnosing pancreatitis}
본 발명은 ANGPTL-4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물, 상기 조성물을 포함하는 췌장염 진단 키트, 췌장염 진단용 마커를 이용한 췌장염의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
췌장에서 발생하는 질환에는 급성 및 만성 췌장염, 췌장암이 약 80%를 차지하고 있으며, 췌장 질환은 대부분 초기에는 증상이 없거나 애매한 경우가 많아서 조기에 췌장 질환을 진단하기가 쉽지 않으며 조기진단을 위해서는 다양한 영상검사, 혈액검사, 췌장 기능검사를 적절하게 이용해야 한다. 그럼에도 불구하고 현재까지도 이런 여러 가지 진단 방법을 이용하여도 췌장 질환의 조기 진단율의 향상을 기대할 수가 없는 것이 현 실정이다. 췌장염은 급성과 만성으로 분류되며, 전세계적으로 급성 췌장염에 의한 사망률이 약 15% 정도로 추산된다. 또한 췌장괴사가 있는 경우 세균감염 발생률이 현저히 높아지고, 세균감염을 동반한 환자의 20%는 폐 손상 등의 원격장기 기능부전, 전신 합병증 등을 수반하는 중증 경과를 거쳐 결국 40%의 높은 사망률을 보인다고 알려져 있으며 만성 췌장염은 췌장조직의 영구, 비 가역 손상을 유발하여 췌장 석회화와 섬유화, 췌관 협착과 확장 등의 변화를 보이며, 만성 췌장염 환자 중 거의 절반에 해당하는 췌장염 환자들이 사망과 관련된 위험상황에 노출되어 있다는 보고도 있다. 또한 만성 췌장염은 췌장암으로 이어지며 췌장암으로 발견될 확률은 1.5-3.2%로서 일반인보다 높은 것으로 알려져 있다. 현재 췌장염 치료는 금식 또는 약물치료만을 실시하고 있으나 치료대상자도 제한적이고 그 효과 또한 국한적이거나 미비한 실정이어서 극심한 통증을 호소하더라도 진통제를 제외하고는 이를 해결할 수 있는 방법이 없다. 그러므로 특이 증상이 없는 췌장염은 이미 발병하고 난 후에는 치료법이 거의 없기 때문에 췌장염에 대한 조기 진단 및 치료를 위한 연구가 더욱 필요한 상황이다.
지금까지 질병관련 바이오 마커의 연구는 암, 심혈관질환, 그리고 뇌질환연구 중심으로 대규모 다기관 임상연구들이 다양한 분야에서 시도되어 왔으나 췌장염의 경우 질병 및 치료를 타겟으로 하는 바이오 마커는 거의 전무한 상태이다. 게다가 알려져 있는 마커들도 대부분 일반적인 위험인자의 역할만이 알려져 있기 때문에 조기진단에 따라 치료의 효과가 크게 영향을 받는 췌장염을 타겟할 수 있는 새로운 위험인자 및 치료 인자 마커의 발굴을 하는 것이 매우 중요하다고 보여진다.
한편, ANGPTL-4 유전자는 지방조직에서 발현하는 아디포카인(adipokine)으로서 처음 발견되었고 지방대사에 관여는 것으로 알려져 왔다. 최근 ANGPTL-4는 에너지 대사, 상처 회복, 종양형성, 신혈관생성, 산화환원반응 조절까지 관여함이 확인되었는데 특히 지질 단백질 가수 분해 효소 활성(LPL, lipoprotein lipase activity)을 억제하면서 혈중 지질 수치를 강력하게 증가시켰고 이 과정에서 염증을 유발하는 유도물질로서 작용함이 밝혀졌으나, ANGPTL-4가 췌장염에서의 역할에 대한 연구는 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 췌장염을 진단하기 위한 바이오 마커를 개발하고자 연구를 계속한 결과, 췌장염 환자에서 정상인에 비해 ANGPTL-4 유전자의 발현이 현저히 증가함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 ANGPTL-4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오 마커 조성물을 포함하는 췌장염 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장염 진단용 바이오 마커를 이용한 췌장염의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 ANGPTL-4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오 마커 조성물을 포함하는 췌장염 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 췌장염 진단용 바이오 마커를 이용한 췌장염의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 ANGPTL-4 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 바이오 마커는 췌장염 환자에서 정상인에 비해 현저하게 발현이 증가하기 때문에, 췌장염의 발병 유무를 정확하고 빠르게 진단하는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 경증 및 중증 급성췌장염(AP) 동물모델과 췌장염 환자를 대상으로 췌장 특이적 마커들을 발굴하기 위하여 수행한 microarray 유전자 분석을 나타낸 도이다.
도 2는 태생 하루된 마우스와 6주령 마우스의 다양한 장기에서 ANGPTL-4의 발현 정도를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 췌장염에 걸린 동물모델의 ANGPTL-4의 발현 정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 4는 급성췌장염(AP)동물모델의 췌장조직에서 ANGPTL-4의 발현 정도를 면역조직화학으로 확인한 도이다.
본 발명은 ANGPTL-4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 진단은 췌장염의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 췌장염의 종류에는 급성 및 만성 췌장염을 포함한다.
본 발명에서 "마커"란 췌장염을 진단할 수 있는 물질로, 췌장염과 관련된 폴리펩타이드, 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 마커는 ANGPTL-4로 췌장염 환자에서 현저하게 발현이 증가하는 유전자이다.
본 발명에서 “mRNA 발현 수준 측정”이란 췌장염을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 췌장염에 관련된 ANGPTL-4 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 예를 들어, 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이다. 본 발명에서 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.
본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 췌장염에 관련된 ANGPTL-4 유전자의 핵산 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 “단백질 발현 수준 측정”이란 췌장염을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 췌장염과 관련된 ANGPTL-4 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.
본 발명에서, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
본 발명의 마커는 췌장염 환자에서 정상인에 비해 현저하게 발현이 증가하기 때문에, 췌장염의 발병 유무를 정확하고 빠르게 진단하는데 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이오 마커 조성물을 포함하는 췌장염 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 ANGPTL-4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 췌장염을 진단할 수 있다. 본 발명의 키트에는 췌장염을 위한 프라이머, 프로브, 항체 등 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치가 더 포함될 수 있으며, 바람직하게는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트의 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 마커 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합 효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 마이크로어레이 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 본 발명의 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이를 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 생물학적 시료로부터 ANGPTL-4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준보다 증가하면 췌장염에 걸린 것으로 예측 또는 진단하는 단계;를 포함하는 췌장염의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서 “생물학적 시료”는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 세포 등을 포함하며, 바람직하게는 췌장조직이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 마커는 췌장염 환자에서 정상인에 비해 현저하게 발현이 증가하기 때문에, 정상 대조구 시료와의 비교를 통해, 췌장염의 발병 유무를 정확하고 빠르게 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 췌장염 유도.
실험에 사용하기 위한 동물모델에서 췌장염은 다음과 같은 방법으로 유도하였다. 경증(Mild) 급성췌장염은 세루레인(Cerulein) 50 μg/kg 용량으로 1시간 간격으로 5회 복강 주사를 하여 급성 췌장염을 유도하였으며, 마지막 세루레인 주사 2시간 후 사해하였다. 중증(Severe) 급성췌장염은 세루레인 50 μg/kg 용량으로 1시간 간격으로 5회 복강 주사하고, 마지막 세루레인 주사 1시간 후 LPS 20mg/kg로 단일 복강 투여하여 중증 급성췌장염을 유도하였으며. 마지막 세루레인, LPS 주사 2시간 후 사해하였다.
실시예 2. 췌장 특이적 마커 발굴 위한 Microarray 분석 수행.
경증 및 중증 급성췌장염(AP) 동물모델과 췌장염 환자를 대상으로 췌장 특이적 마커들을 발굴하기 위하여 microarray 유전자 분석을 실시하였다. DNA chip 은 (주)지노믹트리사의 44 K GeneTrack mouse cDNA chip(44,000개의 알려진 유전자들과 EST로 구성)하였다. 췌장염 동물에서 췌장 선방세포를 분리하여 추출한 RNA 에 대하여 Cy5 염료(dye)를 이용하여 형광 표지(labeling)된 cDNA를 만들고 대조 시료인 정상 췌장 조직에서 분리한 선방세포 RNA pool에 Cy3 염료를 표지하였다. 그 후 세척(Washing) 과정을 거쳐 혼성화(hybridization)를 완료하였다. cDNA microarray는 Axon Instrument GenePix4000B Scanner를 이용하여 10 micron 해상도로 스캔하여, 그 결과 파일을 GenePix Pro 3.0 소프트웨어에 의해서 분석하였다.
Array 데이터의 분석은 Eisen 등이 개발한 Cluster 프로그램을 이용하여 평균-연관 계층군집화(average-linkage hierarchical clustering) 방법을 각 유전자와 조직 샘플에 적용하였다. 그 결과를 분석하여 췌장의 선방세포에서 유전자 발현의 특성을 관찰하였고, 그룹과의 차이 및 연관성을 분석하기 위해 Tree-View 소프트웨어를 통하여 도식을 얻었다. 이의 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 약 2150개의 유전자가 대조군에 비해 상향조절이 된 것을 확인하였고, 그 중에서 5-10 배 이상 발현이 증가된 마커들 약 100개 유전자들이 확보되었다. 그 중에서 발현도 높은 ANGPTL-4에 주목하게 되었다.
실시예 3. 정상 마우스의 췌장에서의 ANGPTL-4 발현.
정상 마우스의 췌장에서의 ANGPTL-4의 발현정도를 확인하기 위하여 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 수행하였다. 태생 하루 된 마우스와 6주령 마우스의 다양한 장기에서 총 RNA를 분리하고, 분리한 RNA에 역전사효소를 넣어 cDNA를 만든 후 ANGPTL-4 cDNA의 일부를 증폭하기 위한 primer를 가지고 PCR을 시행하여 cDNA의 일부를 대량으로 증폭하였다. 그 후 0.8% 한천 겔에서 전기영동으로 발현량을 확인하였다. 이의 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 태생 하루된 마우스와 6주령 마우스의 췌장에서 ANGPTL-4의 발현량은 적은 것으로 확인되었다. 이로써 ANGPTL-4가 췌장 질환 특이적 마커로서의 가능성이 있음을 알 수 있다.
실시예4. 췌장염 동물모델의 혈액에서의 ANGPTL-4의 발현.
췌장염 동물모델의 혈액에서의 ANGPTL-4의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 췌장염 유도 동물의 심장채혈을 통해 혈액을 채취하여 췌장염 유도된 동물의 혈액 내 사이토카인(cytokines) 등 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블랏(Western blot)으로 분석하기 위해 단백질을 분리하였다. 그리고 혈액과 PBS를 1:2의 부피비로 섞은 후 Histopaque(Ficoll, sigma #10771)를 동량 섞어준 후 상온에서 30분간 2400rpm으로 원심분리 하여 3층으로 분리된 층 중 단백질 층인 맨 윗 칸을 분리하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. ANGPTL-4에 대한 항체를 1시간 동안 처리하고 PBS-T로 세척한 후, 각각에 대한 2차 항체를 30분간 처리하고 ECL detection 용액 (Amersham)으로 확인하였다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 경증 및 중증 급성췌장염(AP) 동물모델의 혈액에서 ANGPTL-4의 발현이 증가함을 확인하였다.
실시예 5. 췌장염 동물모델의 췌장조직에서의 ANGPTL-4의 발현.
췌장염 동물모델의 췌장조직에서의 ANGPTL-4의 발현을 확인하기 위하여 면역조직화학(immunohistochemistry)을 수행하였다. 췌장 조직 샘플은 10% PFA(paraformaldehyde) 용액에 고정시킨 후, 파라핀 절편을 통해 준비된 4 μm 조직절편을 탈파라핀시켜 세척한 후 염소(goat) 또는 토끼(rabbit) 혈청과 함께 미리 블로킹 시켰다. 조직 슬라이드는 ANGPTL-4의 1차 항체를 1: 500의 농도로 실온에서 1시간 동안 배양시킨 후 비오틴결합 2차 항체(biotinylated secondary antibody)를 1:1000 의 농도로 1시간 동안 배양시켰다. 그 후 조직 세척을 한 후 streptodavidin-HRP에 다시 40분 동안 실온에서 배양한 후 디아미노벤지딘 수용성 사염산 기질(diaminobenzidine tetrahydrochloride substrate)로 10분 동안 발색하여 각 조직의 부분을 무작위적으로 3부분 이상 찍은 후 metaview 프로그램을 통해 분석하였다. 이의 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 급성췌장염(AP)동물모델의 췌장조직에서 ANGPTL-4의 발현이 증가됨을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 혈액 및 췌장 조직에서 ANGPTL-4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물
  2. 제 1항에 있어서, 상기 췌장염은 급성 췌장염 또는 만성 췌장염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물
  3. 제 1항에 있어서, 상기 ANGPTL-4 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 ANGPTL-4 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는, 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 ANGPTL-4의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 췌장염 진단 키트.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 췌장염 진단 키트.
  7. (a) 혈액 및 췌장 조직에서 ANGPTL-4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준보다 증가하면 췌장염에 걸린 것으로 예측 또는 진단하는 단계;를 포함하는 췌장염의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 췌장염의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 췌장염의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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