CN111455062B - 一种用于新型冠状病毒易感基因检测的试剂盒及平台 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于新型冠状病毒易感基因检测的试剂盒以及检测平台，所述的试剂盒包括SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：38所示的引物。本发明的试剂盒灵敏度高，特异性强，可检测低至0.01ng/μL的人gDNA核酸样本(约5‑6个基因拷贝)，可节约样本使用量；35个位点可实现2孔检测，准确性达100％；经过多次优化完善的预处理试剂，多种组分实现预混配制，大大简化了临床应用时检测人员体系配制和操作难度，易于操作，有效降低使用门槛和上手难度；配套一体化检测平台，操作简便快速，自动检测和分析结果。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)平台的用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)易感基因检测的试剂盒。
背景技术
SARS-CoV-2是新出现的冠状病毒变种，因此现今的临床研究是初步性的。病毒潜伏期平均大约3-7天，最长不超过14天。大多数患者表现以下呼吸道症状为主，常见临床表现包括发热、四肢乏力、干咳等症状，其他表现包含鼻塞、流鼻涕、头痛、咽痛、咳血，咳痰、或腹泻等。有部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现。还有部分患者无任何临床表现。病毒感染严重后，会引发多种并发症包含急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脓毒症休克、全身炎症反应综合征、难以纠正的代谢性酸中毒、急性心肌损伤，和出凝血功能障碍等。从而看出此病毒对不同人群的感染和致病力不同。
SARS-CoV-2是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约60-140nm，属于网巢病毒目冠状病毒科。此病毒每组基因组长度约三万个核苷酸左右。与SARS一样可以利用自己的RBD的S1蛋白与人体ACE2进行结合，通过呼吸道上皮细胞进入肺部进行复制过程，且主要作用对象也是与SARS相同的T淋巴细胞。有研究指出，当新型冠状病毒入侵人体后，由于ACE2本身在结肠细胞重的表达与人体免疫、调节病毒性感染正相关，会因被病毒下调表达而激活肾素-血管紧张素系统(RAS)。由于RAS和人体血压等关键体征有关，ACE2不但对冠状病毒有介导作用，也会进一步导致人体免疫力下降。ACE2基因的完整性影响其表达水平，并会直接影响ACE2蛋白受体对SARS-CoV-2的感染结合能力。
同时AHSG基因能够编码一种急性期蛋白质，在正常人体的血清中，AHSG蛋白的浓度维持在稳定的范围；当人体感染产生炎症反应时，AHSG蛋白的浓度会升高，高浓度水平的AHSG蛋白在发挥抗炎作用的同时，还可直接或间接起抑制病毒感染的作用。MBL基因能编码合成甘露糖结合凝集素，它参与补体的激活，是补体激活第三条途径中的重要组份，进而间接起到参与机体抗微生物防御反应及免疫调节的作用，在病原微生物感染早期的抗病毒过程中非常重要，当该凝集蛋白表达降低或出现功能缺陷时，将会导致免疫能力的减弱。
结合以上信息，对ACE2、AHSG和MBL基因在不同人群的多态性检测，可做出个人对新型冠状病毒易于感染能力的评估。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Time-of-flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有对应关系，并以质/荷比计算分子量。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测，最后根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。MALDI-TOF质谱很适合用于对蛋白质、多肽和多糖、核酸等生物大分子的研究。因其具有测定质量范围宽、灵敏度高、速度快、精确度高及对盐的耐受性较好等优点，已广泛应用于蛋白质及核酸的分子量和序列测定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，查找新型冠状病毒目前所有已报道的潜在易感基因，根据已有研究文献和市场情况，覆盖所有最新数据库、指南或专家共识中汇总统计而得的位点；其次，结果要准确可靠、灵敏度高、特异性强，所需模板量尽可能少，满足人群普遍筛查检测；另外，操作需简便快捷、结果判读简单客观，不易出错，且通量高、成本低廉，对样本个数要求低，可随到随检，适宜全国不同地区大规模推广。这样，各级地方医院和实验室可以及时方便地开展易感基因的检测，尽可能多的覆盖人群进行筛查，尽早了解其是否为新型冠状病毒的易感人群，从而可以指导临床给出合理的建议，采取更个性化的预防和治疗措施。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明一方面涉及用于病毒易感基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如下表所示引物：
在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒还包括用于病毒易感基因特异位点的单碱基延伸检测的引物序列，所述引物选自下表所示引物中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种以上或全部引物：
在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒包括如下试剂：
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂：包括如下主要组分
(2)扩增反应引物预混合液：SEQ ID NO：1～38所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度为0.3～3μM；
(3)单碱基延伸反应引物预混合液：SEQ ID NO：39～73所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度介于3～30μM；
(4)除盐树脂：包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末；
(5)检测芯片：包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片；
(6)纯突变对照：包含35个位点突变阳性的人病毒易感基因对应片段质粒溶液，浓度大于500拷贝/μL；
(7)杂合对照：包含35个位点突变阳性的人病毒易感基因对应片段质粒、野生型人基因组(gDNA)的混合溶液，突变型质粒和野生型人gDNA拷贝浓度相等，浓度大于500拷贝/μL；
(8)纯野生对照：包含野生型人gDNA的溶液，病毒易感基因浓度大于500拷贝/μL。
在本发明的一个优选实施方式中，所述扩增反应引物预混合液具体为，SEQ IDNO：1～38所示的引物的混合液，各引物等比例混合，最终摩尔浓度浓度均为0.5μM；优选的，SEQ ID NO：1～11所示引物浓度0.5μM，SEQ ID NO 12～25所示引物浓度1μM，SEQ ID NO：26～38所示引物浓度2μM。
在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于，所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为，各延伸引物摩尔浓度比值如下：
SEQ ID No.39-42﹕SEQ ID No.43-46﹕SEQ ID No.47-49﹕SEQ ID No.50﹕SEQ IDNo.51-52﹕SEQ ID No.53-55﹕SEQ ID No.56-58﹕SEQ ID No.59-60﹕SEQ ID No.61﹕SEQ IDNo.62-65﹕SEQ ID No.66-68﹕SEQ ID No.69-70﹕SEQ ID No.71﹕SEQ ID No.72-73＝5.64﹕5.8﹕5.93﹕6.98﹕7.03﹕7.66﹕7.82﹕8.12﹕8.16﹕8.58﹕8.58﹕8.93﹕9.68﹕9.71；
优选地，各延伸引物摩尔浓度比值如下：
SEQ ID No.39-42﹕SEQ ID No.43-46﹕SEQ ID No.47-49﹕SEQ ID No.50﹕SEQ IDNo.51-52﹕SEQ ID No.53-55﹕SEQ ID No.56-58﹕SEQ ID No.59-60﹕SEQ ID No.61﹕SEQ IDNo.62-65﹕SEQ ID No.66-68﹕SEQ ID No.69-70﹕SEQ ID No.71﹕SEQ ID No.72-73＝5.34﹕6.1﹕6.2﹕6.62﹕6.96﹕7.31﹕7.42﹕7.83﹕8.02﹕8.28﹕8.38﹕8.53﹕8.87﹕9.01。
本发明还提供一种集成一体化的用于病毒易感基因检测的技术平台，其包括飞行时间质谱检测系统和上述试剂盒。
有益效果：
(1)本发明提供了一种检测新型冠状病毒易感基因突变的引物组合和检测试剂盒，优化的体系和试剂灵敏度高，特异性强，可检测低至0.01ng/μL的人gDNA核酸样本(约5-6个拷贝)，可减少需要的样本量；准确性达100％；配套一体化检测平台，操作简便快速，结果分析容易，通量高，成本低，具有比现有基于QPCR、反向点杂交或NGS方法学的相关产品更优异的性能，实用性也非常突出，尤其适宜在全国范围的各级医院及实验室推广应用，方便快速地开展人群筛查诊断，指导预防和治疗措施。
(2)本发明参考全球共享的SNP数据库NCBI dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)、国际千人基因组SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)以及中国国内相关指南，选取具有中国人群高发的病毒易感相关基因突变位点，经过多次筛选和优化扩增引物和单碱基延伸引物组合后，35个位点可实现2孔检测；经过多次优化完善的预处理试剂，多种组分实现预混配制，大大简化了临床应用时操作人员进行体系配制和后续检测的难度，显著提升了微量体系配制和检测的稳定性和重复性，易于操作，有效降低使用门槛和上手难度；一体化仪器自动检测和分析结果，输出文件可直接导入lims报告系统，结果分析和发布简单客观，不易出错；全流程6-7h内完成192个样本检测，检测通量高，易于大规模推广应用。
(3)本发明采用一种基于MALDI-TOF MS技术的核酸质谱分析系统，属于高精度DNA定性分析平台。该技术平台是目前全球唯一可以准确检测核酸的质谱技术平台，完美整合了PCR技术的高灵敏度、芯片技术的高通量、质谱技术的高精确度和计算机智能分析的强大功能，为市场提供了一个具有显著成本优势，简易工作流程和高通量的全自动解决方案。准确性≥99.7％，除盐、点样、检测一体化整合，自动化程度高，操作简便快速，结果判读简单；一次检测384个样本，检测样本通量高，也可一次检测单个样本，检测通量灵活，可随到随检；位点通量中高，单孔最多可检测超过40个位点，可降低用量珍贵样本，成本低至数十元，节约筛查成本，降低国家医疗支出，适宜全国不同经济水平地区全面推广，更适用于相关基因的大样本科研用途。
附图说明
图1为1例临床样本(1号)检测结果图。DP-TOF型飞行时间质谱检测系统检测软件界面，软件依据各孔的35位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示35个位点均为野生型。
图2为1例临床样本(2号)检测结果图。DP-TOF型飞行时间质谱检测系统检测软件界面，软件依据各孔的35位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示位点为杂合突变，其他位点均为野生型。
图3为1次优化实验测试结果图。DP-TOF型飞行时间质谱检测系统检测软件界面，软件依据各孔的35位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示位点均正常读出结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制本发明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照所属领域的常规操作进行，或按照制造厂商所建议的条件进行。本发明中所用的方法及其相关的试剂，可以有其他可选择和替代方案，能够达到相同技术结果即可。
实施例1：检测病毒易感基因突变的引物由上海百力格生物技术有限公司合成，序列如下：
扩增引物：
单碱基延伸引物：
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') | 检测位点 |
| SEQ ID NO：39 | GACCTGATGGCCTTT | rs2248690 |
| SEQ ID NO：40 | CGACTTGTGGAGAGC | rs1800450 |
| SEQ ID NO：41 | CCAGAGCTGTGTCAAA | rs2106809 |
| SEQ ID NO：42 | AAAGATGGGCGTGATG | rs879922 |
| SEQ ID NO：43 | TCCGATTCTGGCCTTTG | rs2285666 |
| SEQ ID NO：44 | ACCTGGCAAAATAAACTT | rs4646155 |
| SEQ ID NO：45 | GAAGCAATCTAAGGACAA | rs1514283 |
| SEQ ID NO：46 | CCCTTTTCTTGCATTCTAT | rs4646176 |
| SEQ ID NO：47 | TATGGTGCAATTATCTGAA | rs2074192 |
| SEQ ID NO：48 | CTGATGTAGAAGTGTGGAGA | rs233575 |
| SEQ ID NO：49 | CTAAGCATTTAAAATCCATTG | rs4646156 |
| SEQ ID NO：50 | TGCTATGAGGCAGTACTTTT | rs4646174 |
| SEQ ID NO：51 | TCCTTCCTATATCAGTCCAATT | rs1431172217 |
| SEQ ID NO：52 | GAGAGAAAGCACAAAATACA | rs34998679 |
| SEQ ID NO：53 | CTATGACCAAGTCTCTATAGTA | rs1258744122 |
| SEQ ID NO：54 | CTCTTTCCTCTCCTCTTTCC | rs1437492704 |
| SEQ ID NO：55 | TTCCCAAAGCCAAACAAAATTAT | rs867060899 |
| SEQ ID NO：56 | TCAGAACATTACAGAATCAAAC | rs199951323 |
| SEQ ID NO：57 | AGCAGTCACAAATGAATAAAT | rs1352194082 |
| SEQ ID NO：58 | ACAAACTTTATTAGCTAATATCCT | rs1009196459 |
| SEQ ID NO：59 | TCATAATCACTACTAAAAATTAGTAGC | rs868599322 |
| SEQ ID NO：60 | GGTATCAGATTATAAATGTGTCTTAC | rs1340886951 |
| SEQ ID NO：61 | CCAAAAACATATGTTCTTCACCTA | rs750065285 |
| SEQ ID NO：62 | TTGTTTATTATCTTTAATTTGCAGT | rs61433707 |
| SEQ ID NO：63 | ATTGTTGGGACTCTGCCATTTACTT | rs1514280 |
| SEQ ID NO：64 | TCATCAACAGCTCCA | rs4240157 |
| SEQ ID NO：65 | CTCCACTTCTCTAACAT | rs2316903 |
| SEQ ID NO：66 | CGGCCTGATAATTTTTTAA | rs4646143 |
| SEQ ID NO：67 | GAAAGGAGAAAATAATCCA | rs971249 |
| SEQ ID NO：68 | ATTCTTACAACAGTTTCTGTC | rs757066 |
| SEQ ID NO：69 | GATCTGTTTTATTTAGGCTT | rs2023802 |
| SEQ ID NO：70 | ATGTAAAAGAAAAACTTGAC | rs138763015 |
| SEQ ID NO：71 | ACAAGAAAACTGTAATTTACC | rs4646124 |
| SEQ ID NO：72 | GGTTGTTTGAGATTTAAAGTA | rs1978124 |
| SEQ ID NO：73 | TCTCTATCTGATGG | rs146962767 |
实施例2：检测病毒易感基因的突变型质粒由上海生工生物工程有限公司合成，共5个突变型质粒(pUC57克隆质粒+插入序列)，具体如下表：
注：*对应突变位点SNP号、通用名及突变频率数据来源于全球共享的SNP数据库NCBI dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)、国际千人基因组SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)、文献以及中国国内相关指南报道。
实施例3：病毒易感基因的突变检测试剂盒的制备。
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂(浙江迪谱诊断技术有限公司，货号：20010100)，包括如下主要组分：
(2)扩增反应引物预混合液：SEQ ID NO：1～38所示的核苷酸序列的混合液；优选方案为，SEQ ID NO：1～11所示引物浓度0.5μM，SEQ ID NO：12～25所示引物浓度1μM，SEQID NO：26～38所示引物浓度2μM；
(3)单碱基延伸反应引物预混合液：SEQ ID NO：39～73所示的核苷酸序列的混合液，各延伸引物摩尔浓度优选方案如下：
SEQ ID No.39-42﹕SEQ ID No.43-46﹕SEQ ID No.47-49﹕SEQ ID No.50﹕SEQ IDNo.51-52﹕SEQ ID No.53-55﹕SEQ ID No.56-58﹕SEQ ID No.59-60﹕SEQ ID No.61﹕SEQ IDNo.62-65﹕SEQ ID No.66-68﹕SEQ ID No.69-70﹕SEQ ID No.71﹕SEQ ID No.72-73＝5.64﹕5.8﹕5.93﹕6.98﹕7.03﹕7.66﹕7.82﹕8.12﹕8.16﹕8.58﹕8.58﹕8.93﹕9.68﹕9.71；
(4)除盐树脂：包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末；
(5)检测芯片：包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片。
(6)纯突变对照品：包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的35个位点突变型人病毒易感基因对应片段质粒水溶液，浓度大于500拷贝/μL。
(7)杂合对照品：包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的35个位点突变型人病毒易感基因对应片段质粒、野生型人基因组(gDNA)的混合水溶液，突变型质粒和野生型人gDNA拷贝浓度相等，浓度大于500拷贝/μL。
(8)纯野生对照品：包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的野生型人gDNA的水溶液，病毒易感基因浓度大于500拷贝/μL。
实施例4：临床样本病毒易感基因常见致病性突变位点检测方法。
仪器：DP-TOF型飞行时间质谱检测系统(浙江迪谱诊断技术有限公司)，Qubit 2.0荧光计(美国，ThermoFisher公司)，Mastercycler X50h 384孔快速定性PCR仪(德国，Eppendorf公司)，Mastercycler ProS 96孔快速定性PCR仪(德国，Eppendorf公司)，BECKMAN
22R台式微量冷冻离心机，WH-866型涡旋振荡器(太仓华利达)，低速板式离心机(安徽中佳)、恒温振荡器(杭州奥盛)。
1.人gDNA核酸模板的制备：成人外周血样本采用全血DNA抽提试剂盒(迪谱诊断，货号20020100)，按照试剂盒说明书操作。抽提完成后用Qubit 2.0荧光计测定核酸浓度，立即检测或-20℃保存备用。
2.利用1组优化的扩增引物和1组优化的单碱基延伸引物进行病毒易感基因常见致病性突变位点的检测，具体包括如下步骤；
(1)PCR试剂配制(试剂准备区)：
从试剂盒中取出T-PCR反应混合液和PCR酶混合液，分别在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下：
| 试剂 | T-PCR反应混合液 | PCR酶混合液 | PCR扩增引物预混合液 |
| 用量 | 1.67μL | 0.33μL | 1μL |
计算上述各试剂的使用量，充分混匀后，按3μL量分装到PCR反应管或384孔PCR板中，转移至样本处理区。
(2)上样(样本处理区)：
分别加入2μL样品DNA溶液，盖紧反应管或384孔PCR板，转移至检测区。
(3)PCR扩增(核酸扩增区)：
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增：
*注：PCR产物暂时不进行下一步实验操作，可4℃保存过夜。
(4)SAP试剂配制(试剂准备区)：
从试剂盒中取出SAP反应混合液和SAP酶混合液，分别在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下：
| 试剂 | SAP反应混合液 | SAP酶混合液 |
| 用量 | 1.70μL | 0.30μL |
(5)加样(核酸扩增区)：
向3的PCR产物中分别加入2μL的上述SAP反应液，盖紧反应管或384孔PCR板。
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上,按以下程序进行SAP消化：
*注：SAP产物应立即进行下一步操作，不建议放置4℃过夜。
(6)延伸试剂配制(试剂准备区)：
从试剂盒中取出T-延伸反应混合液和延伸酶混合液，在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下：
| 试剂 | T-延伸反应混合液 | 延伸酶混合液 | 单碱基延伸引物预混合液 |
| 用量 | 0.72μL | 0.34μL | 0.94 |
(7)加样(核酸扩增区)：
按一定顺序向6的SAP产物中分别加入2μL的上述延伸反应液，盖紧反应管或384孔PCR板。
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上,按以下程序进行延伸扩增：
*注：延伸产物暂不进行下一步实验操作，可4℃保存过夜。
(8)使用DP-TOF飞行时间质谱检测系统进行质谱检测(扩增分析区)：
按照DP-TOF核酸质谱仪操作说明书进行标准操作，选择所需检测样本对应芯片及孔号，仪器自动进行样本延伸产物除盐、芯片点样和检测，并自动对结果进行分析。
(9)将质谱仪分析完的结果文件导入样本结果报告系统，发布样本结果报告。
实施例5：用本发明所述试剂盒进行病毒易感基因突变检测准确性测试
(1)随机抽取6例临床体检人血样，进行全血gDNA抽提，测定浓度；
(2)取试剂盒中的3个对照品(纯突变型对照品、杂合对照品、纯野生型对照品)；
(3)根据实施例3进行3个对照品和6例未知结果体检人样本的病毒易感基因突变位点检测；
(4)采用序列金标准的Sanger测序法验证本发明所述的试剂盒检测病毒易感基因突变的准确性，由上海百力格生物技术有限公司合成扩增各突变位点所在区域的验证引物对，序列如下：
验证PCR反应体系如下：
混匀反应混合液，8000g离心快甩，进行验证PCR，程序如下：
每个样本跑5管PCR，扩增完成后2％的琼脂糖电泳确定扩增片段，并送测序公司(杭州尚亚生物技术有限公司)测序验证，结果与质谱检测结果比对。比对结果如下：
结果显示，三个对照品检测结果与预期结果完全一致，准确性100％；6例体检样本检测结果与Sanger测序法结果完全一致，显示本发明所述的试剂盒及检测体系结果准确性为100％。
实施例6：部分位点其他备选引物测试
部分位点进行了多个引物组合的测试，除了上述优选方案外，另外合成了部分区域的扩增引物和部分位点的不同单碱基延伸引物，引物由上海百力格生物技术有限公司合成，序列如下：
扩增引物：
单碱基延伸引物：
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') | 检测位点 |
| GPE1 | TAGGGCAGGAGCCTCGCTA | rs2023802 |
| GPE2 | TCCATCAGTCGGCGACTC | rs138763015 |
| GPE3 | CCGTCACCGATGAGCTCCTGGAC | rs146962767 |
| GPE4 | TGACGACCTCCTTCCG | rs971249 |
| GPE5 | CGCCTGAGCCACCAGCAGCAACAG | rs757066 |
上述扩增引物和延伸引物，经过分别与其他引物组成混合液，采用实施例3的方法进行不同组合间的平行测试比对，检测结果显示，3对扩增引物检测效果合格，与优选方案差异不大，可作为备选；5个位点的不同延伸引物检测效果，GPE2和GPE5效果合格，而针对rs971249和rs146962767的多种延伸引物组合测试表现欠佳，表现为信号峰低或未出峰，仪器结果判读失败。经过多次优化测试发现，采用优选方案所述延伸引物效果最佳。
实施例7：用本发明所述试剂盒进行病毒易感基因突变检测灵敏度测试
根据实施例3进行病毒易感基因突变检测灵敏度测试。
采用实施例4中1-3号样本核酸模板进行稀释后，用本发明所述的试剂盒和体系进行病毒易感基因突变检测，考察灵敏度。检测结果如下表：
结果显示，本发明所述引物组和试剂盒和检测体系能检测低至0.01ng/μL(即3拷贝/μL)的核酸模板，再低一个梯度浓度则部分位点无法检出，显示本发明所述试剂盒具有极高的灵敏度。
综上所述，本发明提供了一种优化的检测新型冠状病毒基因突变的引物组合和突变检测试剂盒，优化的体系和试剂和灵敏度高，特异性强，可检测低至0.01ng/μL的人gDNA核酸样本(约5-6个基因拷贝)，可节约样本使用量；35个位点可实现2孔检测，准确性达100％；经过多次优化完善的预处理试剂，多种组分实现预混配制，大大简化了临床应用时检测人员体系配制和操作难度，易于操作，有效降低使用门槛和上手难度；配套一体化检测平台，操作简便快速，自动检测和分析结果，结果文件可直接导入1ims报告系统，结果分析和发布简单客观，不易出错；通量高，成本低廉，实用性非常突出，临床应用前景广阔，尤其适宜在全国范围大规模推广应用，满足不同经济水平的各级医院和实验室方便快速地开展普通人群的筛查诊断，指导预防和临床治疗。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
<120> 一种用于新型冠状病毒易感基因检测的试剂盒及平台
<160> 73
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 1
acgttggatg gagattcctt ccaaccttc 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 2
acgttggatg ggcaggacca ggctttaaat 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 3
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<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 4
acgttggatg tcaaagctag gggctgacct 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 5
acgttggatg tggtcctcgc cccccgtgga 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 6
acgttggatg agctccgtgc ccagttagtg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 7
acgttggatg cgctgctggg ggcagaggta 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 8
acgttggatg ccaacccaat actcatcgag 30
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<212> DNA
<213> COVID-19
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acgttggatg caagtcctca cctgccacaa 30
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<212> DNA
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acgttggatg ctgtgtgttc agcaagacac 30
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<211> 30
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<213> COVID-19
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acgttggatg tgtgactgct cgtctacatt 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
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acgttggatg agtcacacca cgtaaagatc 30
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<212> DNA
<213> COVID-19
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acgttggatg agtcagtgaa ctcacaagtg 30
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<212> DNA
<213> COVID-19
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acgttggatg tgtcacagca ccagaaattg 30
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<212> DNA
<213> COVID-19
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acgttggatg cataacacga ccaaaaaata 30
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> COVID-19
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acgttggatg agagcctgca cctatatctg 30
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acgttggatg cgtcactgca ccggattata 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 29
acgttggatg tgtcgctccc cgtcacaatt 30
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<212> DNA
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<400> 30
acgttggatg tgtcagtgaa caggctgttg 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
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acgttggatg tggaactgat ccaaaccttg 30
<210> 32
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<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 32
acgttggatg ggtctgtgga cccaaatatg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 38
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<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 39
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<210> 40
<211> 15
<212> DNA
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<400> 40
cgacttgtgg agagc 15
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<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 41
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<400> 46
cccttttctt gcattctat 19
<210> 47
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<213> COVID-19
<400> 47
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<210> 48
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<212> DNA
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<400> 48
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<210> 49
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<212> DNA
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ctaagcattt aaaatccatt g 21
<210> 50
<211> 20
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ctatgaccaa gtctctatag ta 22
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<213> COVID-19
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<210> 57
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<400> 57
agcagtcaca aatgaataaa t 21
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 58
acaaacttta ttagctaata tcct 24
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 59
tcataatcac tactaaaaat tagtagc 27
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<212> DNA
<213> COVID-19
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<213> COVID-19
<400> 61
ccaaaaacat atgttcttca ccta 24
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<213> COVID-19
<400> 62
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attgttggga ctctgccatt tactt 25
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<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 64
tcatcaacag ctcca 15
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<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 65
ctccacttct ctaacat 17
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 66
cggcctgata attttttaa 19
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 67
gaaaggagaa aataatcca 19
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 69
gatctgtttt atttaggctt 20
<210> 70
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<400> 70
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acaagaaaac tgtaatttac c 21
<210> 72
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<213> COVID-19
<400> 72
ggttgtttga gatttaaagt a 21
<210> 73
<211> 14
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 73
tctctatctg atgg 14
Claims (8)
1.用于SARS-CoV-2病毒易感基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括SEQID NO：1~ SEQ ID NO：38所示的引物，还包括用于病毒易感基因特异位点的单碱基延伸检测的引物序列，序列如SEQ ID NO：39~ SEQ ID NO：73所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：
（1）飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂：包括如下主要组分
（2）扩增反应引物预混合液：SEQ ID NO：1~38所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度为0.3~3μM；
（3）单碱基延伸反应引物预混合液：SEQ ID NO：39~73所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度介于3~30μM；
（4）除盐树脂：包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末；
（5）检测芯片：包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片；
（6）纯突变对照：包含35个位点突变阳性的人病毒易感基因对应片段质粒溶液，浓度大于500拷贝/μL；
（7）杂合对照：包含35个位点突变阳性的人病毒易感基因对应片段质粒、野生型人基因组gDNA的混合溶液，突变型质粒和野生型人gDNA拷贝浓度相等，浓度大于500拷贝/μL；
（8）纯野生对照：包含野生型人gDNA的溶液，病毒易感基因浓度大于500拷贝/μL。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，所述扩增反应引物预混合液具体为，SEQ ID NO：1~38所示的引物的混合液， SEQ ID NO：1~11所示引物浓度0.5μM，SEQ ID NO：12~25所示引物浓度1μM，SEQ ID NO：26~38所示引物浓度2μM。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为，各延伸引物摩尔浓度比值如下：
SEQ ID No：39-42﹕SEQ ID No：43-46﹕SEQ ID No：47-49﹕SEQ ID No：50﹕SEQ ID No：51-52﹕SEQ ID No：53-55﹕SEQ ID No：56-58﹕SEQ ID No：59-60﹕SEQ ID No：61﹕SEQ ID No：62-65﹕SEQ ID No：66-68﹕SEQ ID No：69-70﹕SEQ ID No：71﹕SEQ ID No：72-73＝5.64﹕5.8﹕5.93﹕6.98﹕7.03﹕7.66﹕7.82﹕8.12﹕8.16﹕8.58﹕8.58﹕8.93﹕9.68﹕9.71。
5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为，各延伸引物摩尔浓度比值如下：
SEQ ID No：39-42﹕SEQ ID No：43-46﹕SEQ ID No：47-49﹕SEQ ID No：50﹕SEQ ID No：51-52﹕SEQ ID No：53-55﹕SEQ ID No：56-58﹕SEQ ID No：59-60﹕SEQ ID No：61﹕SEQ ID No：62-65﹕SEQ ID No：66-68﹕SEQ ID No：69-70﹕SEQ ID No：71﹕SEQ ID No：72-73＝5.34﹕6.1﹕6.2﹕6.62﹕6.96﹕7.31﹕7.42﹕7.83﹕8.02﹕8.28﹕8.38﹕8.53﹕8.87﹕9.01。
6.一种集成一体化的用于病毒易感基因检测的系统，其包括飞行时间质谱检测系统和权利要求1~5任意一项所述试剂盒。
7.权利要求1~5任意一项所述试剂盒在制备病毒易感基因检测的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，所述的病毒是指SARS-CoV-2新型冠状病毒。
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