CN109355376A - 脆性x综合征fmr1基因检测引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

脆性x综合征fmr1基因检测引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脆性X综合征FMR1基因检测引物、试剂盒及检测方法，该脆性X综合征FMR1基因检测引物，包括用于扩增FMR1基因5'非编码区域的特异性引物F1和F2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1‑2所示；以及用于扩增CGG重复区域的引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明的脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒可解决CG含量高无法扩增FMR1基因长片段的问题，其灵敏度Southern杂交的875倍。

Description

脆性X综合征FMR1基因检测引物、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术，特别涉及一种脆性X综合征FMR1基因检测引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
脆性X综合征(fragile X syndrome，FXS)是最常见的遗传性智力低下疾病之一，发病率男性约1/4000，女性约1/6000(1/5000-1/8000)，在智力低下人群中仅次于唐氏综合征。脆性X综合征发病的分子遗传学基础是脆性X智力低下基因1(Fragile X mentalretardation gene 1，FMR1，OMIM:309550，位于Xq27.3)的5’端非翻译区(CGG)n三核苷酸重复序列异常扩增以及启动子区CpG岛的甲基化，但两者之间的关系尚不明确。95％以上的FXS患者因CGG重复机制引起发病，同时还有5％以下的FXS患者则是由FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响了FMRP的正常结构和功能，而导致FXS。
FMR1基因(CGG)n重复序列异常扩增具有高度多态性(见下表1)，中国内地正常人CGG重复数为5～50次。FMR1基因的(CGG)n重复有4种类型：正常型小于54次、前突变型55～200次、全突变型大于200～230次、以及CGG重复数在55～200次者的前突变携带者，男性可伴有智力低下，女性往往表现为智力正常，但其子女发生FXS的风险明显增加(风险几率可参考下表1数据)。当CGG重复超过200时，FMR1基因CpG岛常发生甲基化，FMR1转录受抑制或减弱，其编码产物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)表达缺陷或减少，导致突触可塑性改变，影响神经元和树突的发育及正常功能，进而引发一系列复杂的临床精神症状。
也有报道指出，脆性X综合征前突变女性携带者(而非全突变)似乎是40岁前绝经的一个风险因素。那些过早出现卵泡刺激素升高的不育女性可能是FMR1基因前突变携带者的候选筛查人群；女性携带者的CGG重复数大于55但小于80时，CGG重复数越大，女性发生卵巢早衰的年龄越小；CGG重复数大于79时发生POF的风险明显增高；然而CGG重复数大于或等于100时卵巢早衰风险似乎不再增加或者反而下降，但准确的CGG重复数阈值仍然未知。前突变男性携带者50岁后显现脆性X相关震颤/共济失调症，其多系统神经异常主要为进行性紧张震颤、共济失调、帕金森病、认知能力减退和自身免疫缺陷病等。FMR1基因(CGG)n重复数的突变类型与疾病性状的联系见下表1(CGG重复数的突变类型和导致性状)所示。
表1
FMR1的(CGG)n重复数在亲代向子代传递时可发生动态突变，由前突变扩展为全突变，导致相应基因组区域高甲基化而阻止mRNA合成，其产物智力低下蛋白(FMRR)合成被阻断导致发病。男性前突变遗传给后代的可能性很小，但女性前突变次数对后代的影响风险却随着CGG重复数目增大而升高，见下表2所示。前突变携带者比例在各个国家和人群中呈现比例从1：109～1：549不等。美国ACMG2005年FXS基因检测指南指出：需对前突变孕妇在15周后做胎儿的产前诊断，并在2013年再次对FXS的筛查和诊断技术及报告内容形式做了规范。但ACMG在2005及2013的指南中均指出临床上不建议做人群携带者筛查和新生儿筛查，仅在科研协议下进行。(Population carrier screening and newborn screening forfragile X syndrome are not recommended at this time and should occur onlyunder a research protocol.)EJHG 2015年对FXS-PGD做了详细的技术及报告规范。
现有脆性X综合征检测技术中，依据FMR1基因突变的特点，已建立了多种有效的实验室诊断方法，诸如Southern杂交、甲基化特异性PCR、免疫细胞化学方法等。常用Southernblot结合PCR完成其诊断。
Southern blot法是主要确诊方法，但对CGG重复数较少的携带者或嵌合体可能漏诊，酶解不完全时则可能误诊。而且该法费用昂贵，费时费力，需要大量DNA，有放射性危害，不适合基层大范围筛查。
常规PCR检测可诊断正常和CGG重复数较少的携带者，但无法诊断CGG重复数较多的携带者和全突变者。以前的实验室普遍使用聚丙烯酰胺平板电泳配合其它一些生物技术来进行基因的多态性分析，方法虽然成熟但是却耗时、耗力、非自动化，另外一种可以用来进行基因多态性分析的手段为高效液相色谱法，但是由于它的分辨率较低和成本较高而缺乏应用远景。
三引物PCR(TP-PCR)配合毛细管电泳(CE)在较多文献中被用来做FMR1CGG重复数的检测，已被广泛应用。作为高效、快速分析方法的毛细管电泳，近年来已经成为分析化学中最重要的手段之一。和传统的平板电泳方法相比，它具有高效、高速、高灵敏度的特点，更为重要的是，它又是一种自动化的仪器分析方法。目前毛细管电泳已被广泛地应用于蛋白质、多肽和核酸等生物大分子的分离分析研究，在基因领域的优势更加明显，被用于基因突变研究、基因突变引起的遗传疾病、肿瘤以及病毒感染疾病等的临床诊断研究、法医检验等领域的分离分析。
与脆性X综合征检测相关的已经公开或者有权的部分专利如下表2所示。
表2
总结以上，常规PCR法检测，由于无法扩增高“GC长片段”，大约20％女性该基因为纯合子，需要用Southern杂交来验证是否是杂合子。即现有的脆性X综合征FMR1基因的PCR检测需依赖Southern杂交来完成其诊断。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种脆性X综合征FMR1基因检测引物，可区别女性纯合子和杂合子，解决了常规PCR法无法区别纯合子和杂合子的问题；
进一步的，提供一种包含上述脆性X综合征FMR1基因检测引物的试剂盒以及该试剂盒的检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种脆性X综合征FMR1基因检测引物，包括用于扩增FMR1基因5'非编码区域的特异性引物F1和F2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示；
以及用于扩增CGG重复区域的引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
一种脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括上述的脆性X综合征FMR1基因检测引物。
一种上述的脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒的检测方法，其试剂盒中的PCR反应液包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，所述第一PCR反应液的组分含量为：水：6.375μL；2×GC buffer I：12.5μL；25mM MgCl2：2μL；100mM dATP：0.1μL；100mM dTTP：0.1μL；100mMdCTP：0.1μL；100mM dGTP：0.075μL；10mM 7-deaza-dGTP：0.25μL；10μM F1：0.5μL；10μM F2：0.5μL；5U/μL Hotstart LA Taq酶：0.5μL；
所述第二PCR反应液的组分含量为：水：5.875μL；2×GC buffer I：12.5μL；25mMMgCl2：2μL；100mM dATP：0.1μL；100mM dTTP：0.1μL；100mM dCTP：0.1μL；100mM dGTP：0.075μL；10mM 7-deaza-dGTP：0.25μL；10μM F1：0.5μL；10μM F2：0.5μL；10μM F3：0.5μL；5U/μLHotstart LA Taq酶：0.5μL。
所述第一PCR反应液的扩增的条件设置为：97℃下预变性5min；98℃下变性40s，65℃下退火35s，72℃下延伸4min，30-45个循环；最后在72℃下延伸10min；
所述第二PCR反应液的扩增的条件设置为：97℃下预变性5min；98℃下变性40s，65℃下退火35s，72℃下延伸4min，10个循环；98℃下变性40s，65℃下退火35s，72℃下延伸5min±25s/cycle，25个循环；最后在72℃下延伸10min。
本发明的有益效果在于：
(1)设计上述引物F1、F2和F3，采用三引物PCR法，对FMR1基因的5'非编码区的不同CGG区设计特异性引物和CGG重复区引物进行不同重复数片段的扩增，CGG重复引物扩增可区别女性纯合子和杂合子，解决了常规PCR法无法区别纯合子和杂合子的问题。常规PCR法检测，由于无法扩增高“GC长片段”，大约20％女性该基因为纯合子。这需要用Southern杂交来验证是否是杂合子，本发明可以很好地解决了这一难题，降低了对Southern杂交的依赖。
(2)其检测方法中，引入7-deaza-dGTP PCR法，解决了CG含量高无法扩增FMR1基因长片段的问题。用7-deaza-dGTP碱基替代了PCR体系中的大部分dGTP，从而改变扩增条件，一次性扩增FMR1基因中CG含量很高的(CGG)n的重复区，解决了由于FMR1基因CG含量高，导致无法扩增长片段的问题。同时利用可降低高GC区退火温度的GC Buffer进行PCR体系条件的优化，结合优化的PCR程序对不同重复数的CGG区进行准确扩增；且本发明试剂盒的灵敏度非常高，是Southern杂交的875倍。
附图说明
图1为本发明实施例的脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒中的引物设计示意图；
图2为本发明实施例的脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒中的引物扩增结构示意图；
图3为正常(CGG重复数<54)的检测结果示意图；
图4为前突变(CGG重复数为55-200)的检测结果示意图；
图5为全突变的(CGG重复数>200)检测结果示意图；
图6为纯合子与杂合子的检测结果示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：采用三引物PCR法，对FMR1基因的5’非编码区的不同CGG区设计特异性引物和CGG重复区引物进行不同重复数片段的扩增。
下述对本申请的技术方案进行详细阐述。
1、技术原理
采用三引物PCR法，对FMR1基因的5’非编码区的不同CGG区设计特异性引物和CGG重复区引物进行不同重复数片段的扩增，利用可降低高GC区退火温度的GC Buffer进行PCR体系条件的优化，结合优化的PCR程序对不同重复数的CGG区进行准确扩增。
同时，选择毛细管电泳技术对FMR1基因扩增产物进行长度多态性检测，有高灵敏度的检测能力，且有高效、快速的优点，也可较好的检测异源双链DNA分子(即突变型和野生型的杂合DNA分子)。
2、技术方案
1)引物设计
根据国内外对FMR1基因的研究结果，将Genebank数据库中调取的FMR1相关基因全序列进行比对分析，用Primer5.0设计针对FMR1基因特异扩增引物(F1，F2，其中F2用FAM标记)及CGG重复引物(F3)，见下方示意图。其中，图1为引物设计示意图，图2为结果示意图。
2)引物筛选
利用正交试验方法，在同一管中同时扩增目标序列及内参序列，通过大量实验对比筛选引物和探针，实验结果证明引物和探针序列左右平移或长度改变，实验结果均有很大不同。三引物PCR法，模板浓度、比例均对扩增效果有重要影响。引物太长会有非特异扩增信号，太短则扩增效率比较低，检测灵敏度下降。
根据多重PCR体系的特点，合理搭配各对引物的浓度，通过大量的实验优化最终确立的引物组合见表3所示。
表3
3)引物以及反应体系其他组分浓度确定
引物终浓度选择80nM-200nM，MgCl2终浓度选择1mM-5mM，dNTP终浓度选择100nM-200nM，Taq酶终浓度选择2-5U/反应，7-deaza-dGTP选择100nM-200nM/反应，利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应体系见表4和表5。表4为Gene-specificPCR反应液(即第一反应液)配方；表5为CGG RP PCR反应液(即第二反应液)配方。
表4
表5
试剂 1人份(μL)
纯化水 5.875
2×GC Buffer I 12.5
25mM MgCl2 2
100mM dATP 0.1
100mM dTTP 0.1
100mM dCTP 0.1
100mM dGTP 0.075
10mM 7-deaza-dGTP 0.25
10μM F1 0.5
10μM F2 0.5
10μM F3 0.5
5U/μL Hotstart LA Taq酶 0.5
总量 23
注：DNA加样量为2μL，总反应体积为25μL。
4)反应条件的确定
经过大量实验对比优化，最终确定的最佳反应条件具体参见表6-7，其中，表6为Gene-specific PCR扩增程序(即第一反应液的扩增程序)，表7为CGG RP PCR扩增程序(即第二反应液的扩增程序)。
表6
表7
5)结果判断
选择梯度Marker、不同重复数的质控品做对照，优化PCR产物的毛细管分析流程及数据分析方法。选择不同重复数的质粒DNA做阳性质控品和Marker，将正常(CGG重复数<54)、前突变(CGG重复数：55-200)及全突变患者(CGG重复数>200)进行区分。结果示意图如图3-5，其中，图3表示正常(CGG重复数<54)的检测结果示意图，图4表示前突变(CGG重复数为55-200)的检测结果示意图；图5表示全突变的(CGG重复数>200)检测结果示意图。
具体实施方式
实施例1
本发明试剂盒对临床样品的检测情况
使用本发明试剂盒对临床300例样本进行检测，本发明试剂盒检测临床样本检测结果见下表8。
表8
基因型 数量(例)
正常 212
前突变 83
全突变 5
本发明试剂盒对临床300例样本检测结果与测序结果进行对比，阳性符合率和阴性符合率均为100％，准确率达100％，本发明试剂盒检测结果和测序结果对比统计结果下表9。
表9
注：Southern blot结果中阳性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阳性，阴性是指本发明试剂盒检测范围之外的其他基因型样本阳性或者阴性。
本产品的性能指标：
(1)测定准确性
对测定准确性进行研究，选用30例包含3个位点的临床样本，每例样本均包含高、中、低3个浓度，每个浓度重复检测3次，均用3批产品进行检测，分别计算该基因位点基因型的符合率。结果显示相应的位点基因型，研究结果与Southern blot结果完全符合，产品符合率为90/90。
(2)最低检测限
对最低检测限进行研究，选用6种包含3个位点全部基因型的临床样本每种样本包含7个浓度梯度，每个浓度重复检测12次，均采用3批产品检测进行检测。确定本试剂盒能稳定检出基因组DNA的最低浓度为10ng/μL。
(3)分析特异性
对特异性进行研究，均采用3批产品进行检测，结果如下：
通过干扰筛查试验，当全血样本中甘油三酯≤13.5mmol/L或总胆红素≤358.24μmol/L时，不是本试剂盒的干扰物质，溶血样本不影响本试剂盒检测结果。
通过干扰评价试验，20IU/mL肝素抗凝剂是本品的外源性干扰物质，2mg/mL枸橼酸钠或5mg/mL EDTA作抗凝剂不是本品的干扰物质。
用本试剂盒检测9例临床样本：包括1例G6PD突变阴性样本(野生型样本)、3例G6PD其他突变样本(c.517T>C、c.835G>A、c.868A>G)，1例缺失型α-地贫样本(-α3.7/αα)、1例非缺失型α-地贫样本(αCSα/αα)，1例弓形虫感染DNA样本、1例巨细胞病毒感染全血样本、1例大肠杆菌DNA样本，检测结果与核酸序列测定结果比较，前8例检测结果与Southern blot结果完全相同，后1例无检测出任何信号，即9例均无交叉反应。
(4)重复性
对重复性进行研究，选择3例包含3个位点基因型的临床样本，每例样本重复检测20次，结果显示重复性较好。
实施例2
本发明试剂盒的临床应用
1、预期用途
本试剂盒用于体外定性检测人类全血基因组DNA样本，能够检测出中国人常见的3种位点，如下表10所示：
表10
2、检验原理
本试剂盒产品采用改良的多重PCR结合毛细管电泳技术。
三引物PCR：用三引物PCR法，对FMR1基因的5’非编码区的不同CGG区设计特异性引物和CGG重复区特异引物进行不同重复数片段的扩增，利用可降低高GC区退火温度的GCbuffer进行PCR体系条件的优化，结合优化的PCR程序对不同重复数的CGG区进行准确扩增。
毛细管电泳技术：对FMR1基因扩增产物进行长度多态性检测，有高灵敏度的检测能力，且有高效、快速的优点，也可较好的检测异源双链DNA分子(即突变型和野生型的杂合DNA分子)。
3、主要组成成分如下表11。
表11
4、适用仪器
PCR仪，ABI 3730(xL)。
5、储存条件及有效期
储存条件：试剂盒避光储存于-18℃以下，避免反复冻融。
有效期：6个月。
6、样本要求
(1)本试剂盒样本来源为抗凝全血，所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA，不能使用肝素抗凝。
(2)样本采集：抽取静脉血1-5mL入含有抗凝剂的管中，标记好样本信息。
(3)血样保存：抗凝全血在室温放置不超过24小时，2-8℃保存不超过一个月，-18℃以下保存不超过两年，-70℃可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。
(4)血样运输：抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。
7、检验方法
7.1DNA的提取
本试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)或试剂盒提取人基因组DNA，推荐使用深圳会众生物技术有限公司的全血DNA提取试剂盒。若采用深圳会众生物技术有限公司的全血DNA提取试剂盒，直接按说明书加样；若用酚-氯仿或其它方法提取DNA，则要测定DNA浓度，必要时进行浓缩或稀释，将DNA浓度调整至10-200ng/μL后才能进行检测实验。
7.2PCR扩增
从试剂盒中取出所有组分置于室温融化并振荡混匀，5000rpm离心5～10秒。
取出八联管或96孔PCR板，做好标识。
每人份反应体系的配制如下表12所示：
表12
反应液可直接分装成23μL/份，加入2μL各待检DNA样本，盖紧管盖，5000rpm离心5～10秒。
将上述已加模板的反应管5000rpm离心5～10秒后，置于基因扩增仪中，并记录好样本摆放顺序，按下表13设置PCR扩增参数。
表13
8、结果判断
位点检测结果：正常(CGG重复数<54)、前突变(CGG重复数：55-200)及全突变患者(CGG重复数>200)。
9、检验方法的局限性
本试剂盒为定性产品，不能对FRM1基因进行定量测定。
10、产品性能指标
(1)测定准确性
对测定准确性进行研究，选用30例包含3个位点的临床样本，每例样本均包含高、中、低3个浓度，每个浓度重复检测3次，均用3批产品进行检测，分别计算该基因位点基因型的符合率。结果显示相应的位点基因型，研究结果与Southern blot结果完全符合，产品符合率为90/90。
(2)最低检测限
对最低检测限进行研究，选用6种包含3个位点全部基因型的临床样本每种样本包含7个浓度梯度，每个浓度重复检测12次，均采用3批产品检测进行检测。确定本试剂盒能稳定检出基因组DNA的最低浓度为10ng/μL。
(3)分析特异性
对特异性进行研究，均采用3批产品进行检测，结果如下：
通过干扰筛查试验，当全血样本中甘油三酯≤13.5mmol/L或总胆红素≤358.24μmol/L时，不是本试剂盒的干扰物质，溶血样本不影响本试剂盒检测结果。
通过干扰评价试验，20IU/mL肝素抗凝剂是本品的外源性干扰物质，2mg/mL枸橼酸钠或5mg/mL EDTA作抗凝剂不是本品的干扰物质。
用本试剂盒检测9例临床样本：包括1例G6PD突变阴性样本(野生型样本)、3例G6PD其他突变样本(c.517T>C、c.835G>A、c.868A>G)，1例缺失型α-地贫样本(-α3.7/αα)、1例非缺失型α-地贫样本(αCSα/αα)，1例弓形虫感染DNA样本、1例巨细胞病毒感染全血样本、1例大肠杆菌DNA样本，检测结果与核酸序列测定结果比较，前8例检测结果与Southern blot结果完全相同，后1例无检测出任何信号，即9例均无交叉反应。
(4)重复性
对重复性进行研究，选择3例包含3个位点基因型的临床样本，每例样本重复检测20次，结果显示重复性较好。
11、注意事项
(1)试剂盒必须严格按照所要求的保存条件保存，各组分使用前请充分融化、混匀并稍事离心后再开盖使用，以保证反应体系体积完整及防止潜在的污染。
(2)请严格分区操作实验，各区物品均为专用，实验室环境污染、试剂污染、样本交叉污染可能导致假阳性结果；试剂运输、保存不当或试剂配置不准确可能会引起试剂检测效能下降、出现假阴性或检测不准确的结果。
(3)为保证实验结果准确性，请务必在扩增前测定DNA浓度和纯度，确保样本符合本试剂盒的检测要求后再进行后续实验。
(4)本试剂盒适用样本为外周枸橼酸钠或EDTA抗凝全血，若使用其他类型的样本，出现检测结果差异与本试剂盒质量无关。
(5)反应液配置、分装及加样的操作过程中应尽量避光，加样后尽快盖紧管盖并稍事离心。
综合以上，本发明采用三引物PCR-毛细管电泳分析法对FMR1基因5'-非编码区的CGG重复区进行特异性扩增，扩增产物直接在ABI3500XL仪器上进行片段分析，通过Marker大小分析扩增产物大小范围，对正常人、前突变和患者进行鉴定区分。
1、本发明引入7-deaza-dGTP PCR法，解决了CG含量高无法扩增FMR1基因长片段的问题。用7-deaza-dGTP碱基替代了PCR体系中的大部分dGTP，从而改变扩增条件，一次性扩增FMR1基因中CG含量很高的(CGG)n的重复区，解决了由于FMR1基因CG含量高，导致无法扩增长片段的问题。
2、本专利采用三引物法，CGG重复引物扩增可区别女性纯合子和杂合子，解决了常规PCR法无法区别纯合子和杂合子的问题。
常规PCR法检测，由于无法扩增高“GC长片段”，大约20％女性该基因为纯合子。这需要用Southern杂交来验证是否是杂合子。本发明试剂盒很好地解决了这一难题，降低了对Southern杂交的依赖。
根据图6，纯合子：第一个高峰之后，无CGG扩增产物峰出现，如图6中上部A部分所示；
杂合子：最长片段(高峰之后)，之后还会出现一个高峰，如图6中下部B部分所示。
3、灵敏度非常高，是Southern杂交的875倍。
在检测全突变方面，本发明试剂盒的灵敏度是Southern杂交的5倍。上样量对比：
Southern杂交的：7μg；Gene-specific FMR1 PCR：40ng；Southern杂交是Gene-specific FMR1 PCR的175倍。以上样量与灵敏度推算：5×175＝875，试剂盒的灵敏度是Southern杂交的875倍。
综上，本发明以三引物PCR法为技术原理，通过设计特异的FMR1引物，并使用较优的GC扩增buffer和7-deaza-dGTP，对CGG重复区进行扩增，将扩增产物做毛细管电泳的片段分析，同时以不同突变数的质粒DNA模板对实验进行监测，实验方法稳定、可靠、快速，结果判读直观容易，为临床诊断及治疗提供快速、有力的依据。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳会众生物技术有限公司
<120> 脆性X综合征FMR1基因检测引物、试剂盒及检测方法
<130> 2018
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtgc tcagctccgt ttcggtttca cttccggt 48
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caggaaacag ctatgaccct cgaggcccag ccgccgccgc c 41
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caggaaacag ctatgacccc gccgccgccg 30

Claims (7)

1.一种脆性X综合征FMR1基因检测引物，其特征在于，包括用于扩增FMR1基因5'非编码区域的特异性引物F1和F2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示；
以及用于扩增CGG重复区域的引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的脆性X综合征FMR1基因检测引物，其特征在于，引物F2的5'端进行荧光标记。
3.一种脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括权利要求1-2任意一项所述的脆性X综合征FMR1基因检测引物。
4.根据权利要求3所述的脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括终浓度为1-5mM的MgCl2、终浓度为100-200nM的dNTP，终浓度为2-5U/反应的Taq酶和终浓度为100-200nM/反应的7-deaza-dGTP；引物F1、F2和F3的终浓度均为80nM-200nM。
5.根据权利要求3所述的脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒，其特征在于，引物F2的5'端标记FAM荧光基团。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，所述第一PCR反应液的组分含量为：
水：6.375μL；
2×GC buffer I：12.5μL；
25mM MgCl2：2μL；
100mM dATP：0.1μL；
100mM dTTP：0.1μL；
100mM dCTP：0.1μL；
100mM dGTP：0.075μL；
10mM 7-deaza-dGTP：0.25μL；
10μM F1：0.5μL；
10μM F2：0.5μL；
5U/μL Hotstart LATaq酶：0.5μL；
所述第二PCR反应液的组分含量为：
水：5.875μL；
2×GC buffer I：12.5μL；
25mM MgCl2：2μL；
100mM dATP：0.1μL；
100mM dTTP：0.1μL；
100mM dCTP：0.1μL；
100mM dGTP：0.075μL；
10mM 7-deaza-dGTP：0.25μL；
10μM F1：0.5μL；
10μM F2：0.5μL；
10μM F3：0.5μL；
5U/μL Hotstart LATaq酶：0.5μL。
7.一种权利要求6所述的脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述第一PCR反应液的扩增的条件设置为：97℃下预变性5min；98℃下变性40s，65℃下退火35s，72℃下延伸4min，30-45个循环；最后在72℃下延伸10min；
所述第二PCR反应液的扩增的条件设置为：97℃下预变性5min；98℃下变性40s，65℃下退火35s，72℃下延伸4min，10个循环；98℃下变性40s，65℃下退火35s，72℃下延伸5min±25s/cycle，25个循环；最后在72℃下延伸10min。
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