CN109207573A - 基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒，本发明的引物组碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.450，覆盖了F8、F9、F11、vWF、F2、F7和SRY共7个基因全部的外显子、剪接区以及部分启动子区和内含子区，共128个目标区域、225对引物，可同时一次性检测甲型血友病、乙型血友病、丙型血友病、血管性血友病、凝血因子II缺乏症和凝血因子VII缺乏症等全部6种疾病的基因突变位点。本发明可应用于血友病等先天性出血性疾病的致病位点检测、筛查和家系成员筛查及相应致病变异科学研究。该方法操作简单、准确性高、耗时短，大大的节约了Sanger测序逐个基因逐个片段去检测所用的时间成本和人力成本。

Description

基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合、方法 及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒。

背景技术

血友病是一组遗传性凝血功能障碍的先天性出血性疾病，其共同的特征是某些凝血因子缺乏、活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，血友病被收录其中。大规模流行病学调查显示血友病的发病率为15-20/10万人，是先天性出血性疾病中最为常见的疾病。据文献报道，截至2007年5月，中国注册的血友病患者约8000人，而根据流行病学的推算，中国应该有6-10万名血友病患者，目前我国血友病的误诊和漏诊率较高(中国小儿血液与肿瘤杂志，2010，15：49-51)，究其原因，一方面可能与对疾病的认识不足、以及疾病表型和临床表现复杂多样化有关，另一方面与目前缺乏确诊的实验室检查方法有关。因此，建立快速、精准的检测技术，对我国血友病的早期识别和诊治有极其重要的意义。

常见的血友病包括甲型血友病(凝血因子VIII缺乏症)、乙型血友病(凝血因子IX缺乏症)和丙型血友病(凝血因子XI缺乏症)3类。另外，临床上还有血管性血友病、凝血因子II缺乏症、凝血因子VII缺乏症等凝血因子缺乏导致的先天性出血性疾病，临床表现多有相似，难以区分。这些疾病都有明确的致病基因和变异位点，因此，建立一种简单、快速、可同时检测多种血友病等先天性出血性疾病的致病基因变异位点的方法，有助于快速鉴别不同凝血因子缺陷导致的血友病和其他先天性出血性疾病。

甲型血友病，又称凝血因子VIII缺乏症，是F8基因突变导致凝血因子VIII功能缺陷所致的一种凝血功能障碍性遗传病，呈X连锁隐性遗传，男性发病，女性可携带致病基因，发病率约为1/5000的男性活婴，女性患者极为罕见。常见的致病变异包括F8基因内含子22倒位和内含子1倒位，约占甲型血友病的45-50％；F8基因外显子1至外显子26及其剪接区的点突变和小片段缺失，约占甲型血友病的45％-50％；F8基因大片段缺失，约占5％。F8基因的变异类型复杂多样，截至2018年2月，共报道F8基因无义突变和错义突变1428种、剪接位点变异160种、小片段插入或缺失503种、复杂重组12种。其中明确具有致病性的点突变、片段插入或缺失变异有283种，分布在F8基因全部的外显子、部分剪接区、启动子区上，另外内含子4上有致病变异c.601+1632G>A位点。因此基因检测需要覆盖整个F8基因的外显子、剪接区、启动子区，才能不漏诊。

乙型血友病，又称凝血因子IX缺乏症，是F9基因突变导致凝血因子IX功能缺陷所致的一种凝血功能障碍性遗传病，呈X连锁隐性遗传，发病率约为男性活婴的1/30000。常见的致病变异为F9基因的点突变和小片段插入或缺失，分布在外显子、剪接区和启动子区，约占乙型血友病的97％；少数为大片段缺失，为外显子部分缺失，约占乙型血友病的3％。F9基因的变异类型也是复杂多样的，目前收录在美国NCBI临床疾病相关变异数据库(ClinVar，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)中明确具有致病性的F9基因变异位点有117种。同样，基因检测需要覆盖整个F9基因的外显子、剪接区。

丙型血友病，又称凝血因子XI缺乏症，是F11基因突变导致凝血因子XI功能缺陷所致的一种凝血功能障碍，又称作Rosenthal综合征，呈常染色体连锁隐性遗传，其致病基因F11位于人类第4号染色体上，该病在我国较为少见。F11基因的致病变异主要为点突变，也有少数为小片段缺失导致。目前收录在ClinVar数据库中明确具有致病性的F11基因变异位点有56种，均位于F11基因外显子上或剪接区。

血管性血友病，又称von Willebrand病(von Willebrand disease,vWD)，是临床上常见的一种遗传性出血性疾病，其发病机制是vWF基因突变导致患者血浆血管性血友病因子vWF数量减少或质量异常，呈常染色体连锁隐性遗传，其致病基因vWF位于人类第12号染色体上。而凝血因子II缺乏症和凝血因子VII缺乏症则是分别由于F2基因和F7基因突变，导致凝血因子II和VII功能缺陷所致的凝血功能障碍，呈常染色体隐性遗传，致病基因F2和F7分别位于人类第11号和第13号染色体上。

基因检测被认为是诊断血友病及先天性出血性疾病的“金标准”，但由于涉及到的基因数量大、复杂性高，分子生物学检测和诊断极具挑战性。另一方面，由于人群遗传异质性和个体差异等原因，致病基因的突变位点和类型在群体中呈高度多态性，不同地域的人群不断有检出新的致病突变位点的文献报道。因此，基因突变的异质性和个体差异性，决定了血友病及先天性出血性疾病的基因突变检测需要覆盖致病基因的所有外显子及内含子剪接区，才能准确的、全覆盖、无遗漏的识别其致病突变，单纯检测某个基因的几个热点突变位点将会产生很大的漏检。而目前还没有一次性同时检测和鉴别多种血友病的遗传学检测试剂盒面市。

国内外目前多采用IS-PCR检测F8基因倒位、采用Sanger测序的方法进行单个血友病点突变和插入缺失的检测，这种方法一次只能检测单个基因的某几个热点突变，难以对整个基因的潜在致病位点和新的突变位点全部检出，可出现60％以上的假阴性，在鉴别诊断时需要逐个基因逐个位点检测，操作繁琐、耗时耗力。随着技术的进步，全外显子组高通量测序实现了同时检测多个基因变异，但全外显子组高通量测序价格昂贵，用于少数单基因病的检测非常的浪费，并且因为人类基因组的庞大、全外显子组测序技术本身的局限，会有少部分基因不能覆盖和随机漏检。因此，选择目标基因进行靶基因建库测序是同时检测多种基因的最佳选择，既能覆盖目标基因的所有靶区域、又能避免全外显子组测序高昂的价格。

发明内容

鉴于此，本发明克服血友病等先天性出血性疾病的病种类繁多、基因变异广泛、复杂性高等技术障碍，开发了一套基于高通量测序的多种血友病靶向文库的构建方法及相应试剂盒，可用于多种血友病的同时精准检测、还能同时与血管性血友病、凝血因子II缺乏症、凝血因子VII缺乏症等凝血因子缺乏导致的出血性疾病相鉴别。试剂盒包含了检测F8、F9、F11、vWF、F2、F7共6个明确的致病基因以及Y染色体基因SRY，覆盖目标基因的128个外显子区、剪接区以及部分启动子区和内含子区。SRY基因作为参考，协助遗传咨询师分析时确保生物学样本性别一致。本发明共计5.17kb靶区域，可同时对包括甲型血友病、乙型血友病、丙型血友病、血管性血友病、凝血因子II缺乏症、凝血因子VII缺乏症共6个疾病的基因变异进行一次性精准检测和分型。该方法操作简单、耗时短，大大的节约了Sanger测序逐个基因逐个片段去检测所用的时间成本和人力成本。

本发明为实现上述目的提出的一种技术方案是：即一种基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合，所述引物组合包括225对引物，其碱基序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.450所示，检测覆盖F8、F9、F11、vWF、F2、F7和SRY共7个基因全部的外显子、剪接区以及部分启动子区和内含子区，共128个目标区域。

上述引物组合在制备检测如下疾病的试剂中的应用，包括甲型血友病、乙型血友病、丙型血友病、血管性血友病、凝血因子II缺乏症和凝血因子VII缺乏症中全部6种或至少其中一种疾病。将SEQ ID No.1～SEQ ID No.450全部引物对或部分引物对，装载于同一个包装管或至多2个包装管里，组成引物混合池。

本发明还提供了一种基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的试剂盒，包括碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.450的全部引物对或部分引物对。所述试剂盒还包括PCR缓冲液、DNA聚合酶等。

使用上述试剂盒构建的体系包括无核酸酶的超纯水2.6μL，2×PCR缓冲液5μL，DNA聚合酶0.2μL，浓度为250nM的引物组混合池1.2μL，浓度为20-50ng/μL的样本DNA模板1μL。也可以是上述体系的倍比体积或等浓度体系。

本发明另一方面提供一种基于高通量测序的多种血友病靶向文库的构建方法，利用上述引物混合池，用待样本DNA作为模板进行超高重PCR扩增、常规纯化及去除非特异性产物后，获得目标基因的靶向文库。

所述的多种血友病靶向文库的构建方法中超高重PCR扩增体系为：

所述扩增体系也可以是上述体系的倍比体积或等浓度体系。

优选的，超高重PCR扩增条件为：95℃ 10min；98℃ 15s，60℃ 5mim，9～11个循环；10℃ ∞。

本发明的有益技术效果为：本发明覆盖了7个基因全部的外显子区、剪接区及部分启动子区和内含子区，共128个目标区域、225对引物，且225对引物装载于同一个包装管或至多2个包装管里，可同时一次性检测6种疾病的基因变异，覆盖了甲型血友病、乙型血友病、丙型血友病、血管性血友病、凝血因子II缺乏症和凝血因子VII缺乏症。本发明可应用于血友病等疾病的致病突变检测、产前筛查和家系成员筛查及相应致病变异研究。本发明的7个基因的225个片段可同时在一个反应管里完成建库，不需要像Sanger测序那样做225次反应，大大的节约了时间成本。与Sanger测序比较，本发明技术的准确性为100％、并且操作简单、耗时短，避免了Sanger测序一次只能测单个基因的单个片段带来的繁重的工作量和经济成本。

附图说明

附图1合格的DNA样本示意图。

附图2本发明所构建多种血友病靶向文库质检示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明的实施方案进行详细的描述。应理解，这些实施例意在说明实施本发明的现已知的一个最佳的实施方案，但是不应该认为本发明局限于这些实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域技术人员熟知的常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1引物组合

针对F8、F9、F11、vWF、F2、F7和SRY共7个基因全部的外显子、剪接区以及部分启动子区和内含子区，共128个目标区域。其中F8和F9基因还包括了启动子区、F2基因还包括了部分3’UTR区、F8基因还包含了部分内含子4，共设计合成了225对引物，其碱基序列如SEQID No.1～SEQ ID No.450所示。

检测的基因及覆盖区域如下表：

优化后的引物如下表：

将上述SEQ ID No.1～SEQ ID No.450送生物公司合成，SEQ ID No.1～SEQ IDNo.450全部引物或部分引物对进行等量混合，装载在同一个包装管或至多2个包装管里，组成引物混合池，可同时一次性检测甲型血友病、乙型血友病、丙型血友病、血管性血友病、凝血因子II缺乏症和凝血因子VII缺乏症等全部6种疾病或至少其中一种疾病的基因变异位点。

实施例2检测样本处理和DNA提取

本发明的检测样本可以是全血、血凝块、新鲜病理组织、石蜡包埋组织，本实施例仅以全血样本为例进行说明。

为减少各种抗凝剂对PCR反应的干扰，应采用EDTA-K2抗凝的采血管采集静脉血，静脉血应当天进行DNA的提取和纯化，如果当天不能及时提取，则应放4℃冰箱保存。可采用DNA提取试剂盒或者全自动DNA提取仪等常规DNA提取纯化的方法进行。于Nanodrop 2000微量核酸蛋白检测仪检测DNA浓度，测定260/280比值以及260/230比值。所提DNA经0.5％琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的电泳条带，长度大于20kb，无明显降解(如图1所示)，且样本浓度大于20ng/μL、260/280控制在1.8-2.0之间视为合格。DNA短期保存可存于4℃，长期保存需置于-20℃或-70℃冰箱。

实施例3构建多种血友病靶向文库

将实施例2中提取的样本DNA进行标化处理，调整浓度至40-50ng/ul作为扩增模板，采用实施例1所述SEQ ID No.1～SEQ ID No.450引物中的全部或者部分引物组成的引物混合池，进行超高重PCR扩增。按照以下扩增体系和条件进行PCR扩增，也可按照以下体系的倍比体积或等浓度体系进行超高重PCR扩增：

优选的，扩增条件为：95℃ 10min；98℃ 15s，60℃ 5mim，9～11个循环；10℃ ∞。

扩增产物磁珠纯化、去除非特异性产物、再纯化，获得目标基因的靶向文库。可采用常规方法添加高通量测序引物及barcode标签，以减少后期测序费用。

实施例4方法学评价及样本验证

选取12例样本，其中3例临床诊断明确的甲型血友病和乙型血友病样本，9例亲属样本，提取DNA，采用本发明方法构建多种血友病靶向文库，常规二代高通量测序、生物信息学分析，筛选和解读SNV和indel变异位点，评价本发明检测的所有7个基因的128个目标区域的覆盖情况。对样本检出的致病变异位点同时采用Sanger测序，比较评价本发明方法的准确性。

覆盖度：12个样本的检测结果显示，对于目标区域的128个目标区域的51676bp范围内，51652bp核苷酸被检出检出、24bp未检测到，检出覆盖度达99.95％，经数据库比对，F8基因未覆盖到24bp核苷酸为F8基因的次要转录本NM_019863的外显子1，不存在致病变异，不影响结果判读；而F8基因的主要转录本NM_000132已全部覆盖，因此F8基因实际上为全覆盖。具体情况见下表：

检出能力及准确性评估：3例患者样本2例检出F8基因致病突变、1例患者检出F9基因致病突变，与临床表型完全一致。9例亲属样本检出F8基因致病突变携带者2例，F9基因致病突变携带者2例。与Sanger测序结果比较，本发明方法检出变异位点的位置和基因型的符合率和准确性为100％。见下表：

实施例5本发明试剂盒的使用方法

(1)DNA提取：采用常规方法提取样本DNA，质检。

(2)试剂准备：酶取出置冰上，混合引物池及其他试剂取出解冻。

(3)加样：优选的，按10μL体系加样。也可以按12.5μL、25μL以及50μL等体系加样，按倍比调整各试剂的加样量即可。10μL加样体系如下：

(4)扩增：加样完成后，对PCR管可瞬时离心将样本和试剂聚于管底，取出PCR管置于PCR扩增仪上进行扩增。优选的，超高重PCR扩增条件为：95℃ 10min；98℃ 15s，60℃5mim，9～11个循环；10℃ ∞。得到的扩增产物4℃保存。

(5)测序前准备：扩增产物磁珠纯化、去除非特异性产物、再纯化，获得目标基因的靶向文库。可采用常规方法添加高通量测序引物及barcode标签，以减少后期测序费用。

(6)质检、测序及分析：采用Agilent2100对文库质量进行质检，主峰在290-450bp区间(如图2所示)。合格文库采用常规方法对文库进行高通量二代测序及生物信息学分析，得到样本的变异位点。

综上所述，本发明开发建立了一种基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒，可用于多种血友病的致病突变检测、产前筛查和家系成员筛查，该方法覆盖了7个基因全部的外显子区、剪接区及部分启动子区和内含子区，共128个目标区域，可同时一次性检测6种血友病等先天性出血性疾病的基因变异，该方法操作简单、耗时短、结果准确可靠，大大的节约了Sanger测序逐个基因逐个片段去检测所用的时间成本和人力成本，可推广应用。

Claims (8)

1.一种基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括225对引物，其碱基序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.450所示，检测覆盖F8、F9、F11、vWF、F2、F7和SRY共7个基因全部的外显子、剪接区以及部分启动子区和内含子区，共128个目标区域。

2.权利要求1所述引物组合在制备检测如下疾病的试剂中的应用，包括甲型血友病、乙型血友病、丙型血友病、血管性血友病、凝血因子II缺乏症和凝血因子VII缺乏症中全部6种或至少其中一种疾病。

3.根据权利要求2所述应用，将SEQ ID No.1～SEQ ID No.450全部引物对或部分引物对，装载于同一个包装管或至多2个包装管里，组成引物混合池。

4.基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的试剂盒，其特征在于：包括碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.450的全部引物对或部分引物对。

5.根据权利要求4所述基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的试剂盒，其特征在于：使用所述试剂盒构建的体系包括无核酸酶的超纯水2.6μL，2×PCR缓冲液5μL，DNA聚合酶0.2μL，浓度为250nM的引物组混合池1.2μL，浓度为20-50ng/μL的样本DNA模板1μL。

6.一种基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的构建方法，其特征在于：用所述碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.450的引物对构建的引物混合池，以样本DNA作为模板进行超高重PCR扩增、常规纯化及去除非特异性产物后，获得目标基因的靶向文库。

7.根据权利要求6所述基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的构建方法，其特征在于：所述超高重PCR扩增体系为：

或所述扩增体系的倍比体积或等浓度体系。

8.根据权利要求6或7所述基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的构建方法，其特征在于：所述超高重PCR扩增条件为：95℃10min；98℃15s，60℃5mim，9～11个循环；10℃∞。