KR102279183B1 - 췌장염 고위험군 진단용 바이오마커 - Google Patents

Abstract

췌장염 고위험군에 대한 진단 마커로서 서열번호 1의 111번 내지 112번째 서열인 GA가 A로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 2의 111번째 서열이 A에서 AT로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 2의 113번째 서열이 C에서 CGAATAA로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 3의 161번째 서열이 C에서 T로 변형된 IGSF3 돌연변이 유전자, 및 서열번호 4의 111번째 서열이 G에서 A로 변형된 IGSF3 돌연변이 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 돌연변이 유전자와 이를 이용한 췌장염 고위험도 진단 방법을 제공한다.

Description

췌장염 고위험군 진단용 바이오마커{Biomarker for diagnosing the high risk group of pancreatitis}

본 발명은 췌장염 고위험군 진단용 바이오마커에 관한 것이다.

췌장염은 한국에서 2018년 기준 월 1만명 가량이 진료를 받는 질환이며, 이 중 15%는 사망까지 이를 수 있는 위험한 질환이다.

췌장염의 초기에는 대부분의 환자들이 확실한 증상이 없는 경우가 많고, 정확한 진단을 위해서는 영상검사, 혈액검사, 췌장 기능검사를 다양하게 이용해야 하므로 조기 진단이 쉽지 않은 실정이다. 또한 췌장염 환자의 20 내지 30%는 원인을 정확히 알 수 없어 특발성 췌장염으로 진단되고 있다.

췌장염의 흔한 원인은 알코올이라고 알려져 있으나, 음주자 중에서 일부에서만 췌장염이 발병하고, 유전적 감수성이 있다면 약간의 음주로도 췌장염이 발생할 수 있으므로, 유전적 감수성 차이가 발병에 중요한 역할을 할 것으로 추측된다. 또한 췌장염은 발병 후에는 확실한 치료방법이 없기 때문에 유전자 검사를 통해 췌장염 고위험군을 미리 선별하고 예방하는데 도움을 줄 수 있는 바이오마커가 필요하다.

유전성 췌장염과 연관이 있다고 알려진 유전자는 PRSS1, PRSS2, SPINK1, CFTR, CTRC 등이 보고되고 있다. 그러나 보고된 유전자들은 구체적인 발병 기전에서 역할이 명확하지 않고 이를 이용한 진단 결과도 활용될 정도의 신뢰성을 얻지는 못한 실정이다.

대한민국 공개공보 제10-2015-0001287호(2015.01.06)

일 구체예에 따르면, 생물학적 시료로부터 HYDIN 유전자 또는 IGSF3 유전자의 변이를 확인하는 단계를 포함하는 췌장염 고위험도 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

다른 구체예에 따르면, HYDIN 유전자 및 IGSF3 유전자 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 변이를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 췌장염 고위험도 진단용 조성물을 제공한다.

일 양상은 췌장염 고위험군에 대한 진단 마커로서 서열번호 1의 111번 내지 112번째 서열인 GA가 A로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 2의 111번째 서열이 A에서 AT로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 2의 113번째 서열이 C에서 CGAATAA로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 3의 161번째 서열이 C에서 T로 변형된 IGSF3 돌연변이 유전자, 및 서열번호 4의 111번째 서열이 G에서 A로 변형된 IGSF3 돌연변이 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 돌연변이 유전자를 제공한다.

췌장염의 고위험군은 췌장염 발병의 가장 흔한 원인인 담석 또는 알코올 등의 명확한 원인 없이 췌장염이 발생할 수 있는 환자군을 의미하며, 소량의 알코올 섭취로 췌장염이 발생할 가능성이 있는 군도 고위험군에 포함될 수 있다.

본 발명자는 담석 검사 및 알코올 섭취여부 조사를 통해서도 원인을 명확히 알기 어려운 췌장염 환자군을 대상으로 유전자 검사를 실시한 결과 일반인에게서는 발견되지 않는 HYDIN 유전자 및 IGSF3 유전자에 변이가 다수 발견됨을 발견하였으며, HYDIN 유전자 및 IGSF3 유전자의 변이는 췌장암 고위험군 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 상기 HYDIN 유전자 변이 및 IGSF3 유전자 변이는 원인이 명확치 않은 고위험군 췌장염 환자군에서 발견되며, 통계적으로 normal 집단과의 fisher's exact test의 p-value가 0.1 이하이고, population allele frequency DB (예를들어 ExAC, KRG, KOVA)에서 발견되지 않았거나 population allele frequency가 0.0001 이하이며, 이전 임상논문 및 DB 상에서 췌장염과 연관성이 알려지지 않았던 것들이다. 또한 상기 변이들은 ACMG(American Medical College of Medical Genetics) 가이드라인을 적용하여 분류한 결과 병원성(pathogenic)이거나 유사 병원성(likely pathogenic)에 해당한다.

상기 췌장염 고위험도 진단은 췌장염 발병의 가능성을 진단하는 것으로서, 유전적 감수성이 높은지 여부를 진단하는 것일 수 있고, 예를 들면 특별한 원인이 없이, 또는 약간의 음주에 의해서도 췌장염이 발병할 가능성이 높은 환자를 진단하는 것일 수 있다.

상기 HYDIN 유전자는 인간의 16번 염색체에 위치하는 유전자이며, 자세한 정보는 Genebank ID: NG_033116로 검색할 수 있다.

상기 IGSF3(Immunoglobulin Superfamily Member 3) 유전자는 인간 1번 염색체에 위치하는 유전자이며, 자세한 정보는 Genebank ID: NG_050917로 검색할 수 있다.

상기 서열번호 1의 염기서열은 참조 유전체 GRCh37를 기준으로 인간 16번 염색체의 70,841,287 내지 71,264,625번에 위치하는 HYDIN 유전자에 속하는 70895954 내지 70896126번 염기일 수 있으며, 서열번호 1의 111번 내지 112번째 서열인 GA는 70896015 내지 70896016번 염기일 수 있다.

상기 서열번호 2의 염기서열은 참조 유전체 GRCh37를 기준으로 인간 16번 염색체의 70,841,287 내지 71,264,625번에 위치하는 HYDIN 유전자에 속하는 70977748 내지 70977928번 염기일 수 있으며, 서열번호 2의 111번째 서열인 A는 70977809번 염기일 수 있고, 서열번호 2의 113번째 서열인 C는 70977811번 염기일 수 있다.

상기 서열번호 3의 염기서열은 참조 유전체 GRCh37를 기준으로 인간 1번 염색체의 117,117,020 내지 117,210,377번에 위치하는 ISGF3 유전자에 속하는 117142757 내지 117142997번 염기일 수 있고, 서열번호 3의 161번 서열인 C는 117142868번 염기일 수 있다.

상기 서열번호 4의 염기서열은 참조 유전체 GRCh37를 기준으로 인간 1번 염색체의 117,117,020 내지 117,210,377번에 위치하는 ISGF3 유전자에 속하는 117156524 내지 117156714번 염기일 수 있고, 서열번호 3의 161번 서열인 C는 117156585번 염기일 수 있다.

상기 HYDIN 유전자의 변이는 프레임쉬프트 변이일 수 있다. 상기 프레임쉬프트 변이는 서열번호 1의 111번 내지 112번째 서열인 GA가 A로 변형된 것일 수 있고, 서열번호 2의 111번째 서열이 A에서 AT로 변형된 것일 수 있고, 또는 서열번호 2의 113번째 서열이 C에서 CGAATAA로 변형된 것일 수 있다.

HYDIN 유전자에 있어서, HYDIN 유전자의 일부에 해당하는 서열번호 1의 111-112번 서열이 GA에서 A로 변형되거나, 서열번호 2의 111번 서열이 A에서 AT로 변형되거나, 서열번호 2의 113번 서열이 C에서 CGAATAA로 변형되면 프레임쉬프트 돌연변이에 의해 HYDIN 유전자의 발현이 약화될 수 있고, 췌장염에 대한 유전적 민감성이 증가하거나 췌장염 발병 위험성이 증가할 수 있다.

상기 IGSF3 유전자의 변이는 종결 돌연변이일 수 있다. 상기 종결 돌연변이는 서열번호 3의 161번째 서열이 C에서 T로 변형된 것, 또는 서열번호 4의 111번째 서열이 G에서 A로 변형된 것일 수 있다.

IGSF3 유전자에 있어서, IGSF3의 일부인 서열번호 3의 161번째 서열이 C에서 T로 변형되거나, 서열번호 4의 111번째 서열이 G에서 A로 변형되면 종결코돈이 형성되고 이로 인해 종결 돌연변이(Nonsense Mutation)가 일어나 IGSF3의 정상적인 발현이 저하될 수 있고, 췌장염에 대한 유전적 민감성이 증가하거나 췌장염 발병 위험성이 증가할 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 분리한 생물학적 시료로부터 HYDIN 유전자 또는 IGSF3 유전자의 변이를 확인하는 단계를 포함하는 췌장염 고위험도 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 HYDIN 유전자 변이 또는 IGSF3 유전자 변이가 확인된 경우 상기 개체를 췌장염 고위험군으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

생물학적 시료(biological sample)는 분석하고자 하는 개체의 genomic DNA를 포함하고 있는 시료를 의미한다. 일 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 체액, 모근, 혈액, 혈장, 췌장 조직, 또는 혈청일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 HYDIN 유전자의 변이는 서열번호 1의 111번 내지 112번째 서열인 GA가 A로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 2의 111번째 서열이 A에서 AT로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 및 서열번호 2의 113번째 서열이 C에서 CGAATAA로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 ISGF3 유전자의 변이는 서열번호 3의 161번째 서열이 C에서 T로 변형된 IGSF3 돌연변이 유전자, 및 서열번호 4의 111번째 서열이 G에서 A로 변형된 IGSF3 돌연변이 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 췌장염 고위험도 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 한국인을 대상으로 하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 췌장염은 특발성 췌장염일 수 있다. 특발성 췌장염(idiopathic pancreatitis)은 병력 청취, 신체검사, 간기능 검사, 중성지방, 복부 초음파, 및 CT의 영상학적 검사 등 초기 검사에서 뚜렷한 원인을 찾지 못하는 경우를 의미하며, 급성 췌장염 환자의 약 20 내지 30%가 특발성 췌장염 환자로 분류된다.

상기 유전자 변이 확인은 HYDIN 또는 IGSF3 유전자의 mRNA 또는 단백질을 검출하여 확인하는 것일 수 있다.

mRNA는 상기 돌연변이 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 공지된 다양한 시퀀싱 방법을 이용하여 검출할 수 있다. mRNA를 검출하기 위한 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯 (northern blot), DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

돌연변이 단백질은 상기 돌연변이 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정할 수 있다. 돌연변이 단백질을 측정하기 위한 분석방법으로 웨스턴 블로팅, ELISA, 방사선 면역분석법, 방사선 면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS, 단백질칩 등을 이용할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

일 구체예에서, 상기 유전자 변이 확인은 딥 리시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 특이적 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), TaqMan 기법, SnapShot 기법 및 qRT-PCR 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기법에 의하여 수행되는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 유전자 변이 확인은 HYDIN 유전자, IGSF3 유전자, 또는 HYDIN 및 IGSF3 유전자의 증폭 산물의 유전자 변이를 확인하는 것일 수 있다.

상기 증폭은 PCR 증폭일 수 있으며, 이는 통상기술자에게 잘 알려져 있으므로 자세한 기재를 생략한다.

상기 HYDIN 유전자 증폭은 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍, 또는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍으로 증폭하는 것일 수 있다.

상기 IGSF3 유전자 증폭은 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍, 또는 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍으로 증폭하는 것일 수 있다.

또 다른 양상은, 생물학적 시료로부터 상기 췌장염 고위험군에 대한 진단 마커인 HYDIN 돌연변이 유전자 또는 IGSF3 돌연변이 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 돌연변이 단백질을 검출하기 위한 제제를 포함하는 췌장염 고위험도 진단용 조성물을 제공한다.

mRNA를 검출하는데 사용되는 제제는 상기 돌연변이 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

프라이머는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 베이스 페어이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

단백질을 검출하는데 사용되는 제제는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법, 재조합 DNA 방법 또는 파아지 항체 라이브러리 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으므로 자세한 설명을 생략한다.

상기 제제는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍, 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍을 포함할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 췌장염 고위험도 진단용 조성물을 포함하는, 췌장염 고위험도 진단용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 "키트"란 췌장염 발병 위험성을 예측 또는 진단할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 생물학적 시료로부터 특정 유전자의 돌연변이 존재 여부를 확인할 수 있는 형태라면 제한이 없다.

상기 키트는 HYDIN 유전자 또는 IGSF3 유전자의 변이에 대해 상보적인 서열을 가지는 프로브 또는 프라이머를 포함할 수 있다.

상기 키트는 마이크로어레이, 유전자 증폭 키트 또는 면역분석(immunoassay)용 키트일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있으며, 상기 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

상기 유전자 증폭 키트는 일반적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄 반응(repair chain reaction), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification, TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 면역분석용 키트는 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시될 수 있다. 상기 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체일 수 있다. 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구체예에 따른 HYDIN 유전자 및 IGSF3 유전자 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 변이를 검출하기 위한 제제를 사용하여 췌장염 고위험도 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 이용하면, HYDIN 유전자 또는 IGSF3 유전자 상에 존재하는 변이를 검출함으로서 췌장염의 위험도를 판단 또는 예측하는데 도움을 줄 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 High Sensitivity DNA kit 를 이용한 라이브러리 정도 관리 결과를 나타낸 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 환자의 혈액에서 DNA 추출

원인이 명확히 밝혀지지 않은 췌장염 환자(담석이 발견되지 않고 알코올 섭취량이 1달에 1회 이하)의 혈액 2 ml를 채취하고 QIA amp DNA Blood Midi Kit(Qiagen, 51185)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 혈액 2 ml에 protease K 200 ㎕와 Lysis buffer 2.5ml를 첨가하고 혼합하여 70℃에서 10분간 반응시켰다. 반응액을 QIA amp 스핀 컬럼을 이용하여 정제한 후, wash buffer를 이용하여 2회 세척하였다. 멸균된 증류수 160 ㎕를 이용하여 gDNA를 elution 하여 NanoDrop One(Thermofisher)으로 DNA 양을 측정하였다.

실시예 2: 차세대 염기서열 분석(NGS)용 라이브러리 제작

SureSelect XT 라이브러리 키트(Agilent Technologies, 미국)를 사용하여 NGS를 위한 라이브러리를 제작하였다. 먼저 시료에서 추출한 DNA를 Covaris Sample Preparation System, S-series or E-series model (Covaris, 미국)을 사용하여 150 ~ 200bp 크기의 단편으로 절단하였다. 절단된 DNA 단편은 High Sensitivity DNA kit (Agilent Technologies, 미국)을 사용하여 Agilent 2100 Bioanalyzer 기기 (Agilent Technologies, 미국)로 제대로 절단되었는지 확인하였다.

절단된 DNA 단편 48 ㎕, 10× End Repair Buffer 10 ㎕, dNTP Mix 1.6 ㎕, T4 DNA Polymerase 1 ㎕, Klenow DNA Polymerase 2 ㎕, T4 Polynucleotide Kinase 2.2 ㎕ 을 혼합하고, 총 반응액이 100 ㎕ 가 되도록 Nuclease-free water로 보정하여 혼합 반응액을 준비하였다. 준비된 혼합 반응액을 thermal cycler 기기에서 20℃ 로 30분간 반응시켜 DNA 단편의 말단을 수선하였다. 말단이 수선된 DNA 단편은 180 ㎕의 AMPure XP beads 용액으로 세척하였고, 32 ㎕ 의 Nuclease-free water에 용해시켰다.

말단이 수선된 DNA 단편 30 ㎕, 10× Klenow Polymerase Buffer 5 ㎕, dATP 1 ㎕, Exo(-) Klenow 3 ㎕ 을 혼합하고, 총 반응액이 50 ㎕ 가 되도록 Nuclease-free water로 보정하여 혼합 반응액을 준비하였다. 준비된 혼합 반응액을 thermal cycler 기기에서 37 ℃ 로 30분간 반응시켜 DNA 단편의 3' 말단을 아데닐화 하였다. 3' 말단이 아데닐화된 DNA 단편은 90 ㎕의 AMPure XP beads 용액으로 세척하였고, 15 ㎕ 의 Nuclease-free water에 용해시켰다.

3' 말단이 아데닐화된 DNA 단편 13 ㎕, 5× T4 DNA Ligase Buffer 10 ㎕, Diluted SureSelect Adaptor Oligo Mix 1 ㎕, T4 DNA Ligase 1.5 ㎕ 을 혼합하고, 총 반응액이 50 ㎕ 가 되도록 Nuclease-free water로 보정하여 혼합 반응액을 준비하였다. 준비된 혼합 반응액을 thermal cycler 기기에서 20℃로 15분간 반응시켜 DNA 단편의 양 말단에 어댑터를 연결하였다. 양 말단에 어댑터가 연결된 DNA 단편은 90 ㎕의 AMPure XP beads 용액으로 세척하였고, 32 ㎕ 의 Nuclease-free water에 용해시켰다.

양 말단에 어댑터가 연결된 DNA 단편 30 ㎕, SureSelect Primer 1.25 ㎕, SureSelect ILM Indexing Pre-Capture PCR Reverse Primer 1.25 ㎕, 5× Herculase II Reaction Buffer 10 ㎕, 100 mM dNTP Mix 0.5 ㎕, Herculase II Fusion DNA Polymerase 1 ㎕ 을 혼합하고, 총 반응액이 50 ㎕ 가 되도록 Nuclease-free water로 보정하여 혼합 반응액을 준비하였다. 준비된 혼합 반응액을 thermal cycler 기기에서 98℃ 에서 2분 반응시킨 후, 98℃ 에서 30초, 65℃ 에서 30초, 72℃ 에서 1분의 과정을 10 Cycle 반복하고, 72℃ 에서 10분을 반응시켜 증폭하였다. 증폭된 DNA는 90 ㎕의 AMPure XP beads 용액으로 세척하였고, 32 ㎕ 의 Nuclease-free water로 용해시켰다.

현재까지 진행된 DNA의 길이와 양을 측정하기 위하여 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, 미국) 기기와 DNA 1000 chip 으로 제작된 라이브러리의 길이와 양을 측정하였고, 길이가 225 ~ 275bp인 조건에 만족하는지 확인하였다. 세척된 DNA 32 ㎕를 45℃ 이하 조건에서 원심진공농축기를 사용하여 3.4 ㎕ (221 ng / ㎕) 로 농축시켰다. SureSelect Hyb 1 6.63 ㎕, SureSelect Hyb 2 0.27 ㎕, SureSelect Hyb 3 2.65 ㎕, SureSelect Hyb 4 3.45 ㎕ 혼합하여 SureSelect Block Mix 13 ㎕를 만들었다. 만들어진 SureSelect Block Mix 13 ㎕ 와 농축된 DNA 3.4 ㎕ 를 혼합하여 thermal cycler 기기에서 95℃ 로 5분간 반응시킨 뒤, 65℃ 로 5분 이상 유지시켰다. 반응시킨 DNA에 Hybridization buffer 13 ㎕, RNase Block solution 5 ㎕, Epilepsy panel primer 2 ㎕ 를 혼합하여 thermal cycler 16~24시간 혼성시켰다. 혼성시킨 DNA를 Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads (Invitrogen, 미국) 용액으로 캡쳐하였고, 30 ㎕ 의 Nuclease-free water에 용해시켰다.

캡쳐된 DNA 14 ㎕, 5× Herculase II Reaction Buffer 10㎕, Herculase II Fusion DNA Polymerase 1㎕, 100 mM dNTP Mix 0.5㎕, SureSelect ILM Indexing Post-Capture Forward PCR Primer 1㎕, SureSelect 8 bp Index primer 5㎕을 혼합하고 총 반응액이 50 ㎕ 가 되도록 Nuclease-free water로 보정하여 혼합 반응액을 준비하였다. 준비된 혼합 반응액을 thermal cycler 기기에서 98℃ 에서 2분 반응시킨 후, 98℃ 에서 30초, 57℃ 에서 30초, 72℃ 에서 1분의 과정을 16 Cycle 반복하고, 72℃ 에서 10분을 반응시켜 시퀀싱을 하기 위한 라이브러리로 증폭시켰다. 증폭된 라이브러리는 90 ㎕의 AMPure XP beads 용액으로 세척하였고, 30 ㎕ 의 Nuclease-free water에 용해시켰다.

실시예 3: 차세대 염기서열 분석(NGS)용 라이브러리

제작된 NGS용 라이브러리가 서열 결정에 사용될 수 있는가를 확인하기 위하여 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, 미국) 와 High Sensitivity DNA kit (Agilent Technologies, 미국)을 사용하여 제작된 라이브러리의 길이와 양을 측정하였고, 길이가 250 ~ 350bp인 조건을 만족하는 라이브러리를 서열 결정에 사용하였다. High Sensitivity DNA kit 를 이용한 라이브러리 정도 관리 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 4: 차세대 염기서열 분석(NGS) 서열결정 수행

클러스터 생성을 위해, 상기 실시예에서 준비된 라이브러리를 플로우 셀 (flow cell)에 로드하였다. fragment들은 라이브러리 어댑터에 보완적인 표면 결합 올리고체(surface-bound oligos)에 의해 캡쳐되었다. 그 후 fragment들은 다리 증폭 (bridge amplification)을 통해 구별가능한 클론 클러스터로 증폭되었다. 클러스터 생성을 완료하고 템플릿에 시퀀싱을 준비하였다.

실시예 5. 표적유전자 돌연변이에 대한 검출 소프트웨어 수행

상기의 HiSeq2500을 이용해 얻어진 짧은 염기서열 데이터들에 대한 분석은 GATK4.0 best practice 파이프라인을 이용해 수행하였다. Fastqc 0.11.7 소프트웨어를 이용하여 생성된 염기서열에 대한 퀄리티를 체크하였고, cutadapt 1.18을 사용하여 라이브러리 제작에 사용된 adaptor 들이 잘못 반응하여 만들어진 염기서열들을 제거하였다. Adaptor가 제거된 fastq 파일에 대하여 BWA 0.7.12-r1039 를 사용하여 UCSC의 hg19 레퍼런스(reference) 서열에 대한 정렬을 수행하였다. Hg19에 정렬하여 만들어진 sam 파일에 Picard 2.18.2 Sortsam을 사용하여 시료의 염기서열 조각들에 대하여 유전체 내 위치(coordinate)를 기준으로 순서를 정렬하였다.

정렬된 파일은 sam 파일의 binary 형태인 bam 파일로 반환되었다. 정렬된 bam 파일에 대하여 Picard 2.18.2의 Mark Duplicates 를 사용하여 라이브러리 제작과정에서 생성된 PCR 중복체(duplicate)를 제거하였다. PCR 중복체들은 이후 분석과정에서 PCR에 의한 편향성을 갖게 하여 실험 결과에 대한 해석을 다르게 할 수 있으므로 이 단계에서 제거하였다. 중복체가 제거된 결과에 대하여 시퀀싱 장비의 오류를 배제하기 위하여 samtools 0.1.19 를 사용하여 해당 DNA 조각이 정렬 된 score를 나타내는 mapping quality에 대하여 제한하였다. 표적유전자를 효과적으로 분석하기 위하여, 이렇게 필터 된 결과에 bedtools 2.25.0을 사용하여 표적유전자가 포함되어 있는 유전자만을 분석할 수 있도록 BED 파일을 적용하여 분석 시간을 단축하였다. 위의 결과 파일에 대하여 GATK4.0 Base Recalibrator 를 사용하여 시퀀싱 장비별로 존재하는 basepair quality에 대한 보정(recalibration)을 진행하였다. Basepair quality에 대한 보정을 마친 파일에 대하여 GATK4.0 Haplotype Caller를 통하여 variant calling을 진행하였다.

실시예 6: 질병원인 돌연변이의 검출

상기 실시예 5에서 검출된 돌연변이에 대하여 Normal 샘플 10개에서 이전에 발견되지 않은 돌연변이들을 선정하였다. 선정된 돌연변이 중에서 돌연변이가 발생한 유전자의 유전패턴(inheritance pattern)과 돌연변이의 유형(예를 들어, stop gain, missense variant, frameshift variant 등)에 따라 인구집단변이빈도(population allele frequency) 기준을 정하여 질병원인 돌연변이를 선정하였다. 췌장염 집단에서 발견되었고 통계적으로 normal 집단과의 fisher's exact test의 p-value가 0.1 이하인 변이들 중에 population allele frequency DB (예를들어 ExAC, KRG, KOVA)에서 발견되지 않았거나 population allele frequency가 0.0001 이하의 변이들을 선정하였다. 이전 임상논문 및 DB 상에서 췌장염과 연관성이 이미 알려진 변이들은 제외하였다.

이렇게 선정된 변이들에 대해 ACMG(American Medical College of Medical Genetics) 가이드라인을 적용하여 pathogenicity를 예측한 결과가 병원성(pathogenic)이거나 유사 병원성(likely pathogenic)인 변이들을 선정하였다. 정상그룹에서 발견되지 않았으며 췌장염 그룹에서 높은 비율로 존재하는 병원성 변이들을 선정한 결과를 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.

chrom	position	Ref seq	alt seq	pancreatitis AN	pancreatitis AC	normal AN	normal AC
1	117156585	G	A	68	29	20	0
1	117142868	C	T	68	30	20	0
16	70977811	C	CGAATAATAATA	68	6	20	0
16	70977809	A	AT	68	9	20	0
16	70896015	GA	G	68	34	20	0

상기 표 1의 AN(allele number)은 그룹에 속한 전체 allele의 갯수로서 췌장염 환자 34명에게 68개의 allele이 존재하며 normal은 10명에게 20개의 allele이 존재한다. 상기 표 1의 AC(allele count)는 각 그룹에서 발견된 해당 변이의 allele의 개수다. 상기 표 1의 5종류의 변이들은 normal에서는 발견되지 않았으며 모두 위에서 설명한대로 ACMG 가이드라인에 의해 pathogenic 변이로 분류된다. 상기 표 1에 기재된 바와 같이 정상그룹에서 발견되지 않는 변이들이 원인이 명확치 않은 췌장염 그룹에서 다수 발견되었다.

해당 변이들에 대한 추가적인 정보는 하기 표 2와 같다.

chrom	pos	ref seq	alt seq	variant function	gene_name	HGVS cDNA	HGVS protein
1	117156585	G	A	stop_gained	IGSF3	c.634C>T	c.634C>T
1	117142868	C	T	stop_gained	IGSF3	c.1784G>A	c.1784G>A
16	70977811	C	CGAATAATAATA	frameshift_variant	HYDIN	c.6572_6573insTATTATTATTC	c.6572_6573insTATTATTATTC
16	70977809	A	AT	frameshift_variant	HYDIN	c.6574_6575insA	c.6574_6575insA
16	70896015	GA	G	frameshift_variant	HYDIN	c.11712delT	c.11712delT

실시예 7: HYDIN, IGSF3의 검증

HYDIN 유전자는 GRCh37 기준(참조 유전자 정보)으로 16번 염색체(chr 16)의 70,841,287-71,264,625 염기에 해당하는 부분이다. HYDIN 유전자의 변이를 검출하기 위하여 하기 표 3 및 표 4의 프라이머 세트를 제작하고 검증하였다.

HYDIN chr16: 70,841,287-71,264,625 (GRCh37 기준) Target Variant: 70896015
Primer 1 (서열번호 6)	TTG TGC CTG CCA AGA AGG GT	70895907~70895926	Tm 53.8 ℃ GC content: 55%
Primer 2(서열번호 5)	ACG ATG CAT ACA GGC AGC AC	70896107~70896126	Tm 53.8 ℃ GC content: 55%
서열번호 1 ct ttgtgcct gccaagaagg gt gttgtggc gagcacattt tcttactggc 70895954 agaaaaggtt gctctcgaag tctccaatgt ccaacgggga gaattttact 70896004 TTGAACTTCT GA ATCTTCCC Caccggcacg attcccgaag agggctccac 70896054 agagaagggc tgtggggaac cctcggccca gtggtccatg gtgctgtcca 70896104 gg gtgctgcc tgtatgcatc gt

HYDIN chr16: 70,841,287-71,264,625 (GRCh37 기준) Target Variant: 70977809
Primer 1 (서열번호 8)	TGG CAT GGA CCC ACC TGT AT	70895907~70895926	Tm 53.8 ℃ GC content: 55%
Primer 2(서열번호 7)	GTG GCT GGT AAG TGT AGG AG	70896107~70896126	Tm 53.8 ℃ GC content: 55%
서열번호 2 gg tggcatgg acccacctgt at ccgctctg ccaggatctg cacgagaagt 70977748 tcatccggga gcacacagct catcagcccg gtctcgcctc cgacactggg 70977798 ACTAACACTG A G C CAGCGGT Ggatgggccc cggggggaga gggctggagg 70977848 aaatctgttg agtgggagaa ggatcaggag tcagaatctg gccttgtatc 70977898 tcaacaa ctc ctacacttac cagccac agg

상기 표 3의 서열번호 1에서 111번 내지 112번째 뉴클레오티드가 GA에서 G로 변형된 돌연변이, 상기 표 4의 서열번호 2에서 111번째 뉴클레오티드가 A에서 AT로 변형된 돌연변이, 또는 상기 표 4의 서열번호 2에서 113번째 서열이 C에서 CGAATAA로 변형된 돌연변이가 확인된 환자는 췌장염 발병의 위험도가 높은 것으로 확인되었다.

IGSF3 유전자는 GRCh37 기준(참조 유전자 정보)으로 1번 염색체(chr 1)의 117,117,020-117,210,377 염기에 해당하는 부분이다. IGSF3 유전자의 변이를 검출하기 위하여 하기 표 5 및 표 6의 프라이머 세트를 제작하고 검증하였다.

IGSF3 chr1: 117,117,020-117,210,377 (GRCh37 기준) Target Variant: 117142868
Primer 1 (서열번호 10)	TTC TCG ATG GCA GTT CGG GT	117142730-117142749	Tm 53.8 ℃ GC content: 55%
Primer 2(서열번호 9)	CTC TCC AGA AAT GGG CTT CG	117142956~117142975	Tm 53.8 ℃ GC content: 55%
서열번호 3 gacgttgttg ctggactcag cc ttctcgat ggcagttcgg gt tcggaagc 117142757 tggaggacct gtccccccac tggacccctc cgtcccgggt gaaggtcacc 117142807 aagtcatgga actccaccgt gcccaccggc tggaaccgcc atgtcaccga 117142857 CACGGGGACC C AGGCAGGGT Agtggggttt gatgatacac tgcaagtcaa 117142907 aggagtcgct gtaggtcacc cccggtgtcc gggagatggc tgtgactgcg 117142957 aagcccattt ctggagag aa agcagagaga ttcaaccaga

IGSF3 chr1: 117,117,020-117,210,377 (GRCh37 기준) Target Variant: 117156585
Primer 1 (서열번호 12)	CTC GCA GTA GAA TTC GCC CT	117156478~117156497	Tm 53.8 ℃ GC content: 55%
Primer 2(서열번호 11)	ATT CAG CAC AGC CAC CTG TC	117156680~117156699	Tm 53.8 ℃ GC content: 55%
서열번호 4 ggc ctcgcag tagaattcgc cct ggtcaga aggctgcagg tggaagatgg 117156524 tgaggcggaa ggtggtcctc cccagcttgt ccagccgcac ctcccccagg 117156574 CTCTGCCTCT G GGCATATTC Gctgctggag tgaagcatga aatctcggct 117156624 cagggagatg acctccacgg gcttctcgcc aactttctgc cggagccagg 117156674 ccaca gacag gtggctgtgc tgaat ggtct ctgaggccac

IGSF3 유전자는 GRCh37 기준으로 1번 염색체(chr 1)의 117,117,020- 117,210,377 염기에 해당하는 부분이다. 표 5의 서열번호 3에서 161번째 서열이 C에서 T로 변형된 돌연변이, 또는 표 6의 서열번호 4에서 111번째 서열이 G에서 A로 변형된 돌연변이가 확인된 환자는 췌장염 발병의 위험도가 높은 것으로 확인되었다.

<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation Medysapiens <120> Biomarker for diagnosing the high risk group of pancreatitis <130> PN190250 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HYDIN 70896015 <400> 1 ctttgtgcct gccaagaagg gtgttgtggc gagcacattt tcttactggc agaaaaggtt 60 gctctcgaag tctccaatgt ccaacgggga gaattttact ttgaacttct gaatcttccc 120 caccggcacg attcccgaag agggctccac agagaagggc tgtggggaac cctcggccca 180 gtggtccatg gtgctgtcca gggtgctgcc tgtatgcatc gt 222 <210> 2 <211> 230 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HYDIN 70977809 <400> 2 ggtggcatgg acccacctgt atccgctctg ccaggatctg cacgagaagt tcatccggga 60 gcacacagct catcagcccg gtctcgcctc cgacactggg actaacactg agccagcggt 120 ggatgggccc cggggggaga gggctggagg aaatctgttg agtgggagaa ggatcaggag 180 tcagaatctg gccttgtatc tcaacaactc ctacacttac cagccacagg 230 <210> 3 <211> 290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGSF3 117142868 <400> 3 gacgttgttg ctggactcag ccttctcgat ggcagttcgg gttcggaagc tggaggacct 60 gtccccccac tggacccctc cgtcccgggt gaaggtcacc aagtcatgga actccaccgt 120 gcccaccggc tggaaccgcc atgtcaccga cacggggacc caggcagggt agtggggttt 180 gatgatacac tgcaagtcaa aggagtcgct gtaggtcacc cccggtgtcc gggagatggc 240 tgtgactgcg aagcccattt ctggagagaa agcagagaga ttcaaccaga 290 <210> 4 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGSF3 117156585 <400> 4 ggcctcgcag tagaattcgc cctggtcaga aggctgcagg tggaagatgg tgaggcggaa 60 ggtggtcctc cccagcttgt ccagccgcac ctcccccagg ctctgcctct gggcatattc 120 gctgctggag tgaagcatga aatctcggct cagggagatg acctccacgg gcttctcgcc 180 aactttctgc cggagccagg ccacagacag gtggctgtgc tgaatggtct ctgaggccac 240 240 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HYDIN 70896015 Forward Primer <400> 5 acgatgcata caggcagcac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HYDIN 70896015 Backward(Reverse) Primer <400> 6 ttgtgcctgc caagaagggt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HYDIN 70977809 Forward Primer <400> 7 gtggctggta agtgtaggag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HYDIN 70977809 Backward(Reverse) Primer <400> 8 tggcatggac ccacctgtat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGSF3 117142868 Forward Primer <400> 9 ctctccagaa atgggcttcg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGSF3 117142868 Backward(Reverse) Primer <400> 10 ttctcgatgg cagttcgggt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGSF3 117156585 Forward Primer <400> 11 attcagcaca gccacctgtc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGSF3 117156585 Backward(Reverse) Primer <400> 12 ctcgcagtag aattcgccct 20

Claims (9)

1. 삭제
2. 개체로부터 분리한 생물학적 시료로부터
   HYDIN 유전자 또는 IGSF3 유전자의 변이를 확인하는 단계를 포함하는,
   췌장염 고위험도 진단에 관한 정보를 제공하는 방법으로,
   상기 HYDIN 유전자의 변이는 서열번호 1의 111번 내지 112번째 서열인 GA가 G로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 2의 111번째 서열이 A에서 AT로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 및 서열번호 2의 113번째 서열이 C에서 CGAATAA로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이고,
   상기 IGSF3 유전자의 변이는 서열번호 3의 161번째 서열이 C에서 T로 변형된 IGSF3 돌연변이 유전자, 및 서열번호 4의 111번째 서열이 G에서 A로 변형된 IGSF3 돌연변이 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인,
   췌장염 고위험도 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
3. 삭제
4. 제 2 항에 있어서,
   상기 췌장염 고위험도 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 한국인을 대상으로 하는 것인,
   췌장염 고위험도 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
5. 제 2 항에 있어서,
   상기 췌장염은 특발성 췌장염인,
   췌장염 고위험도 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
6. 제 2 항에 있어서,
   상기 유전자 변이 확인은 HYDIN 또는 IGSF3 유전자의 mRNA 또는 단백질을 검출하여 확인하는 것인,
   췌장염 고위험도 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
7. 생물학적 시료로부터 돌연변이 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 돌연변이 단백질을 검출하기 위한 제제를 포함하는,
   췌장염 고위험도 진단용 조성물로,
   상기 돌연변이 유전자는 서열번호 1의 111번 내지 112번째 서열인 GA가 G로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 2의 111번째 서열이 A에서 AT로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 2의 113번째 서열이 C에서 CGAATAA로 변형된 HYDIN 돌연변이 유전자, 서열번호 3의 161번째 서열이 C에서 T로 변형된 IGSF3 돌연변이 유전자, 및 서열번호 4의 111번째 서열이 G에서 A로 변형된 IGSF3 돌연변이 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 돌연변이 유전자인,
   췌장염 고위험도 진단용 조성물.
   
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 제제는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍, 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 프라이머쌍으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는,
   췌장염 고위험도 진단용 조성물.
9. 제 7 항의 조성물을 포함하는, 췌장염 고위험도 진단용 키트.
   

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