CN108315416A - 基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法，属于生物分子检测领域。本发明公开了基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法及试剂盒，包含肿瘤组织DNA提取的方法；设计肺癌靶向治疗分子诊断相关基因的panel；PCR引物扩增；文库构建和高通量测序的流程方法。本发明公开的确定肺癌基因突变位点的特异性引物和试剂盒用于检测16个致癌基因的316个突变情况，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。本发明的检测方法和试剂盒灵敏度高达1％，检测结果明确客观，可以直接反应相关基因的具体突变位点，对癌症早期诊断或辅助诊断及筛查和癌症愈后监测有重要意义。

Description

基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒 及方法
技术领域
本发明属于生物分子检测领域，更具体地说，涉及一种基于高通量测序技术的肺癌靶向治疗分子诊断引物、试剂盒及诊断方法。
背景技术
根据国家癌症中心公布的最新数字显示，我国恶性肿瘤发病及死亡居首位的是肺癌，每年新发病例约73.3万，死亡约59.1万，占所有因癌死亡人数的35％以上，超越了交通事故、自然灾害等，成为了影响我国人口死亡的最主要因素。对比过去三十年统计数据，我国肺癌的死亡率上升了465％。而根据美国癌症协会公布的《2017年度美国癌症数据调查报告》显示，美国肺癌发病率和死亡率持续显著下降。该报告分析认为，美国肺癌发病率和死亡率呈现双下降主要得益于三大因素：积极控烟、推广筛查和新型疗法的应用。大量学者和医务人员也认为推广筛查和新型疗法的应用将大大推进我国的肺癌筛查、诊断和治疗水平。
目前，我国临床上对肺癌仍以组织病理学诊断为确诊和治疗的依据，使用的治疗方法是根据其分期采取手术或手术结合放化疗进行治疗。但由于肺癌缺乏有效的早期诊断手段以及受国民健康意识的影响，70％以上的患者在确诊时已是中晚期，错过了最佳手术时期。而肺癌各种化疗方案的总体有效性仅为30％左右，同时有些患者无法耐受化疗和放疗以及化疗后很快耐药，从而导致肺癌患者确诊后5年生存率很低，晚期患者五年生存期小于15％。
近年来，分子靶向治疗逐渐受到人们的关注且在欧美国家已广泛应用于临床。分子靶向治疗是使用药物针对已经明确的致癌基因，特异地杀死肿瘤细胞，因此分子靶向治疗的副作用更小和特异性更高，也为晚期肺癌患者提供了新的有效治疗手段。这其中最典型的例子是肺腺癌的EGFR突变靶向治疗。在我国，约30％非小细胞肺癌患者存在EGFR突变。对这类患者采用EGFR激酶抑制剂-吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼，有效率可以达到70％～80％。过去十年针对肺癌的特定基因突变开展的靶向治疗就已让晚期肺癌患者中位生存期显著增加2.4倍，从此前的14.1个月延长至33.5个月，相较于传统的治疗方法优势明显。目前，临床上关于肺癌的靶向药物，然而除激酶抑制剂-吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼以外，还有多种基因特异位点的抑制剂对肺癌显示出较好的抑制效果。然而，并非所有的肺癌患者对分子靶向治疗均表现出较好的疗效，比如现有资料表明EGFR基因突变与EGFR激酶抑制剂敏感性相关，EGFR基因突变患者对EGFR激酶抑制剂吉非替尼的有效率达60％以上，而EGFR基因野生型(即未突变型)患者的有效率仅为10％～15％。因此，明确肺癌组织的突变状况对靶向药物的临床使用和疗效预测有重要的指导意义。而分子靶向药物的使用需要明确肿瘤患者存在可靶向治疗的基因突变，所以基因突变的检测是确定治疗方案的关键。
临床中肺癌的诊断样品70％是小的活检样品，其首先被用于临床病理学诊断，剩下的有限组织若要用作分子诊断，则对其核酸含量及提取方法都有较高的技术操作要求。且病理形态相同的肺癌，由于分子遗传学改变，在分子水平上呈现高度异质，这种组织的异质性使得一些活检样本无法反应肿瘤基因突变的全貌，从而导致对靶向治疗的反应差别很大。同时，肿瘤异质性也是不断变化的，无法通过一两次的活检或组织样本来检测患者的病情。
高通量测序技术通过多基因、多位点的集成式检测，可一次性检测与肿瘤靶向治疗密切相关的基因位点。它所需的核酸要求不高，是应用于肿瘤基因检测的一个很好的选择。此外，肿瘤是基因组疾病，单一基因的检测难以满足指导个体化治疗的需要。而以高通量测序和大数据分析为基础，对肺癌进行多基因突变检测，能够精确的地给出患者癌组织的基因突变信息，从而指导医生为病人制定针对性的个性化靶向治疗方案。同时，也可用于肺癌病人的早期诊断和筛查。目前，在美国高通量测序技术已广泛用于癌症的筛查、诊断和治疗过程中，对美国癌症的死亡率下降做出了突出的贡献。
然而，在国内市场上对于肺癌的检测主要停留在单个或几个位点的检测水平，检测方法一般使用荧光PCR、芯片分析等方法，例如，中国专利申请号为201310200169.7，申请公布日为2013年9月11日的专利文件公开了一种用于检测ALK基因表达的探针、引物及试剂盒，包括以下序列：SEQ ID NO1-SEQ ID NO12，该发明的引物和探针可以特异检测ALK基因表达差异，以确定是否存在ALK基因融合，该发明建立的用于检测ALK基因表达差异的实时荧光PCR体系，通过检测5’端和3’端基因表达量的差异，提供ALK基因表达差异外显子的定性评估，适用于肺癌患者在进入个性化靶向治疗之前。中国专利申请号为201310068052.8，申请公布日为2013年6月5日的专利文件公开了一种早期肺癌多位点关联基因的引物、探针、试剂盒及其制备方法和检测方法。该发明针对肺癌的早期检测与之相关联的EGFR，CHRNA3，CHRNA5及ERCC1基因内部的rs2239680，rs16969968，rs12910984及rs2298881位点的基因型进行分型，利用以上4个位点联合作为肺癌早期诊断的标志物，提高了检测的真实性和准确性。然而，由于癌症是基因组疾病，单一或几个基因突变位点的检测难以满足指导个体化治疗的需要。已经报道的几种检测肺癌的方法只包含了极少的几个基因突变位点，不能有效的反应患者癌症突变的全貌，难以用于临床指导，且临床发现单一基因的靶向用药多数存在治疗无效或很快产生药物抗性等不利反应，因此，我们需要一种更加全面有效的检测手段。同时，对癌症进行全基因组或全外显子测序可以获得海量的基因突变数据。然而，这些测序费用极其昂贵，后期数据分析要求极高、耗时长达数月，且由于我们对绝大多数基因突变在癌症中的功能认识有限，目前仅针对极少的一部分基因研发出了靶向药物。因此，全基因组或全外显子测序检测肺癌的方法无法应用于临床需求。根据前期研究表明，肺癌存在多种基因突变，其中最常见的突变包括致癌基因AKT1、ALK、ARAF、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、FGFR3、KIT、KRAS、MAP2K1、MTOR、NRAS、PDGFRA、PIK3CA和PTEN，更重要的是这些突变临床上均已开发或正在测试靶向药物，对于这些基因突变的检测将更好的指导医生为病人制定针对性的个性化靶向治疗方案。
综上所述，现有的肺癌的检测方法都存在一定的缺陷，例如结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴性多、检测基因少、通量低等问题。而现在市场上存在的一些基于高通量测序技术检测肺癌的方法，存在对样品的要求较高、目的性不强、操作繁琐、引物或探针设计复杂、检测费用高等缺点，特别是不能指导靶向用药，因此急需一种新型的检测方法以满足市场和医疗的需求。
发明内容
1.要解决的问题
针对现有的肺癌基因突变位点难以准确确定、重复性差、假阳性和假阴性多、通量低等问题，本发明提供一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法，用于检测确定16个致癌基因的316个突变的方法，所述的致癌基因为AKT1、ALK、ARAF、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、FGFR3、KIT、KRAS、MAP2K1、MTOR、NRAS、PDGFRA、PIK3CA和PTEN，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明针对肺癌靶向治疗分子诊断的16个致癌基因的316个突变位点的特定序列设计了特异性引物(SEQ ID No.1～SEQ ID No.82)，检测的基因为AKT1、ALK、ARAF、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、FGFR3、KIT、KRAS、MAP2K1、MTOR、NRAS、PDGFRA、PIK3CA和PTEN；可以扩增致癌基因AKT1、ALK、ARAF、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、FGFR3、KIT、KRAS、MAP2K1、MTOR、NRAS、PDGFRA、PIK3CA和PTEN的突变位点区域，扩增产物经高通量测序获得其序列信息，从而检测确定出样品中这些基因的突变状况。本发明所用引物(SEQ ID No.1～SEQ IDNo.82)，可使用多重PCR扩增技术在一管中同时有效的扩增目标序列，所得PCR产物纯化后经二轮PCR引入测序接头和barcode后，用于制备测序文库和上机进行高通量测序，所构建的测序文库经NanoDrop 2000、Agilent Bioanalyzer2100、LabChip GX Touch、Qubit 3.0和qPCR检测合格后适用于多种高通量测序平台，包括Illumina NextSeq 500/550测序仪、Illumina MiSeq测序仪、Illumina MiniSeq测序仪、Illumina HiSeq 2500/3000/4000测序仪和Illumina NovaSeq等测序仪。
一种确定肺癌基因突变位点的特异性引物，引物序列为SEQ ID No.1～SEQ IDNo.82中的一种或多种组合。引物序列的设计要结合特定基因片段，检测目的突变位点等因素，采用合适的算法设计得到。
一种肺癌靶向治疗分子诊断试剂盒，包括引物序列为SEQ ID No.1～SEQ IDNo.82中的一种或多种组合。
表1肺癌16个靶向治疗分子诊断基因突变位点检测SEQ No.1～SEQ No.82引物序列
备注：序列号代表引物序列的编号，Forward Primer表示正向引物序列，ReversePrimer代表反向引物序列。
一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，包括以下步骤：
A.从待测样品中提取基因组DNA；
B.使用上述的基因特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.82，对步骤A中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增；
C.对步骤B中得到的多重PCR扩增产物进行纯化；
D.对步骤C中的纯化产物进行二轮PCR扩增，引入测序接头和barcode；
E.对步骤D中的二轮PCR产物进行纯化和质控，完成测序文库的构建；
F.对步骤E中构建的测序文库进行高通量测序，获得目的基因片段的序列信息；
G.将步骤F中的获得的目的基因片段的序列信息与正常的基因序列进行比对分析，得到目的基因片段的突变信息。
更进一步地，步骤A中的待测样品包括但不限于新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织和石蜡包埋肿瘤组织；提取基因组DNA时，使用但不限于组织DNA提取试剂盒和石蜡包埋组织DNA提取试剂盒。
步骤A中提取基因组DNA后对DNA进行质量检测，用于质量检测的仪器优选为NanoDrop2000和Qubit 3.0，对DNA的质量要求为：DNA浓度大于5ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0；步骤B中的特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.82进行多重PCR扩增时同时加入
更进一步地，步骤B中所述的基因组DNA上的目的片段是指分别包含肺癌16个靶向治疗分子诊断基因的316个突变位点的基因片段，16个靶向治疗分子诊断基因分别为AKT1、ALK、ARAF、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、FGFR3、KIT、KRAS、MAP2K1、MTOR、NRAS、PDGFRA、PIK3CA和PTEN。16个靶向治疗分子诊断基因的316个突变位点相关信息如表2所示。
表2 16个肺癌靶向治疗分子诊断基因的316个突变位点和相应靶向药物信息
备注：基因表示基因名称，如AKT1代表AKT1基因；COSMIC ID是指基因突变在癌症基因组突变数据库中的编号，如肺癌中AKT1基因一个最常见的突变在癌症基因组突变数据库中的编号为COSM33765；核苷酸变异代表编码序列的突变，如c.49G>A表示编码区第49位鸟苷酸突变成为腺苷酸；氨基酸变异表示氨基酸序列的突变，如p.E17K表示蛋白序列中第17位的谷氨酸突变为赖氨酸；位置则指该突变在染色体上的位置，如14:105246551-105246551表示突变发生在14号染色体105246551位点；此外，ins代表插入，del代表缺失，*表示终止子，？代表对编码蛋白影响未知。
更进一步地，步骤B中多重PCR扩增的反应体系为：2X MasterMix(包含DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs)25μL、包含所述SEQ No.1～SEQ No.82引物的引物panel(10nM each)10μL、待测DNA样品10～20ng，用ddH2O加至50μL；步骤B中多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；然后进行聚合酶链式扩增：95℃变性20s，60℃退火和延伸4min，共进行20～23个循环；最终72℃延伸4min。
步骤B中使用肺癌突变基因特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.82，对步骤A中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增，扩增产物经处理后进行高通量测序，用以检测表2中的基因突变状况。检测每个突变位点的引物对分别为：SEQ No.1和SEQ No.2检测AKT1基因COSM33765突变，SEQ No.3和SEQ No.4检测ALK基因COSM28056突变，SEQ No.5和SEQ No.6检测ALK基因COSM28055、COSM28061和COSM28057突变，SEQ No.7和SEQ No.8检测ARAF基因COSM1742787和COSM5044705突变，SEQ No.9和SEQ No.10检测BRAF基因COSM308550、COSM475、COSM477、COSM478、COSM1127、COSM1583011、COSM473、COSM474、COSM476、COSM6137、COSM1130、COSM1126、COSM1125、COSM471、COSM470、COSM1121、COSM253330、COSM211600和COSM27639突变，SEQ No.11和SEQ No.12检测BRAF基因COSM460和COSM451突变，SEQ No.13和SEQ No.14检测CDKN2A基因COSM3092239、COSM13670、COSM13221、COSM28562、COSM1247967、COSM3906638、COSM13294、COSM13698、COSM1247961、COSM12479、COSM753746、COSM4774787、COSM13830、COSM3952632、COSM13811、COSM3433073、COSM3092261、COSM13701、COSM12547、COSM48297、COSM12481、COSM753741、COSM12484、COSM13489、COSM3092274、COSM13618、COSM12751和COSM4604974突变，SEQ No.15和SEQNo.16检测EGFR基因COSM1451536和COSM21683突变，SEQ No.17和SEQ No.18检测EGFR基因COSM21686、COSM21685、和COSM21687突变，SEQ No.19和SEQ No.20检测EGFR基因COSM18441、COSM6252、COSM6253、COSM18425、COSM6239和COSM747426突变，SEQ No.21和SEQNo.22检测EGFR基因COSM3734668突变，SEQ No.23和SEQ No.24检测EGFR基因COSM4745530、COSM291998、COSM6241、COSM48921、COSM48923和COSM6240突变，SEQ No.25和SEQ No.26检测EGFR基因COSM13553、COSM12429、COSM133630、COSM6224、COSM12374和COSM6213突变，SEQNo.27和SEQ No.28检测ERBB2基因COSM1205571、COSM14060、COSM436499、COSM14062、COSM436500和COSM5802314突变，SEQ No.29和SEQ No.30检测FGFR3基因COSM24842突变，SEQ No.31和SEQ No.32检测FGFR3基因COSM719、COSM726、COSM720、COSM731、COSM1428730和COSM3993568突变，SEQ No.33和SEQ No.34检测KIT基因COSM6142、COSM1177、COSM1180、COSM1328、COSM1190、COSM133763、COSM1192、COSM1329、COSM1198、COSM23418、COSM1210、COSM1211、COSM1217、COSM1216、COSM1219、COSM1221、COSM1235、COSM1239、COSM18896、COSM1246、COSM1247、COSM1248、COSM19216、COSM1252、COSM1253、COSM1255、COSM1256、COSM1258、COSM1257和COSM1260突变，SEQ No.35和SEQ No.36检测KIT基因COSM1304、COSM19326和COSM12706突变，SEQ No.37和SEQ No.38检测KIT基因COSM36053突变，SEQNo.39和SEQ No.40检测KIT基因COSM1312、COSM1310、COSM1314、COSM12710、COSM1316、COSM133670、COSM12709、COSM19280、COSM1318、COSM19109、COSM3604523、COSM1320、COSM1321和COSM1322突变，SEQ No.41和SEQ No.42检测KRAS基因COSM19900、COSM19404和COSM19905突变，SEQ No.43和SEQ No.44检测KRAS基因COSM1212768、COSM1168052、COSM554、COSM555、COSM552、COSM553、COSM87298、COSM549、COSM550、COSM547和COSM546突变，SEQ No.45和SEQ No.46检测KRAS基因COSM1511785、COSM4384683、COSM543、COSM12703、COSM20818、COSM12721、COSM12722、COSM526、COSM530、COSM531、COSM4745557、COSM532、COSM534、COSM87281、COSM14209、COSM249888、COSM4387522、COSM513、COSM515、COSM527、COSM529、COSM5413585、COSM25801、COSM512、COSM520、COSM521、COSM522、COSM516、COSM517和COSM516突变，SEQ No.47和SEQ No.48检测MAP2K1基因COSM1235485、COSM2257207、COSM3690509、COSM3503329、COSM555604、COSM1562837、COSM5588244、COSM1725008、COSM2257208、COSM1235481、COSM5369532、COSM4756761、COSM1235478、COSM5520914、COSM1235479、COSM1678546和COSM5732210突变，SEQ No.49和SEQ No.50检测MAP2K1基因COSM4166154、COSM4166152、COSM4166153、COSM555601、COSM1315829、COSM235614、COSM1167912、COSM1315861、COSM1374186和COSM1235480突变，SEQ No.51和SEQ No.52检测MTOR基因COSM1686998突变，SEQ No.53和SEQ No.54检测NRAS基因COSM30646、COSM33693、COSM53223、COSM12725、COSM579、COSM585、COSM586、COSM12730、COSM583、COSM584和COSM580突变，SEQ No.55和SEQ No.56检测NRAS基因COSM572、COSM574、COSM569、COSM564、COSM565、COSM566、COSM561、COSM562和COSM563突变，SEQ No.57和SEQ No.58检测PDGFRA基因COSM133645和COSM739突变，SEQ No.59和SEQ No.60检测PDGFRA基因COSM22414和COSM22415突变，SEQ No.61和SEQ No.62检测PIK3CA基因COSM759、COSM17442、COSM760、COSM1041495、COSM761、COSM27133、COSM763、COSM12458、COSM764、COSM27374、COSM765、COSM766、COSM12459、COSM767、COSM24712和COSM5881065突变，SEQ No.63和SEQ No.64检测PIK3CA基因COSM17444、COSM12461、COSM12590、COSM771、COSM36286、COSM12591、COSM29313、COSM773、COSM94984、COSM36288、COSM12592、COSM27504、COSM774、COSM775、COSM776、COSM1041525、COSM24714和COSM12597突变，SEQ No.65和SEQ No.66检测PTEN基因COSM428078、COSM3967199、COSM5020、COSM5270、COSM5275、COSM5878、COSM28916、COSM921056和COSM5232429突变，SEQ No.67和SEQ No.68检测PTEN基因COSM5311和COSM5328突变，SEQ No.69和SEQ No.70检测PTEN基因COSM5313和COSM685105突变，SEQNo.71和SEQ No.72检测PTEN基因COSM27933、COSM1474840、COSM1474841、COSM23629、COSM4948、COSM5322和COSM5960388突变，SEQ No.73和SEQ No.74检测PTEN基因COSM5149、COSM13116和COSM35665突变，SEQ No.75和SEQ No.76检测PTEN基因COSM5154、COSM1297486、COSM88109、COSM5810、COSM5159、COSM1173612、COSM428088、COSM921131、COSM5231546和COSM428089突变，SEQ No.77和SEQ No.78检测PTEN基因COSM86061、COSM4613228、COSM5312和COSM28899突变，SEQ No.79和SEQ No.80检测PTEN基因COSM921150、COSM921151、COSM5008和COSM5892突变，SEQ No.81和SEQ No.82检测PTEN基因COSM5310、COSM685100和COSM3807907突变。
更进一步地，步骤C中对多重PCR扩增产物纯化的方法为：使用Agencourt AMPureXP磁珠进行纯化，50μL PCR反应体系中首先加入25μL Agencourt AMPure XP磁珠除去基因组DNA，然后在上清中加入30μL Agencourt AMPure XP磁珠，经200μL 70％乙醇洗涤两次后，彻底挥发乙醇。
更进一步地，步骤D中二轮PCR扩增引入测序接头和barcode的反应体系为：干燥的磁珠中加入2X MasterMix 25μL和包含不同barcode的接头引物3μL，加ddH2O至50μL；2XMasterMix中包含DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs，接头引物的浓度为10nM，步骤D中二轮PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；然后进行聚合酶链式扩增：95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共进行6～8个循环；最终72℃延伸5min。设计不同的barcode，目的用来区分不同的样本，可以根据设计者的意愿随意加不同长度和序列来进行区分。
更进一步地，包含barcode的接头引物序列为SEQ ID No.83～SEQ ID No.95(序列如表3所示)，适用于Illuminate测序仪。
表3用于Illuminate测序仪测序文库构建的接头引物序列(SEQ ID No.83～SEQID No.95)
备注：Adapter Name代表接头的名称，Sequence表示接头的核苷酸序列信息，所有接头的5’端都经过磷酸化修饰，*代表修饰引物中的磷酸酯键，斜体黑色字母标示barcode序列。
更进一步地，步骤E中二轮PCR扩增产物使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，50μL PCR反应体系中加入45μL Agencourt AMPure XP磁珠，经200μL 70％乙醇洗涤两次后，彻底挥发乙醇后，加入20μL ddH2O进行洗脱，获得测序文库；质控是指使用Qubit 3.0、NanoDrop2000、Agilent Bioanalyzer 2100、LabChip GX Touch或qPCR对测序文库的DNA进行质量检测，测序文库的DNA需要满足以下条件：浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0，片段大小位于250bp～500bp之间。
本发明中构建的测序文库适用于多种高通量测序平台，包括Illumina NextSeq500/550测序仪、Illumina MiSeq测序仪、Illumina MiniSeq测序仪、Illumina HiSeq2500/3000/4000测序仪和Illumina NovaSeq等测序仪；步骤E中所得的测序文库按照不同测序方法的要求进行上机前处理，使得上样量相当的、不同barcode标记的测序文库处于测序方法需要的缓冲液体系中，能够直接用于上机测序。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的特异性引物，可以一次性检测确定肺癌靶向治疗分子诊断16个基因的316个突变位点的突变情况，具有特异性强、非特异性扩增程度低、各引物间相互干扰小、扩增效果好等优点，在进行多重PCR扩增时，这些引物混合溶解于同一管中同时加入，效率非常高；
(2)本发明提供了一种确定肺癌基因突变位点的方法，样品要求低，起始样品DNA的量可以低至1ng，可以使用各种来源的样品进行DNA的提取，包括且不限于新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织和石蜡包埋肿瘤组织等，而且可以使用已发生降解的DNA样品；
(3)本发明的检测通量高，一次可以检测十几个到几百个样品的16个基因的316个突变位点状况，高效便捷；
(4)本发明的确定方法，灵敏度高，检测灵敏度高达1％，检测结果明确客观，可以直接确定相关基因的具体突变位点，对于指导临床肺癌靶向治疗分子诊断、靶向用药以及用于癌症早期诊断或辅助诊断及筛查和癌症愈后监测有重要意义；
(5)本发明的检测确定方法安全快速，不含有毒有害物质，对实验人员和环境都无危害，检测速度快，仅需两到三天就可以获得检测结果；
(6)本发明的检测确定方法基于多重PCR技术和高通量测序技术，可以同时检测16个临床已有或正在测试靶向药物的基因的316个突变位点，使用的特异性引物和接头及优化的实验体系，使得检测方法简单易行、特异性高、重复性好、准确度高，对肺癌靶向治疗分子诊断基因的突变位点具有检测通量高、检测速度快、准确性和重复性好、安全性高等众多优点，为指导肺癌患者的个性化治疗，辅助肺癌的早期诊断及癌症愈后检测提供一种高效的方法。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要的混淆本发明的概念。在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动，这些等价形式同样落入本发明所限定的范围。
实施例1
对某T2bN1M1期肺鳞癌活检组织进行检测确定基因突变的相关信息，步骤如下：
所用样本为T2bN1M1期肺癌新鲜活检组织，采用DNA提取试剂盒提取肺癌新鲜活检组织中的基因组DNA，应用SEQ No.1～SEQ No.82对提取得到的基因组DNA进行多重PCR扩增后，采用Illumina NextSeq 500测序仪进行测序分析，具体实施方法如下：
A.基因组DNA提取：使用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit，参照试剂盒说明书进行基因组DNA的提取。获得的基因组DNA进行凝胶电泳和使用NanoDrop 2000进行质量检测，要求基因组DNA没有明显的降解，浓度大于10ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0，并使用Qubit 3.0进行精确定量。
B.多重PCR扩增：使用引物SEQ No.1～SEQ No.82对10ng基因组DNA进行多重PCR扩增，获得AKT1、ALK、ARAF、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、FGFR3、KIT、KRAS、MAP2K1、MTOR、NRAS、PDGFRA、PIK3CA和PTEN这16个目的基因的316个突变位点区域的目标扩增片段。
所用的多重PCR反应体系为：GeneRead DNAseq Panel 5X PCR Buffer 10μL、GeneRead HotStar Taq DNA Polymerase(6U/μL)2.5μL、含所述SEQ No.1～SEQ No.82引物的引物panel(10nM each)10μL、待测DNA样品10～20ng，用ddH2O加至50μL；多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；然后进行聚合酶链式扩增：95℃变性20s，60℃退火和延伸4min，共进行22个循环；最终72℃延伸4min。
C.PCR产物纯化：步骤B中多重PCR扩增产物使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，50μL PCR反应体系中首先加入25μL Agencourt AMPure XP磁珠除去基因组DNA，然后在上清中加入30μL Agencourt AMPure XP磁珠，经200μL 70％乙醇洗涤两次后，彻底挥发乙醇。
D.二轮PCR引入测序接头和barcode：所用的二轮PCR反应体系为：干燥的磁珠中加入GeneRead DNAseq Panel 5X PCR Buffer 10μL、GeneRead HotStar Taq DNAPolymerase
(6U/μL)2.5μL、含不同barcode的接头引物(10nM)3μL，加ddH2O至50μL；二次PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；然后进行聚合酶链式扩增：95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共进行7个循环；最终72℃延伸5min。
E.二轮PCR产物纯化和质控：使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，50μL PCR反应体系中加入45μL Agencourt AMPure XP磁珠，经200μL 70％乙醇洗涤两次后，彻底挥发乙醇后，加入20μL ddH2O进行洗脱，获得测序文库。测序文库的DNA浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0，片段大小位于250bp～500bp之间(使用Qubit 3.0、NanoDrop2000和LabChip GX Touch对测序文库的DNA进行质量检测)。
F.高通量测序：等量的DNA测序文库使用Illuminate Library NormalizationSolutions进行平衡后按照Illuminate NextSeq 500测序仪操作进行上样测序，测序结束后，对获得的序列进行拼接后使用软件进行比对分析，筛选出发生突变的基因位点。
检测信息如下表4所示
检测结果如下表5所示
根据检测结果，确定了该T2bN1M1期肺鳞癌是由于EGFR基因的编码区第2573位胸腺嘧啶核苷酸突变为鸟嘌呤核苷酸，导致蛋白序列中第858位的亮氨酸突变为精氨酸。本实施例中确定了基因以及氨基酸的突变位点，有利于T2bN1M1期肺鳞癌的靶向治疗方案确定。
实施例2
某转移性肺腺癌，经FISH检测结果为EGFR拷贝数扩增，ERBB2拷贝数扩增。使用本发明的方法对其进行分子检测，确定具体的突变位点。
所用样本为石蜡包埋的肺癌组织，采用DNA提取试剂盒提取石蜡包埋组织中的基因组DNA，应用SEQ No.1～SEQ No.82对提取得到的基因组DNA进行多重PCR扩增后，采用Illumina NextSeq 500测序仪进行测序分析，具体实施方法如下：
A.基因组DNA提取：使用Qiagen GeneRead DNA FFPE Kit，参照试剂盒说明书进行基因组DNA的提取。获得的基因组DNA使用NanoDrop 2000进行质量检测，要求DNA浓度大于5ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0，并使用Qubit 3.0进行精确定量。
步骤B～F的操作与实施例1相同。
检测信息如下表6所示
检测结果如下表7所示
根据检测结果，确定了该转移性肺腺癌是由于EGFR基因的编码区第2310-2311位之间插入了GGGTTA核苷酸序列，导致蛋白序列中第770-771位插入了甘氨酸和亮氨酸两个氨基酸；ERBB2基因的编码区第2236位发生G核苷酸缺失并插入了TTAT序列，导致蛋白序列中第746位甘氨酸的缺失并发生亮氨酸和半胱氨酸的插入。本实施例中确定了基因以及氨基酸的突变位点，有利于转移性肺腺癌的靶向治疗方案确定。
本发明对肺癌靶向治疗分子诊断16个基因的316个突变位点具有检测通量高、特异性强、样本来源广泛、不易发生污染且安全性高等众多优点，检测结果具有很好的重复性和准确性，对肺癌具有较好的辅助诊断和指导治疗作用。

Claims (10)

1.一种确定肺癌基因突变位点的特异性引物，其特征在于：引物序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.82中的一种或多种组合。
2.一种肺癌靶向治疗分子诊断试剂盒，其特征在于：包括引物序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.82中的一种或多种组合。
3.一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：包括以下步骤：
A.从待测样品中提取基因组DNA；
B.使用权利要求1中所述的基因特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.82，对步骤A中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增；
C.对步骤B中得到的多重PCR扩增产物进行纯化；
D.对步骤C中的纯化产物进行二轮PCR扩增，引入测序接头和barcode；
E.对步骤D中的二轮PCR产物进行纯化和质控，完成测序文库的构建；
F.对步骤E中构建的测序文库进行高通量测序，获得目的基因片段的序列信息；
G.将步骤F中的获得的目的基因片段的序列信息与正常的基因序列进行比对分析，得到目的基因片段的突变信息。
4.根据权利要求3所述的一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：步骤A中的待测样品包括但不限于新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织和石蜡包埋肿瘤组织；提取基因组DNA时，使用但不限于组织DNA提取试剂盒和石蜡包埋组织DNA提取试剂盒。
5.根据权利要求3所述的一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：步骤B中所述的基因组DNA上的目的片段是指分别包含肺癌16个靶向治疗分子诊断基因的316个突变位点的基因片段，16个靶向治疗分子诊断基因分别为AKT1、ALK、ARAF、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、FGFR3、KIT、KRAS、MAP2K1、MTOR、NRAS、PDGFRA、PIK3CA和PTEN。
6.根据权利要求3或5所述的一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：步骤B中多重PCR扩增的反应体系为：2X MasterMix(包含DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs)25μL、包含所述SEQ No.1～SEQ No.82引物的引物panel10μL、待测DNA样品10～20ng，用ddH2O加至50μL，引物浓度为10nM each；步骤B中多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；然后进行聚合酶链式扩增：95℃变性20s，60℃退火和延伸4min，共进行20～23个循环；最终72℃延伸4min。
7.根据权利要求6所述的一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：步骤C中对多重PCR扩增产物纯化的方法为：50μL PCR反应体系中首先加入25μLAgencourt AMPure XP磁珠除去基因组DNA，然后在上清中加入30μL Agencourt AMPure XP磁珠，经乙醇洗涤后，彻底挥发乙醇。
8.根据权利要求6所述的一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：步骤D中二轮PCR扩增引入测序接头和barcode的反应体系为：干燥的磁珠中加入2X MasterMix25μL和包含不同barcode的接头引物3μL，加ddH2O至50μL；2X MasterMix中包含DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs，接头引物的浓度为10nM，步骤D中二轮PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；然后进行聚合酶链式扩增：95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共进行6～8个循环；最终72℃延伸5min。
9.根据权利要求8所述的一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：包含barcode的接头引物序列为SEQ ID No.83～SEQ ID No.95，适用于Illuminate测序仪。
10.根据权利要求9所述的一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：步骤E中二轮PCR扩增产物使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，50μL PCR反应体系中加入45μL Agencourt AMPure XP磁珠，经乙醇洗涤后，彻底挥发乙醇后，加入20μLddH2O进行洗脱，获得测序文库；质控是指使用Qubit 3.0、NanoDrop2000、AgilentBioanalyzer 2100、LabChip GX Touch或qPCR对测序文库的DNA进行质量检测，测序文库的DNA需要满足以下条件：浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0，片段大小位于250bp～500bp之间。
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