CN116287192A - 一种整合smn1与smn2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒及其应用。本发明在PCR反应中同时扩增SMN基因外显子、SMN2修饰因子、SMN1微小致病变异与分子遗传标记，通过毛细管电泳分析PCR产物以SMN基因皆为2拷贝数的SMA正常对照进行计算，对SMN1和SMN2基因第7、8外显子拷贝数进行相对定量的检测，计算出0、1、2、3、≧4拷贝数的SMN基因，区分SMN基因外显子拷贝数正常、杂合与纯合缺失突变，可提示SMN2转录子增加、SMN1具有微小致病变异，并提供家系分析需要的信息，明确SMN1基因遗传途径。从DNA样本开始，2.5小时内可以出结果，只需要一次PCR实验即可实现覆盖SMA所有遗传变异方式的辅助诊断，检测技术流程简单，容易实现标准化。

Description

一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试 剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒及其应用。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一种由于脊髓前角及延髓运动神经元变性导致近端肢体和躯干进行性对称性肌无力和肌萎缩的常染色体隐性遗传病，因位于染色体5q11.2-q13.3上的运动神经元存活基因1(survival motor neuron 1,SMN1)缺失或突变致使运动神经元存活蛋白(survival motor neuron protein,SMN)表达降低而致病，位居2岁以下致死性遗传病首位。SMA在存活新生儿中的发病率约1/6000～1/10000，但中国人群携带率高达1/42，2018年已被列入我国《第一批罕见病目录》。

SMA为单基因遗传病，但其遗传变异方式非常多样，约95％患者存在SMN1第7号外显子和/或第8号外显子纯合缺失，即SMN1拷贝数为0，另有5％为SMN1点突变复合等位基因缺失所致的复合杂合突变单拷贝患者，均可影响全长mRNA转录导致体内SMN蛋白水平降低而致病。目前国内已报导的微小致病性变异中检测频次≧2，且经美国遗传与基因组学学会(ACMG)致病性评估确认是致病性微小变异有共7种，包括c.22dupA、c.683T>A、c.689C>T、c.863G>T、c.400G>A、c.463_464delAA、c.835-5T>G。

再者，就SMA携带者而言，除SMN1“1+0”型的常见基因型外，仍有近8％包括SMN1“2+0”型、SMN1“1+1^d”型在内的隐形携带者，此类携带者的SMN1拷贝数≥2，与正常人完全相同，给遗传咨询带来诸多复杂性。基于25％的常染色体隐性遗传再发概率及中国人群的高携带率，如不及时给予精准诊断，全国每年将不可避免增加至少5000名新发患儿，给社会带来沉重负担。

SMN2为SMN1的高度同源基因，两者仅5个碱基差异，但因SMN2第7号外显子c.840C>T突变可破坏剪接增强子结构导致SMN2外显子7跳跃，进而编码出易被降解的不稳定截短蛋白(SMNΔ7)，最后仅表达少量功能性SMN蛋白维持生理功能。作为SMA疾病进程的最重要生物标志物，SMN2拷贝数与疾病严重程度呈负相关，拷贝数越高，疾病表型相对越轻。同時有研究发现一些携带2个SMN2拷贝数的SMA患者并不是严重的1型而是更轻的2型或者3型，进一步分析发现这些患者SMN2上存在罕见的多态性变异(c.859G>C、c.835-44A>G等)，经功能实验证实这些变异可导致含外显子7的全长转录本增加，SMN蛋白水平提升从而缓解疾病进展及预后。因此，SMN1与SMN2均为SMA遗传学检测的要素，一次性实现SMN1与SMN2的精准检测对患者诊断与预后十分重要，更对携带者及整个家系的遗传咨询具有重要意义。

国际上，SMA的通用基因检测方法——多重连接探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)在遗传学诊断与携带者筛查的临床应用上具有一定局限性。该方法虽可在同一反应管内可检测多达50个核苷酸序列的拷贝数变化、鉴定基因外显子缺失、重复等突变，可明确区分患者、携带者及正常人，并同时检测SMN2拷贝数，但检测成本高、检测方法繁琐、耗时至少7个工作日，且实验结果重复性差，无法检测出约5％复合杂合突变的SMA患者，易造成SMA漏诊及遗传咨询假阴性。因此，为实现快速、经济的精准诊断，亟需研发新的检测方法以满足多级临床需求。

因复合杂合突变患者与隐形携带者的存在，国内外现有SMA检测技术并不能同时满足所有患者与携带者的快速精准诊断与筛查需求，疾病漏诊极易发生，更可导致遗传咨询假阴性，增加出生缺陷。有鉴于此，需要一种改良方法，以准确、专一并更快速的方式一次性同时检测SMN1与SMN2拷贝数、SMN1微小变异、SMN2修饰因子，以及分子遗传标记(shorttandem repeat,STR)进行SMN基因的家系连锁分析，确定是否有2+0或1+1^d的隐性携带者，即覆盖SMA所有遗传变异方式的多重突变扩增系统荧光PCR技术，进行家系连锁分析，明确SMN1基因遗传途径，真正实现快速精准诊断所有基因类型的SMA患者及携带者。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒及其应用。

为实现前述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒，所述试剂盒包含：

1)针对SMN1、SMN2基因拷贝数进行检测的引物，所述SMN1与SMN2基因拷贝数检测位点包括以下：SMN1外显子7、SMN1外显子8、SMN2外显子7、SMN2外显子8；

2)针对SMN1微小变异进行检测的引物，所述SMN1微小变异包含以下：c.22dupA、c.683T>A、c.689C>T、c.863G>T、c.400G>A、c.463_464delAA、c.835-5T>G；

3)针对SMN2修饰因子进行检测的引物，所述SMN2修饰因子包含以下：c.859G>C与c.835-44A>G；

4)针对5号染色体位于SMN1和SMN2基因附近的短串联重复序列位点进行检测的引物，所述短串联重复序列位点包含以下：D5S125、D5S629、D5S1414、D5S1408、D5S610、D5S112；

5)针对内控基因进行检测的引物，所述内控基因包含以下：CFTR、RPP30；

6)多重聚合酶连锁反应(PCR)试剂。

进一步的，所述试剂盒针对SMN1微小变异与SMN2修饰因子设置对应野生型检测引物，所述SMN1微小变异与SMN2修饰因子对应野生型包含以下：c.22A、c.683T、c.689C、c.863G、c.400G、c.463A、c.835-5T、c.859G与c.835-44A。

进一步的，所述试剂盒中的引物序列具体如SEQ ID NO.1～49，具体序列如下表所示。

进一步的，所述试剂盒中的引物至少包含一种以上的荧光基团，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、TMR、NED、PET、ROX中的任意一种。

一种非疾病诊断治疗目的的检测SMA遗传变异的方法，其是利用上述一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒进行。

进一步的，上述一种非疾病诊断治疗目的的检测SMA遗传变异的方法，包含以下步骤：

(1)于PCR试剂中混合待测DNA样品及SEQ ID NO.1-49所示的引物；

(2)将步骤(1)得到的混合物接受聚合酶连锁反应，并对聚合酶连锁反应后的目的片段进行荧光标记毛细管电泳分析；

(3)以GeneMapper软件通过高分辨率的技术将步骤(2)产出不同荧光与不同片段长度的扩增产物分开，并产生检测峰面积信息；

(4)通过对各检测峰的面积判断，确认待测DNA样品是否发生SMA遗传变异。

进一步的，上述一种非疾病诊断治疗目的的检测SMA遗传变异的方法中，所述SMA遗传变异包括待测DNA样品中SMN1外显子7、SMN2外显子7、SMN1外显子8以及SMN2外显子8的拷贝数是否发生变异，以及待测DNA样品是否具有SMN1微小变异与SMN2修饰基因，以及待测DNA样品是否为SMN(2+0)基因型SMA隐性携带者。

上述一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒在SMA基因检测中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)合并多阶段的PCR扩增反应于同一管，一次性解决多重PCR扩增定量与定性问题。利用多种不同类型的引物在单管反应液中，进行PCR扩增反应，全程需要1.5小时，同时扩增SMN1、SMN2基因的第7外显子与第8外显子区域、SMN2修饰因子、中国常见的SMA微小致病性变异(检测频次≧2)及SMN1基因分子遗传标记(STR)，合并原本多阶段的PCR扩增反应在同一管，一次性解决多重PCR问题，可大幅缩短检测时间。

(2)透过总拷贝数的复核，确保检测结果的正确性。除第7外显子，同时检测SMN1和SMN2基因第8外显子，正常情况在SMN1与SMN2在第7外显子、第8外显子的SMN1+SMN2的总拷贝数应一致，若发现总拷贝数不一致情况，则表示PCR扩增存在问题，可避免出现假阴性或假阳性结果导致误判。

(3)同时检测SMA的致病基因SMN1和临床表型预测基因SMN2，可区分SMA患者、携带者与正常人。对于SMN1基因为0拷贝数的患者，结合SMN2基因拷贝数结果，辅以SMN2基因修饰因子(c.859G>C与c.835-44A>G)的检测，可评估疾病的严重程度，并可作为临床药物治疗预后评定。

(4)同时包含中国常见的SMA微小致病性变异检测，可补充拷贝数检测的不足，填补5％复合杂合突变SMA患者的空白，避免出现假阴性结果。

(5)SMN1的2+0基因型个体是一种特殊的SMA隐性携带者，大约有8％的携带者属于此基因型，给携带者筛查以及家系的遗传咨询带来了巨大的挑战。SMN1基因分子遗传标记(STR)的检测，可用于家系连锁分析，对全家系内SMA预防以及SMN1(2+0)基因型的确认具有重要意义。

(6)本发明单管PCR反应，搭配一孔毛细管电泳分析，在2.5小时内可以出结果，一次性定量SMN1和SMN2基因拷贝数、定性检测SMN1基因微小变异、SMN2修饰因子及SMN基因分子遗传标记，其中SMN1拷贝数和致病性变异的检测结果用于诊断或排除诊断，SMN2拷贝数和修饰因子的检测结果作为患者诊断后的治疗、临床管里和预后评估的参考指标，患者检测覆盖率达百分百，可精准区分SMA正常人、携带者与患者，提供SMA表型预测，同时满足全家系多重检测临床需求，并有望进一步开展新生儿筛查。因此，对实现SMA的三级预防、对降低出生缺陷、提高我国人口素质、大幅降低社会医疗成本等具有重要社会意义。

附图说明

图1为SMA携带型样本检测结果，SMN1:SMN2为1:1。

图2为SMA正常型样本检测结果，SMN1:SMN2为2:2。

图3为SMA正常型样本检测结果，SMN1：SMN2为3∶3。

图4为SMA正常型样本检测结果，SMN1：SMN2为4∶2。

图5为SMA致病性微小变异c.22dupA样本检测结果，SMN1：SMN2为3∶1。

具体实施方式

实施例1引物设计

根据NCBI数据库，查找SMN1和SMN2基因第7、8外显子、2个SMN2修饰因子、7个SMN1微小致病变异、6个SMN基因分子遗传标记位点、CFTR与RPP30基因，设计特异引物，具体如SEQ ID NO.1～49所示。其中SMN第7、8外显子做SMN拷贝数判读，SMN2修饰因子提示SMA患者的SMN转录子增加，SMN1微小致病变异提示样本为可能的携带者或患者，两个内参基因(CFTR与RPP30)用于PCR效率的监控。

SMA反应液与SMA引物混合液配制

表2SMA反应液组分配制表

组分	每反应终浓度
		10X Taq Buffer(Thermo)	1.5X
25mM MgCl2	0.6mM
		dATP/dTTP/dGTP/dCTP	各0.5mM
甜菜碱	2.0M

表3SMA引物混合液组分配制表

实施例2PCR扩增与结果分析

1、样本处理：核酸提取试剂盒(Qiagen，QlAmp DNABlood Mini Kit,貨號51104)提取人类基因组DNA用于后续的PCR反应，DNA浓度为7.5ng/uL～60ng/uL，OD₂₆₀nm/OD₂₈₀nm的比值在1.6-2.0之间。

2、扩增试剂配制：

(1)从试剂盒取出SMA反应液、SMA引物混合液，于室温解冻，上下颠倒混匀后，用微量离心机短暂离心，使所有液体沉降于管底。

(2)扩增试剂配制：按下表4配制扩增试剂

表4扩增试剂配制表

扩增试剂	每反应体积
		SMA反应液	15μL
SMA引物混合液	33μL
		DNA热启动聚合酶	0.1μL
总体积	18.1μL

(3)在PCR反应管中分别加入18μL配制好的扩增试剂，转移到样本处理区加样。

3、加样：在对应的含有18μL的扩增试剂的PCR反应管中分别加入2μL待测样本基因组DNA、正常对照及空白对照，盖上PCR反应管盖后，短暂离心。

4、PCR扩增与毛细管电泳仪分析：

(1)将PCR反应管放入PCR仪设定反应程序，反应体积设定：20μL；

(2)荧光标记毛细管电泳分析PCR扩增产物：采用ABI3130、ABI3730、ABI3500Dx、或ABI SeqStudio Genetic Analyzer毛细管基因分析仪进行检测，取1μL扩增产物、10μL 1％GeneScan 500LIZ Size Standard(以10μL GeneScan 500LIZ Size Standard加990μL Hi-Di Formamide配制，即为1vol％GeneScan 500LIZ Size Standard)，95℃变性3分钟，立即放冰上2分钟，上机检测。

5、软件分析：

反应程序结束后，以GeneMapper软件对PCR扩增产物进行片段大小分析，分析所需的Analysis Method、Panel与Size Standard文件可从网站下载，数据导入、分析参数设置和结果分析具体信息请参见GeneMapper用户手册。

6、检测峰比值计算：

待测样本与正常对照的SMA基因与两个内参基因的检测峰面积分别除以内参基因面积总和，再以待测样本除以SMA女性对照各位点对应的值，即为各位点的检测峰比值(R)。

7、结果判读：

(1)内参基因检测峰比值(R)落于1.80-2.20间，SMN1与SMN2基因第7、8外显子检测峰比值按下表进行拷贝数判读。

拷贝数判读	检测峰比值(R)范围
		0	R＜0.20
1	0.20≤R＜1.45
		2	1.45≤R＜2.5
3	2.5≤R＜3.5
		≥4	R≥3.5

(2)当SMN1为0拷贝或1拷贝具有致病性复合杂合突变时，SMN2修饰因子c.859G>C与c.835-44A>G位点具变异检测峰讯号，可提示SMN2全长转录子增加，可结合其他临床信息提示有较轻SMA症状的可能。

(3)当SMN1拷贝数为1拷贝，SMN1致病性变异位点具变异检测峰讯号时(c.22dupA:217bp、c.835-5T>G:251bp、c.863G>T:284bp、c.463_464delAA:296bp、c.689C>T:327bp、c.683T>A:340bp、c.400G>A:359bp)可提示SMN1上可能存在以上致病性微小变异，需要结合其他方法学如长片段扩增、三代测序与临床信息、家族史做综合评估。

实施例3试剂性能验证

1、评估本发明试剂的诊断准确度

检测10份准确性参考品(包括4份缺失参考品，5份携带参考品和1份微小变异参考品)，如下表，分别检测高、中、低浓度，样本浓度分别为60ng/uL、25ng/uL、15ng/uL，各浓度进行三重复测试，检测三批试剂，SMA基因外显子拷贝数符合要求。

表5准确性参考品第7外显子和第8外显子基因拷贝数

2、特异性参考品符合率

检测12份正常参考品，如下表，分别检测高、中、低浓度，样本浓度分别为60ng/uL、25ng/uL、15ng/uL，各浓度进行三重复测试，检测三批试剂，检测结果特异性符合率为100％。

表6特异型参考品第7外显子和第8外显子基因拷贝数

3.重复性

检测3份重复性参考品，各浓度进行十次重复检测，检测三批试剂，拷贝数判断皆正确，检测结果皆符合。

表7重复性参考品第7外显子和第8外显子基因拷贝数

4、检测限

检测13份检测限参考品，如下表，样本浓度分别稀释至20ng/μL、15ng/μL，各进行20次重复测试，检测三批试剂，检测结果重复数皆符合要求。

表8检测限参考品第7外显子和第8外显子基因拷贝数

实施例4

1.收集150例EDTA抗凝全血样本，采用荷兰MRC-Holland公司研制的

Probemix P021作为参比方法，验证结果之间的一致性。

2.收集EDTA抗凝全血样本采用核酸提取试剂盒(Qiagen,QlAmp DNA Blood MiniKit,貨號51104)提取人类基因组DNA，用微量分光亮度计检测DNA的浓度与纯度，150例样本浓度为15ng/uL-60ng/uL，OD_260nm/OD_280nm的比值在1.6-2.0之间。

3.按照实施例2的步骤，进行DNA加样，以PCR仪进行反应，

4.按实施例2的步骤，进行结果分析，结果如下表，皆符合SMA外显子拷贝数要求，其中SMA患者检测51例样本、SMA携带者检测22例样本、SMA正常个体检测77例样本，共检测150例样本(表9)。

表9 150例样本检测结果

/>

/>

*MLPA：多重连结探针扩增法，其作为本揭示内容之正控制组。

依据表9及图1到图4之结果，本发明可以精确测定人类个体SMN基因外显子的拷贝数，进而鉴定脊髓性肌萎缩患者、脊髓性肌萎缩携带者及正常型。

实施例5

1.针对SMN基因点突变样本，收集21例EDTA抗凝全血样本，采用SMN基因一代测序作为参比方法，验证结果之间的一致性。

2.收集EDTA抗凝全血样本采用核酸提取试剂盒(Qiagen,QlAmp DNA Blood MiniKit,貨號51104)提取人类基因组DNA，用微量分光亮度计检测DNA的浓度与纯度，21例样本浓度为15ng/uL-60ng/uL，OD_260nm/OD_280nm的比值在1.6-2.0之间。

3.按照实施例2的步骤，进行DNA加样，以PCR仪进行反应，

按实施例2的步骤，进行结果分析，结果如下表，皆符合SMA外显子拷贝数要求，其中SMN基因c.22dupA检测14例样本、c.683T>A检测2例样本、c.689C>T、c.863G>T、c.400G>A、c.463_464delAA、c.835-5T>G各检测1例样本，共检测21例样本(表10)。

表1021例样本检测结果

应当理解的是，前述对实施方式的描述仅是以实施例的方式给出，且本领域所属技术领域中具有通常知识者可进行各种修改。以上说明书、实施例及实验结果提供本发明之例示性实施方式之结构与用途的完整描述。虽然上文实施方式中揭露了本发明的各种具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (8)

1.一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含：

1)针对SMN1、SMN2基因拷贝数进行检测的引物，所述SMN1与SMN2基因拷贝数检测位点包括以下：SMN1外显子7、SMN1外显子8、SMN2外显子7、SMN2外显子8；

2)针对SMN1微小变异进行检测的引物，所述SMN1微小变异包含以下：c.22dupA、c.683T>A、c.689C>T、c.863G>T、c.400G>A、c.463_464delAA、c.835-5T>G；

3)针对SMN2修饰因子进行检测的引物，所述SMN2修饰因子包含以下：c.859G>C与c.835-44A>G；

4)针对5号染色体位于SMN1和SMN2基因附近的短串联重复序列位点进行检测的引物，所述短串联重复序列位点包含以下：D5S125、D5S629、D5S1414、D5S1408、D5S610、D5S112；

5)针对内控基因进行检测的引物，所述内控基因包含以下：CFTR、RPP30；

6)多重聚合酶连锁反应试剂。

2.根据权利要求1所述的一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒针对SMN1微小变异与SMN2修饰因子设置对应野生型检测引物，所述SMN1微小变异与SMN2修饰因子对应野生型包含以下：c.22A、c.683T、c.689C、c.863G、c.400G、c.463A、c.835-5T、c.859G与c.835-44A。

3.根据权利要求2所述的一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含的引物序列具体如SEQ ID NO.1～49所示。

4.根据权利要求3所述的一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒，其特征在于：所述引物至少包含一种以上的荧光基团，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、TMR、NED、PET、ROX中的任意一种。

5.权利要求1所述的试剂盒在制备检测SMA基因的产品中的应用。

6.一种非疾病诊断治疗目的的检测SMA遗传变异的方法，其特征在于：利用权利要求4所述试剂盒进行。

7.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测SMA遗传变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)于多重聚合酶连锁反应试剂中混合待测DNA样品及SEQ ID NO.1-49所示的引物；

2)将步骤1)得到的混合物进行聚合酶连锁反应，并对聚合酶连锁反应后的目的片段进行荧光标记毛细管电泳分析；

3)以GeneMapper软件将步骤2)产出的不同荧光与不同片段长度的扩增产物分开，并产生检测峰面积信息；

4)通过对各检测峰的面积判断，确认待测DNA样品是否发生SMA遗传变异。

8.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测SMA遗传变异的方法，其特征在于：所述SMA遗传变异包括待测DNA样品SMN1外显子7、SMN1外显子8、SMN2外显子7以及SMN2外显子8的拷贝数是否发生变异，以及待测DNA样品是否具有SMN1微小变异与SMN2修饰因子，以及待测DNA样品是否为SMN2+0基因型的SMA隐性携带者。

Images