CN111118141A - 一种用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（g6pd）基因突变检测的引物序列及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症相关致病突变的引物序列及试剂盒。试剂盒包括5对扩增引物，能特异地扩增G6PD缺乏症相关G6PD基因16个常见突变位点区域；16条单碱基延伸引物，用于检测G6PD基因16个突变位点基因型；另外包括预处理及检测专用试剂。本发明所述试剂盒可实现1孔检测临床G6PD缺乏症致病相关常见16种突变，灵敏度高、特异性强、准确性高，并且操作简便、低成本、高通量，检测快速，结果自动判读，易于临床推广应用。本发明可应用于产前诊断或新生儿遗传病筛查检测，为G6PD缺乏症携带者或患者的快速检测提供一种可靠的检测试剂。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)平台的用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因突变检测的引物序列及试剂盒。
背景技术
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(glucose-6-phosphate dehydrogenasedeficiency,G6PDd)是因调控葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PD)基因突变导致其G6PD活性降低所致，属伴X连锁不完全显性遗传病。其发病常由误食蚕豆而诱发，故又称“蚕豆病”。患者在感染、氧化应激、食物或药物诱发等情况下，可发生急性溶血性贫血、高胆红素血症，严重者可致核黄疸，甚至危及生命。本病重在预防，通过新生儿疾病筛查及时发现G6PDd患者。避免接触食物、药物等诱发因素，是对该病进行预防的主要措施。全世界约2亿人罹患此病，中国是本病的高发区之一，在海南、广东、广西、云南、贵州、四川等我国南方地区高发,呈南高北低的分布特点，且男性发病率高于女性，患病率为0.2-44.8％。
G6PDd的致病原因是G6PD基因突变，G6PD基因位于Xq28，长约20kb，包含13个外显子，编码515个氨基酸的蛋白酶，起始密码子位于第2外显子，第1外显子不参与翻译。目前已报道的致病性突变有214种。而不同的基因突变类型，可以导致G6PD结构不一样，酶活性有差异，即使G6PD基因没有功能缺失，也有可能存在不同程度缺乏。
G6PDd男性多于女性，因为男性只有一条X染色体,一旦这唯一的染色体G6PD基因功能缺失,则表现为G6PD重度缺乏；女性有两条X染色体,如果仅有1条X染色体G6PD基因功能缺失,则为杂合子,表现为中度缺乏,两条X染色体均缺失G6PD基因才表现为重度缺乏。
将G6PD缺乏症的致病性变异分为I-IV类：I类致病性变异导致酶活性严重缺乏，伴先天性非球形细胞溶血性贫血，主要位于外显子6、10和13，这些致病性变异所编码的氨基酸多位于底物结合区、NADP+辅酶结合区等重要结构域；II类致病性变异导致酶活性严重缺乏；III类致病性变异导致酶活性轻中度缺乏；IV类致病性变异导致酶活性轻度降低或正常(主要为外显子5和9的致病性变异)。大部分导致G6PD缺乏症的致病性变异属于I、II、III类，极少数为IV类。
G6PD缺乏症的临床表现与一般溶血性贫血大致相同。分新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血、非球形细胞溶血性贫血等临床类型。多数患者症状较轻，特别是女性杂合子，平时不发病，无自觉症状，部分患者可表现为慢性溶血性贫血症状。常因食用蚕豆、服用或接触某些药物、感染等诱发血红蛋白尿、黄疸、贫血等急性溶血反应。但少数患者因G6PD缺乏诱发的严重的急性溶血性贫血。因红细胞破坏过多，如不及时处理，可引起肝、肾、或心功能衰竭，甚至死亡。G6PD缺乏症是新生儿病理性黄疸的主要原因,患G6PD缺乏症的新生儿中，约50％的患儿会出现新生儿黄疸，其中约12％可发展为核黄疸，导致脑部损害，引起智力低下。
G6PDd的及早诊断和预防是我国优生优育工作的一个重要组成部分。因此，我国多个省份已开始对育龄夫妇G6PD进行筛查，并将G6PDd列入新生儿疾病筛查常规项目。
目前国内外对G6PDd患者的筛查方法主要有高铁血红蛋白还原试验、硝基四氮唑蓝纸片试验、G6PD缺陷变性珠蛋白小体试验及基因诊断等。酶学检测对女性杂合子诊断困难，因其酶活性变化范围很大，需根据经验设定合理酶活阈值，这也是G6PD缺乏症目前实验室漏检的主要原因。而且，这些生化检测的方法耗时长且繁琐，结果容易受样本取样、运输、保存、检测、温度、环节等各个环节影响，而且仅适用与已经出生的婴儿，对产前诊断无能为力。
2019年最新的“新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查与诊断实验室检测技术专家共识”中指出，基因诊断是可靠的确诊方法，推荐有条件的实验室开展基因诊断；并总结，已报道的中国人群突变类型有40余种，其中c.1376G>T、c.1388G>A、c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T五种突变类型占约95％；c.392G>T、c.487G>A、c.517T>C、c.592OT.c.1004C>A五种突变类型占约3.5％，均为单碱基突变；其他类型偶发。
目前，用于G6PD基因突变检测的方法和产品主要有荧光定量熔解曲线法、反向点杂交法、Sanger测序法、高通量测序法。荧光定量结合溶解曲线法单孔检测通量有限，只能检测少数位点已知突变，每个位点的每种突变基因型均需设计特异引物；覆盖常见位点需要多孔并且每孔进行多重检测，多重探针设计要求高，技术难度大，检测探针成本高昂，结果判读手工操作，易错判；反向点杂交法体系每个位点每一种基因型均需设计探针，成本高昂，分辨率取决于探针有效性，容易有非特异性，且检测流程长，操作复杂，体系开放，样本间极易污染；Sanger测序法是序列金标准，但是流程长，操作复杂，且需要手工判读每一个位点，覆盖常见位点需要多孔检测，成本高，通量低；高通量测序法虽然可一次检测覆盖G6PD所有致病性位点，但其仪器和检测试剂成本高昂，检测样本数量少的时候会造成浪费，导致成本更高，且体系所需核酸样本量高(50ng以上)，新生儿足跟血样本量少，浓度低，经常需要进行多个项目的筛查检测，因此很难获得足够的核酸模板；高通量测序检测流程长达3-5天，操作复杂，且需要专业的生信分析人员分析数据，结果判读困难，因此无法作为筛查项目在全国各级地方中小医院大规模推广应用。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Time-of-flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有对应关系，并以质/荷比计算分子量。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测，最后根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。MALDI-TOF质谱很适合用于对蛋白质、多肽和多糖、核酸等生物大分子的研究。因其具有测定质量范围宽、灵敏度高、速度快、精确度高及对盐的耐受性较好等优点，已广泛应用于蛋白质及多肽的分子量和序列测定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种针对父母和新生儿G6PDd携带者和患者的筛查方案，首先，G6PD基因致病性变异(突变)位点尽可能全，至少覆盖所有最新数据库、指南或专家共识中汇总统计而得的中国人群高发的致病性突变类型；其次，结果要准确可靠、灵敏度高、特异性强，所需模板量尽可能少，满足新生儿少量足跟血干血片筛查检测；另外，操作需简便快捷、结果判读简单客观，不易出错，且通量高、成本低廉，对样本个数要求低，可随到随检，适宜全国不同地区各级医院大规模推广。这样，各级地方医院可以及时方便地开展G6PD基因突变检测，尽可能多的覆盖育龄父母或新生儿人群进行G6PDd筛查诊断，尽早了解其是否为G6PD缺乏症的患者或者携带者，从而可以指导临床给出合理的建议，避免使用可能引起溶血的药物或食物，进而预防和降低新生儿期黄疸，特别是核黄疸的发生率。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一组用于G6PD基因致病性突变区域扩增的引物序列，包括如下表所示引物：
本发明提供第二种技术方案：一组用于G6PD基因常见致病性突变位点的单碱基延伸检测的引物序列，包括如下表所示引物：
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') | 检测位点 |
| SEQ ID NO：11 | tCGGGCTCCCAGCAGA | c.487G>A |
| SEQ ID NO：12 | attccGCAGGTCCCTCCCGA | c.517T>C |
| SEQ ID NO：13 | TtCCGTGAGGACCAGATCTAC | c.592C>T |
| SEQ ID NO：14 | tACGGCTGCAAAAGTG | c.1004C>A |
| SEQ ID NO：15 | tTGGCTTTCTCTCAGGTCAAG | c.871G>A |
| SEQ ID NO：16 | CTCACCTCTCATTCTCCACATAGA | c.1024C>T |
| SEQ ID NO：17 | tAGCAGTGGGGTGAAAATA | c.1388G>A |
| SEQ ID NO：18 | ttcatCCTCAGCGACGAGCTCC | c.1376G>T |
| SEQ ID NO：19 | cctATGCCCTCCACCTGG | c.392G>T |
| SEQ ID NO：20 | gtCCATCAGTCGGATACAC | c.95A>G |
| SEQ ID NO：21 | agtGCCACATGAATGCCC | c.383T>C |
| SEQ ID NO：22 | atAGCCAGATGCACTTCGTG | c.1360C>T |
| SEQ ID NO：23 | tGCTCCCTGACGCCTA | c.1311T>C |
| SEQ ID NO：24 | atGACGAGCTCCGTGAG | c.1381G>A |
| SEQ ID NO：25 | tCTCCACGATGATGCGGT | c.493A>G |
| SEQ ID NO：26 | actGCAGTGGGGTGAAAATAC | c.1387C>T |
上述8种核酸序列在一次1孔检测中使用。
本发明的第三种技术方案为：一种用于检测G6PD基因常见致病性突变的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂：包括如下主要组分
(2)扩增反应引物预混合液：所述权利要求1中的SEQ ID NO：1～10所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度为0.3～3μM；
(3)单碱基延伸反应引物预混合液：所述权利要求2中的SEQ ID NO：11～26所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度介于5～30μM；
(4)除盐树脂：包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末；
(5)检测芯片：包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片；
(6)纯突变对照：包含16个位点突变阳性的人G6PD基因对应片段质粒水溶液，浓度大于500拷贝/μL。
(7)杂合对照：包含16个位点突变阳性的人G6PD基因对应片段质粒、野生型人基因组(gDNA)的混合水溶液，突变型质粒和野生型人gDNA拷贝浓度相等，浓度大于500拷贝/μL。
(8)纯野生对照：包含野生型人gDNA的水溶液，G6PD基因浓度大于500拷贝/μL。
作为优选，所述扩增反应引物预混合液具体为，所述权利要求1中的SEQ ID NO：1～10所示的引物的混合液，各引物等比例混合，最终摩尔浓度浓度均为0.5μM。
进一步地，SEQ ID NO：1～6所示引物浓度0.5μM，SEQ ID NO：7～8所示引物浓度1μM，SEQ ID NO：9～10所示引物浓度2μM。
作为又一优选，所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为，各延伸引物摩尔浓度比值如下：SEQ ID No.11﹕SEQ ID No.12﹕SEQ ID No.13﹕SEQ ID No.14﹕SEQ ID No.15﹕SEQID No.16﹕SEQ ID No.17﹕SEQ ID No.18﹕SEQ IDNo.19﹕SEQ ID No.20﹕SEQ ID No.21﹕SEQID No.22﹕SEQ ID No.23﹕SEQ ID No.24﹕SEQ ID No.25﹕SEQ ID No.26＝6.42﹕8.44﹕9.05﹕6.54﹕9.04﹕10.12﹕8.33﹕9.38﹕7.36﹕8.05﹕7.53﹕8.61﹕6.27﹕7.12﹕7.57﹕9.22。
进一步地，各延伸引物摩尔浓度比值如下：SEQ ID No.11﹕SEQ ID No.12﹕SEQ IDNo.13﹕SEQ ID No.14﹕SEQ ID No.15﹕SEQ ID No.16﹕SEQ ID No.17﹕SEQ ID No.18﹕SEQIDNo.19﹕SEQ ID No.20﹕SEQ ID No.21﹕SEQ ID No.22﹕SEQ ID No.23﹕SEQ ID No.24﹕SEQID No.25﹕SEQ ID No.26＝6.42﹕8.44﹕13.58﹕6.54﹕9.04﹕20.24﹕8.33﹕14.07﹕7.36﹕8.05﹕7.53﹕8.61﹕6.27﹕7.12﹕7.57﹕18.44。
有益效果：
(1)本发明提供了一种检测G6PD基因致病性突变的引物组合和突变检测试剂盒，优化的体系和试剂灵敏度高，特异性强，可检测低至0.01ng/μL的人gDNA核酸样本(约5-6个拷贝)，可节约珍贵的新生儿血样；准确性达100％；配套一体化检测平台，操作简便快速，结果分析容易，通量高，成本低，具有比现有基于QPCR、反向点杂交或NGS方法学的相关产品更优异的性能，实用性也非常突出，尤其适宜在全国范围的各级医院推广应用，方便快速地开展G6PDd患者和携带者的筛查诊断，指导临床治疗，进而预防和降低新生儿期黄疸，特别是核黄疸的发生率，提升我国优生优育工作水平。
(2)本发明参考全球共享的SNP数据库NCBI dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)、国际千人基因组SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)以及中国国内相关指南，选取具有明确致病临床意义和中国人群高发的G6PDd相关致病性基因突变位点，经过多次筛选和优化扩增引物和单碱基延伸引物组合后，16个位点可实现1孔检测；经过多次优化完善的预处理试剂，多种组分实现预混配制，并已获得国家医疗器械备案，大大简化了临床应用时操作人员进行体系配制和后续检测的难度，显著提升了微量体系配制和检测的稳定性和重复性，易于操作，有效降低使用门槛和上手难度；一体化仪器自动检测和分析结果，输出文件可直接导入lims报告系统，结果分析和发布简单客观，不易出错；全流程6-7h内完成384个样本检测，检测通量高，易于大规模推广应用。
(3)配套一体化检测平台，操作简便快速，自动检测和分析结果，结果文件可直接导入lims报告系统，结果分析和发布简单客观，不易出错；通量高，成本低廉，实用性非常突出，临床应用前景广阔，尤其适宜在全国范围大规模推广应用，满足不同经济水平的各级医院方便快速地开展G6PDd患者和携带者或新生儿的筛查诊断，指导临床治疗，进而预防和降低新生儿期黄疸，特别是核黄疸的发生率，提升我国优生优育工作水平。
附图说明
图1为纯突变对照品检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面，软件依据各孔的16位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示16位点均为纯突变型。
图2为杂合突变对照品检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面，软件依据各孔的16位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示16位点均为杂合型。
图3为纯野生型对照品检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面，软件依据各孔的16位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示16位点均为野生型。
图4为1例临床样本(1号)检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面，软件依据各孔的16位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示16个位点均为野生型。
图5为1例临床样本(2号)检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面，软件依据各孔的16位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示c.1311C>T位点为杂合突变，其他位点均为野生型。
图6为1次优化实验测试结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面，软件依据各孔的16位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示c.1381G>A(rs782608284)和c.1387C>T(rs1557229502)两个位点检测失败，其他位点均正常读出结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制本发明。
实施例1：检测G6PD基因突变的引物由上海百力格生物技术有限公司合成，序列如下：扩增引物：
单碱基延伸引物：
实施例2：检测G6PD基因常见致病性突变的突变型质粒由上海生工生物工程有限公司合成，共3个突变型质粒(pUC57克隆质粒+插入序列)，覆盖99％以上中国人群常见G6PDd致病性突变发生率，具体如下表：
注：*对应突变位点SNP号、通用名及突变频率数据来源于全球共享的SNP数据库NCBI dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)、国际千人基因组SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)、文献以及中国国内相关指南报道。
实施例3：G6PD基因常见致病性突变检测试剂盒的制备。
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂，包括如下主要组分：
(2)扩增反应引物预混合液：所述SEQ ID NO：1～10所示的核苷酸序列的混合液；其中SEQ ID NO：1～6所示引物浓度0.5μM，SEQ ID NO：7～8所示引物浓度1μM，SEQ ID NO：9～10所示引物浓度2μM；
(3)单碱基延伸反应引物预混合液：所述权利要求2中的SEQ ID NO：11～26所示的核苷酸序列的混合液，各延伸引物摩尔浓度如下：SEQ ID No.11﹕SEQ ID No.12﹕SEQ IDNo.13﹕SEQ ID No.14﹕SEQ ID No.15﹕SEQ ID No.16﹕SEQ ID No.17﹕SEQ ID No.18﹕SEQIDNo.19﹕SEQ ID No.20﹕SEQ ID No.21﹕SEQ ID No.22﹕SEQ ID No.23﹕SEQ ID No.24﹕SEQID No.25﹕SEQ ID No.26＝6.42﹕8.44﹕13.58﹕6.54﹕9.04﹕20.24﹕8.33﹕14.07﹕7.36﹕8.05﹕7.53﹕8.61﹕6.27﹕7.12﹕7.57﹕18.44；
(4)除盐树脂：包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末；
(5)检测芯片：包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片。
(6)纯突变对照品：包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的16个位点突变型人G6PD基因对应片段质粒水溶液，浓度大于500拷贝/μL。
(7)杂合对照品：包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的16个位点突变型人G6PD基因对应片段质粒、野生型人基因组(gDNA)的混合水溶液，突变型质粒和野生型人gDNA拷贝浓度相等，浓度大于500拷贝/μL。
(8)纯野生对照品：包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的野生型人gDNA的水溶液，G6PD基因浓度大于500拷贝/μL。
实施例3：临床样本G6PD基因常见致病性突变位点检测方法。
仪器：Qubit 2.0荧光计(美国，ThermoFisher公司)，Mastercycler X50h 384孔快速定性PCR仪(德国，Eppendorf公司)，Mastercycler ProS 96孔快速定性PCR仪(德国，Eppendorf公司)，BECKMAN
22R台式微量冷冻离心机，WH-866型涡旋振荡器(太仓华利达)，低速板式离心机(安徽中佳)、恒温振荡器(杭州奥盛)。
1.人gDNA核酸模板的制备：成人外周血样本采用全血DNA抽提试剂盒(迪谱诊断，货号：20020100)，新生儿足跟血干血片样本采用微量DNA提取试剂盒(新景生物，货号：3102050)，按照试剂盒说明书操作。抽提完成后用Qubit 2.0荧光计测定核酸浓度，立即检测或-20℃保存备用。
2.利用1组优化的扩增引物和1组优化的单碱基延伸引物进行G6PD基因常见致病性突变位点的检测，具体包括如下步骤；
(1)PCR试剂配制(试剂准备区)：
从试剂盒中取出T-PCR反应混合液和PCR酶混合液，分别在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下：
| 试剂 | T-PCR反应混合液 | PCR酶混合液 | PCR扩增引物预混合液 |
| 用量 | 1.67μL | 0.33μL | 1μL |
计算上述各试剂的使用量，充分混匀后，按3μL量分装到PCR反应管或384孔PCR板中，转移至样本处理区。
(2)上样(样本处理区)：
分别加入2μL样品DNA溶液，盖紧反应管或384孔PCR板，转移至检测区。
(3)PCR扩增(核酸扩增区)：
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增：
*注：PCR产物暂时不进行下一步实验操作，可4℃保存过夜。
(4)SAP试剂配制(试剂准备区)：
从试剂盒中取出SAP反应混合液和SAP酶混合液，分别在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下：
| 试剂 | SAP反应混合液 | SAP酶混合液 |
| 用量 | 1.70μL | 0.30μL |
(5)加样(核酸扩增区)：
向3的PCR产物中分别加入2μL的上述SAP反应液，盖紧反应管或384孔PCR板。
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上,按以下程序进行SAP消化：
*注：SAP产物应立即进行下一步操作，不建议放置4℃过夜。
(6)延伸试剂配制(试剂准备区)：
从试剂盒中取出T-延伸反应混合液和延伸酶混合液，在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下：
| 试剂 | T-延伸反应混合液 | 延伸酶混合液 | 单碱基延伸引物预混合液 |
| 用量 | 0.72μL | 0.34μL | 0.94 |
(7)加样(核酸扩增区)：
按一定顺序向6的SAP产物中分别加入2μL的上述延伸反应液，盖紧反应管或384孔PCR板。
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上,按以下程序进行延伸扩增：
*注：延伸产物暂不进行下一步实验操作，可4℃保存过夜。
(8)使用DP-TOF飞行时间质谱检测系统进行质谱检测(扩增分析区)：
按照DP-TOF核酸质谱仪操作说明书进行标准操作，选择所需检测样本对应芯片及孔号，仪器自动进行样本延伸产物除盐、芯片点样和检测，并自动对结果进行分析。
(9)将质谱仪分析完的结果文件导入样本结果报告系统，发布样本结果报告。
实施例4：用本发明所述试剂盒进行G6PD基因突变检测准确性测试
(1)随机抽取12例临床体检人血样，进行全血gDNA抽提，测定浓度；
(2)取试剂盒中的3个对照品(纯突变型对照品、杂合对照品、纯野生型对照品)；
(3)根据实施例3进行3个对照品和12例未知结果体检人样本的G6PD基因突变位点检测；
(4)采用序列金标准的Sanger测序法验证本发明所述的试剂盒检测G6PD基因突变的准确性，由上海百力格生物技术有限公司合成扩增各突变位点所在区域的验证引物对，序列如下：
验证PCR反应体系如下：
混匀反应混合液，8000g离心快甩，进行验证PCR，程序如下：
每个样本跑5管PCR，扩增完成后2％的琼脂糖电泳确定扩增片段，并送测序公司(杭州尚亚生物技术有限公司)测序验证，结果与质谱检测结果比对。比对结果如下：
结果显示，三个对照品检测结果与预期结果完全一致，准确性100％；12例体检样本检测结果与Sanger测序法结果完全一致，显示本发明所述的试剂盒及检测体系结果准确性为100％。
实施例5：部分位点其他备选引物测试
部分位点进行了多个引物组合的测试，除了上述优选方案外，另外合成了部分区域的扩增引物和部分位点的不同单碱基延伸引物，引物由上海百力格生物技术有限公司合成，序列如下：扩增引物：
单碱基延伸引物：
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') | 检测位点 |
| GP2E | ttgtATCGTGGAGAAGCCC | c.517T>C |
| GP10E2 | aggCATCAGTCGGATACAC | c.95A>G |
| GP14E | TTCTCAGCGACGAGCTCCATGAG | c.1381G>A |
| GP14E2 | actGACGAGCTCCATGAG | c.1381G>A |
| GP14E3 | cttCTCAGCGACGAGCTCCATGAG | c.1381G>A |
| GP16E | atcccGACGAGCTCCATGAGGCCTGG | c.1387C>T |
| GP16E3 | ttCCTCAGCGACGAGCTCCATGAG | c.1387C>T |
| GP16E4 | CCCTCAGCGACGAGCTCCATGAGTCCTGG | c.1387C>T |
上述扩增引物和延伸引物，经过分别与其他引物组成混合液，采用实施例3的方法进行不同组合间的平行测试比对，检测结果显示，3对扩增引物检测效果合格，与优选方案差异不大，可作为备选；4个位点的不同延伸引物检测效果，GP2E和GP10E2效果合格，而针对c.1381G>A(rs782608284)和c.1387C>T(rs1557229502)的多种延伸引物组合测试表现欠佳，表现为信号峰低或未出峰，仪器结果判读失败(如图6，GP14E2和GP16E效果)。分析原因主要是由于上述两个位点与外侧两个位点c.1376G>T(rs72554665)和c.1388G>A(rs72554664)相距太近，延伸引物难以避免互相重叠竞争。经过多次优化测试发现，采用优选方案所述延伸引物效果最佳。
实施例6：用本发明所述试剂盒进行G6PD基因突变检测灵敏度测试
根据实施例3进行G6PD基因突变检测灵敏度测试。
采用实施例4中1-3号样本核酸模板进行稀释后，用本发明所述的试剂盒和体系进行G6PD基因突变检测，考察灵敏度。检测结果如下表：
结果显示，本发明所述引物组和试剂盒和检测体系能检测低至0.01ng/μL(即3拷贝/μL)的核酸模板，再低一个梯度浓度则部分位点无法检出，显示本发明所述试剂盒具有极高的灵敏度。
综上所述，本发明提供了一种优化的检测G6PD基因致病性突变的引物组合和突变检测试剂盒，优化的体系和试剂和灵敏度高，特异性强，可检测低至0.01ng/μL的人gDNA核酸样本(约5-6个基因拷贝)，可节约珍贵的新生儿血样；16个位点可实现1孔检测，准确性达100％；经过多次优化完善的预处理试剂，多种组分实现预混配制，大大简化了临床应用时检测人员体系配制和操作难度，易于操作，有效降低使用门槛和上手难度；配套一体化检测平台，操作简便快速，自动检测和分析结果，结果文件可直接导入lims报告系统，结果分析和发布简单客观，不易出错；通量高，成本低廉，实用性非常突出，临床应用前景广阔，尤其适宜在全国范围大规模推广应用，满足不同经济水平的各级医院方便快速地开展G6PDd患者和携带者或新生儿的筛查诊断，指导临床治疗，进而预防和降低新生儿期黄疸，特别是核黄疸的发生率，提升我国优生优育工作水平。
序列表
<120> 一种用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）基因突变检测的引物序列及试剂盒
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg gcgatgcctt ccatcagtc 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg ggcacttcct ggcttttaag 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg cgtgaatgtt cttggtgacg 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg tcaaagagag gggctgacat 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg tgatcctcac tccccgaaga 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgttggatg atctccttgc ccaggtagtg 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg cactgctggt ggaagatgtc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg ccaactcaac acccaaggag 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgttggatg cctttcctca cctgccataa 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgttggatg cagtggcatc agcaagacac 30
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcgggctccc agcaga 16
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
attccgcagg tccctcccga 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttccgtgagg accagatcta c 21
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tacggctgca aaagtg 16
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttggctttct ctcaggtcaa g 21
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctcacctctc attctccaca taga 24
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tagcagtggg gtgaaaata 19
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcatcctca gcgacgagct cc 22
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cctatgccct ccacctgg 18
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtccatcagt cggatacac 19
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agtgccacat gaatgccc 18
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atagccagat gcacttcgtg 20
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgctccctga cgccta 16
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgacgagct ccgtgag 17
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tctccacgat gatgcggt 18
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
actgcagtgg ggtgaaaata c 21
Claims (7)
1.一组用于G6PD基因致病性突变区域扩增的引物序列，其特征在于，包括如下表所示引物：
2.一组用于G6PD基因常见致病性突变位点的单碱基延伸检测的引物序列，其特征在于，包括如下表所示引物序列：
上述8种核酸序列在一次1孔检测中使用。
3.一种用于检测G6PD基因常见致病性突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂：包括如下主要组分
(2)扩增反应引物预混合液：所述权利要求1中的SEQ ID NO：1～10所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度为0.3～3μM；
(3)单碱基延伸反应引物预混合液：所述权利要求2中的SEQ ID NO：11～26所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度介于5～30μM；
(4)除盐树脂：包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末；
(5)检测芯片：包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片；
(6)纯突变对照：包含16个位点突变阳性的人G6PD基因对应片段质粒水溶液，浓度大于500拷贝/μL；
(7)杂合对照：包含16个位点突变阳性的人G6PD基因对应片段质粒、野生型人基因组(gDNA)的混合水溶液，突变型质粒和野生型人gDNA拷贝浓度相等，浓度大于500拷贝/μL；
(8)纯野生对照：包含野生型人gDNA的水溶液，G6PD基因浓度大于500拷贝/μL。
4.根据权利要求3所述的用于G6PD基因常见致病性突变检测的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应引物预混合液具体为：所述权利要求1中的SEQ ID NO：1～10所示的引物的混合液，各引物等比例混合，最终摩尔浓度浓度均为0.5μM。
5.根据权利要求3所述的用于G6PD基因常见致病性突变检测的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应引物预混合液具体为：所述权利要求1中的SEQ ID NO：1～6所示引物浓度0.5μM；SEQ ID NO：7～8所示引物浓度1μM；SEQ ID NO：9～10所示引物浓度2μM。
6.根据权利要求3所述的用于G6PD基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为，各延伸引物摩尔浓度比值如下：
SEQ ID No.11﹕SEQ ID No.12﹕SEQ ID No.13﹕SEQ ID No.14﹕SEQ ID No.15﹕SEQ IDNo.16﹕SEQ ID No.17﹕SEQ ID No.18﹕SEQ ID No.19﹕SEQ ID No.20﹕SEQ ID No.21﹕SEQ IDNo.22﹕SEQ ID No.23﹕SEQ ID No.24﹕SEQ ID No.25﹕SEQ ID No.26＝6.42﹕8.44﹕9.05﹕6.54﹕9.04﹕10.12﹕8.33﹕9.38﹕7.36﹕8.05﹕7.53﹕8.61﹕6.27﹕7.12﹕7.57﹕9.22。
7.根据权利要求3所述的用于G6PD基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为，各延伸引物摩尔浓度比值如下：SEQ ID No.11﹕SEQ IDNo.12﹕SEQ ID No.13﹕SEQ ID No.14﹕SEQ ID No.15﹕SEQ ID No.16﹕SEQ ID No.17﹕SEQ IDNo.18﹕SEQ ID No.19﹕SEQ ID No.20﹕SEQ ID No.21﹕SEQ ID No.22﹕SEQ ID No.23﹕SEQ IDNo.24﹕SEQ ID No.25﹕SEQ ID No.26＝6.42﹕8.44﹕13.58﹕6.54﹕9.04﹕20.24﹕8.33﹕14.07﹕7.36﹕8.05﹕7.53﹕8.61﹕6.27﹕7.12﹕7.57﹕18.44。
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|---|---|
| CN (1) | CN111118141B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112442532A (zh) * | 2020-08-27 | 2021-03-05 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒 |
| CN112725440A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-04-30 | 上海百傲科技股份有限公司 | 用于检测g6pd基因的方法、试剂盒、引物对及探针 |
| CN113373212A (zh) * | 2021-06-07 | 2021-09-10 | 右江民族医学院附属医院 | 基于mbmca基因诊断g6pd缺乏症的技术研发平台 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101760566A (zh) * | 2008-12-12 | 2010-06-30 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种hbv基因的核苷酸突变位点的检测方法 |
| CN102899411A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-01-30 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | G6pd缺乏症基因检测试剂盒 |
| CN103088135A (zh) * | 2013-01-23 | 2013-05-08 | 厦门大学 | 一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光pcr熔解曲线检测试剂盒 |
| US20130280745A1 (en) * | 2010-11-24 | 2013-10-24 | Dh Technologies Development Pte. Ltd. | High-throughput, sensitive detection of glucose-6-phosphate dehydrogenase |
| US20140072966A1 (en) * | 2012-09-07 | 2014-03-13 | University Of Bristol | Genetic biomarkers for glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency |
| CN104017862A (zh) * | 2014-04-30 | 2014-09-03 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒 |
| CN110358821A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-10-22 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | 检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症g6pd基因突变的引物、试剂盒和方法 |
-
2020
- 2020-01-15 CN CN202010041230.8A patent/CN111118141B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101760566A (zh) * | 2008-12-12 | 2010-06-30 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种hbv基因的核苷酸突变位点的检测方法 |
| US20130280745A1 (en) * | 2010-11-24 | 2013-10-24 | Dh Technologies Development Pte. Ltd. | High-throughput, sensitive detection of glucose-6-phosphate dehydrogenase |
| US20140072966A1 (en) * | 2012-09-07 | 2014-03-13 | University Of Bristol | Genetic biomarkers for glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency |
| CN102899411A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-01-30 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | G6pd缺乏症基因检测试剂盒 |
| CN103088135A (zh) * | 2013-01-23 | 2013-05-08 | 厦门大学 | 一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光pcr熔解曲线检测试剂盒 |
| CN104017862A (zh) * | 2014-04-30 | 2014-09-03 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒 |
| CN110358821A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-10-22 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | 检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症g6pd基因突变的引物、试剂盒和方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FANGZHAO等: "Rapid detection of six common Chinese G6PD mutations by MALDI-TOF MS", 《BLOOD CELLS, MOLECULES, AND DISEASES》, vol. 32, no. 2, pages 315 - 318 * |
| 赵振东;王洁;: "海南省新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症发生情况及基因突变分析研究", 中国全科医学, no. 06, pages 61 - 64 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112442532A (zh) * | 2020-08-27 | 2021-03-05 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒 |
| CN112442532B (zh) * | 2020-08-27 | 2023-09-26 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒 |
| CN112725440A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-04-30 | 上海百傲科技股份有限公司 | 用于检测g6pd基因的方法、试剂盒、引物对及探针 |
| CN112725440B (zh) * | 2021-02-10 | 2023-08-18 | 上海百傲科技股份有限公司 | 用于检测g6pd基因的方法、试剂盒、引物对及探针 |
| CN113373212A (zh) * | 2021-06-07 | 2021-09-10 | 右江民族医学院附属医院 | 基于mbmca基因诊断g6pd缺乏症的技术研发平台 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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