CN116479103B - 一种检测脊髓性肌萎缩症相关基因的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测脊髓性肌萎缩症相关基因的试剂盒,所述试剂盒含有引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~18所示的用于检测脊髓性肌萎缩症相关基因的扩增引物组,以及引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19~27所示的用于检测脊髓性肌萎缩症相关基因的单碱基延伸引物组。其通过单管反应同时检测脊髓性肌萎缩症基因SMN1和SMN2,能够对SMN1和SMN2拷贝数定量,也同时检测中国人群SMA常见的7个热点突变,具有高准确性、高灵敏度、高通量的特点,适合技术推广和应用。利用本发明的引物组合对疑似脊髓性肌萎缩症的患者、确诊脊髓性肌萎缩症的患者、或有脊髓性肌萎缩症家族病史等高危人群,可以对正常人,携带者和患者进行准确的基因分型的目的。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体地,涉及一种检测脊髓性肌萎缩症相关基因的试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病,是两岁以下婴儿致死性遗传病的头号杀手。任何年龄、人群、性别的人都有可能患上SMA,它的携带率极高。SMA通常根据疾病严重程度与发病年龄分为三个亚型。I型患者(MIM#253300)在出生时或在6个月之前开始发病,不能独自坐或走,并且通常在两年内死于呼吸功能不全。II型患者(MIM#253550)在6个月之后发病,可以独坐但在没有任何辅助设备帮助的情况下不能走路,并且寿命会大大减少,III型患者(MIM#253400)通常在1岁半后发病,可以独立的坐或走路,但在青春期或成人后一般行走能力减弱,需要靠轮椅行动,SMA是致残致死的严重性疾病,早期症状不明显,一旦发病无有效的治疗手段。
SMA致病基因为SMN,该基因有两个非常相似的基因拷贝(SMN1与SMN2),这两个基因的序列高度同源,两者仅有5个碱基的差异,SMN1位于5q13.2,SMN1编码的蛋白广泛表达于各组织细胞。95%的SMA患者是由于SMN1基因纯合缺失所导致的,5%是由于SMN1杂合突变所导致的(SMN1的一个等位基因缺失,另外的一个发生了点突变),SMN2是SMA的一个重要修饰基因,SMN2基因仅能产生10%~15%具有功能、结构稳定的SMN全长蛋白,是由于位于第7号外显子第6位c.840的C/T,影响了SMN2 mRNA外显子7被选择性剪接,SMN2基因的拷贝数与SMA患者的表型的严重程度呈反比关系,SMN2基因拷贝数越多患者的表现型严重程度越轻。SMN1微小致病性变异在不同的人群之间是有差异的,目前在SMA患者人群中已报道,且经美国医学遗传与基因组学学致病性评估确认为SMA最常见的7个微小突变点为:c.22dupA、c.683T>A、c.689C>T、c.863G>T、c.400G>A、c.463_464delAA、c.835-5T>G。
目前SMA的诊断主要依据SMN1发生双等位基因的致病性变异。随着分子生物技术的发展,各种SMA分子诊断技术不断涌现,先后出现的技术有实时荧光定量PCR(qPCR)、等位基因特异PCR(AS-PCR)、聚合酶链反应-变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、聚合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)等,这些技术都有各自的技术弊端,如检测准确率低,实验操作繁琐,检测成本高等,一直以来,临床上SMA基因检测的金标准是MLPA,主要采用荷兰MRC公司的多重连接探针扩增(MLPA)检测试剂盒,但该技术的局限性在于不能检测点微小突变,且检测成本费用高,检测时间较长,很难用于临床的大规模人群筛查,在技术的推广应用方面也面临着巨大的挑战。
飞行时间质谱是由美国Agena Bioscience公司开发,是近年来发展起来的新型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,基于Agena Bioscience公司的MassARRAY DNA飞行质谱分析系统开发,该平台为全球独创核酸质谱高精度DNA定性定量分析平台该系统于推出后,很快成为国际业界公认的SNP基因型分析和DNA甲基化分析的黄金标准,是目前唯一应用飞行质谱对痕量核酸进行全方位研究的技术平台。该技术的原理是样品分析物与芯片基质(硅化合物)共价结合形成结晶后在质谱仪的真空腔中经高能激光激发,核酸分子解吸附为单电荷离子,在电场中离子飞行时间与离子的质量成反比相关,通过检测解吸的核酸分子在真空腔中飞行的时间从而计算获得样品分析物的精确分子量,进而得到分析物的基因型信息。MassARRAY系统是一个完整的分子实验室基因检测和研究的平台,利用MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统,可以高灵敏度和高精确度地快速分析核酸样本。其高通量能力能够满足大检测量的需求,自动分析快速出结果、具有低成本检测几百个基因突变的能力。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足,提供一种检测脊髓性肌萎缩症相关基因的试剂盒,本发明对人类的第5号染色体长臂1区3带第2亚带SMA致病基因和常见的点突变进行检测,该方法通过使用一套扩增引物组和延伸引物组实现单管反应对基因进行定性和定量分析,依次通过PCR扩增反应,SAP反应,UEP反应,既能实现对脊髓性肌萎缩症基因SMN1和SMN2检测,确定SMN1和SMN2拷贝数,又能实现对人群SMA常见7个SNP位点进行准确的基因分型,实现对人类脊髓性肌萎缩症患者的辅助诊断和携带者筛查,做到准确诊断,该方法检测通量高,实验操作容易,检测结果稳定可靠。
本发明的第一个目的是提供一种用于检测脊髓性肌萎缩症相关基因的扩增引物组。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测脊髓性肌萎缩症相关基因的单碱基延伸引物组。
本发明的第三个目的是提供所述的扩增引物组和/或所述的单碱基延伸引物组在制备检测脊髓性肌萎缩症相关基因的试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种检测脊髓性肌萎缩症相关基因的试剂盒。
为了实现上述目的,本发明是通过以下方案予以实现的:
本发明要求保护一种用于检测脊髓性肌萎缩症相关基因的扩增引物组,其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~18所示。
具体地,包括:(1)SMN1/2第7外显子上游引物序列Exon7-F和下游引物序列Exon7-R,SMN1/2第8外显子上游引物序列Exon8-F和下游引物序列Exon8-R,序列信息分别为:
Exon7-F:ACGTTGGATGGTCTTGTGAAACAAAATGC(SEQ ID NO:1),
Exon7-R:ACGTTGGATGGAATGTGAGCACCTTCCTTC(SEQ ID NO:2),
Exon8-F:ACGTTGGATGGGAAGTGGAATGGGTAACTC(SEQ ID NO:3),
Exon8-R:ACGTTGGATGTTTCTCAACTGCCTCACCAC(SEQ ID NO:4);
(2)检测人群SMA的7个常见点突变的引物:
第1外显子c.22dupA上游引物c.22dupA-F和下游引物c.22dupA-R,
第3外显子c.400G>A上游引物c.400G>A-F和下游引物c.400G>A-R,
第3外显子c.463_464delAA上游引物c.463_464delAA-F和下游引物c.463_464delAA-R,
第5外显子c.683T>A上游引物c.683T>A-F和下游引物c.683T>A-R,
第5外显子c.689C>T上游引物c.689C>T-R和下游引物c.689C>T-F,
第7外显子c.863G>T上游引物c.863G>T-F和下游引物c.863G>Tc.863G>T,
第6内含子c.835-5T>G上游引物c.835-5T>G-F,和下游引物c.835-5T>G-R,
序列信息分别为:
c.22dupA-F:ACGTTGGATGTTTGCTATGGCGATGAGCAG(SEQ ID NO:5),
c.22dupA-R:ACGTTGGATGAACAGCACGGAATCCTCCTG(SEQ ID NO:6),
c.689C>T-F:ACGTTGGATGGGTCTAAAATTCAATGGCCC(SEQ ID NO:7),
c.689C>T_R:ACGTTGGATGTGGTCCAGAAGGAAATGGAG(SEQ ID NO:8),
c.400G>A-F:ACGTTGGATGGAGAGAAACCTGTGTTGTGG(SEQ ID NO:9),
c.400G>A-R:ACGTTGGATGGGGAAAGTAGATCGGACAG(SEQ ID NO:10),
c.863G>T-F:ACGTTGGATGTTCCTTACAGGGTTTCAGAC(SEQ ID NO:11),
c.863G>T-R:ACGTTGGATGAATGCTGGCAGACTTACTCC(SEQ ID NO:12),
c.463_464delAA-F:ACGTTGGATGTCCCCAATCTGTGAAGTAGC(SEQ ID NO:13),
c.463_464delAA-R:ACGTTGGATGCTCATCTAGTCTCTGCTTCC(SEQ ID NO:14),
c.683T>A-F:ACGTTGGATGGGTCTAAAATTCAATGGCCC(SEQ ID NO:15),
c.683T>A-R:ACGTTGGATGTGGTCCAGAAGGAAATGGAG(SEQ ID NO:16),
c.835-5T>G-F:ACGTTGGATGGTCTTGTGAAACAAAATGC(SEQ ID NO:17),
c.835-5T>G-R:ACGTTGGATGGAGCACCTTCCTTCTTTTTG(SEQ ID NO:18)。
优选地,还含有内参基因的扩增序列,其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:28~31所示:内参基因REF-C上游引物序列REF-C-F和下游引物序列REF-C-R、REF-T上游引物序列REF-T-F和下游引物序列REF-T-R,序列信息分别为:
REF-T-F:ACGTTGGATGTGTCAGAAGTCTAAGCCA(SEQ ID NO:28),
REF-T-R:ACGTTGGATGTCTTCACTTCTAAAGCTAAG(SEQ ID NO:29),
REF-C-F:ACGTTGGATGGAGTTCCCATTCCTGAATGAGTC(SEQ ID NO:30),
REF-C-R:ACGTTGGATGTCTAAATGGCAACAACGAGCAC(SEQ ID NO:31)。
本发明还要求保护一种用于检测脊髓性肌萎缩症相关基因的单碱基延伸引物组,其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19~27所示。
各延伸引物的序列信息如下:
Exon7-E:CTTTATTTTCCTTACAGGGTTT(SEQ ID NO:19),
Exon8-E:AAACCATCTGTAAAAGACTG(SEQ ID NO:20),
c.22dupA-E:TGAGCAGCGGCGGCA(SEQ ID NO:21),
c.689C>T-E:ACCACCCCACTTACTAT(SEQ ID NO:22),
c.400G>A-E:ACACTGGATATGGAAATAGA(SEQ ID NO:23),
c.863G>T-E:GACAAAATCAAAAAGAAGGAA(SEQ ID NO:24),
c.463_464delAA-E:TTGTATCCTTACCTCTTGAGCATT(SEQ ID NO:25),
c.683T>A-E:CACCACCACCCCACT(SEQ ID NO:26),
c.835-5T>G-E:TTTTTAACTTCCTTTATTTTCCT(SEQ ID NO:27)。
优选地,还含有内参基因的扩增序列延伸引物:其引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:32~33所示,各延伸引物的序列信息如下:
REF-T:TGCATCAGATTCCACAAGCTT(SEQ ID NO:32),
REF-C:CTGCAGACGTAGGTTTTCA(SEQ ID NO:33)。
进一步要求保护所述的扩增引物组和/或所述的单碱基延伸引物组在制备检测脊髓性肌萎缩症相关基因的试剂盒中的应用。
所述试剂盒既能实现对脊髓性肌萎缩症基因SMN1和SMN2检测,确定SMN1和SMN2拷贝数,又能实现对人群SMA常见7个SNP位点进行准确的基因分型。
本发明进一步要求保护一种检测脊髓性肌萎缩症相关基因的试剂盒,含有所述的扩增引物组和/或所述的单碱基延伸引物组。
优选地,含有所述的扩增引物和所述的单碱基延伸引物组。
优选地,还含有多重PCR反应试剂、SAP反应试剂、UEP反应试剂、质谱检测产品中的一种或几种。
更优选地,所述多重PCR反应试剂为PCR Buffer缓冲液、MgCl2、dNTP Mix和PCR酶中的一种或几种。
更优选地,所述SAP反应试剂为SAP缓冲液和SAP酶中的一种或几种。
更优选地,所述UEP反应试剂为延伸缓冲液和延伸终止液中的一种或两种。
更优选地,所述质谱检测产品为质谱检测孔板和芯片。
最优选地,所述试剂盒含有引物混合液、延伸引物混合液、多重PCR反应试剂、SAP反应试剂、UEP反应试剂和质谱检测产品;
其中,引物混合液含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1~18所示的引物,各引物浓度为100μmol/L。
延伸引物混合液含有核苷酸序列如SEQ ID NO:19~27所示的引物,各引物浓度为500μmol/L。
多重PCR反应试剂PCR Buffer缓冲液、MgCl2、dNTP Mix和PCR酶。
SAP反应试剂SAP缓冲液和SAP酶。
UEP反应试剂延伸缓冲液和延伸终止液。
质谱检测产品为谱检测孔板和芯片。
该试剂盒的使用方法为:
1、样品处理
DNA样本通过抽取人的外周血得到,使用凯普核酸提取试剂盒磁珠法DR-4801-KZ型提取全血基因组DNA,再使用凯普自动提取仪4801完成提取实验。
2、多重PCR反应
PCR反应试剂包括超纯水、PCR Buffer缓冲液、25mM MgCl2、25mM dNTP Mix、扩增引物混合物、PCR酶。
PCR反应体系设置如下,DNA样本上样量为10~50ng为适宜。
PCR反应程序设置如下:
3、SAP反应
SAP反应试剂包括:超纯水、SAP缓冲液、SAP酶。
添加2μl的SAP混合液到单孔PCR反应产物(5μl)中,总体积:7μl。
SAP反应体系设置如下:
SAP反应程序设置如下:
4、UEP反应
UEP反应试剂包括:超纯水、延伸缓冲液、延伸终止液、延伸引物混合液、Extend酶。
向上一步的SAP反应产物(7μl)中加入2μl单碱基延伸反应体系,总体积9μl。
单碱基延伸反应体系设置如下:
单碱基延伸反应程序设置如下:
反应结束后,2000rpm瞬时离心,每孔加入16μL的灭菌双蒸水(此时每孔内的总体积为25μL),换新的膜将384孔板封住,震荡混匀后,瞬时离心。
5、质谱检测
上飞行时间质谱仪及分析,导入Assay和对应的384板的样本编号,连接芯片。将384孔板与芯片放置在质谱仪相应的位置,然后按开始键,直到全部完成。检测结果用Typer4.1软件自动分析,并将各位点峰面积导出至Excel文件。
其结果判断方法为:
1、定性检测
根据延伸引物及引物延伸后分子量大小,判读目标位点上为何种基因型,判断原则为当SNR≥5时且峰值≥4,,表示信号峰可信,可按照下表进行突变位点判型。
突变位点 | 野生型 | 纯合突变 | 杂合突变 |
c22dupA | G | A | GA |
c.689C>T | C | T | TC |
c.400G>A | G | A | GA |
c.863G>T | G | T | TG |
c.463-464delAA | T/C | G/A | TG/CA |
c.683T>A | T | A | TA |
c.835-5T>G | T | G | TG |
2、定量检测时
引入了两个目的基因临近序列的两个无CNV变异的内参基因,每次检测中加入2~4份已知SMN1和SMN2为2拷贝的参照样本。需要先消除自身样本拷贝数外其他因素的影响,即需要自身“校正”。
首先计算样本的目标基因峰面积/内参基因峰面积比值,接着根据参照样本和待检样本该比值以及结合参比样本目标基因拷贝数进行计算,对待检样本拷贝数进行推算。以SMN1和SMN2基因拷贝数均为2的正常样本作为参照,根据质谱检测获得待检样本、参照样本的两个内参和目标基因峰面积值,以下公式进行计算:
两个内参基因均按上述公式进行推算并将这两次结果取平均值,该均值则为目标基因的拷贝数数量。检测结果判定见表1和2。
表1相对拷贝数定量数据分析结果判定(SMN1的E7和E8)
拷贝数检测结果 | 判定拷贝数结果 | 结果解释 |
<0.4 | 0 | 受检样本中无此目标基因 |
0.6~1.5 | 1 | 受检样本中缺失了1个目标基因 |
≥1.6 | ≥2 | 受检样本中目标基因正常 |
表2相对拷贝数定量数据分析结果判定(SMN2的E7和E8)
拷贝数检测结果 | 判定拷贝数结果 | 结果解释 |
<0.4 | 0 | 受检样本中无此目标基因 |
0.6~1.5 | 1 | 受检样本中缺失了1个目标基因 |
1.6~2.5 | 2 | 受检样本中目标基因正常 |
≥2.6 | ≥3 | 受检样本中目标基因拷贝数增加 |
如果MALDI-TOF判读拷贝数检测结果处于其他区间,继续重复2次:如果2次判读结果均为正常,确定结果,如果少于2次正常,无法判断,建议采用其方法进行检测。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供一个检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的飞行时间质谱法的引物组合。其通过单管反应同时检测脊髓性肌萎缩症基因SMN1和SMN2,能够对SMN1和SMN2拷贝数定量,也同时检测人群SMA常见的7个热点突变,具有高准确性、高灵敏度、高通量的特点,能够直接分辨15dalton(道尔顿)的差异,不引入荧光等标记物所带来的偏差,信号偏差显著低于定量PCR,保证了单孔多重反应的准确性和重复性,一台质谱仪每天可以检测3000左右个样本,检测所需的样本量少,核酸模板可检测到2ng/μl,适合技术推广和应用。利用本发明的引物组合对疑似脊髓性肌萎缩症的患者、确诊脊髓性肌萎缩症的患者、或有脊髓性肌萎缩症家族病史等高危人群,可以对正常人,携带者和患者进行准确的基因分型的目的。
附图说明
图1为个位点检测结果,A为:SMN1-c.22dupA;B为:Intron6 c.835-5T>G;C为:SMN1c.683T>A;D为:MN1-c.689C>T;E为:SMN1-c.400G>A;F为:SMN1-c.463_464delAA。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种人类脊髓性肌萎缩症的检测试剂盒
一、组成
1、引物混合液
各位点每条扩增引物的原始浓度为100μmol/L,具体含有:(1)SMN1和SMN2第7、8外显子上游引物序列Exon7-F、Exon8-F,SMN1和SMN2第7、8外显子下游引物序列Exon7-R、Exon8-R,序列信息分别为:
Exon7-F:ACGTTGGATGGTCTTGTGAAACAAAATGC(SEQ ID NO:1),
Exon7-R:ACGTTGGATGGAATGTGAGCACCTTCCTTC(SEQ ID NO:2),
Exon8-F:ACGTTGGATGGGAAGTGGAATGGGTAACTC(SEQ ID NO:3),
Exon8-R:ACGTTGGATGTTTCTCAACTGCCTCACCAC(SEQ ID NO:4);
(2)检测人群SMA的7个常见点突变的引物:
第1外显子c.22dupA上游引物c.22dupA-F和下游引物c.22dupA-R,
第3外显子c.400G>A上游引物c.400G>A-F和下游引物c.400G>A-R,
第3外显子c.463_464delAA上游引物c.463_464delAA-F和下游引物c.463_464delAA-R,
第5外显子c.683T>A上游引物c.683T>A-F和下游引物c.683T>A-R,
第5外显子c.689C>T上游引物c.689C>T-R和下游引物c.689C>T-F,
第7外显子c.863G>T上游引物c.863G>T-F和下游引物c.863G>Tc.863G>T,
第6内含子c.835-5T>G上游引物c.835-5T>G-F,和下游引物c.835-5T>G-R,
序列信息分别为:
c.22dupA-F:ACGTTGGATGTTTGCTATGGCGATGAGCAG(SEQ ID NO:5),
c.22dupA-R:ACGTTGGATGAACAGCACGGAATCCTCCTG(SEQ ID NO:6),
c.689C>T-F:ACGTTGGATGGGTCTAAAATTCAATGGCCC(SEQ ID NO:7),
c.689C>T_R:ACGTTGGATGTGGTCCAGAAGGAAATGGAG(SEQ ID NO:8),
c.400G>A-F:ACGTTGGATGGAGAGAAACCTGTGTTGTGG(SEQ ID NO:9),
c.400G>A-R:ACGTTGGATGGGGAAAGTAGATCGGACAG(SEQ ID NO:10),
c.863G>T-F:ACGTTGGATGTTCCTTACAGGGTTTCAGAC(SEQ ID NO:11),
c.863G>T-R:ACGTTGGATGAATGCTGGCAGACTTACTCC(SEQ ID NO:12),
c.463_464delAA-F:ACGTTGGATGTCCCCAATCTGTGAAGTAGC(SEQ ID NO:13),
c.463_464delAA-R:ACGTTGGATGCTCATCTAGTCTCTGCTTCC(SEQ ID NO:14),
c.683T>A-F:ACGTTGGATGGGTCTAAAATTCAATGGCCC(SEQ ID NO:15),
c.683T>A-R:ACGTTGGATGTGGTCCAGAAGGAAATGGAG(SEQ ID NO:16),
c.835-5T>G-F:ACGTTGGATGGTCTTGTGAAACAAAATGC(SEQ ID NO:17),
c.835-5T>G-R:ACGTTGGATGGAGCACCTTCCTTCTTTTTG(SEQ ID NO:18);
(3)内参基因的扩增序列,其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:28~31所示:内参基因REF-C上游引物序列REF-C-F和下游引物序列REF-C-R、REF-T上游引物序列REF-T-F和下游引物序列REF-T-R,序列信息分别为:
REF-T-F:ACGTTGGATGTGTCAGAAGTCTAAGCCA(SEQ ID NO:28),
REF-T-R:ACGTTGGATGTCTTCACTTCTAAAGCTAAG(SEQ ID NO:29),
REF-C-F:ACGTTGGATGGAGTTCCCATTCCTGAATGAGTC(SEQ ID NO:30),
REF-C-R:ACGTTGGATGTCTAAATGGCAACAACGAGCAC(SEQ ID NO:31)。
2、延伸引物混合液
含有延伸引物,每条单碱基延伸引物的原始浓度为500μmol/L,各延伸引物的序列信息如下:
Exon7-E:CTTTATTTTCCTTACAGGGTTT(SEQ ID NO:19),
Exon8-E:AAACCATCTGTAAAAGACTG(SEQ ID NO:20),
c.22dupA-E:TGAGCAGCGGCGGCA(SEQ ID NO:21),
c.689C>T-E:ACCACCCCACTTACTAT(SEQ ID NO:22),
c.400G>A-E:ACACTGGATATGGAAATAGA(SEQ ID NO:23),
c.863G>T-E:GACAAAATCAAAAAGAAGGAA(SEQ ID NO:24),
c.463_464delAA-E:TTGTATCCTTACCTCTTGAGCATT(SEQ ID NO:25),
c.683T>A-E:CACCACCACCCCACT(SEQ ID NO:26),
c.835-5T>G-E:TTTTTAACTTCCTTTATTTTCCT(SEQ ID NO:27),
REF-T:TGCATCAGATTCCACAAGCTT(SEQ ID NO:32),
REF-C:CTGCAGACGTAGGTTTTCA(SEQ ID NO:33)。
还含有多重PCR反应试剂、SAP反应试剂、UEP反应试剂和质谱检测产品;
其中,多重PCR反应试剂PCR Buffer缓冲液、MgCl2、dNTP Mix和PCR酶,
SAP反应试剂SAP缓冲液和SAP酶,
UEP反应试剂延伸缓冲液和延伸终止液,
质谱检测产品为谱检测孔板和芯片。
二、使用方法
1、样品处理
DNA样本通过抽取人的外周血提取与纯化得到,使用凯普核酸提取试剂盒磁珠法DR-4801-KZ型提取全血基因组DNA,再使用凯普自动提取仪4801完成提取实验。
2、多重PCR反应
PCR反应试剂包括超纯水、PCR Buffer缓冲液、25mM MgCl2、25mM dNTP Mix、扩增引物混合物、PCR酶。
PCR反应体系设置如下,DNA样本上样量为10~50ng为适宜。
PCR反应程序设置如下:
3、SAP反应
SAP反应试剂包括:超纯水、SAP缓冲液、SAP酶。
添加2μl的SAP混合液到单孔PCR反应产物(5μl)中,总体积:7μl。
SAP反应体系设置如下:
SAP反应程序设置如下:
4、UEP反应
UEP反应试剂包括:超纯水、延伸缓冲液、延伸终止液、延伸引物混合液、Extend酶。
向上一步的SAP反应产物(7μl)中加入2μl单碱基延伸反应体系,总体积9μl。
单碱基延伸反应体系设置如下:
单碱基延伸反应程序设置如下:
反应结束后,2000rpm瞬时离心,每孔加入16μL的灭菌双蒸水(此时每孔内的总体积为25μL),换新的膜将384孔板封住,震荡混匀后,瞬时离心。
5、质谱检测
上飞行时间质谱仪及分析,导入Assay和对应的384板的样本编号,连接芯片。将384孔板与芯片放置在质谱仪相应的位置,然后按开始键,直到全部完成。检测结果用Typer4.1软件自动分析,并将各位点峰面积导出至Excel文件。
三、结果判断
1、定性检测
根据延伸引物及引物延伸后分子量大小,判读目标位点上为何种基因型,判断原则为SNR≥5时且峰值≥4,按照下表进行突变位点判型。
/>
2、定量检测时
引入了两个目的基因临近序列的两个无CNV变异的内参基因,每次检测中加入2~4份已知SMN1和SMN2为2拷贝的参照样本。需要先消除自身样本拷贝数外其他因素的影响,即需要自身“校正”。
首先计算样本的目标基因峰面积/内参基因峰面积比值,接着根据参照样本和待检样本该比值以及结合参比样本目标基因拷贝数进行计算,对待检样本拷贝数进行推算。以SMN1和SMN2基因拷贝数均为2的正常样本作为参照,根据质谱检测获得待检样本、参照样本的两个内参和目标基因峰面积值,按以下公式进行计算:
两个内参基因均按上述公式进行推算并将这两次结果取平均值,该平均值则作为目标基因的拷贝数检测结果。检测结果判定见表1和2。
表1相对拷贝数定量数据分析结果判定(SMN1的E7和E8)
拷贝数检测结果 | 判定拷贝数结果 | 结果解释 |
<0.4 | 0 | 受检样本中无此目标基因 |
0.6~1.5 | 1 | 受检样本中缺失了1个目标基因 |
≥1.6 | ≥2 | 受检样本中目标基因正常 |
表2相对拷贝数定量数据分析结果判定(SMN2的E7和E8)
拷贝数检测结果 | 判定拷贝数结果 | 结果解释 |
<0.4 | 0 | 受检样本中无此目标基因 |
0.6~1.5 | 1 | 受检样本中缺失了1个目标基因 |
1.6~2.5 | 2 | 受检样本中目标基因正常 |
≥2.6 | ≥3 | 受检样本中目标基因拷贝数增加 |
如果MALDI-TOF判读拷贝数检测结果处于其他区间,继续重复2次:如果2次判读结果均为正常,确定结果,如果少于2次正常,无法判断,建议采用其方法进行检测。
实施例3临床样本人类脊髓性肌萎缩症相关基因的检测
一、实验方法
1、样本来源及类型
选取和合作医疗机构收集的已确诊基因型的SMA gDNA标本,基因型分别为SMN1/SMN2=0/3、SMN1/SMN2=1/2、SMN1/SMN2=2/2的样本各5份,共15份,用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至10~50ng/μL备用。SMN1-c.22dupA 、Intron6c.835-5T>G、SMN1-c.683T>A、SMN1-c.689C>T、SMN1-c.400G>A、SMN1-c.463_464delAA、SMN1-c.863G>T突变的质粒DNA共7例,用灭菌水稀释至5~10ng/μL备用。
2、样本检测
使用实施例1的试剂盒进行样本检测。
二、实验结果
使用实施例1的检测试剂盒对于已知基因型的临床样本进行检测,检测结果显示,与已知的基因型一致,结果见表3。
表3:
序号 | 已知基因型 | 实施例1的试剂盒检出的基因型 | 是否一致 |
01 | SMN1=0拷贝数,SMN2=3拷贝 | SMN1=0拷贝数,SMN2≥3拷贝 | 是 |
02 | SMN1=0拷贝数,SMN2=3拷贝 | SMN1=0拷贝数,SMN2≥3拷贝 | 是 |
03 | SMN1=0拷贝数,SMN2=3拷贝 | SMN1=0拷贝数,SMN2≥3拷贝 | 是 |
04 | SMN1=0拷贝数,SMN2=3拷贝 | SMN1=0拷贝数,SMN2≥3拷贝 | 是 |
05 | SMN1=0拷贝数,SMN2=3拷贝 | SMN1=0拷贝数,SMN2≥3拷贝 | 是 |
06 | SMN1=1拷贝数,SMN2=2拷贝 | SMN1=1拷贝数,SMN2=2拷贝 | 是 |
07 | SMN1=1拷贝数,SMN2=2拷贝 | SMN1=1拷贝数,SMN2=2拷贝 | 是 |
08 | SMN1=1拷贝数,SMN2=2拷贝 | SMN1=1拷贝数,SMN2=2拷贝 | 是 |
09 | SMN1=1拷贝数,SMN2=2拷贝 | SMN1=1拷贝数,SMN2=2拷贝 | 是 |
10 | SMN1=1拷贝数,SMN2=2拷贝 | SMN1=1拷贝数,SMN2=2拷贝 | 是 |
11 | SMN1=2拷贝数,SMN2=2拷贝 | SMN1≥2拷贝数,SMN2=2拷贝 | 是 |
12 | SMN1=2拷贝数,SMN2=2拷贝 | SMN1≥2拷贝数,SMN2=2拷贝 | 是 |
13 | SMN1=2拷贝数,SMN2=2拷贝 | SMN1≥2拷贝数,SMN2=2拷贝 | 是 |
14 | SMN1=2拷贝数,SMN2=2拷贝 | SMN1≥2拷贝数,SMN2=2拷贝 | 是 |
15 | SMN1=2拷贝数,SMN2=2拷贝 | SMN1≥2拷贝数,SMN2=2拷贝 | 是 |
16 | SMN1-c.22dupA | SMN1-c.22dupA(如图1中A) | 是 |
17 | Intron6 c.835-5T>G | Intron6 c.835-5T>G(如图1中B) | 是 |
18 | SMN1 c.683T>A | SMN1 c.683T>A(如图1中C) | 是 |
19 | SMN1-c.689C>T | SMN1-c.689C>T(如图1中D) | 是 |
20 | SMN1-c.400G>A | SMN1-c.400G>A(如图1中E) | 是 |
21 | SMN1-c.463_464delAA | SMN1-c.463_464delAA(如图1中F) | 是 |
22 | SMN1-c.863G>T | SMN1-c.863G>T | 是 |
实施例3 PCR扩增循环数对检测结果的影响
一、实验方法
采用实施例1的试剂盒对实施例3中序号11样本核酸模板进行检测,改变PCR的扩增循环数分别为:25、30、35、40、和45,共5个梯度。
检测结果如下:
/>
二、实验结果
实验结果表明:当PCR的扩增循环数设置为30时,有个别位点未检测出或位点信号峰很低,结果不佳。当PCR的扩增循环数设置为35时,位点都能检测出,拷贝数检测准确,结果最优。当PCR的扩增循环数设置为40时,位点都能检测出,但拷贝数检测不准确,结果不佳。当PCR的扩增循环数设置为45时,位点都能检测出,但拷贝数检测不准确,结果不佳。综上述,分析其原因,PCR扩增循环次数会影响位点和拷贝数的检测准确性,选择PCR的扩增循环数为35时,检测结果最佳,即采用优选方案中的扩增循环次数最佳。
实施例4进行SMA基因突变检测试剂盒灵敏度测试
一、实验方法
对实施例3中序号11~13样本核酸模板进行稀释后,用本发明实施例1的试剂盒和体系进行SMA基因突变检测,检测灵敏度。检测结果如下表:
/>
结果显示,本发明所述的检测试剂盒和检测体系能检测核酸模板到2ng/μl,显示本发明具有极高的敏度高。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,对于本领域的普通技术人员来说,在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测脊髓性肌萎缩症相关基因的扩增引物组,其特征在于,其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~18所示。
2.一种用于检测脊髓性肌萎缩症相关基因的单碱基延伸引物组,其特征在于,其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19~27所示。
3.权利要求1所述的扩增引物组和/或权利要求2所述的单碱基延伸引物组在制备检测脊髓性肌萎缩症相关基因的试剂盒中的应用。
4.一种检测脊髓性肌萎缩症相关基因的试剂盒,其特征在于,含有权利要求1所述的扩增引物组和/或权利要求2所述的单碱基延伸引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,含有权利要求1所述的扩增引物组和权利要求2所述的单碱基延伸引物组。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒,其特征在于,还含有多重PCR反应试剂、SAP反应试剂、UEP反应试剂、质谱检测产品中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述多重PCR反应试剂为PCR Buffer缓冲液、MgCl2、dNTP Mix和PCR酶中的一种或几种。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述SAP反应试剂为SAP缓冲液和SAP酶中的一种或几种。
9.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述UEP反应试剂为延伸缓冲液和延伸终止液中的一种或两种。
10.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述质谱检测产品为质谱检测孔板和芯片。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20160026444A (ko) * | 2014-09-01 | 2016-03-09 | 포항공과대학교 산학협력단 | 척수성 근위축증 진단용 프라이머, 프라이머 세트 및 이를 이용한 척수성 근위축증 진단 방법 |
CN106319085A (zh) * | 2016-11-17 | 2017-01-11 | 郑州大学第附属医院 | 脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用 |
CN110468192A (zh) * | 2019-07-05 | 2019-11-19 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的飞行时间质谱核酸分析方法 |
-
2022
- 2022-12-12 CN CN202211591832.6A patent/CN116479103B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR20160026444A (ko) * | 2014-09-01 | 2016-03-09 | 포항공과대학교 산학협력단 | 척수성 근위축증 진단용 프라이머, 프라이머 세트 및 이를 이용한 척수성 근위축증 진단 방법 |
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Title |
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