CN110331198A - 一种用于肿瘤预后的snp标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤预后的SNP标志物，所述SNP标志物为RPA1基因上的SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734中的至少一个；以及用于检测SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的特异性扩增引物及其应用。本发明提供了与肿瘤预后和放化疗疗效相关的SNP标志物及其应用，以及可用于肿瘤预后和放化疗疗效预测的检测试剂盒，以用于辅助指导个体化治疗和改善肿瘤患者的预后；将本发明的试剂盒应用于临床检测后，能够在治疗前对患者的预后进行评估，针对预后不良的患者制定更加积极有效的治疗方案，从而实现患者的个体化治疗，提供生存率；此外，该试剂盒只需要对外周血进行检测，具有取样方便、操作简单、时效性高等特点。

Description

一种用于肿瘤预后的SNP标志物及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种用于肿瘤预后的SNP标志物及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是新世纪危害人类健康的主要疾病之一，也是全球较大的公共卫生问题之一，给社会带来极大的疾病负担。近20年间，恶性肿瘤已成为我国居民的第一位致死原因。因此，肿瘤防治是全人类重中之重的一大任务。

随着社会需求，各种肿瘤治疗的手段(如放射治疗，化学药物治疗以及生物疗法)迅速发展，肿瘤患者在肿瘤治疗中得到一定受益；但是肿瘤治疗策略中仍存在一些失误，这些失误不仅使患者遭受不少治疗之苦，而且在部分肿瘤中预后得不到很好的改善。这当中的治疗失误其一是广泛地存在过度治疗的现象，尽管存在部分患者接受治疗后并不能得益于相应的治疗，但事实是几乎所有的患者都无不例外的接受治疗，最终结果导致患者生活质量下降，治疗效果与预期不符；其二是忽视了肿瘤固有的生物学特性及个体差异性，没有充分重视肿瘤对于治疗的敏感性以及患者本身的遗传背景，导致患者接受同样的治疗却表现出不同的预后。

放射治疗和化学药物治疗是肿瘤的主要疗法。随着现代计算机和医学影像技术的发展，放射治疗技术已取得极大进步，应用于大部分的恶性肿瘤患者中，对放射治疗敏感的肿瘤包括非小细胞肺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、睾丸精原细胞瘤、肾胚胎瘤、恶性淋巴瘤、以及鼻咽癌等。化学药物治疗是治疗恶性肿瘤的另一重要手段，已从原来主要用于姑息治疗转变成一种重要的肿瘤根治方法。近年来多种肿瘤的化疗疗效等到了显著提高，包括急性白血病、乳腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、睾丸癌等，其中部分患者可根治。为了更好的提高疗效，临床治疗往往采用放化疗结合的方法。放化疗结合在放疗之外，给予患者口服或静脉注射化疗药物，包括同步放化疗，诱导化疗，辅助化疗等，显著提高了肿瘤患者的治疗效果与生存获益。

遗传多态性是指同一生物群体中有两种或两种以上变异类型或基因型并存的现象，遗传多态性的存在决定了不同个体对疾病易感性不同、对药物或其他治疗的反应也存在差异。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是最主要的也是最常见的一种基因组可遗传变异。SNP是由单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的遗传多态性，广泛分布于人类基因组中。作为第三代遗传标记，近年来被广泛应用于恶性肿瘤等重大疾病的诊断以及预后预测，并且表现出快速、灵敏、准确等特点，因而具有广阔的应用前景。

目前还没有能够准确、有效地判断肿瘤预后的SNP位点被应用于肿瘤预后预测。但是，在已有的一些报道中探讨了相关基因的变异与肿瘤预后的相关性，涉及DNA修复基因(ERCC1，XRCC1)、趋化因子(CXCL12，MCP-1)、基质金属蛋白酶(MMP-9，MMP-1)、白细胞介素(IL-8)、肿瘤抑制基因(TP53)、细胞周期相关基因(CCNE1)、前列腺素合成关键基因(PTGS2)、泛素蛋白连接酶(MDM2)等；然而由于这些研究所涉及样本量相对较小，受人群结构等混杂因素影响较大，所得结果仍存在一些争议，其潜在价值不足以得到进一步的开发和应用。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种与肿瘤预后和放化疗疗效相关的SNP标志物及其应用方法，以及可用于肿瘤预后和放化疗疗效预测的检测试剂盒，以用于辅助指导个体化治疗和改善肿瘤患者的预后。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种用于肿瘤预后和放化疗疗效预测的SNP标志物，所述SNP标志物为RPA1基因上的SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734中的至少一个。由此，本发明中用于肿瘤预后和放化疗疗效预测的SNP标志物可以是rs1131636、rs3744767和rs17734中的一个，也可以是rs1131636、rs3744767和rs17734的SNP位点两两组合，还可以是SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734三个一起作为用于肿瘤预后和放化疗疗效预测的SNP标志物组合；需要说明的是，所述SNP标志物适用于所有肿瘤的预后和放化疗疗效预测，尤其是放疗敏感的肿瘤如鼻咽癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、睾丸精原细胞瘤、肾胚胎瘤、恶性淋巴瘤、以及非小细胞肺癌等和化疗敏感的肿瘤如急性白血病、乳腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、睾丸癌等。

在第二个方面，本发明提供了一种用于检测SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的特异性核酸亲和配体，其特征在于，所述特异性核酸亲和配体的碱基序列如SEQID NO.1和2所示。需要说明的是，本发明中用于检测SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的特异性核酸亲和配体的碱基序列包括但不限于如SEQ ID NO.1和2所示的碱基序列，还包括其它与SEQ ID NO.1和2所示的碱基序列一致性达到90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的核酸亲和配体，只要该核酸亲和配体能特异性检测出SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的基因型即可。

在第三个方面，本发明提供了上述的特异性核酸亲和配体在制备用于预测肿瘤预后和/或预测肿瘤放化疗疗效的试剂盒中的应用。优选地，所述肿瘤为鼻咽癌。

在第四个方面，本发明提供了一种用于预测肿瘤预后和/或预测肿瘤放化疗疗效的试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性核酸亲和配体。需要说明的是，用于检测出SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的基因型的方法包括但不限于本发明中的PCR+Sanger测序法，还可以用Taqman或者其他技术检测SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的基因型，因此，其它能检测SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的基因型的方法涉及的试剂也落在本发明的保护范围内。

优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶和去离子水。

在第五个方面，本发明提供了上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)采集待测者外周血，并提取基因组DNA；

(2)以步骤(1)所得基因组DNA为模板，使用权利要求4所述试剂盒进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)所得PCR产物进行测序，获得待测者SNP位点基因型数据并结合统计分析方法，对待测者肿瘤预后和/或肿瘤放化疗疗效进行预测。

优选地，所述步骤(2)中PCR扩增程序为：94℃、2min；98℃、10s，56℃、30s，68℃、40s，33cycles；4℃，∞。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明提供了与肿瘤预后和肿瘤放化疗疗效相关的SNP标志物及其应用，以及可用于肿瘤预后和肿瘤放化疗疗效预测的检测试剂盒，以用于辅助指导个体化治疗和改善肿瘤患者的预后；

本发明提供的检测试剂盒能够通过对肿瘤患者的外周血DNA上的SNP位点进行检测，从而准确预测肿瘤患者的预后；

将本发明的试剂盒应用于临床检测后，能够在治疗前对患者的预后进行评估，针对预后不良的患者制定更加积极有效的治疗方案，从而实现患者的个体化治疗，提供生存率；此外，该试剂盒只需要对外周血进行检测，具有取样方便、操作简单、时效性高等特点。

附图说明

图1为PCR产物电泳结果示意图；

图2为基因分型结果示意图；

图3为总生存曲线图；

图4为无疾病生存曲线图；

图5为无远处转移生存曲线图；

图6为总生存曲线图；

图7为总生存曲线图。

具体实施方式

本发明属于生物医学技术领域，涉及肿瘤的预后，尤其涉及单核苷酸多态性位点与肿瘤预后和肿瘤放化疗疗效的相关性，特别涉及RPA1(复制蛋白A1)基因的单核苷酸多态性位点rs1131636、rs3744767和rs17734与肿瘤预后和/或肿瘤放化疗疗效的相关性及其应用。

本发明的技术方案具体包括以下内容：

(1)以标准操作流程采集患者的外周血样本，系统收集完整的人口学资料和临床信息；

(2)对患者进行定期随访，进行完整的随访资料登记；

(3)对患者进行SNP分型，获取其基因型信息；

(4)基于患者基因型对其预后进行预测；

(5)基于患者基因型对其分层分析。

具体而言，本发明中涉及的实验方法主要包括以下几个部分：

(1)研究样本的选择：

本发明纳入的样本均为在中山大学肿瘤防治中心经病理学确诊的鼻咽癌患者，具有完整的病历资料(含肿瘤分期、病史、检查结果、既往治疗方案等)；患者必须为无肿瘤发病史的初诊患者，且入院前没有接受过与肿瘤相关的放射治疗、化学药物治疗及其他抗肿瘤治疗；患者均为自愿参与研究并签署知情同意书。对纳入研究的患者进行定期随访，在治疗结束后两年内每隔三个月随访一次，其后每隔半年随访一次。

(2)外周血基因组DNA提取：

在第一次治疗开始之前使用EDTA抗凝管采集患者外周血并保存于-80℃冰箱；利用酚-氯仿法按照常规操作流程提取外周血基因组DNA，所获DNA样品浓度通常为20-50ng/μl，纯度(OD260/280)一般在1.6-2.0之间。

(3)试剂盒制备方法：

用于肿瘤预后预测的试剂盒包含特异性扩增包含SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的DNA片段的正向引物5′-CCATCCCCGCTCACAACTT-3′(SEQ IN NO.1)和反向引物5′-GCATTTCAGGGCTGCAAACA-3′(SEQ IN NO.2)，以及PCR缓冲液、dNTP、氯化镁、聚合酶、去离子水等辅助成分。

(4)SNP位点分型：

对包含SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的DNA片段进行特异性扩增，并进一步对扩增产物进行测序，获得上述位点的基因型信息。

(5)统计分析方法：

利用比例风险回归模型(proportional hazards model，简称Cox模型)，分析人口学因素和临床因素(含性别、年龄、临床分期、是否使用调强放疗、是否使用同步放化疗、是否使用诱导化疗、是否使用辅助化疗等)与肿瘤预后的相关性；进一步将与肿瘤预后显著相关的因素(含性别、年龄、临床分期、是否使用调强放疗、是否使用同步放化疗等)作为协变量，计算出SNP基因型对于肿瘤预后的风险比(Hazard ratio，HR)、95％置信区间(95％confidence interval，95％CI)以及P值。统计学分析采用SPSS分析软件完成，统计学显著性水平为P＜0.05，所有检验均为双侧检验。

(6)结果分析：

1.预后分析结果：

与携带rs1131636位点CC基因型的鼻咽癌患者相比，携带rs1131636位点CT/TT基因型的患者具有更短的总生存(HR＝1.81，95％CI＝1.42-2.31，P＝1.84×10^-6)、无疾病生存(HR＝1.48，95％CI＝1.22-1.80，P＝9.14×10^-5)和无远处转移生存(HR＝1.52，95％CI＝1.21-1.90，P＝0.0003)时间。

2.分层分析结果：

携带rs1131636位点CT/TT基因型的患者接受同步放化疗的疗效显著优于单纯放疗的患者，总生存(HR＝0.80，95％CI＝0.67-0.96；P＝0.0167)，而携带rs1131636位点CC基因型的患者接受单纯放疗和同步放化疗没有显著性意义。提示携带rs1131636位点CT/TT基因型的患者可优先予以同步放化疗治疗。

在一些实施例中，本发明提供了一种与肿瘤预后和放化疗疗效相关的SNP标志物及其应用方法，并研制出可用于肿瘤预后和放化疗疗效预测的检测试剂盒，以用于辅助指导个体化治疗和改善肿瘤患者的预后。

在一些实施例中，本发明提供了一种用于肿瘤预后和放化疗疗效预测的SNP标志物，其包括RPA1基因上的SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734中的至少一个；

上述SNP位点基本信息如下表1所示：

表1 相关SNP位点的基本信息

在一些实施例中，本发明提供了一种上述SNP位点的特异性扩增引物，该特异性扩增引物是针对上述SNP位点序列特征而设计，能够扩增出同时包含上述三个SNP位点的DNA片段，其碱基序列为：5′-CCATCCCCGCTCACAACTT-3′(正向引物，SEQ IN NO.1)；5′-GCATTTCAGGGCTGCAAACA-3′(反向引物，SEQ IN NO.2)。

在一些实施例中，本发明提供了一种上述SNP位点的特异性扩增引物在制备用于肿瘤预后和放化疗疗效相关的预测试剂盒中的应用。

在一些实施例中，本发明提供了一种能够用于肿瘤预后和放化疗疗效相关的预测的试剂盒，其包括上述SNP位点的特异性扩增引物，以及PCR缓冲液、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶、去离子水等辅助成分；在一些实施例中，该试剂盒还包含相应的标准品和/或对照品。

在一些实施例中，本发明提供了上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)采集待测者外周血，并提取基因组DNA；

(2)使用上述试剂盒进行PCR扩增，PCR反应程序设定为：94℃、2min；98℃、10s，56℃、30s，68℃、40s，33cycles；4℃，∞。

(3)对PCR产物进行测序，获得SNP位点基因型数据并对待测者预后进行预测。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。若无特别指明，以下实施例中所涉及的研究方法均为常规方法。

实施例1

本发明中用于肿瘤预后和/或放化疗疗效的试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包括用于检测SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的特异性扩增引物、PCR缓冲液、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶和去离子水；其中，特异性扩增引物的碱基序列如SEQ ID NO.1和2所示。

实施例2 样本采集和临床及随访资料整理

样本采集主要针对从2003年3月至2012年4月期间在中山大学肿瘤防治中心确诊为鼻咽癌且接受后续治疗的患者，通过对临床资料进行整理，选择了符合标准的3257例样本进行后续的基因分析和预后分析。所有患者均具有明确的病理学诊断和完整的病历资料(含肿瘤分期、病史、检查结果、既往治疗方案等)；所有患者均为无肿瘤发病史的初诊患者，且入院前没有接受过与肿瘤相关的放射治疗、化学药物治疗及其他抗肿瘤治疗；所有患者均为自愿参与研究并签署知情同意书。对纳入研究的患者进行定期随访，在治疗结束后两年内每隔三个月随访一次，其后每隔半年随访一次，末次随访时间为2016年8月22日，纳入的鼻咽癌患者临床信息与预后资料整理如下表2所示。

表2 纳入样本临床特征及预后情况

实施例3 患者DNA扩增及基因型检测

取实施例2中患者的外周血样本按照酚-氯仿法标准流程进行处理后，提取出基因组DNA，DNA浓度为20-50ng/μl，纯度(OD260/280)在1.6-2.0之间，使用特异性的扩增引物[正向引物：5′-CCATCCCCGCTCACAACTT-3′(SEQ IN NO.1)，反向引物：5′-GCATTTCAGGGCTGCAAACA-3′(SEQ IN NO.2)]和实施例1的试剂盒进行PCR扩增，反应体系如表2所示。

表3 PCR反应体系

PCR扩增反应程序设置为：94℃、2min；98℃、10s，56℃、30s，68℃、40s，33cycles；4℃，∞。

PCR反应结束后，进行DNA电泳(1％琼脂糖凝胶，电压：120V，时间30分钟)对PCR产物进行检测，选取片段大小符合预期(673bp)、条带单一、亮度适中的PCR产物(如图1所示)，用ABI 3730测序仪进行测序，测序结果如图2所示。

实施例4 肿瘤预后预测

结合基因SNP分析结果(由实施例3的测序结果得出)以及实施例2的纳入的鼻咽癌患者随访数据进行相关性分析可知，与携带rs1131636位点CC基因型的鼻咽癌患者相比，携带rs1131636位点CT/TT基因型的患者具有更差的总生存(HR＝1.81，95％CI＝1.42-2.31，P＝1.84×10^-6，如图3所示)、无疾病生存(HR＝1.48，95％CI＝1.22-1.80，P＝9.14×10^-5，如图4所示)和无远处转移生存(HR＝1.52，95％CI＝1.21-1.90，P＝0.0003，如图5所示)。

实施例5 肿瘤放化疗效预测

结合基因SNP分析结果(由实施例3的测序结果得出)以及实施例2的纳入的鼻咽癌患者随访数据进行相关性分析可知，携带rs1131636位点CT/TT基因型的患者接受同步放化疗的疗效显著优于单纯放疗的患者，总生存(HR＝0.80，95％CI＝0.67-0.96；P＝0.0167，如图6所示)，而携带rs1131636位点CC基因型的患者接受单纯放疗和同步放化疗没有显著性意义(如图7所示)。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学肿瘤防治中心

<120> 一种用于肿瘤预后的SNP标志物及其应用

<130> 2018

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccatccccgc tcacaactt 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcatttcagg gctgcaaaca 20

Claims (7)

1.一种用于肿瘤预后的SNP标志物，其特征在于，所述SNP标志物为RPA1基因上的SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734中的至少一个。

2.用于检测SNP位点rs1131636、rs3744767和rs17734的特异性核酸亲和配体，其特征在于，所述特异性核酸亲和配体的碱基序列如SEQ ID NO.1和2所示。

3.权利要求2所述的特异性核酸亲和配体在制备用于预测肿瘤预后和/或预测肿瘤放化疗疗效的试剂盒中的应用。

4.一种用于预测肿瘤预后和/或预测肿瘤放化疗疗效的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的特异性核酸亲和配体。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶和去离子水。

6.权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采集待测者外周血，并提取基因组DNA；

(2)以步骤(1)所得基因组DNA为模板，使用权利要求4所述试剂盒进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)所得PCR产物进行测序，获得待测者SNP位点基因型数据并结合统计分析方法，对待测者肿瘤预后和/或肿瘤放化疗疗效进行预测。

7.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增程序为：94℃、2min；98℃、10s，56℃、30s，68℃、40s，33cycles；4℃，∞。