CN111218506B - 一种smn1和smn2基因拷贝数的检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种SMN1和SMN2基因拷贝数的检测试剂盒。在一管PCR反应液中利用8种引物同时扩增SMN1第7外显子、SMN1第8外显子、SMN2第7外显子、SMN2第8外显子，同时以一组或两组以上的管家基因监控PCR反应效率，通过毛细管电泳分析PCR产物以SMN1与SMN2基因皆为2拷贝数的SMA正常对照进行计算，对SMN1、SMN2基因拷贝数进行相对定量的检测，计算出0、1、2、3、等于或大于4拷贝数的SMN1与SMN2基因，区分SMA患者、携带者或正常人。从DNA样本开始，3小时内可以出结果，只需要一次PCR实验即可检测出SMN1与SMN2基因拷贝数情况，检测技术流程简单，容易实现标准化。

Description

一种SMN1和SMN2基因拷贝数的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种SMN1和SMN2基因拷贝数的检测试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症（SMA）为一种脊髓前角运动神经元退化变性导致肌无力、肌萎缩和瘫痪的疾病，根据发病年龄及临床表现分为Ⅰ型（严重型）、Ⅱ型（中间型）、Ⅲ型（轻型）和Ⅳ型（成人型）。一般神经专科根据发病年龄、临床表现及病情进展程度进行临床诊断，辅助检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉活检，结合家族史和 SMN1 基因分析可进行确诊。SMA Ⅰ型为最严重的亚型，患者在出生后6个月内发病，一般生存期在2岁以内；SMA Ⅱ型为中度型，患者通常在6~18个月内发病，其生存期仰赖于外来健康支援照护，可存活至成年；SMAⅢ型为轻度型，患者由出生后18个月至成年都有可能发病，其病情进展较为缓慢，最终仍死于呼吸肌麻痹，SMA Ⅳ型为成人型，30岁后发病，症状轻微，生存期正常。
SMN基因（Survival motor neuron）位于染色体5q11.2~q13.3 上，全长约为27kb，含有9个外显子，分别为外显子1、2a、2b、3、4、5、6、7和8，人基因组有两个紧邻的高度同源的SMN 基因为SMN1基因（survival motor neuron gene 1，运动神经元存活基因1）与SMN2基因（survival motor neuron gene 2，运动神经元存活基因2），两基因序列上仅有5个碱基的差异，其中2个碱基位在第7、8外显子上，另3个碱基则位在内含子6、7中。SMNl 是主要功能基因，该基因突变可导致 SMA 发病。SMN2为临床表型的调节基因，影响病情的严重程度，其拷贝数增加可减轻SMA 表型。SMN1基因与SMN2基因的第7外显子上存有关键的碱基差异，导致SMN2表达的蛋白无法取代SMN1基因的作用。SMN蛋白广泛分布于全身组织，于脑部、脊髓与肌肉表达水评最高；当SMN基因缺失或突变时，会使得SMN蛋白的数目、结构与功能产生异常。当SMN蛋白数量低于运动神经元所需的最低含量时，就会导致运动神经元变性。95%以上SMA患者是由于SMN1 第7号外显子和/或的第8号外显子产生缺失或转换所致，其余5%SMA患者为SMN1点突变或其他外显子缺失导致。
目前已发展出许多方法用来进行SMA分子检测，聚合酶链反应─限制酶片段长度多态性(PCR-RFLP)、变性高效液相分析(DHPLC)、多重连接探针扩增(MLPA) 、高分辨熔解曲线(HRM)、实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time qPCR)等技术。
聚合酶链反应─限制性酶切片段长度多态性（PCR-restriction fragmentlength polymorphism, PCR-RFLP，分别对SMN1基因和SMN2基因的第7、8外显子进行PCR扩增，在第7外显子中，限制性内切酶Dra I消化PCR扩增产物，SMN1片段上无Dra I切位点，不能被切割；SMN2片段采用错配引物建构出Dra I位点，故能够被酶切消化。同理，在第8外显子中，由于SMN2片段存在限制性内切酶Dde I切位，使其酶切后产生两片段，而SMN1无此位点，因此无法切割。PCR-RFLP操作方法简便，结果清晰容易判读，为临床上常使用于SMN1基因为纯合缺失的检测方法，但缺点为可能因酶切未完全而造成假阴性的结果产生，同时这种方法只能检测出纯合缺失，无法确认杂合缺失。
变性高效液相分析(DHPLC)，将SMN1基因与SMN2基因的PCR扩增产物加入到DNASep色谱柱后，在适当的变性温度下，经过产物与缓冲液的作用，根据带有突变序列的异源双链与相应同源双链之间，不同序列的DNA同源双链之间柱保留时间的差异从而将SMN1基因、SMN2基因缺失突变与点突变区分出来。再通过计算SMN1基因与SMN2基因的比值实现基因拷贝数的相对定量，若没有加入对照组计算SMN1或SMN2的基因数，可能造成伪阳性的误判。
多重连接探针扩增(MLPA)，针对SMA相关基因设计多组探针，经探针与靶序列DNA进行杂交、连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析。多重连接探针扩增技术在杂合突变检测中更具优势，能够检测出已知的点突变及基因拷贝数的增加或减少，但其检测方法繁琐，需要两天的时间才能出结果。
高分辨率熔解曲线分析技术（High-resolution melting, HRM），SMN基因突变位点不匹配会导致双链DNA在升温过程中先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就能判断是否存有突变位点，不同的突变位点或杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形。该技术无需有序列特异性探针，且可对未知位点进行筛查，但该法多用于点突变及小片段缺失的检测。
实时荧光定量PCR技术（Real-Time qPCR），透过PCR反应中加入荧光基团，利用荧光讯号的累积实时监控整个PCR的过程，通过Log模板起始浓度与Cp值的线性关系对SMA相关基因拷贝数定量。校正单管反应中SMN1基与内标基因的表现量、SMN2基因与内标基因的表现量，再通过对照品标准化计算，实现基因拷贝数的相对定量。但检测结果伪阳性、伪阴性机会高，用于疾病诊断没问题，但对于携带者的检测稳定性不高，现行市面上无同时检测SMN1与SMN2的取证试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SMN1和SMN2基因拷贝数的检测方法与脊髓性肌萎缩症相关基因核酸检测试剂盒及其应用，在一管内实现SMN1和SMN2基因第7外显子与第8外显子的检测。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
一种SMN1和SMN2基因拷贝数的PCR扩增反应检测引物，利用8种不同引物在一管反应液中，进行PCR扩增反应，同时扩增SMN1、SMN2第7外显子与第8外显子区域；
其中第一引物为黏合SMN1与SMN2第7外显子差异位点上游区域的通用引物，同时第一引物5’端包含非人源性基因组序列SEQ ID NO.1；第二引物黏合SMN1与SMN2第7外显子的差异位点区域，特异性黏合SMN1第7外显子序列，同时第二引物5’端包含非人源性基因组序列SEQ ID NO.2；第三引物黏合SMN1与SMN2第7外显子的差异位点区域，特异性黏合SMN2第7外显子序列，同时第三引物5’端包含非人源性基因组序列SEQ ID NO.2；
第四引物为黏合SMN1与SMN2的第8外显子差异位点下游区域的通用引物，同时第四引物5’端包含与第一引物相同或部分相同的非人源性基因组序列SEQ1；第五引物黏合SMN1与SMN2第8外显子的差异位点区域，特异性黏合SMN1第8外显子序列，同时第五引物5’端包含非人源性基因组序列SEQ ID NO.2；第六引物黏合SMN1与SMN2第8外显子的差异位点区域，特异性黏合SMN2第8外显子序列，同时第六引物5’端包含非人源性基因组序列SEQ IDNO.2；
第七引物包含第一引物和第四引物的非人源基因组序列SEQ ID NO.1。第八引物包含第二引物、第三引物、第五引物和第六引物的非人源基因组序列SEQ ID NO.2，其中第八引物且具有荧光标记。
第二引物与第三引物的3’端末端碱基分别与SMN1和SMN2第7外显子的差异位点保持一致，同时第二引物与第三引物的3’端倒数第二个或第三个碱基引入错配碱基。
第五引物与第六引物的3’端末端碱基分别与SMN1和SMN2第8外显子的差异位点保持一致，同时第二引物与第三引物的3’端倒数第二个或第三个碱基引入错配碱基。
第二引物或第三引物其中一条引物5’端包含至少5个以上碱基的非人源基因组序列SEQ3。
第五引物或第六引物其中一条引物5’端包含至少5个以上碱基的非人源基因组序列SEQ ID NO.3。
在8种引物的PCR扩增反应中，包含一组或两组以上的管家基因引物对，选自GAPDH、ACTB、HBB、CFTR或RPP30。
管家基因的上游与下游引物5’端分别包含非人源性基因组序列SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2。
所述8种引物具体包含：
第一引物P1：TCGACGCACGCTCCTGCTACAGCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTG
第二引物P2：TGACCGTCTGCGCCTCGTTCACCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCGG
第三引物P3：TGACCGTCTGCGCCTCGTTCACTTCACCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTATA
第四引物P4：TCGACGCACGCTCCTGCTACAAGCCATGTCCACCAGTTAGATTC
第五引物P5：TGACCGTCTGCGCCTCGTTCAAACCATCTGTAAAAGACCGG
第六引物P6：TGACCGTCTGCGCCTCGTTCACTTCAAACCATCTGTAAAAGACGGA
第七引物P7：TCGACGCACGCTCCTGCTACA
第八引物P8：TGACCGTCTGCGCCTCGTTC
其中画单线部分为非人源性基因组，序列如SEQ ID NO.1所示，画双线部分为非人源性基因组序列如SEQ ID NO.2所示，加粗为非人源性基因组序列SEQ ID NO.3所示。
所述检测引物在制备脊髓性肌萎缩症相关基因核酸检测试剂盒中的应用，
检测使用待检的DNA样本；
所述脊髓性肌萎缩症相关基因SMN1和SMN2基因核酸检测试剂盒，组成成分包括SMA反应液、SMA引物混合液、DNA聚合酶、SMA正常对照、SMA空白对照；
所述SMA引物混合液中包含所述8种引物及一组或两组以上的管家基因引物对。
所述SMA反应液中包含增强剂，所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中的一种或多种；
所述SMA正常对照包含SMN1、SMN2、 ACTB、HBB基因皆为两拷贝数的质粒；
所述脊髓性肌萎缩症相关基因核酸检测试剂盒的PCR扩增反应的循环数为24-30循环；
将DNA待测样本使用脊髓性肌萎缩症相关基因SMN1和SMN2基因核酸检测试剂盒进行PCR扩增反应产生的PCR产物，以毛细管电泳仪进行片段大小的分析，以片段大小区分6个位点，包括SMN1 第7外显子、SMN1 第8外显子、SMN2 第7外显子、SMN2 第8外显子、ACTB、HBB，同时以SMA正常对照进行对比计算，检测出待测样本的SMN1与SMN2的拷贝数，能区分0、1、2、3、等于或大于4拷贝数的SMN1与SMN2基因。
本发明的特点在于：
（1）一管PCR扩增反应，检测SMN1和SMN2，区分SMA患者、携带者或正常人：在一管PCR反应液中可同时扩增SMN1 第7外显子、SMN1 第8外显子、SMN2 第7外显子、SMN2 第8外显子，同时以一组或两组以上的管家基因监控PCR反应效率，透过SMN1与SMN2基因皆为2拷贝数的SMA正常对照进行计算，对SMN1、SMN2基因拷贝数进行相对定量的检测，计算出0、1、2、3、等于或大于4拷贝数的SMN1与SMN2基因，区分SMA患者、携带者或正常人。
（2）合并两阶段扩增反应设计，增加扩增一致性：利用8种不同引物在一管反应液中，进行PCR扩增反应，同时扩增SMN1、SMN2第7外显子与第8外显子区域，包含原本两个阶段的PCR扩增反应。第一阶段扩增：第一引物分别跟第二引物和第三引物扩增出5’端带有非人源性基因组序列SEQ1、3’端带有非人源性基因组SEQ2的SMN1第7外显子与SMN2第7外显子的扩增产物；第四引物分别跟第五引物和第六引物扩增出5’端带有非人源性基因组序列SEQ1、3’端带有非人源性基因组SEQ2的SMN1第8外显子与SMN2第8外显子的扩增产物。第二阶段扩增：以第一阶段扩增出5’端带有非人源性基因组序列SEQ1、3’端带有非人源性基因组SEQ2的SMN2第7外显子、SMN2第7外显子、SMN1第8外显子与SMN2第8外显子的扩增产物为模板，以第七引物和第八引物进行第二次扩增。以特殊的多重引物设计搭配非人源性基因组序列，解决多重PCR定量系统，扩增一致性问题，提高拷贝数相对定量的准确度。
（3）透过错配碱基引物设计，区分SMN1和SMN2，提高检测特异性：第二引物与第三引物的3’端末端碱基分别与SMN1和SMN2第7外显子的差异位点保持一致，同时第二引物与第三引物的3’端倒数第二个或第三个碱基引入错配碱基，能区分SMN1和SMN2第7外显子的PCR的扩增产物；第五引物与第六引物的3’端末端碱基分别与SMN1和SMN2第8外显子的差异位点保持一致，同时第二引物与第三引物的3’端倒数第二个或第三个碱基引入错配碱基，能区分SMN1和SMN2第8外显子的PCR的扩增产物。
（4）临床表型预测：SMN2为临床表型的调节基因，影响病情的严重程度，其拷贝数增加可减轻SMA 表型症状。在SMN1为0拷贝数的患者，可透过SMN2拷贝数结果，区分临床表型，预估SMA发病年龄与疾病的严重程度。
（5）透SMN1与SMN2在第7外显子与第8外显子的总拷贝数，增加SMN1与SMN2拷贝数检测的可靠性：在SMN1与SMN2在第7外显子、第8外显子的SMN1+SMN2的总拷贝数应一致，若发现总拷贝数不一致情况，可能为PCR扩增问题，可重复检测确认，增加SMN1与SMN2拷贝数检测的可靠性。
（6）检测灵敏度高，操作简便：与SMA分子诊断的金标准MLPA相比，只需要一次PCR实验，一管反应液，进行毛细管电泳分析，即可检测出SMN1和SMN2的各自拷贝数，从DNA样本开始，3小时内可以出结果，检测技术流程简单，容易实现标准化，同时DNA加样量为10-120ng，灵敏度高，样本浓度低至5ng/ul，依旧能准确检测出SMN基因的拷贝数。
附图说明
图1为引物设计示意图。
图2为SMA正常对照结果图(SMN1:SMN2为2:2)。
图3为SMA患者样本结果图(SMN1:SMN2为0:2)。
图4为SMA携带型样本结果图(SMN1:SMN2为1:3)。
图5为SMA正常型样本结果图(SMN1:SMN2为3:2)。
具体实施方式
实施例1
1、SMA反应液与SMA引物混合液配制
表1 SMA反应液组份配制表
Figure 59425DEST_PATH_IMAGE001
表2 SMA引物混合液组份配制表
Figure 407230DEST_PATH_IMAGE002
* ACTB上游引物序列：
TGACCGTCTGCGCCTCGTTCCATGTACGTTGCTATCCAGGC，
ACTB下游引物序列：
TCGACGCACGCTCCTGCTACAGCTCATTGCCAATGGTGATGAC，
HBB上游引物序列：
TGACCGTCTGCGCCTCGTTCACACAACTGTGTTCACTAGC，
HBB下游引物序列：
TCGACGCACGCTCCTGCTACATGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG。
实施例2 PCR扩增与结果分析
1、样本处理：核酸提取仪(MagCore)以及核酸提取试剂盒(MagCore Genomic DNAWholeBlood Kit) 提取人类基因组DNA用于后续的PCR反应，DNA浓度为2.5ng/uL~60ng/uL，OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间。
2、扩增试剂配制：
（1）从试剂盒取出SMA反应液、SMA引物混合液，于室温解冻，上下颠倒混匀后，用微量离心机短暂离心，使所有液体沉降于管底。
（2）扩增试剂配制：按下表3配制扩增试剂
表3 扩增试剂配制表
Figure 940980DEST_PATH_IMAGE003
* 为了减少分液误差，建议在配制扩增试剂时根据样本数量（n）分别取（n+1）人份的反应液和混合酶。n=待测样本数+ SMA正常对照1份 + SMA空白对照1份。
（3）将配制好的试剂用震荡器震荡均匀，用微量离心机短暂离心，使液体沉降于管底。
（4）在PCR反应管中分别加入18μL配制好的扩增试剂，转移到样本处理区加样。
3、加样：在对应的含有18μL 的扩增试剂的PCR反应管中分别加入2μL待测样本基因组DNA、SMA正常对照及SMA空白对照，盖上PCR反应管盖后，短暂离心。
4、PCR扩增与毛细管电泳仪分析：
（1）将PCR反应管放入PCR仪按表4方法设定反应程序，反应体积设定：20μL；
表4 扩增反应程序
Figure 261103DEST_PATH_IMAGE004
（2）毛细管电泳分析PCR扩增产物：采用ABI3130、ABI3730、ABI3500Dx、或ABISeqStudio Genetic Analyzer毛细管基因分析仪进行检测，取0.5uL PCR扩增产物、0.5uL500 LIZ Size Standard、9uL Hi-Di Formamide，混匀后95℃变性 3min，立即放冰上2min，上机检测。
5、软件分析：
反应程序结束后，以GeneMapper软件对PCR扩增产物进行片段大小分析，分析所需的Analysis Method、Panel与Size Standard文件可从公司网站下载，数据导入、分析参数设置和结果分析具体信息请参见GeneMapper用户手册。
6、检测峰比值计算：待测样本与SMA正常对照的SMN1第7外显子、SMN1第8外显子、SMN2第7外显子、SMN2第8外显子的检测锋面积分别除以管家基因面积总合，再以待测样本除以SMA正常对照各位点对应的值，即为各位点的检测峰比值。
7、结果判读：
（1）SMN检测峰比值按下表进行拷贝数判读
Figure 493544DEST_PATH_IMAGE005
（2）若检测锋比值落于检测峰比值范围外，或者SMN1 与SMN2第7外显子、SMN1 与SMN2第8外显子的SMN1+SMN2的总拷贝数不一致，需要重新检测，检测结果按上表判读。
实施例3 试剂性能验证
1、SMA正常对照制备
将2拷贝数的SMN1第7外显子质粒、2拷贝数的SMN2第7外显子质粒、2拷贝数的SMN1第8外显子质粒、2拷贝数的SMN2第8外显子质粒、2拷贝数的ACTB质粒、2拷贝数的HBB质粒，分别以等比例混合，终浓度为14500拷贝/μL。
2、缺失参考品符合率
检测4份缺失参考品，如下表，分别检测高、中、低浓度，浓度分别为60 ng/uL、25ng/uL、5 ng/uL，各浓度进行三重复测试，检测三批试剂，检测结果阳性符合率为100%。
表5 缺失参考品SMN1和SMN2的第7外显子和第8外显子基因拷贝数
Figure 531907DEST_PATH_IMAGE006
3、携带参考品符合率
检测5份缺失参考品，如下表，分别检测高、中、低浓度，浓度分别为60 ng/uL、25ng/uL、5 ng/uL，各浓度进行三重复测试，检测三批试剂，检测结果阳性符合率为100%。
表6 携带参考品SMN1和SMN2的第7外显子和第8外显子基因拷贝数
Figure 603768DEST_PATH_IMAGE007
4、正常参考品符合率
检测12份缺失参考品，如下表，分别检测高、中、低浓度，浓度分别为60 ng/uL、25ng/uL、5ng/uL，各浓度进行三重复测试，检测三批试剂，检测结果阳性符合率为100%。
表7 正常参考品SMN1和SMN2的第7外显子和第8外显子基因拷贝数
Figure 778398DEST_PATH_IMAGE008
5.重复性
检测3份重复性参考品，SMN1：SMN2在第7外显子与第8外显子的拷贝数，分别为1：0、0：1、2：2，浓度分别为25ng/uL、5 ng/uL，各浓度进行十重复检测，检测三批试剂，拷贝数判断皆正确，检测结果皆符合。
表8 重复性参考品SMN1和SMN2的第7外显子和第8外显子基因拷贝数
Figure 910302DEST_PATH_IMAGE009
5、最低检测限
检测21份检测限参考品，如下表，浓度分别稀释至15ng/µL、10ng/µL、5ng/µL，各进行20重复测试，检测三批试剂，检测结果重复数皆符合要求。
表9 检测限参考品SMN1和SMN2的第7外显子和第8外显子基因拷贝数
Figure 435961DEST_PATH_IMAGE010
实施例4
1.收集143例脊髓性肌萎缩症产前筛查的EDTA抗凝全血样本，采用荷兰MRC-Holland公司研制的SALSA® MLPA® Probemix P021-B1 SMA 作为参比方法，验证结果之间的一致性。
2.收集EDTA抗凝全血样本采用核酸提取仪(MagCore)以及核酸提取试剂盒(MagCore Genomic DNA WholeBlood Kit)提取人类基因组DNA，用微量分光亮度计检测DNA的浓度与纯度，120例样本浓度为2.5ng/uL-60ng/uL，OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间。
3. 按照实施例2的步骤，进行DNA加样，以PCR仪进行反应，
4.按实施例2的步骤，进行结果分析，结果如下表，皆符合拷贝数要求，其中SMA患者检测15例样本、SMA携带型检测20例样本、SMA正常型检测108例样本，共检测142例样本（表10）。
表10 143例样本检测结果
Figure 311513DEST_PATH_IMAGE011
Figure 606228DEST_PATH_IMAGE012
Figure 440192DEST_PATH_IMAGE013
Figure 921989DEST_PATH_IMAGE014
Figure 601232DEST_PATH_IMAGE015
Figure 750454DEST_PATH_IMAGE016
Figure 224160DEST_PATH_IMAGE017
Figure 458833DEST_PATH_IMAGE018
Figure 410608DEST_PATH_IMAGE019
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 胜亚生物科技(厦门)有限公司
<120> 一种SMN1和SMN2基因拷贝数的检测试剂盒
<130> 15
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgacgcacg ctcctgctac a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgaccgtctg cgcctcgttc 20
<210> 3
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acttc 5
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcgacgcacg ctcctgctac agcagcctaa taattgtttt ctttggg 47
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgaccgtctg cgcctcgttc ccttccttct ttttgatttt gtcgg 45
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgaccgtctg cgcctcgttc acttcacctt ccttcttttt gattttgtat a 51
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcgacgcacg ctcctgctac aagccatgtc caccagttag attc 44
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgaccgtctg cgcctcgttc aaaccatctg taaaagaccg g 41
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgaccgtctg cgcctcgttc acttcaaacc atctgtaaaa gacgga 46
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcgacgcacg ctcctgctac a 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgaccgtctg cgcctcgttc 20
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgaccgtctg cgcctcgttc catgtacgtt gctatccagg c 41
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcgacgcacg ctcctgctac agctcattgc caatggtgat gac 43
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgaccgtctg cgcctcgttc acacaactgt gttcactagc 40
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tcgacgcacg ctcctgctac atggtctcct taaacctgtc ttg 43

Claims (10)

1.一种SMN1和SMN2基因拷贝数的PCR扩增反应检测引物，其特征在于：所述引物包含8种不同的引物，
其中第一引物为黏合SMN1与SMN2第7外显子差异位点上游区域的通用引物，同时第一引物5’端包含非人源性基因组序列SEQ ID NO.1；第二引物黏合SMN1与SMN2第7外显子的差异位点区域，特异性黏合SMN1第7外显子序列，同时第二引物5’端包含非人源性基因组序列SEQ ID NO.2；第三引物黏合SMN1与SMN2第7外显子的差异位点区域，特异性黏合SMN2第7外显子序列，同时第三引物5’端包含非人源性基因组序列SEQ ID NO.2；
第四引物为黏合SMN1与SMN2的第8外显子差异位点下游区域的通用引物，同时第四引物5’端包含与第一引物相同或部分相同的非人源性基因组序列SEQ ID NO.1；第五引物黏合SMN1与SMN2第8外显子的差异位点区域，特异性黏合SMN1第8外显子序列，同时第五引物5’端包含非人源性基因组序列SEQ ID NO.2；第六引物黏合SMN1与SMN2第8外显子的差异位点区域，特异性黏合SMN2第8外显子序列，同时第六引物5’端包含非人源性基因组序列SEQID NO.2；
第七引物包含第一引物和第四引物的非人源基因组序列SEQ ID NO.1，第八引物包含第二引物、第三引物、第五引物和第六引物的非人源基因组序列SEQ ID NO.2，其中第八引物且具有荧光标记。
2.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：第二引物与第三引物的3’端末端碱基分别与SMN1和SMN2第7外显子的差异位点保持一致，同时第二引物与第三引物的3’端倒数第二个或第三个碱基引入错配碱基。
3.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：第五引物与第六引物的3’端末端碱基分别与SMN1和SMN2第8外显子的差异位点保持一致，同时第二引物与第三引物的3’端倒数第二个或第三个碱基引入错配碱基。
4.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：第二引物或第三引物其中一条引物5’端包含至少5个以上碱基的非人源基因组序列SEQ ID NO.3。
5.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：第五引物或第六引物其中一条引物5’端包含至少5个以上碱基的非人源基因组序列SEQ ID NO.3。
6.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：在8种引物的PCR扩增反应中，还包含一组或两组以上的管家基因引物对，选自GAPDH、ACTB、HBB、CFTR或RPP30 。
7.根据权利要求6所述的检测引物，其特征在于：管家基因的上游与下游引物5’端分别包含非人源性基因组序列SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2。
8.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：所述引物包含：
第一引物P1：TCGACGCACGCTCCTGCTACAGCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGG；
第二引物P2：TGACCGTCTGCGCCTCGTTCCCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCGG；
第三引物P3：TGACCGTCTGCGCCTCGTTCACTTCACCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTATA ；
第四引物P4：TCGACGCACGCTCCTGCTACAAGCCATGTCCACCAGTTAGATTC；
第五引物P5：TGACCGTCTGCGCCTCGTTCAAACCATCTGTAAAAGACCGG；
第六引物P6：TGACCGTCTGCGCCTCGTTCACTTCAAACCATCTGTAAAAGACGGA；
第七引物P7：TCGACGCACGCTCCTGCTACA；
第八引物P8：TGACCGTCTGCGCCTCGTTC；
其中非人源性基因组序列SEQ ID NO.1为TCGACGCACGCTCCTGCTACA，非人源性基因组序列SEQ ID NO.2为TGACCGTCTGCGCCTCGTTC，非人源性基因组序列SEQ ID NO.3为ACTTC。
9.一种包含SMN1和SMN2基因拷贝数的PCR扩增反应检测引物在制备脊髓性肌萎缩症相关基因核酸检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述检测试剂盒，组成成分包括SMA反应液、SMA引物混合液、DNA聚合酶、SMA正常对照、SMA空白对照；
所述SMA引物混合液中包含权利要求1与6所述的引物组合获得；
所述SMA反应液中包含增强剂，所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中的一种或多种；
所述SMA正常对照包含SMN1、SMN2、 ACTB、HBB基因皆为两拷贝数的质粒。
10.如权利要求9所述的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：利用8种不同引物在一管反应液中，进行PCR扩增反应，同时扩增SMN1、SMN2第7外显子与第8外显子区域；PCR扩增反应的循环数为24-30循环；将DNA待测样本使用所述检测试剂盒进行PCR扩增反应产生的PCR产物，以毛细管电泳仪进行片段大小的分析，以片段大小区分6个位点，包括SMN1 第7外显子、SMN1 第8外显子、SMN2 第7外显子、SMN2 第8外显子、ACTB、HBB，同时以SMA正常对照进行对比计算，检测出待测样本的SMN1与SMN2的拷贝数，能区分0、1、2、3、等于或大于4拷贝数的SMN1与SMN2基因。
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