CN108531576A

CN108531576A - 检测脆性x染色体综合征的试剂盒和系统

Info

Publication number: CN108531576A
Application number: CN201810323295.4A
Authority: CN
Inventors: 王明旭; 王冬; 石旺
Original assignee: Beijing Cigna One Hundred Physicians From A Family For Generations Learn Co Ltd Of Inspection Institute
Current assignee: Beijing Cigna One Hundred Physicians From A Family For Generations Learn Co Ltd Of Inspection Institute
Priority date: 2018-04-12
Filing date: 2018-04-12
Publication date: 2018-09-14

Abstract

本发明提供了能够检测脆性X染色体综合征的试剂盒和系统，包括Q扩增体系试剂和TP扩增体系试剂，其中，Q扩增体系试剂包括扩增引物FMR1‑F、FMR1‑QR，TP扩增体系包括扩增引物TP、TP‑R。本发明提供的试剂盒和系统能够进行Q扩增和IP扩增，利用不同引物对对GC重复度高的模板进行检测，优化了扩增体系，结合利用高灵敏度的毛细管电泳，能够检测到200个以上CGG的重复，准确度高。

Description

检测脆性X染色体综合征的试剂盒和系统

技术领域

本发明属于生物和医疗领域，涉及脆性X染色体的检测。

背景技术

脆性X染色体综合征(Fragile X Syndrome，FXS)，于1943年由 Martin和Bell首次发现，因此又被称为Martin-Bell综合征。它主要表现为智力中度或者重度低下，语言表达能力障碍，行为注意力障碍，癫痫发作等表型。其发病率约1/2500，其中，男性发病率为1/1000，女性发病率为 1/2000。而男性智力低下的患者中大概15％是由于该疾病引起的。

目前已确认其分子致病基因为FMR1(fragile X mental retardation 1)。该基因在Genbank编号为3129728，定位于染色体Xq27.3，其5端非翻译区有CGG三核苷酸的重复序列，并具有多态性。ACMG guidelines在2006年推出检测FMR1指南，并在2013年进行了指南更新。ACMG依据CGG重复数将FXS分为4种类型：正常型NOR，CGG重复数小于44；中间型INT，CGG重复数介于45-54中间；前突型PM，CGG重复数介于55-200 之间；全突型FM，CGG重复数大于200。

FXS是一种不完全显性X连锁遗传病，男性的外显率为80％，女性为 30％。女性前突变者和约50％全突变者表型正常，而男性全突变者几乎 100％表现出不同程度的智力低下。男性前突变者会将突变基因传递给女儿时，CGG序列不会有大的扩增，但是到孙代可能会发展成全突变。

FXS是X连锁先天性智力低下中最常见的疾病之一，在智力低下中仅次于唐氏综合征。目前常用的分子生物学检测方法有southern blot，但该技术繁琐费时，需要大量的高质量DNA，不适合做常规的筛查。而PCR方法的引入给FXS的检测带来了很大变革。1991年，Fu等用PCR扩增包括 CGG在内的DNA片段，进行琼脂糖凝胶电泳检测，为FXS的检测开拓了新的视野。1996年，Warner等发明了TP-PCR的方式检测DM1基因的动态突变。

然而，FMR1基因CGG重复序列高GC，并且部分存在重复数多于 200，PCR难以进行有效扩增，也无法通过Sanger测序的方式解决；而普通的琼脂糖电泳鉴定技术无法确定CGG重复数。因此，本领域依然存在准确检测FMR1基因CGG重复序列数量的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测CGG重复度高的序列的新思路，以解决现有技术存在的问题。

在第一个方面，本发明提供一种检测脆性X染色体综合征的试剂盒，所述试剂盒包括Q扩增体系试剂和TP扩增体系试剂，其中，

Q扩增体系试剂包括扩增引物FMR1-F、FMR1-QR，TP扩增体系包括扩增引物TP、TP-R，其中FMR1-F的序列如SEQ ID NO:1～4任一项所示， FMR1-QR的序列如SEQ ID NO:5～7任一项所示，TP的序列如SEQ ID NO: 8或9所示，TP-R的序列如SEQ ID NO:10所示。

优选地，所述试剂盒中还包括DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、甜菜碱、DMSO和dNTP。

进一步优选地，所述DNA聚合酶为KOD DNA聚合酶，所述DNA聚合酶缓冲液为KODDNA聚合酶缓冲液。

第二个方面，提供检测脆性X染色体综合征的系统，包括本发明的试剂盒和毛细管电泳体系。

优选地，所述毛细管电泳体系为ABI3130XL测序仪。

进一步优选地，所述系统还包括GeneMarker软件。

本发明中，FMR1被检测的参考序列如SEQ ID NO:11所示。

本发明提供的试剂盒和系统能够进行Q扩增和IP扩增，利用不同引物对对GC重复度高的模板进行检测，优化了扩增体系，结合利用高灵敏度的毛细管电泳，能够检测到200个以上CGG的重复，准确度高。本发明的试剂盒和系统所需要的DNA量少，对DNA纯度要求不高，适合做常规的筛查。

附图说明

图1为样品A、B、D扩增产物的凝胶电泳图；

图2为样品C扩增产物的凝胶电泳图；

图3为样品A的GeneMarker图谱；

图4为样品B的GeneMarker图谱；

图5为样品C的GeneMarker图谱；

图6为样品D的GeneMarker图谱。

具体实施方式

下面将结合具体实施例详细描述本发明，但本发明的内容不限于此，本领域技术人员根据本文描述所作出的不背离本发明精神的改变、修饰都落入本发明保护的范围。

如没有明确说明，以下实施例中所使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得。

如没有明确说明，以下实施例中所使用的方法都是本领域常规方法，技术人员可以根据实施例的描述完成所述实验并获得相应的结果。

以下实施例中使用的ABCD四个样品来源于临床高度怀疑脆性X综合征患者，患者已知情同意。

实施例1：静脉外周血DNA提取

按照以下DNA提取步骤，提取ABCD四个样品的DNA：

1、分装400μL红细胞裂解液(QIAGEN，Cat：158904)到1.5mL离心管，分别加入200μL来自四个患者的静脉外周血，混匀；

2、56℃孵育10min，其间混匀数次；

3、13000g离心1min，弃上清，加入200μL细胞裂解液(QIAGEN， Cat：158906)，混匀；

4、加入10μL蛋白酶K(QIAGEN，Cat：158918)，混匀；

5、13000g离心1min，将上清转移至干净的1.5mL离心管中，加入 400μL异丙醇，混匀，混匀后可看到DNA沉淀析出；

6、13000g离心1min，弃上清，加入400μL 70％乙醇漂洗沉淀；

7、13000g离心1min，弃上清，重复洗涤一次；

8、开盖晾干使乙醇完全挥发，加入100μL无DNA酶/RNA酶的去离子水使沉淀完全溶解；

9、使用分光光度计检测DNA浓度，并将其稀释成30ng/μl的DNA样品，备用。

实施例2：PCR扩增

采用以下表1所示的引物和表2所示的扩增体系对实施例1制备得到的 DNA样品进行扩增：

表1：引物序列

注：FAM表示引物序列5’端进行FAM类型的修饰，FAM:6-羧基荧光素，信号显示颜色蓝色；NO表示序列没有修饰。

PCR扩增体系：每个样品进行两管扩增，分别标记为Q体系和TP体系，其中扩增体系分别如下：

表2：扩增体系

PCR扩增程序如下所示：

表3：PCR扩增程序

反应完成后，回收扩增产物，备用。对得到的Q方案的产物进行普通琼脂糖凝胶电泳，结果如图1和2所示。

由图可知，样品A和B主要产物在400bp，样品C的主要产物为 1000bp，样品D的主要产物为400bp。

实施例3：对扩增的四个产物按照片段分析流程进行分析

1、ABI片段分析

1)将Q体系和TP体系产物以体积比2:1的比例混合；

2)取1μl混合PCR加入到含有0.2μl Liz 1200内标(ABI，Cat： 4379950，作为判断样本大小的参照)的9μl甲酰胺中；

3)95℃变性4-10min，放入ABI 3130XL测序仪进行检测，得到原始毛细管电泳数据。

2、数据分析

1)打开GeneMarker 2.2.0，导入原始毛细管电泳数据；

2)点击左上角Project，选择Run；

3)在Run wizard界面中选择Panel、Size Standard、Standard Color进行定义；

4)在菜单中设置好X轴的范围为150-1000；

5)采用GeneMarker读取数据生成图谱，获取全长片段大小，样品 ABCD的图谱分别如图3-6所示。依据峰位置分析CGG重复情况。

3、根据测序仪读取CGG重复次数计算：计算公式为Y＝2.75X+220.62

(R²＝0.9998)(X代表重复次数，Y表示片段大小)。并根据表4的依据对重复次数进行判读：

表4：判读依据

CGG重复次数	FMR1基因突变
		N<45	正常型
N＝45～55	中间型
		N＝55～200	前突变型
N>200	全突变型

通过计算公式计算每个样品的重复次数。A＝39；B＝55；C＞200； D＝84。根据结果判读标准，A为正常型NOR，B为中间型INT，C为全突型FM；D为前突型PM。这个结果与临床最终诊断结果一致。

本发明在对基因进行全长扩增的基础上，增加了TP扩增，使得序列中间CGG的重复能够得到很好的直观效果。对于200个重复单元的扩增，由于序列的特殊性，扩增效率较低，采用毛细管代替普通琼脂糖电泳，实现了现有技术无法有效检测该基因高GC含量的问题，准确度得到提高。

SEQ ID NO:11：

ctggcacagggtgcacatacagtaggggcagaaatgaacctcaagtgcttaacacaatttttaaaaaatatatagtcaa gtgaaagtatgaaaatgagttgaggaaaggcgagtacgtgggtcaaagctgggtctgaggaaaggctcacattttga gatcccgactcaatccatgtcccttaaagggcacagggtgtctccacagggccgcccaaaatctggtgagagaggg cgtagacgcctcaccttctgcctctacgggtcacaaaagcctgggtcaccctggttgccactgttcctagttcaaagtct tcttctgtctaatccttcacccctattctcgccttccactccacctcccgctcagtcagactgcgctactttgaaccggacc aaaccaaaccaaaccaaaccaaaccaaaccagaccagacaccccctcccgcggaatcccagagaggccgaactg ggataaccggatgcatttgatttcccacgccactgagtgcacctctgcagaaatgggcgttctggccctcgcgaggc agtgcgacctgtcaccgcccttcagccttcccgccctccaccaagcccgcgcacgcccggcccgcgcgtctgtcttt cgacccggcaccccggccggttcccagcagcgcgcatgcgcgcgctcccaggccacttgaagagagagggcgg ggccgaggggctgagcccgcggggggagggaacagcgttgatcacgtgacgtggtttcagtgtttacacccgcag cgggccgggggttcggcctcagtcaggcgctcagctccgtttcggtttcacttccggtggagggccgcctctgagcg ggcggcgggccgacggcgagcgcgggcggcggcggtgacggaggcgccgctgccagggggcgtgcggcag cgcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggaggcggcggcggcggcggcggcggcggcggctgggcctcgagcgcccgcagcccacctctcgggggcgggctcccggcgctagcagggctgaagagaagatggaggagctggtggtggaagtgcggggctccaatggcgctttctacaag

<110>北京信诺佰世医学检验所有限公司

<120>检测脆性X染色体综合征的试剂盒和系统

<130>GW1183127DF

<160>11

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

ctcagctccg tttcggtttc acttcg 26

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

gctcagctcc gtttcggttt cacttc 26

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

gtttgctcag ctccgtttcg gtttcacttc cggt 34

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

ggtggagggc cgcctctgag cgggc 25

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

ccgcacttcc accaccagct cctccatctt c 31

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

gcacttccac caccagctcc tccat 25

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

cttctcttca gccctgctag cgccg 25

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

tcgtatgccg tcttctgct 19

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

tcgtatgccg tcttctgctt 20

<210>10

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>10

tcgtatgccg tcttctgctc ccgccgccgc cgccg 35

<210>11

<211>1099

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

ctggcacagg gtgcacatac agtaggggca gaaatgaacc tcaagtgctt aacacaattt 60

ttaaaaaata tatagtcaag tgaaagtatg aaaatgagtt gaggaaaggc gagtacgtgg 120

gtcaaagctg ggtctgagga aaggctcaca ttttgagatc ccgactcaat ccatgtccct 180

taaagggcac agggtgtctc cacagggccg cccaaaatct ggtgagagag ggcgtagacg 240

cctcaccttc tgcctctacg ggtcacaaaa gcctgggtca ccctggttgc cactgttcct 300

agttcaaagt cttcttctgt ctaatccttc acccctattc tcgccttcca ctccacctcc 360

cgctcagtca gactgcgcta ctttgaaccg gaccaaacca aaccaaacca aaccaaacca 420

aaccagacca gacaccccct cccgcggaat cccagagagg ccgaactggg ataaccggat 480

gcatttgatt tcccacgcca ctgagtgcac ctctgcagaa atgggcgttc tggccctcgc 540

gaggcagtgc gacctgtcac cgcccttcag ccttcccgcc ctccaccaag cccgcgcacg 600

cccggcccgc gcgtctgtct ttcgacccgg caccccggcc ggttcccagc agcgcgcatg 660

cgcgcgctcc caggccactt gaagagagag ggcggggccg aggggctgag cccgcggggg 720

gagggaacag cgttgatcac gtgacgtggt ttcagtgttt acacccgcag cgggccgggg 780

gttcggcctc agtcaggcgc tcagctccgt ttcggtttca cttccggtgg agggccgcct 840

ctgagcgggc ggcgggccga cggcgagcgc gggcggcggc ggtgacggag gcgccgctgc 900

cagggggcgt gcggcagcgc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcgga ggcggcggcg 960

gcggcggcgg cggcggcggc tgggcctcga gcgcccgcag cccacctctc gggggcgggc 1020

tcccggcgct agcagggctg aagagaagat ggaggagctg gtggtggaag tgcggggctc 1080

caatggcgct ttctacaag 1099

Claims

1.一种检测脆性X染色体综合征的试剂盒，所述试剂盒包括Q扩增体系试剂和TP扩增体系试剂，其中，

Q扩增体系试剂包括扩增引物FMR1-F和FMR1-QR，TP扩增体系包括扩增引物TP和TP-R，其中FMR1-F的序列如SEQ ID NO:1～4任一项所示，FMR1-QR的序列如SEQ ID NO:5～7任一项所示，TP的序列如SEQ ID NO:8或9所示，TP-R的序列如SEQ ID NO:10所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、甜菜碱、DMSO和dNTP。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶为KOD DNA聚合酶，所述DNA聚合酶缓冲液为KOD DNA聚合酶缓冲液。

4.一种检测脆性X染色体综合征的系统，包括权利要求1-3任一项所述的试剂盒和毛细管电泳体系。

5.根据权利要求4所述的系统，其中，所述毛细管电泳体系为ABI3130XL测序仪。

6.根据权利要求5所述的系统，其中，还包括GeneMarker软件。