CN1482256A - 鼻咽癌分子标志物—brd7试剂盒 - Google Patents
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Abstract
鼻咽癌分子标志物—BRD7试剂盒。本发明通过PCR技术和直接测序法对BRD7基因的编码区进行单核苷酸多态性(Coding－region Single Nucleotide Polymorphism，cSNP)分析，并计算基因型在对鼻咽癌患者和正常人群中的分布。利用BRD7基因编码区同一外显子两个偶联的cSNP等位基因型T450和G737多态性，制成价廉简便的鼻咽癌早期基因诊断试剂盒。该试剂盒的使用将提高鼻咽癌的早期诊断、改善鼻咽癌的预后，提高鼻咽癌的生存率，这将是一个成本低，但具有潜伏巨大的市场的诊断试剂盒，具有明显的社会效益和经济效益。
Description
[技术领域]本发明涉及一种用于诊断鼻咽癌的分子标志物。
[背景技术]鼻咽癌是我国南方高发的一种恶性肿瘤，湖南省是鼻咽癌高发省之一。目前鼻咽癌筛查所用的检测方法，多为EB病毒的血清学检查和EB病毒检测。由于EB病毒产生抗体需要一段相对较长的时间，且检测方法的敏感性和特异性并不理想，因此尚不能做到真正意义上的早期诊断。
随着肿瘤分子机制的深入研究，肿瘤分子标志物的检测将成为21世纪肿瘤(癌)筛检的方向。SNP是基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入/缺失等，据估计基因组中大约平均每1000bp就会有一个SNP。SNP可以划分两种形式：一即基因编码区(Coding Region)的功能性变异，二遍布于整个基因组的非编码区(调控区、内含子和剪接连接区等)的单核苷酸变异。SNP作为第三代遗传标记不仅用于致病基因的搜寻和进化、种群多样性研究，更重要的是，SNP尤其是cSNP与人类各种遗传特征相关。
[发明内容]本发明的目的是利用BRD7基因编码区C450T和A737G的多态性，提供一种鼻咽癌分子标志物-BRD7试剂盒。
研究表明BRD7基因是鼻咽癌良好的候选抑瘤基因。本发明采用PCR-SSCP技术和直接测序法对BRD7基因的编码区进行单核苷酸多态性(Coding-region Single Nucleotide Polymorphism，cSNP)分析，并对鼻咽癌家系的高危成员、散发性鼻咽癌病人和正常人进行BRD7基因等位基因分型。在BRD7基因的编码区发现了2个cSNP(C450T和A737G)，T450与G737多态性偶联发生在87.7％的鼻咽癌活检组织和配对外周血、所有的鼻咽癌家系的患者及易感成员中，仅存在于22％的正常人血标本中。T450和G737偶联的多态性改变是鼻咽癌发生和发展的重要的遗传易感风险之一(P＜0.01)，可以作为鼻咽癌的分子标志物，用于鼻咽癌高危人群的筛选和早期诊断。
运用BRD7基因编码区的C450T和A737G多态性制作诊断试剂盒。
1.RNA抽提与差异RT-PCR
按照TRIzolTM试剂盒(Gibco BRL公司)操作程序提取鼻咽癌活检组织RNA；后用DNase-I消化RNA中痕量DNA，PCR扩增GADPH检测无特异扩增条带以保证DNA消化完全。RNA取量约为2μg按RT试剂盒(Promega)操作步骤进行逆转录反应。采用下列参数进行差异PCR扩增BRD7基因的cDNA编码区：94℃变性50s；55℃复性50s；72℃延伸1min；30个循环终止。
2.SSCP
为了检测BRD7基因在鼻咽癌中有无突变，5μl PCR产物加等量的加样缓冲液，95℃，3min后冰浴5min，其5μl上样于9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，10mM电泳3～5h。取下凝胶按下列程序银染：10％乙醇固定10min；1％HNO3 10min，双蒸水洗一次；0.2％AgNO3 20min，洗两次；3％的Na2CO3(0.05％甲醛)显色至条带清晰为止。
3.基因组DNA提取
抽提50例鼻咽癌活检组织及配对血标本、50例正常人外周血淋巴细胞和2个家系永生化淋巴细胞基因组DNA。
4.特异性PCR和测序
根据上述多态性结果，选择扩增多态性高发区的两端引物(5’-GAACAGACACCCCTTCAAG-3’和5’-TGTGAGGTGTCTGTTCCA-3’)。根据其位于在同一个外显子，直接对基因组DNA进行扩增。模板量取1μg，参数同上。PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶分离后QIAQUIK Gel Extraction Kit回收、纯化后，用ABI公司的377型DNA自动测序仪直接测序分析。
5.统计学处理
对BRD7等位基因型在鼻咽癌人群和正常人分布，采用SPSS软件进行统计学处理。
该试剂盒的制作可以通过如下步骤进行：收集鼻咽癌病人的外周血淋巴细胞，抽提病人外周血淋巴细胞的DNA，就BRD7基因编码区同一外显子两个偶联的cSNP等位基因型T450和G737多态性的两侧设计引物约500bp，直接对基因组DNA进行PCR扩增，模版量取1ug，参数为94℃变性50s；55℃复性50s；72℃延伸1min；30个循环终止。PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶分离后QIAQUIK Gel Extraction Kit回收、纯化后测序分析，检测鼻咽癌患者BRD7基因两个SNP的基因型。
利用BRD7基因编码区同一外显子两个偶联的cSNP等位基因型T450和G737多态性，制成价廉简便的鼻咽癌早期基因诊断试剂盒。该试剂盒的使用将提高鼻咽癌的早期诊断、改善鼻咽癌的预后，提高鼻咽癌的生存率，这将是一个成本低，但具有潜伏巨大的市场的诊断试剂盒，具有明显的社会效益和经济效益。
[附图说明]
图1：BRD7基因的等位基因纯合子AA；
图2：BRD7基因的等位基因纯合子AC；
图3：BRD7基因的等位基因纯合子CC；
图4：BRD7基因的等位基因纯合子CT；
图5：BRD7基因的等位基因纯合子TT；
图6：BRD7基因的等位基因纯合子AA；
图7：BRD7基因的等位基因纯合子AG；
图8：BRD7基因的等位基因纯合子GG。
Claims (1)
1.鼻咽癌分子标志物-BRD7试剂盒，其特征在于：本发明通过收集鼻咽癌病人的外周血淋巴细胞，抽提病人外周血淋巴细胞的DNA，就BRD7基因编码区同一外显子两个偶联的cSNP等位基因型T450和G737多态性的两侧设计引物约500bp，直接对基因组DNA进行PCR扩增，模版量取1ug，参数为94℃变性50s；55℃复性50s；72℃延伸1min；30个循环终止，PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶分离后QIAQUIK Gel Extraction Kit回收、纯化后测序分析，检测鼻咽癌患者BRD7基因两个SNP的基因型。
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