CN103045743A - 用于鼻咽癌易感基因snp位点检测的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒。本发明所述的试剂盒包括:检测鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位点rs2860580的PCR扩增引物和单碱基延伸引物;检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19区域的SNP位点rs1572072和rs9510787的PCR扩增引物和单碱基延伸引物;检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs28421666、rs2860580和rs2894207的PCR扩增引物和单碱基延伸引物;检测鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位点rs6774494的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。本发明所述的试剂盒可用于同时检测多个鼻咽癌易感基因的SNP位点,可以为个体罹患鼻咽癌风险程度、鼻咽癌高发区人群普查,筛查鼻咽癌发病高危人群以及进行相应预防措施提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒。
背景技术
鼻咽癌是鼻咽上皮来源的恶性肿瘤,多发于鼻咽顶部和咽隐窝,是一种多因素影响的复杂性疾病,其发生及发展与遗传因素、环境因素及EBV病毒感染密切相关。中国是世界鼻咽癌高发区,据世界卫生组织统计,2008年,中国新发病例占全球39.2%(33101人),因鼻咽癌死亡病例占全球40.5%(20899人);并且,鼻咽癌好发于壮年,严重影响人民健康和经济发展。
近几年,巴德年院士提出的现代“3P”医学理念正不断得到推广。“3P”医学模式,即预测(Prediction)、预防(Prevention)和个体化诊疗(Personalization),强调利用个体基因组等信息,进行疾病的预测和防治,对于疾病的态度由“重治”转变为“重防”。同样,鼻咽癌的防治关键将是进行患病高危人群的筛查,提高早诊率。临床研究发现,鼻咽癌早期治疗效果远高于晚期。临床分期是影响治疗效果的重要因素,早期无局部淋巴结转移鼻咽癌的5年生存率(75.7%)远高于淋巴结转移鼻咽癌(58.2%)和晚期远处转移鼻咽癌(34.9%)。然而,目前仍然缺乏有效的用于高危人群筛查、早期诊断方法策略,加上鼻咽癌的早期症状无特异性和原发部位较隐蔽,不易被发现,80%鼻咽癌患者就诊时已处于中晚期,治疗效果不理想,导致临床上鼻咽癌的5年生存率一直徘徊于60%左右。进行鼻咽癌高发区人群筛选,能够筛选患病高危人群,提高鼻咽癌早诊率,是提高治疗效果的关键。因而,开发鼻咽癌发病风险预测、用于鼻咽癌高危人群筛查的新型手段具有重要的意义。
目前临床上提高鼻咽癌早期诊断率主要是通过提高个人健康意识,结合鼻咽腔检查,并利用EB病毒抗体检测技术以评估EB病毒感染情况(详见专利:CN92114135“一种检测EB病毒抗体的显色试剂及其制造方法”;CN200710027841“检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒及其制备方法”;CN201010255146“EB病毒IgA抗体检测试剂盒(胶体金法)及制备方法”;CN200710029366.1“检测EB病毒gp78抗体的CBA试剂盒及其制备方法”等)。但是,这种策略难以应用于大规模人群的高危人群筛查,难以应用于鼻咽癌的早期预防、预警,也未能够有效地提高早诊率。因此,根据个体携带鼻咽癌易感基因情况,进行鼻咽癌发病风险预测,对于确定鼻咽癌高危人群,提高鼻咽癌早诊率,显得非常重要。
在其它相关的恶性肿瘤研究当中,研究者能够利用个体携带易感基因的情况,对其发病风险进行预测。例如,分别携带BRCA1和BRCA2基因突变的女性,罹患乳腺癌的相对风险分别是正常群体的5-45倍和9-21倍;并且,Antoniou等人通过7个风险相关位点联合分析发现,在BRCA2突变携带者中,5%高危组到80岁时发生乳腺癌的可能性为80~96%,而低危组仅为42~50%,指出这些患病风险差异可以用于指导临床方案。然而,目前缺乏有效的鼻咽癌发病风险预测产品。虽然已有个别申请专利根据鼻咽癌相关基因PLUNC的C-2128T位点、C-1888T位点或由此两位点组成的单倍型来判定个体对鼻咽癌是否易感的方法(详见专利:CN200510008650.1“一种检测与鼻咽癌相关的易感基因PLUNC基因型的方法及PLUNC易感基因”),然而,该方法仅针对极少数的指标检测,准确率较低;并且,该方法可靠性有待于大规模人群样本进行验证。
另外,有大量研究证实恶性肿瘤家族史及一些环境暴露因素(如食用腌制食品的历史、既往吸烟饮酒史、摄取新鲜水果蔬菜及其他食品量、食用中草药的历史等)与鼻咽癌的发生有关系,综合考虑遗传因素和环境因素对鼻咽癌发病风险进行预测是必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒,该试剂盒可用于同时检测多个鼻咽癌易感基因的SNP位点,可以为个体罹患鼻咽癌风险程度、鼻咽癌高发区人群普查,筛查鼻咽癌发病高危人群以及进行相应预防措施提供参考。
本发明所述的一种用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒,所述试剂盒包括:检测鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位点rs2860580的PCR扩增引物和单碱基延伸引物;检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19区域的SNP位点rs1572072和rs9510787的PCR扩增引物和单碱基延伸引物;检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs28421666、rs2860580和rs2894207的PCR扩增引物和单碱基延伸引物;检测鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位点rs6774494的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。
根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征,所述检测鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位点rs2860580的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQID NO:3。
根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征,所述检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19区域的SNP位点rs1572072的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ IDNO:6。
根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征,所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs28421666的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ ID NO:9。
根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征,所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs2860580的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ ID NO:12。
根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征,所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs2894207的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ ID NO:15。
根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征,所述检测鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位点rs6774494的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ IDNO:18。
根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征,所述检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19的SNP位点rs9510787的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ ID NO:21。
本发明所述的试剂盒以是以本发明人的基于大规模样本量的鼻咽癌人群和正常人对照人群及全基因组水平鼻咽癌易感基因筛查结果的前期研究为基础,结合其它已知的鼻咽癌相关易感基因,选择7个单核苷酸多态性位点(SNP)进行制备的。采取受检者外周血、唾液或漱口水来源的基因组DNA,在本发明所述的试剂盒上进行基因分型检测,再利用多重PCR扩增及桑格(Sanger)测序方法,检测这7个单核苷酸位点,综合分析环境因素(腌制食品食用史、既往吸烟史、新鲜水果蔬菜食用量)、肿瘤家族史及鼻咽癌易感基因位点单核苷酸多态性(SNP)信息,利用遗传风险计分模型,推测受检者罹患鼻咽癌的风险程度,克服了现有的仅仅通过检测EB病毒感染情况、或者依靠极少数的易感基因指标的等结果来进行鼻咽癌发病风险判断的不足。本发明所述的试剂盒能够在受检者任何一个年龄阶段进行检测,结合受检者环境暴露因素,提示受检者不同时期罹患鼻咽癌的风险程度,能够进行大规模人群普查、筛选鼻咽癌发病高危人群,实现鼻咽癌发病风险预测、预警,提高早诊率。
具体实施方式
1、本发明所述的试剂盒所检测的受检者基因组SNP位点(7个)
通过本发明人大规模样本量的鼻咽癌全基因组关联分析,得到与鼻咽癌发病显著相关的SNP,另外结合HapMap,dbSNP等数据库挑选出SNP位点,并进行位点实验成功率评分,确定要进行研究的7个SNP位点。其中,rs1412829位于基因CDKN2A-CDKN2B区域,rs1572072和rs9510787位于基因TNFRSF19区域,rs2860580、rs2894207和r s28421666位于基因HLA区域,rs6774494位于基因MDS1-EVI1区域。
表1、与鼻咽癌发病显著相关的7个SNP位点
2.设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物并合成。
表2、待测SNP位点的PCR扩增引物(PCRP)及单碱基延伸引物(UEP)
3、DNA提取
使用Qiagen DNA midi kit(100)试剂盒或类似产品,提取组织、细胞或血样中的DNA。用分光光度计定量,琼脂糖凝胶电泳质检,基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/ul,转移至384孔板,-20℃储存备用。
4、PCR扩增
PCR扩增采用多重PCR技术,在384孔板中进行,每个反应体系总体积为5ul。
(1)在一个新的1.5ml EP管中配制PCR master mix溶液。
(2)使用24通道加样器,调节加样体积为4ul,在384孔板的每个加样孔中加入PCRmaster mix液。该384孔板即为PCR反应板。
(3)取出已经制备好的DNA样品384孔板,使用24通道加样器,调节加样体积为1ul,每个5ulPCR反应体系中包含模板DNA20-50ng,Hotstar Taq0.5U,每条扩增引物0.5pmol,0.1ul的25mM dNTPs。
(4)在兼容384孔板的PCR仪上设定PCR反应条件为:94℃4分钟;94℃20秒,56℃30秒,72℃1分钟,45个循环;72℃3分钟;4℃保持。将384孔PCR反应板放置于PCR仪上,启动PCR反应。
5、PCR产物碱性磷酸酶处理
(1)在PCR反应结束后,将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase,虾碱性磷酸酶)处理,以去除体系中游离的dNTPs。
(2)配制碱性磷酸酶处理反应液,SAP Mix。
SAPMix | 对每个反应,ul |
水 | 1.53 |
SAP缓冲液(10x) | 0.17 |
SAP酶(1.7U/ul) | 0.3 |
总体积 | 2 |
(3)使用24通道加样器,调节加样体积为2ul,将SAP Mix加入384孔PCR反应板。
对于每个碱性磷酸酶处理反应孔,反应体系总体积为7ul,其中PCR产物5ul,SAP
混合液2ul(SAP0.5U,buffer0.17ul)。
(4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上,设定PCR反应条件:37℃40分钟;85℃5分钟;4℃维持,启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
6、单碱基延伸
(1)在碱性磷酸酶处理结束后,进行单碱基延伸反应,反应体系总体积9ul。
(2)配制单碱基延伸反应液,EXTEND Mix。
EXTEND Mix | 对每个反应,ul |
水 | 0.619 |
延伸引物混合物1或2 | 0.94 |
iPLEX缓冲液plus | 0.2 |
iPLEX终止液 | 0.2 |
iPLEX酶 | 0.041 |
总体积 | 2 |
(3)使用24通道加样器,调节加样体积为2ul,将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔,单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7ul及EXTEND Mix液2ul.(其中各延伸反应引物混合物0.94ul,iPLEX酶0.041ul,延伸混合物0.2ul)。
(4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上,设定PCR反应条件:
I.94℃,30秒
II.94℃,5秒
III.52℃,5秒
IV.80℃,5秒
V.回到III,4次或以上
VI.回到II,39次或以上
VII.72℃,3分钟
VII.4℃恒定
启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
7、树脂纯化
(1)将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中;
(2)加16ul水到延伸产物的对应孔内;
(3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中,封膜,低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触;
(4)离心使树脂沉入孔底部。
8、芯片点样
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪,将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
9、质谱检测
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of fligh,基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析,检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
10、测试样品来检测基因分型结果的准确性。
验证样品的结果与原先所作的基因分型结果是否一致。或者通过直接测序的结果和芯片检测的结果进行统计分析验证基因分型的准确率。
结果:
对于本发明所述的试剂盒的效果,本发明人通过灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、受试者工作特性(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线、疾病风险再分类(Reclassification)等对基于遗传因素(此试剂盒涵盖的7个SNP位点)和环境因素构建的鼻咽癌预测模型的拟合效果进行分析。
鼻咽癌与7个单核苷酸多态性的关联分析:如表3所示,logistic回归的关联分析表明,7个SNP均与鼻咽癌的发病风险相关,其中位于HLA区域的三个SNP位点rs2860580、rs2894207、rs28421666与鼻咽癌关联的OR较高,平均每个等位基因的OR值(95%CI)分别为1.85(1.63-2.09)、1.72(1.46-2.02)、1.54(1.30-1.83),且趋势线检验P值均小于0.001。
表3、鼻咽癌发病风险和7个SNP的关联分析
每个SNP的比值比在调整年龄、性别、教育程度、方言、居住类型后用logistic回归分析进行评估发病风险预测模型:如表4所示,三种模型拟合性都很好,其中综合流行病学因素和遗传风险因素的模型拟合度最好,AUC值为0.73。
表4、AUC(曲线下面积)评估基于不同因素的发病风险预测模型
a.流行病学模型结合环境暴露因素(包括咸鱼食用量、新鲜水蔬食用量、吸烟史)和肿瘤家族史;遗传风险模型包括7个SNP分型结果;综合模型整合了受试者的流行病学因素和遗传学因素。
b.依据Hosmer Lemeshow拟合优度检验计算χ2值和P值,χ2值<20(P>0.01)被认为是校正好的的模型。
c.模型中的AUC值以非参数方法比对,P值是以综合模型为基准计算的。
对流行病学模型和综合模型数据再分类:如表5所示,计算得到综合判别改善IDI(integrated discrimination index)为0.05,P<0.001;净再分类改善NRI(netreclassification improvement)为16%,P<0.001,说明模型中增加包含7个SNP位点的遗传因素能更好的预测鼻咽癌发病风险。
表5、流行病学模型和综合模型的数据再分类
特异性和灵敏性:基于本发明所述的7个SNP位点的遗传因素模型的灵敏度为58.18%,比鼻咽癌家族史这一涵盖有部分遗传因素在内的预测模型灵敏度(17.16%)要高41.02个百分点,而包含了流行病学和基于7个SNP位点的遗传因素在内的综合预测模型灵敏度和特异度分别达到了较高的值。
表6、预测鼻咽癌发病风险各因素的灵敏度和特异性
模型 | 灵敏度 | 特异度 |
基于鼻咽癌家族史模型 | 17.16% | 94.45% |
基于环境因素的模型 | 60.71% | 67.17% |
流行病学(鼻咽癌家族史和环境因素)模型 | 63.37% | 67.99% |
遗传因素模型 | 58.18% | 61.69% |
综合模型(流行病学因素和环境因素) | 63.73% | 72.58% |
本发明所述的试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点。基于本发明所述的试剂盒可应用于鼻咽癌发病风险预测,将所得到鼻咽癌发病的遗传危险系数代入本发明提及的综合考虑模型,即基于咸鱼食用量、新鲜水果蔬菜食用量、吸烟史等环境暴露因素、肿瘤家族史因素及遗传因素(基于7个SNP位点)的鼻咽癌发病风险预测的综合模型,能够预测个体罹患鼻咽癌的风险。
Claims (8)
1.一种用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:检测鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位点rs2860580的PCR扩增引物和单碱基延伸引物;检测鼻咽癌易感基因TNFRSFl9区域的SNP位点rsl572072和rs9510787的PCR扩增引物和单碱基延伸引物;检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs28421666、rs2860580和rs2894207的PCR扩增引物和单碱基延伸引物;检测鼻咽癌易感基因MDSl-EVIl的SNP位点rs6774494的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。
2.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒,其特征在于:所述检测鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位点rs2860580的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ ID NO:3。
3.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒,其特征在于:所述检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19区域的SNP位点rs1572072的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ IDNO:6。
4.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒,其特征在于:所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs28421666的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ ID NO:9。
5.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒,其特征在于:所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs2860580的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ ID NO:12。
6.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒,其特征在于:所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs2894207的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ ID NO:15。
7.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒,其特征在于:所述检测鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位点rs6774494的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQID NO:18。
8.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒,其特征在于:所述检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19的SNP位点rs9510787的两个PCR扩增引物,其序列分别为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20,以及单碱基延伸引物,其序列为SEQ IDNO:21。
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